黄瓜果实苦味基因BT紧密连锁的SSR标记及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102690823 A (43)申请公布日 2012.09.26 CN 102690823 A *CN102690823A* (21)申请号 201210185989.9 (22)申请日 2012.06.06 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) A01H 1/04(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号 (72)发明人 顾兴芳 张圣平 苗晗 王烨 (74)专利代理机构 北京海虹嘉诚知识产权代理 有限公司 11129 代理人 张涛 (54) 发明名称。

2、 黄瓜果实苦味基因Bt紧密连锁的SSR标记及 其应用 (57) 摘要 本 发 明 “黄 瓜 果 实 苦 味 基 因 Bt 紧 密 连 锁 的 SSR 标 记 及 其 应 用” ， 涉 及 生 物 育 种 辅 助 技 术。 标 记 序 列 如 下 ： SSR21558-F/ SSR21558-R:GTGGGGGATGTGATTCAGAC/ CATCATCCATTCCCCTCAAC， 其 扩 增 的 特 征 条带如 Seq ID No.1 所示 （175bp） 和 Seq ID No.2 所示 （192bp） 。SSR20054-F/ SSR20054-R ： GTTTGTGAGGGAAACGCA。

3、AT/ TCAAAAAGCTTCCTTCCTTCA， 其扩增的特征条带如 Seq ID No.3 所示 （127bp） 和 Seq ID No.4 所示 （108bp） 。本发明的两个标记与 Bt 基因的连锁更 加紧密， 对于黄瓜果实苦味的分子标记辅助育种 体系的建立更有帮助 ； 采用本发明获得的 SSR 标 记， 可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行果 实苦味或果实无苦味的筛选， 具有高效、 限制少、 准确的优点， 为黄瓜育种选择无苦味材料提高了 选择效率和准确性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局。

4、 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 4 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 黄瓜果实苦味基因 Bt 紧密连锁的 SSR 标记， 序列如下 ： SSR21558-F/SSR21558-R: GTGGGGGATGTGATTCAGAC/CATCATCCATTCCCCTCAAC， 其扩增的特征条带如Seq ID No.1所 示和 Seq ID No.2 所示， SSR20054-F/SSR20054-R:GTTTGTGAGGGAAACGCAAT/TCAAAAAGCTTCCTTCCTTCA， 其扩增的 特征条带如 Seq ID No.3 和 Seq ID No.4 所。

5、示。 2.权利要求1所述的SSR标记在选择无果实苦味基因Bt的黄瓜种质资源中的应用， 其 步骤如下 ： （1） 采用所述 SSR 标记为引物对黄瓜待选材料的基因组 DNA 分别进行 PCR 扩增， （2） 对扩增结果进行凝胶电泳检测， （3） 从凝胶电泳检测的结果中选出没有出现所述果实苦味特征条带的材料。 3.根据权利要求2或3所述的应用， 所述PCR扩增的体系 ： GoTaq GreenMasterMix5L （PromeGa） ， 15nGDNA， 正向、 反向引物各 30nG， 其余以 ddH2O 补足至 10L。 4. 根据权利要求 2 或 3 所述的应用， PCR 扩增的程序为 ： 。

6、94预变性 4min ； 94变性 15s ； 55退火 15s ； 72延伸 30s ； 35 个循环 ； 72保温 5min。 5. 根据权利要求 2 4 任一所述的应用， 所述凝胶电泳检测指采用 6的非变性聚丙 烯酰胺凝胶， 于 160V 恒电压电泳分离， 最后银染显色。 权 利 要 求 书 CN 102690823 A 2 1/6 页 3 黄瓜果实苦味基因 Bt 紧密连锁的 SSR 标记及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物育种辅助技术， 特别是一种黄瓜果实苦味基因 Bt 紧密连锁的 SSR 标记及其应用。 背景技术 0002 黄瓜 （Cucumis sativus L.） 生产。

