一种具有解磷能力的成团肠杆菌及应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102690763 A (43)申请公布日 2012.09.26 CN 102690763 A *CN102690763A* (21)申请号 201210040912.2 (22)申请日 2012.02.23 CGMCC No. 5005 2011.06.29 C12N 1/20(2006.01) B09C 1/10(2006.01) A01C 1/00(2006.01) A01G 1/00(2006.01) A01C 21/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 西北大学 地址 710069 陕西省西安市太白北路 229 号 (。

2、72)发明人 朱晓丽 范代娣 马沛 任永霞 梁丽华 申烨华 (74)专利代理机构 西安西达专利代理有限责任 公司 61202 代理人 谢钢 (54) 发明名称 一种具有解磷能力的成团肠杆菌及应用 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 株 解 磷 细 菌， 已 保 藏 于 中 国 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 委 员 会 普 通 微 生 物 中 心，其 分 类 命 名 为 成 团 肠 杆 菌 （Enterobacteragglomerans） RKMC-7， 保藏编号为 CGMCC No.5005。在铅污染土壤中接种含有该菌 的菌剂能够促进可交换态铅的固定， 固定效率达 77%-91。

3、.4%， 该菌剂制备方法简单， 原料来源丰富， 易于实现大规模生产， 可以实现边修复边进行农 业生产的效果， 对保证粮食安全和环境保护具有 重要意义。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 6 页 1/2 页 2 1. 一种具有解磷能力的成团肠杆菌， 其分类命名为成团肠杆菌 （Enterobacter agglomerans） RKMC-7， 已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编 号为 CGMCC No.5005。

4、。 2. 根据权利要求 1 所述的具有解磷能力的成团肠杆菌， 其特征在于该菌株具有以下特 性 ： 在固体培养基 A 上菌落颜色呈乳白色， 圆形凸起， 边缘整齐 ； 在固体培养基 B 上菌落呈 圆形， 淡白色， 周围有透明圈 ； G-， 好氧或兼性厌氧， 呈长杆状 ； 最适生长温度2832， 最适 pH 值为 6.87.5 ； 在液体培养基 C 中解无机磷能力为 635.415.6 mg/L ， 能够产生草酸、 乳酸、 柠檬酸和琥珀酸， 使培养液 A 的 pH 从初始的 6.8-7.5 降至 4.13-3.54， 产吲哚乙酸 的能力为 64.75.2mg/l， 能够产生铁载体 ； 能够抗青霉素、。

5、 先锋霉素、 氨苄青霉素、 红霉素 生长 ； 在固体培养基 A 能够耐受 1200mg/L 的 Pb2+生长， 在含铅的液体培养基 A 中能够耐受 1000mg/L 的 Pb2+生长 ； 所述固体培养基A组成为 ： 胰蛋白胨5-10 g， 酵母粉 3-5 g， NaCl 5-10 g， 蒸馏水 1000 mL， 琼脂粉 15-20g， 蒸馏水 1000ml， pH 值 6.8-7.5 ； 所述的培养基 B 组成为 ： 葡萄糖 10 g， Ca3(PO4)2 5-13 g， MgCl26H2O 5 g， MgSO47H2O 0.25 g， KCl 0.2-0.5 g， (NH4)2SO4 0.1。

6、 -0.2g， 琼脂粉 15 g， 蒸馏水1000 mL, pH 6.8-7.5。 3. 含有权利要求 1 所述成团肠杆菌的微生物菌剂。 4. 权利要求 3 所述微生物菌剂的制备方法， 包括以下步骤 ： 1) 菌种发酵 将冻存的团肠杆菌 RKMC-7 在 37条件下快速解冻， 按照 0.5-1% 的接种量接入装有 10-15ml 液体培养基 A 的试管中， 28-32， 静置培养 8-12hrs， 得到 RKMC-7 的一级种子液 ； 二级三角瓶液体培养 将一级种子液按照 3-5% 的接种量接入装有 50-100ml 液体培养基 A 的三角瓶中， 28-32， 150-200rpm 培养 8-。