7、中， 特别是设施栽培过程中， 有时会有苦味果实 产生， 导致收益损失 （Rehm et al.， 1957 ； 顾兴芳等， 2000 ； Kano et al.， 2002） 。瓜类植物 的苦味是由一类称为葫芦素(Cucurbitacins)的物质引起 （Rice et al.， 1981 ； Balkema et al.， 2003） 。葫芦素属于葫芦烷型四环三萜化合物， 对大多数生物体有毒 （Smyth et al.， 2002） 。果实苦味是影响黄瓜生产的问题之一。荷兰黄瓜育种家早在 1959 已经开始无苦味 黄瓜的选育工作， 并育成相应的品种， 这些品种的营养器官和果实均无苦味 （An。

8、deweG and Bruyn， 1959） 。 研究导致黄瓜果实苦味发生的基因的分子标记和遗传定位， 对于利用分子标 记辅助选择 （Marker Assisted Selection， MAS） 技术培育无苦味黄瓜具有重要意义。 0003 已报道的控制黄瓜果实苦味的两个基因是 Bt 和 Bt-2（Barham， 1953 ； Walters， 2001） 。本实验室保存的黄瓜材料 PI183967（基因型为 BiBiBtBt） 含有 Bt 基因。前人关 于黄瓜果实苦味的研究多集中于遗传规律、 基因连锁、 环境影响、 品种选育等方面。已有研 究表明， Bt 和 Bt-2 基因均符合单基因显性遗。

9、传， 符合质量性状遗传的特点 （Barham， 1953 ； InGGamer and Deponti， 1981 ； Walters et al.， 2001） 。Bt 基因与黄瓜雌性基因 F 不存在 连锁 （Cowen and Helsel， 1983 ； 顾兴芳等， 2005） 。 Bt-2基因与果色一致基因u、 暗色果皮基 因 D、 小刺基因 ss 连锁 （Wehner and Liu， 1998 ； Walters et al.， 2001） 。栽培条件影响黄 瓜苦味的发生 （Kano et al.， 2003） ， 当土壤中的氮素过多或不足、 有机肥缺乏、 温度过低或 过高、 日光。

10、照射不足、 营养不良、 上壤干旱缺水、 病虫害以及植株衰弱多病等条件下， 都可诱 发葫芦素的形成和积累， 从而形成苦味果实。 0004 对于黄瓜果实苦味决定基因 Bt 分子水平的研究主要是由本实验室开展进行的。 我们从分子水平对果实苦味基因进行了研究并获得了与 Bt 基因连锁的两个显性 AFLP 标 记 ： E23M66-101 和 E25M65-213。这两个标记与 Bt 基因的遗传距离分别为 5cM 和 4cM， 并且 位于 Bt 基因的两侧 （顾兴芳等， 2006） 。2011 年以果实无苦味的黄瓜纯合自交系新泰密刺 （btbt） 和果实有苦味 46GBt（BtBt） 为亲本构建的含有 。

11、184 个单株的 F2群体为试材， 对其 进行 SSR 标记遗传连锁分析， 构建了 Bt 基因的 SSR 连锁群。与 Bt 基因最近的两侧标记为 SSR10795 和 SSR07081， 遗传距离分别为 0.8cM 和 2.5cM（张圣平等， 2011） 。但是上述标记 还存在连锁距离相对较远， 且标记的检测准确率相对较低的问题， 在进行无苦味黄瓜育种 筛选中的选择效率相对较低。 0005 黄瓜果实苦味的遗传比较复杂， 受到营养体苦味基因 Bi 的影响， 隐性 bi 基因与 Bt 基因存在互作效应 （Gu et al.， 2007） 。但在纯合 Bi 基因背景下， Bt 基因是独立遗传的 （B。

12、arham， 1953 ； Walters and Wehner， 1998 ； Gu et al.， 2007） 。 为了排除黄瓜营养体苦味基 因对果实苦味基因的互作影响， 本发明中利用营养体苦味基因纯合的基因型， 进行了果实 说 明 书 CN 102690823 A 3 2/6 页 4 苦味 Bt 基因的 SSR 分子标记及遗传定位研究。 0006 目前检测黄瓜苦味的方法多为感观品尝和化学检测， 化学检测虽可检测大批材料 但较为繁琐， 其结果也不够准确 ； 感观品尝仅适于少量材料的检测， 并且无法进行精确定级 （顾兴芳等， 2004） ， 所以急需建立一套快速准确鉴定苦味的方法， 为培育无。