7、12hrs ； 发酵罐发酵 将 RKMC-7 的一级培养液按照 5-10% 的接种量分别接入装有发酵培养基 C 的发酵罐中， 进行发酵培养， 罐温 28-32， 培养 pH6.8-7.5， 通气培养 30-48 hrs ； 所述的培养基 C 组成为 ： 麸皮 5-10g， 豆粕 30-50g ， 玉米粉 3-5g， KH2PO4 5-10g/ml, K2HPO4 0.1-0.2g/ml, Ca2(PO4)3 5-13 g， MgSO47H2O 5-10 g， 水 1000ml， pH 6.87.5 ； 2） 将秸秆粉、 草炭土、 麸皮和豆粕用高速粉碎机粉碎， 过 60 目筛， 按照质量百分比为。

8、 20-30 ： 20-30 ： 5-10 ： 30-50 的比例均匀混合 ； 3） 将步骤 1） 中得到的发酵液打入储液罐即得液态解磷菌剂， 有效活菌数达 5-10109 CFU/ml ； 将发酵液按照 50-100ml/kg 的剂量与步骤 2） 中所得的固态基质混匀， 28-32发酵 5-7 天， 即得到固体菌剂， 菌体密度达到 1-2109 CFU/g。 5. 权利要求 1 所述成团肠杆菌在土壤重金属污染环境治理中的应用。 6. 根据权利要求 5 所述应用， 其特征在于重金属为铅离子。 7.根据权利要求5所述应用， 其特征在于使用方法为 ： 在植物浸种或浸根时以100-200 倍的液体菌。

9、剂稀释液浸泡种子或植物根部 2-5hrs， 育苗期或生长期灌根采用 300-600 倍的 液体菌剂稀释液 10-40ml/Kg 土壤剂量浇灌稀释液， 整个生长期灌根 1-3 次 ； 固态菌剂作为 基肥和追肥使用， 使用剂量为 5-20g/Kg 土壤。 权 利 要 求 书 CN 102690763 A 2 2/2 页 3 8. 权利要求 1 所述成团肠杆菌在土壤生态修复中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102690763 A 3 1/8 页 4 一种具有解磷能力的成团肠杆菌及应用 技术领域 0001 本发明涉及一种具有解磷能力的成团肠杆菌， 属于微生物应用技术领域。 背景技术 0002 随着。

10、全球人口的快速增长、 工业化和城市化的快速发展， 重金属污染已经成为中 国乃至世界土壤污染的严重问题。目前， 全世界平均每年排放约 500 万 t 铅。过去 50 年， 排放到全球环境中的铅约有7.83105 t 其中大部分进入土壤， 致使世界各国土壤出现不 同程度的铅污染。2003 年我国国家环保总局提供的数据显示， 我国近 l 5 的耕地面积受 到铅污染， 我国大中城市郊区蔬菜、 粮食、 水果、 肉类与畜产品中铅的超标率分别为 38.6%、 28.0%、 27.6%、 41.9% 和 71.1%。可见， 土壤重金属铅污染的修复已迫在眉睫。 0003 在重金属毒性表中， 铅排在常见的具有潜在。

11、毒性元素的第 3 位。过量的铅不仅会 阻滞作物生长发育， 降低作物产量和品质， 还可以通过生物链的富集而损害人的神经、 消 化、 免疫和生殖系统， 尤其是对儿童的智力发育造成严重障碍。 0004 目前， 治理土壤铅污染的技术主要有物理化学法和生物修复技术等。物理化学法 见效快， 但对环境扰动较大， 花费很高。目前， 国内外对于应用可溶性磷酸盐固化土壤中的 Pb 研究较多， 但是应用磷酸盐固化技术， 需要施加大量的磷酸盐， 因此花费较高， 磷酸盐除 了与土壤中的铅形成磷氯铅矿等难溶物质外， 还会与土壤中的其它物质如钙、 铁、 铝等形成 多种复合物 ； 另外， 固化剂的使用能够改变土壤结构， 对土。

12、壤微生物也可能产生一定影响 ； 还有一些研究认为磷固化剂的施用会导致土壤中磷的富集， 使铅和磷的淋滤性增加， 从而 可能导致地下水和地表水体中磷和铅含量增高。 0005 生物修复法是一种很有前景的修复方法， 目前研究较多的是超富集植物修复技 术， 至今已经发现多种具有强重金属富集能力的超富集植物。但是， 由于已发现的 Pb 超富 集植物种类尚少， 生物量较小， 生长速度慢， 修复周期长， 目前仍难以用于实际的 Pb 污染土 壤的修复。此外， 我国人口众多， 已查明受污染或污染情况不明的农田面积很大， 现实情况 是不得不在受重金属污染或污染情况不明的农田进行农作物生产。 但是, 利用超富集植物 。

13、修复技术历时长且占用大量的农田 , 不适宜在一些低污染农田土壤推广应用。因此， 在不 影响农业生产的前提下 , 选种重金属拒 ( 低 ) 吸收的植物优良品种 , 利用生物、 化学等 措施原位钝化、 阻抗土壤 - 植物系统中重金属运移是一种新型、 有效的农田重金属污染治 理技术， 目前已经成为国内外污染农田修复技术研究的热点。 0006 土壤中总磷含量大约为 0.04-0.1%， 但只有其中的 1-2.5% 能够被植物吸收利用， 绝大多数为难溶态在土壤中积累。全球每年使用约 3000 万吨磷素化肥， 但其中的 80% 由于 吸附、 沉积或固定作用成为植物难以吸收利用的无效磷。解磷菌能将土壤中植物。

14、难以吸收 利用的固定态磷转化为可吸收利用的形态， 当土壤中存在铅污染时， 游离态磷与土壤中的 铅形成难溶的磷氯铅矿等， 降低铅的生物可利用性。 解磷菌有很强的根际效应， 根际的解磷 菌能够使土壤中的铅形成难溶性的磷酸盐富集在植物根部， 抑制 Pb 从植物根部向地上部 分的转移， 提高食物的安全性。另外， 部分解磷菌除具有解磷能力外还可产生铁载体、 吲哚 说 明 书 CN 102690763 A 4 2/8 页 5 乙酸、 具有 ACC 脱胺酶活性等促进植物生长。但是自然界野生的解磷菌都存在生长缓解磷 能力较弱， 而且在污染环境中， 野生菌株生长受到抑制， 不能满足污染修复的需要。 为此， 需 。

15、要采用种种方法来打破菌种的正常代谢， 提高其生长能力、 解磷能力和抗性能力等， 要达到 此目的， 主要措施就是需要进行菌种的选育， 如进行物理和化学诱变等。 发明内容 0007 本发明的目的之一是通过紫外线 - 等离子体复合诱变获得一株可用于土壤重金 属污染环境治理的具有高效解磷能力和抗重金属 Pb 生长能力的成团肠杆菌。 0008 本发明的目的之二是提供含有上述的成团肠杆菌的微生物菌剂及其制备方法。 0009 本发明的目的之三是提供上述成团肠杆菌在土壤重金属 Pb 污染环境治理和生态 修复中的应用。 0010 本发明实现过程如下 ： 一种具有高效解磷能力的成团肠杆菌， 其分类命名为团肠杆菌 。

16、（Enterobacter agglomerans） RKMC-7， 于 2011 年 6 月 29 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心 （北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所） ， 保藏编号为 CGMCC No.5005。 0011 RKMC-7 在固体培养基 A 上菌落颜色呈乳白色， 圆形凸起， 边缘整齐 ； 在固体培养 基 B 上菌落呈圆形， 淡白色， 周围有透明圈 ； G-， 好氧或兼性厌氧， 呈长杆状 ； 其最适的生长 温度 2832， 最适的 pH 值为 6.87.5 ； 在液体培养基 C 中解无机磷能力为 635.415.6 mg/L ，。