13、苦味黄瓜提供理 论依据。分子标记辅助选择 (MAS) 技术通过找到与苦味基因紧密连锁的分子标记可在苗期 或直接用种子进行鉴定， 简工节本， 大大缩短育种进程。 发明内容 0007 本发明的目的在于克服现有技术不足， 提供了与黄瓜果实苦味基因 Bt 紧密连锁 的 SSR 标记， 并提供了其在选择无苦味黄瓜种质资源上的应用， 采用本发明获得的 SSR 标 记， 可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行果实苦味或果实无苦味的筛选， 具有高效、 限 制少、 准确的优点， 为黄瓜育种选择无苦味材料提高了选择效率和准确性。 0008 黄瓜果实苦味基因 Bt 紧密连锁的 SSR 标记， 序列如下 ： 0009 。

14、SSR21558-F/SSR21558-R:GTGGGGGATGTGATTCAGAC/CATCATCCATTCCCCTCAAC（Seq ID No.5 和 SEQ ID No.6） ， 其扩增的特征条带如 Seq ID No.1 和 Seq ID No.2 所示。其中 Seq ID No.1 所示 175 个核苷酸的片段与果实苦味基因 Bt 连锁， Seq ID No.2 所示 192 个 核苷酸的片段与果实不苦基因 bt 连锁。 0010 SSR20054-F/SSR20054-R:GTTTGTGAGGGAAACGCAAT/TCAAAAAGCTTCCTTCCTTCA（Seq ID No.7 。

15、和 SEQ ID No.8） ， 其扩增的特征条带如 Seq ID No.3 和 Seq ID No.4 所示。其中 Seq ID No.3 所示的 127 个核苷酸的片段与果实苦味基因 Bt 连锁， Seq ID No.4 所示 108 个核苷酸的片段与果实不苦基因 bt 连锁 ； 0011 上述SSR标记在筛选含有无果实苦味基因Bt的黄瓜种质资源中的应用， 其步骤如 下 ： 0012 （1） 采用上述 SSR 标记为引物对黄瓜品种待选材料的基因组 DNA 分别进行 PCR 扩 增， 0013 （2） 对扩增结果进行凝胶电泳检测， 0014 （3） 从凝胶电泳检测的结果中选出没有出现所述果实。

16、苦味特征条带的材料。 0015 所述PCR扩增的体系 ： Green Master Mix 5L， 15ng DNA， 正向、 反向引物各30nG， 其余以 ddH2O 补足至 10L ； 0016 PCR扩增的程序为 ： 94预变性4min ； 94变性15s ； 55退火15s ； 72延伸30s ： 35 个循环 ； 72保温 5min。 0017 所述凝胶电泳检测指采用 6的非变性聚丙烯酰胺凝胶， 于 160V 恒功率电泳分 离， 最后银染显色。 0018 本发明以果实有苦味的野生黄瓜 PI183967（Cucumis sativus var.hardwickii） 和果实无苦味的黄瓜。

17、 931 纯合新泰密刺选系 （btbt） 为亲本构建的含有 189 个单株的 F2群 体为试材， 对其进行 SSR 标记遗传连锁分析 （图 1， 2） ， 构建 Bt 基因的 SSR 连锁群 （图 3） 。该 连锁群中与 Bt 基因最近的两侧的连锁标记之一为 SSR21558， 遗传距离为 0.5cM ； 另一标记 SSR20054， 遗传距离为1.0cM。 经不同遗传背景材料验证， 标记SSR21558检测结果与田间表 现型相比验证的准确率为 ： 为 95%， SSR20054 标记的准确率为 ： 75%， 使用两标记相互印证进 说 明 书 CN 102690823 A 4 3/6 页 5 。

18、行验证的准确率可达 95%。 0019 与 Bt 基因紧密连锁的标记 SSR21558 和 SSR20054 可用于对黄瓜品种候选材料快 速筛选， 特别是可以对黄瓜苗期的材料或种子直接进行分子鉴定从而选出无果实苦味基因 的黄瓜材料， 不需要等到黄瓜开花结果时对其果实进行品尝来判断。分子鉴定比人工品尝 的结果更准确， 不受其它因素干扰， 而且省工省时， 不受季节影响， 大大地缩短了育种周期。 0020 为了达到本发明上述的进行黄瓜果实无苦味材料的筛选目的， 两个 SSR 标记可单 独用于候选材料的筛选。本发明进一步提供了两个 SSR 标记相互印证的筛选方法， 提高了 候选材料的选择准确性。 附图。