17、 能够产生草酸、 乳酸、 柠檬酸和琥珀酸， 使培养液 B 的 pH 从初始的 6.8-7.5 降至 4.13-3.54， 产吲哚乙酸的能力为 64.75.2mg/l， 能够产生铁载体 ； 能够抗青霉素、 先锋霉 素、 氨苄青霉素、 红霉素生长 ； 在固体培养基 A 能够耐受 1200mg/L 的 Pb2+生长， 在含铅的液 体培养基 A 中能够耐受 1000mg/l 的 Pb2+生长 ； 在土壤环境中具有一定的生长优势。 0012 所述固体培养基 A 组成为 ： 胰蛋白胨 5-10 g， 酵母粉 3-5 g， NaCl 5-10 g， 蒸馏水 1000 mL， 琼脂粉 15-20g， 蒸馏水 。

18、1000ml， pH 值 6.8-7.5。 0013 所述的培养基 B 组成为 ： 葡萄糖 10 g， Ca3(PO4)2 5-13 g， MgCl26H2O 5 g， MgSO47H2O 0.25 g， KCl 0.2-0.5 g， (NH4)2SO4 0.1 -0.2g， 琼脂粉 15 g， 蒸馏水 1000 mL, pH 6.8-7.5。 0014 本发明提供的具有解磷能力的成团肠杆菌通过诱变选育方法获得， 包括以下步 骤 ： 1） 以实验室从植物根际筛选的具有较高解磷能力的成团肠杆菌 KMC 作为出发菌株 ； 2） 诱变选育 （1） 制备出发菌株 KMC 的单细胞悬液 将出发菌株 KM。

19、C 接种于液体培养基 A 中， 28-32， 150-180rpm 培养 8-12hrs， 离心， 用 无菌生理盐水洗涤， 置于装有玻璃珠的三角瓶内， 振荡， 使其分散成单细胞的菌悬液 ； 所述的培养基 A 组成为 ： 胰蛋白胨 5-10 g， 酵母粉 3-5 g， NaCl 5-10 g， 蒸馏水 1000ml， pH 值 6.8-7.5 ； （2） 紫外线诱变 将 步 骤 （1）所 得 的 菌 悬 液 分 别 调 节 浓 度 至 105-107CFU/ml， 取 0.1ml 涂 布 于 含 说 明 书 CN 102690763 A 5 3/8 页 6 600-1500mg/L Pb2+固体。

20、培养基 B 上， 进行紫外诱变， 紫外诱变的频率为 10-18W， 照射距离 为 25-50cm， 照射时间 5-10min ； 28-30静置培养 5-7days， 挑选 20-30 个透明圈较大的单 菌落， 进行摇瓶复筛， 用钼蓝比色法测定各菌株的解磷能力， 选择 5-8 株解磷活性最高的菌 株， 再分别作摇瓶复筛， 选出一株解磷活性高且稳定性好的菌株 RKMC， 制成菌悬液用于下一 步等离子体的诱变 ； 所述的摇瓶发酵复筛的步骤是 ： 首先对上述分离得到的 20-30 个透明圈直径 D 与菌落 直径 d 比值较高的菌株接种到 100ml 上述的液体培养基 A 中， 培养 8-12hrs。。

21、取 5ml 菌 液接种到装有 100ml 液体培养基 B 的 250ml 的锥形瓶中， 28-32， 150rpm 摇床振荡培养 5-7days ； （3） 等离子体诱变 将步骤 （2） 所得的 RKMC 菌株， 制成 105-107CFU/ml 的菌悬液， 取 0.1-0.2ml 均匀涂布于 无菌培养皿中， 将培养皿放到等离子下面的电极上， 调节上电极的位置， 使得上下电极之间 的距离控制在 3-8mm 左右， 调节电压为 3-5V， 电流为 0.5-0.8A， 使空气或氩气放电， 得到均 匀的空气或氩气介质阻挡放电等离子体， 放电时间为 2-7min。诱变后立即用无菌生理盐水 或磷酸盐洗脱。

22、， 涂布于含600-1000mg/L Pb2+固体培养基B上， 再进行摇瓶复筛， 挑出一株解 磷活性最高的一株菌 RKMC-P， 制成菌悬液用于下一步的诱变 ； 所述的摇瓶复筛的方法同步 骤 （2） ； （4） 将步骤 （3） 所得的菌悬液活菌数调至 105-107CFU/ml， 循环重复紫外线诱变等离 子体诱变 1-2 次， 最后得到一株耐受重金属 Pb 且解磷活性最高的菌株 RKMC-7。 0015 RKMC-7经16SrDNA鉴定与成团肠杆菌具有高度同源性， 与亲本KMC相比， 碱基相似 率为 95.79%。 0016 本发明还提供一种高效解磷菌剂， 根据营养物载体不同可以为液体菌剂或固。

23、体菌 剂。 0017 菌剂的制备包括以下步骤 ： 1) 菌种发酵 将冻存的 RKMC-7 在 37条件下快速解冻， 按照 0.5-1% 的接种量接入装有 10-15ml 液体培养基 A 的试管中， 28-32， 静置培养 8-12hrs， 得到 RKMC-7 的一级种子液 ； 二级三角瓶液体培养 将一级种子液按照 3-5% 的接种量接入装有 50-100ml 液体培养基 A 的三角瓶中， 28-32， 150-200rpm 培养 8-12hrs ； 发酵罐发酵 将 RKMC-7 的一级培养液按照 5-10% 的接种量分别接入装有发酵培养基 C 的发酵罐中， 进行发酵培养 , 罐温 28-32，。

24、 培养 pH6.8-7.5， 通气培养 30-48 hrs ； 所述的培养基 C 组成为 ： 麸皮 5-10g， 豆粕 30-50g ， 玉米粉 3-5g, KH2PO4 5-10g/ml, K2HPO4 0.1-0.2g/ml, Ca2(PO4)3 5-13 g, MgSO47H2O 5-10 g ， 水 1000ml， p H 6.87.5 ； 2） 将秸秆粉、 草炭土、 麸皮和豆粕用高速粉碎机粉碎， 过 60 目筛， 按照质量百分比为 20-30:20-30:5-10:30-50 的比例均匀混合 ； 3）将步骤 1）中得到的发酵液打入储液罐即得液态解磷菌剂， 有效活菌数可达 5-1010。

25、9 CFU/ml， 将发酵液按照 50-100ml/kg 的剂量与步骤 2） 中所得的固态基质混匀， 说 明 书 CN 102690763 A 6 4/8 页 7 28-32发酵 5-7days， 即得到固体菌剂， 菌体密度达到 1-2109 CFU/g。 0018 本发明提供的解磷菌剂液体菌剂在植物浸种或浸根时以 100-200 倍的液体菌剂 稀释液浸泡种子或植物根部 2-5hrs， 育苗期或生长期灌根采用 300-600 倍的液体菌剂稀释 液 10-40ml/Kg 土壤剂量浇灌稀释液， 整个生长期灌根 1-3 次 ； 固态菌剂作为基肥和追肥使 用， 使用剂量为 5-20g/Kg 土壤。 0。

26、019 本发明的优点与有益效果 ： 1） 采用等离子体诱变和紫外诱变多次循环处理的方法， 保证了突变菌株的稳定性 ； 2） 提供的解磷菌具有高的解磷能力， 能够抗较高浓度的 Pb 生长， 能够分泌吲哚乙酸、 产生铁原子， 传代 14 次遗传性状稳定。能够促进植物生长， 促进铅在植物根部的富集， 抑制 铅从地下部分往地上部分迁移的能力 ； 3） 本发明的菌剂营养要求简单、 易培养、 生长周期短、 能够进行规模化的大生产 ； 4） 本发明的菌剂可以明显促进植物的生长， 促进铅在植物根部的富集， 抑制铅从地下 往地上部分迁移的能力， 通过在污染土壤中选择性种植农作物， 收集植物根部等集中处理， 降低。