19、说明 0021 图 1.SSR21558 对黄瓜亲本材料及 F2群体随机单株的检测结果 0022 P1： PI183967( 苦 ) ； P2： 931( 不苦 ) ； 0023 图 2.SSR20054 对对黄瓜亲本材料及 F2群体随机单株的检测结果 0024 P1： PI183967( 苦 ) ； P2： 931( 不苦 ) ； 0025 图 3. 黄瓜 Bt 基因 F2群体连锁图 具体实施方式 0026 1材料与方法 0027 1.1 试验材料 0028 供试黄瓜材料为 PI183967 （P1） ， Cucumis sativus var.hardwickii， 野生黄瓜， 由 美国威。

20、斯康星大学 Jack staub 教授馈赠， 为现有已知品种， 在 1998 年刘世琦等主编的 蔬 菜栽培学 一书中也有记载， 本实验室有保存， 保证自申请日起二十年内向公众发放用于验 证实验。PI183967 表现型为营养体苦且果实苦， 含营养体苦味基因 Bi 和果实苦味基因 Bt， 基因型为 BiBiBtBt。果实卵圆形、 深绿色果皮、 无光泽、 黑刺、 刺瘤稀， 已完成 60 重测序 ； 0029 931（P2） ： 纯合新泰密刺选系， 从新泰密刺中经多代自交纯化育成， 来自中国农业 科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组， 为现有已知品种， 张凤鸣等在 北方园艺 1989 年第 7 期发表的文。

21、章 保护地优良品种新泰密刺黄瓜简介 一文中也有记载， 保证自申请日起 二十年内向公众发放用于验证实验。 931表现型为营养体苦但果实不苦， 含营养体苦味基因 Bi 和果实无苦味基因 bt， 基因型为 BiBibtbt。果皮深绿色、 无光泽、 白刺、 刺瘤密。已完成 10 重测序。以 PI183967 为母本， 931 为父本杂交， 配制 F1， 自交获得 F2 群体。 0030 SSR 引物来自国际黄瓜基因组计划 （CUGI） ， 共 2112 对 （Ren et al.， 2009） 。详细 结果可以参见 Ren 等在 PloS One2009 年第 4 期在线发表的文章 An inteGr。

22、ated Genetic and cytoGenetic map of the cucumber Genome 。PCR 实验使用 ShanGhai PromeGa 公司 的 GoTaq Green Master Mix ； 凝胶电泳使用盈信阳光公司的 40% 非变性聚丙烯酰胺， 将其 稀释至 6% 后使用。 0031 实施例 1. 黄瓜果实苦味基因 Bt 连锁 SSR 标记的筛选 0032 步骤 1. 黄瓜果实苦味鉴定 0033 供试黄瓜材料于 2010 年 3 月 14 日播种育苗， 4 月 16 日定植于中国农业科学院蔬 菜花卉所春季温室。种植亲本和 F1各 30 株 （3 次重复， 每。

23、重复 10 株） ， F2189 株。苗期常规 说 明 书 CN 102690823 A 5 4/6 页 6 管理。定植后， 前期夜温控制在 12以下， 后期昼温高于 32， 整个生长期控水， 并增施氮 肥， 诱使苦味基因充分表达。参照顾兴芳等 （2004） 的方法， 采用口尝的方法鉴定果实苦味。 从根瓜开始直至试验结束 （1 个生长季节） ， 若每株有 4 次果实出现苦味， 该株即定为果实 苦， 不再品尝， 否则需继续品尝， 未出现苦味的单株， 需品尝植株上所有果实， 一般每株品尝 7 条瓜以上。每株每次由 3 位对苦味敏感者同时品尝， 以确保试验结果的准确性。 0034 结果显示 ： 在 。