27、或最终去除土壤中的铅污染。环境友好且成本低廉 ； 5） 为开发利用植物根际促生菌固定土壤中的铅提供了新途径， 可以边进行农业生产边 修复， 对食物安全和重金属污染土壤的治理具有重要的意义。 附图说明 0020 图 1 为 RKMC-7 分别在固体培养基 A、 固体培养基 B 中生长的平板照片和扫描电镜 照片 ； 图 2 为 RKMC-7 产生铁载体定性实验照片 ； 图 3 为 RKMC-7 产生有机酸的高效液相色谱图 ； 图 4 为 RKMC-7 对抗生素的敏感性 ； 图 5 为 RKMC-7 抗 Pb2+生长图 ； 图 6 为 R KMC-7 传代稳定性 ； 图 7 为 R KMC-7 液体。

28、菌剂对土壤中铅的固定作用 ； 图 8 为在含铅土壤中进行的玉米盆栽试验， 并在土壤中接种 RKMC-7 固体菌剂 ： 其中图 8A 为玉米根部 Pb 的含量 ； 图 8B 为玉米茎部 Pb 的含量 ； 图 8C 为玉米叶 Pb 的含量 ； 图 8D 为 玉米子粒中 Pb 的含量 ； 图 8E 为玉米子粒产量 ； 图 8F 为玉米收获后土壤中可交换态铅的含 量。 具体实施方式 0021 实施例 1 ： 按照本发明提供的具有解磷能力的成团肠杆菌的诱变选育方法， 诱变 筛选能够耐受重金属铅的解磷能力强的诱变菌株， 包括以下步骤 ： 1） 以实验室从植物根际筛选的具有较高解磷能力的成团肠杆菌 KMC 。

29、作为出发菌株 ； 2） 诱变选育 （1） 制备出发菌株 KMC 的单细胞悬液 将出发菌株 KMC 接种于液体培养基 A 中， 28， 150rpm 培养 12hrs， 离心， 用无菌生理盐 水洗涤， 置于装有玻璃珠的三角瓶内， 振荡， 使其分散成单细胞的菌悬液 ； 说 明 书 CN 102690763 A 7 5/8 页 8 所述的培养基 A 组成为 ： 胰蛋白胨 5 g， 酵母粉 5 g， NaCl 10 g， 蒸馏水 1000ml， pH 值 7.2 ； （2） 紫外线诱变 将步骤 （1） 所得的菌悬液分别调节浓度至107CFU/ml， 取0.1ml涂布于含1200mg/L Pb2+ 固体。

30、培养基 B 上， 进行紫外诱变， 紫外诱变的频率为 15W， 照射距离为 30cm， 照射时间 5min ； 28静置培养 7days， 挑选 20 个透明圈较大的单菌落， 进行摇瓶复筛， 用钼蓝比色法测定各 菌株的解磷能力， 选择 5 株解磷活性最高的菌株， 再分别作摇瓶复筛， 选出一株解磷活性高 且稳定性好的菌株 RKMC， 制成菌悬液用于下一步等离子体的诱变 ； 所述的摇瓶发酵复筛的步骤是 ： 首先对上述分离得到的20个透明圈直径D与菌落直径 d 比值较高的菌株接种到 100ml 上述的液体培养基 A 中， 培养 12hrs。取 5ml 菌液接种到 装有 100ml 液体培养基 B 的 。

31、250ml 的锥形瓶中， 28， 150rpm 摇床振荡培养 7days ； （3） 等离子体诱变 将步骤 （2） 所得的 RKMC 菌株， 制成 107CFU/ml 的菌悬液， 取 0.1ml 均匀涂布于无菌培养 皿中， 将培养皿放到等离子下面的电极上， 调节上电极的位置， 使得上下电极之间的距离控 制在 3mm 左右， 调节电压为 3V， 电流为 0.5A， 使空气放电， 得到均匀的空气介质阻挡放电等 离子体， 放电时间为 3min。诱变后立即用无菌生理盐水或磷酸盐洗脱， 涂布于含 1200mg/L Pb2+固体培养基 B 上， 再进行摇瓶复筛， 挑出一株解磷活性最高的一株菌 RKMC-P。

32、， 制成菌悬 液用于下一步的诱变 ； 所述的摇瓶复筛的方法同步骤 （2） ； （4） 将步骤 （3） 所得的菌悬液活菌数调至 107CFU/ml， 循环重复紫外线诱变等离子体 诱变 1 次， 最后得到一株耐受重金属 Pb 且解磷活性最高的菌株 RKMC-7。KMC 与 RKMC-7 的 性质比较如表 1 所示， 从表 1 可以看出 ： 诱变后菌株的解磷能力比诱变前增加了 98.5%. 表 1 KMC 与 RKMC-7 的性质比较 RKMC-7 在分别在固体培养基 A、 固体培养基 B 中生长的平板照片和扫描电镜照片见附 图 1， 从图中可以看出 ： RKMC-7 在固体培养基 B 上能够产生明。

33、显的透明圈， 具有较高的解磷 能力 ； 附图 2 为 RKMC-7 产生铁载体定性实验照片， 从图中可以看出 ： RKMC-7 能够产生一定 量的铁载体 ； 附图 3 为 RKMC-7 产生有机酸的高效液相色谱图， 从图中可以看出， RKMC-7 能 够产生至少 4 种有机酸， 包括草酸、 乳酸、 柠檬酸和琥珀酸， 其中以柠檬酸的产量最高 ； 附图 4 为 RKMC-7 对抗生素的敏感性， 采用 Kirby Bauer 纸片检测 RKMC-7 对抗生素的敏感性， 其 中产生透明圈的有丁胺卡那霉素、 氨苄青霉素、 红霉素、 复方新诺明、 诺氟沙星、 庆大霉素和 环丙沙星 ； 无透明圈的有青霉素、。

34、 氯霉素和先锋霉素 V。从图中可以看出 ： RKMC-7 具有抗青 霉素、 氯霉素和先锋霉素 V 生长的能力， 在土壤环境中具有一定的生长优势。 0022 实施例 2 ： RKMC-7 对 Pb2+的抗性， 测定步骤如下 ： 将 RKMC-7 接种于液体培养基 A 中富集培养， 生长至指数期， 8000 rpm 离心 10 min， 用 0.85%的无菌NaCl溶液洗涤三次后， 再用0.85%的无菌NaCl溶液调整菌液浓度为107 CFU/ 说 明 书 CN 102690763 A 8 6/8 页 9 ml， 吸取1 mL加入含有80 mL添加不同浓度Pb2+ ( 0， 400， 800， 1。

35、000， 1200mg Pb2+/l ) 的液 体培养基 D 的 250 mL 三角瓶中， Pb2+以 Pb(NO3)2 的形式加入， 28 C 培养 5 天后， 600 nm 测定培养液的吸光光度值， 结果表明 ： 在 Pb2+浓度达到 1000mg/L 时， RKMC-7 仍能够生长， 说明 RKMC-7 能够耐受较高浓度的 Pb2+， 在污染较为严重的 Pb 污染土壤中能够生长， 具有修 复 Pb 污染土壤的潜力。RKMC-7 抗 Pb2+生长图如附图 5 所示， 从图中可以看出 ： 在液体培养 基中， RKMC-7 能够抗 1000mg/L 的 Pb2+生长。 0023 实施例 3 ：。

36、 RKMC-7 稳定性测定， 具体步骤如下 ： 将冻存的RKMC-7在37条件下快速解冻， 按照1%的接种量接入装有10ml液体培养基 A的试管中， 28， 静置培养12hrs， 离心， 用0.85%的无菌NaCl溶液洗涤三次后， 再用0.85% 的无菌 NaCl 溶液悬浮， 调整菌体浓度为 1107CFU/ml, 按照 2% 的接种量接入液体培养基 B 中， 150rpm 培养 7 天， 用钼蓝比色法测定上清液可溶性磷的含量 ； 将上述在液体培养基 A 中 的培养液按照 1% 的接种量再转入新鲜的液体培养基 A 中， 重复上述步骤， 共传代 14 次， 测 定 RKMC-7 的解磷能力， 结。