24、189 株 F2代群体中， 存在果实苦味的有 126 株， 不苦的有 57 株， 经卡 方检测， 符合 3:1 的 Mendel 遗传分离比例 （X2c=3.76X20.05.1 3.84） ， 说明黄瓜果实苦味是 由单基因 （Bt） 控制， 苦味相对不苦为显性， 该性状可以按照质量性状进行分析。这与以往 的研究结果相同。 0035 步骤 2.DNA 提取和 SSR 分析 0036 从亲本、 F1和 F2群体单株上取叶片， 冷冻处理后， 用 QuickGene 核酸提取仪， 使用 DNA 试剂盒提取基因组 DNA。 0037 SSR 反应体系 ： 总体积 10L， Green Master M。

25、ix 5L， DNA（5nG L-1） 3L， 正 向、 反向引物 （50nGL-1） 各 0.6L， 其余以 ddH2O 补足 10L。PCR 程序为 ： 94预变性 4min ； 94变性 15s ； 55退火 15s ； 72延伸 30s ： 35 个循环 ； 72保温 5min。扩增产物用 6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶 160V 恒功率电泳分离， 银染显色后在观察灯箱上进行数据分析。 0038 步骤 3.SSR 标记筛选、 数据统计及连锁图构建 0039 先用两个亲本筛选引物， 然后分别以6个果实苦味单株和6个果实不苦单株的DNA 组成的苦味组和不苦组为模板， 用在两亲本间产生多态性的引。

26、物进行 Bt 基因标记的筛选， 只要苦味组和不苦组内分别有 5 株或以上单株的带型一致， 即初步认为该标记与果实苦味 性状相关。筛选了 2112 对引物组合， 选出在双亲产生多态性的 996 对引物组合， 对苦味组 和不苦组的各 6 个单株进行检验， 筛选出 24 对标记， 对 F2群体进行验证后， 得到了 19 对可 用标记。 0040 接着， 将这 19 对标记对整个 F2群体进行分析， 统计条带的分离情况。共显性标记 的统计方法为 ： 来自母本 P1的带型记为 a， 来自父本 P2的带型记为 b， 杂合的带型记为 h， 未 扩增或模糊不清的记为 u。显性标记的统计方法为 ： 若 P1为显。

27、性， 则 F2单株中与 P1带型一 致的记为 d， 与 P2带型一致的记为 b ； 若 P2为显性， 则 F2单株中与 P1带型一致的记为 a， 与 P2带型一致的记为 c。最后利用 JoinMap4.0（van Ooijen & Voorrips， 2001） 作图软件构 建 Bt 基因的 SSR 连锁群 （图 3） ， LOD 阈值 5.0， 分析数据， 获得 Bt 基因的 SSR 连锁图。将 Bt 基因定位于黄瓜第 5 染色体短臂的一端 1.5cM 的范围内， 其中与 Bt 基因两侧最近的标记分 别为 SSR21558 和 SSR20054， 遗传距离分别为 0.5cM 和 1.0cM。。

28、 0041 SSR21558-F/SSR21558-R: 0042 GTGGGGGATGTGATTCAGAC/CATCATCCATTCCCCTCAAC （Seq ID No.5和SEQ IDNo.6） ， 其 扩增的特征条带如 Seq ID No.1 所示 （175bp） 和 Seq ID No.2 所示 （192bp） 。SSR20054-F/ SSR20054-R ： GTTTGTGAGGGAAACGCAAT /TCAAAAAGCTTCCTTCCTTCA（Seq ID No.7 和 SEQ ID No.8） ， 其扩增的特征条带如 Seq ID No.3 所示 （127bp） 和 Seq 。

29、ID No.4 所示 （108bp） 。 0043 步骤 4.PCR 扩增所得差异片段的回收纯化及测序 0044 (1) 目的片段的回收 0045 采用煮沸法。具体操作为 ： 先从胶上将目标条带挖下来装入 1.5mL 的 Eppendorf 说 明 书 CN 102690823 A 6 5/6 页 7 管内， 向管内加入 100L 超纯水， 加水量视胶带颜色深浅而定 ； 常温下浸泡 24h， 转入 95 水浴锅 ( 或 PCR 仪 ) 中煮 30min 后， 5000rpm 离心 3min。产物即可取上清 3L 做模板进行 PCR 扩增， 剩余产物置 -20保存备用。 0046 (2) 目的片。

30、段的纯化 0047 用 PCR 产物直接纯化方法。在 PCR 产物中加入 2 倍体积的无水乙醇， -20过夜放 置， 1,2000rpm 离心 5min 就可以得到纯化产物。 0048 (3) 目的片段与载体的连接 0049 反应体系为10L ： PMD18-T Vector1.0L ； LiGation buffer 5.0L ； 目的片 段 4.0L。 0050 在超净工作台上加样， 混匀反应物， 暂短离心， 16连接约 1h， 过夜也不影响连接 效率。 0051 (4) 连接产物的转化 0052 1） 取出感受态细胞， SolutionA， SolutionB， 置于冰上融化 ； 005。

31、3 2） 感受态 (50L)+5L SolutionA+4L SolutionB+46L 预冷去离子水 ； 0054 3） 用冷却的无菌枪头将上述悬浮液分装到 1.5mL 离心管， 每管加入 105L， 再加 入 5L 的目的 DNA， 轻旋混匀 ； 0055 4） 42水浴热激 90s， 注意不要晃动离心管 ； 0056 5） 快速将管转移到冰浴中， 使细胞冷却 35min ； 0057 6） 加入 500L LB 液体培养基。在 37， 150rpm 摇床上预培养 1h ； 0058 7） 将菌液涂布到含有 100G mL-1Amp、 25G mL-1IPTG 和 40G mL-1X-GA。

32、L 的 LB 固体培养基上， 用一无菌的弯头玻棒轻轻的将菌液均匀涂开， 置于室温直至液体被吸收 ； 0059 8） 倒置平板， 37培养 1216h。 0060 (5) 重组质粒的蓝白斑筛选 0061 经 37培养后， 在涂布 X-Gal/IPTG 的 LB 平板上出现少量蓝色菌落和较多的白色 菌落， 其中白色菌落为重组克隆子。挑取白色单菌落涂抹在划好方格的 LB 液体培养基中， 37， 150rpm 过夜培养。 0062 (6) 菌落 PCR 的检测 0063 吸取 1L 菌液作为模板进行 PCR 扩增。取 4L PCR 产物， 经 1.5% 琼脂糖凝胶电 泳检测， 与 PCR Marker。

33、 标准分子量相比较检测插入片段的大小， 与插入目的片段大小一致 的克隆即为阳性克隆。 0064 (7) 克隆后载体的测序与分析 0065 取 3 个阳性克隆菌液在甘油 （330L 甘油中加入 1000L 菌液） 中各保存两份， 一 份 -20保藏， 一份送去测序。 0066 实施例 2.Bt 基因双侧翼 SSR 标记的验证 0067 利用本课题收集的 20 份不同生态类型的黄瓜材料， 对与 Bt 基因两侧紧密连锁标 记进行验证确定标记 SSR21558 和 SSR20054 用于分子标记辅助选择的准确性。这 20 个单 株的表型为 ： 18 株果实不苦 ； 2 株果实苦。利用标记 SSR215。

34、58 分析结果表明， 在 20 份材料 中均扩增出目的条带， 与田间表现型相比， 检测的正确率为 95.0%。将与 Bt 基因连锁的另 一标记 SSR20054 对上述材料进行验证， 在 20 份 DNA 中均扩增出目的条带， 与田间表现型相 说 明 书 CN 102690823 A 7 6/6 页 8 比， 检测的正确率为 75.0%， 使用两标记相互印证进行验证的准确率可达 95.0%。 0068 本研究中构建了黄瓜果实苦味 Bt 基因的 SSR 连锁图， 所获得的 SSR 标记 （SSR21558 和 SSR20054） 与 Bt 的遗传距离分别 0.5cM 和 1.0cM， 这两个与黄瓜果实苦味基 因紧密连锁的 SSR 标记为黄瓜分子标记辅助选择育种奠定良好的基础。 说 明 书 CN 102690823 A 8 1/4 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 102690823 A 9 2/4 页 10 0003 序 列 表 CN 102690823 A 10 3/4 页 11 0004 序 列 表 CN 102690823 A 11 4/4 页 12 序 列 表 CN 102690823 A 12 1/1 页 13 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102690823 A 13 。