37、果见附图 6， 从图中可以看出传代 14 次， RKMC-7 的解磷能力基本 保持稳定， 这表明溶磷突变株特性不是对环境的适应， 而是稳定的基因突变所致。 0024 液体培养基 D 组成成分为 ： 蔗糖 10 g， NH4NO3 0.5 g， MgCl26H2O 0.5 g， K2HPO4 0.1 g， NaCl 0.1 g， 酵母粉 0.25 g， 蒸馏水 1000 mL， pH 7.2。 0025 实施例 4 ： RKMC-7 菌剂的制备方法， 包括以下步骤 ： 1) 菌种发酵 将冻存的RKMC-7在37条件下快速解冻， 按照1%的接种量接入装有15ml液体培养 基 A 的试管中， 28，。

38、 静置培养 12hrs， 得到 RKMC-7 的一级种子液 ； 二级三角瓶液体培养 将一级种子液按照 5% 的接种量接入装有 100ml 液体培养基 A 的三角瓶中， 28， 150rpm 培养 12hrs ； 发酵罐发酵 将 RKMC-7 的一级培养液按照 5% 的接种量分别接入装有发酵培养基 C 的发酵罐中， 进 行发酵培养 , 罐温 28， 培养 pH 7.2， 通气培养 48 hrs ； 所述的培养基C组成为 ： 麸皮10g， 豆粕50g ， 玉米粉5g, KH2PO4 10g/ml, K2HPO4 0.1g/ ml, Ca2(PO4)3 13 g, MgSO47H2O 5 g ， 水。

39、 1000ml， p H 7.0。 0026 2） 将秸秆粉、 草炭土、 麸皮和豆粕用高速粉碎机粉碎， 过 60 目筛， 按照质量百分比 为 20:30:10:40 的比例均匀混合 ； 3） 将步骤 1） 中得到的发酵液打入储液罐即得液态解磷菌剂， 有效活菌数达到 5109 CFU/ml ； 将发酵液按照 50-100ml/kg 的剂量与步骤 2） 中所得的固态基质混匀， 28发酵 7days， 即得到固体菌剂， 有效活菌数达到 109 CFU/g。 0027 实施例 5 ： RKMC-7 接种对土壤中无效磷的溶解作用， 包括以下步骤 ： 将土壤装入三角瓶中， 每瓶装入 100g， 按照 0、。

40、 200、 800mg P/kg 土壤的剂量加入磷酸 钙， 混合均匀后灭菌， 分别加入 20ml 实施例二中制备的液体菌剂， 对照组分别加入同等剂 量的死菌体， 每组均设三个平行， 充分混匀后 25培养 21 天， 用 0.5M NaHCO3（用浓 NaOH 溶液调 pH 至 8.5） 溶液浸提， 按照 20ml 溶液 /g 土壤的比例加入 NaHCO3溶液， 25振荡 30min， 钼锑抗比色法测定上清液中磷的含量。 说 明 书 CN 102690763 A 9 7/8 页 10 0028 实验结果表明 ： 对照组中土壤速效磷含量分别为 8.35 、 11.25、 15.49 mg/kg ，。

41、 实 验组速效磷含量分别为 24.68、 52.01、 80.02 mg/kg， 分别为对照组的倍 2.96、 4.62 和 5.17 倍 ； 说明该菌剂能够有效溶解土壤中的不溶性磷， 提高土壤中速效磷的含量。 0029 实施例 6 ： RKMC-7 接种对土壤中铅的固定作用， 具体步骤如下 ： 1） 供试土壤铅含量为 22.34 mg/kg， 将土壤装入直径为 21 cm、 高 30 cm 的花盆， 每盆 装土 5 kg。分别按照 0、 400、 800、 1200mg Pb2+ /kg 土壤的剂量加入 Pb(NO3)2溶液， 各实验 组土壤铅的实际含量分别为 ： 22.34、 422.34。

42、、 822.34和1222.34mg/kg， 每个剂量组设6个平 行， 充分混匀后每隔 5 天浇一次去离子水， 平衡 30 天 ； 2） 将上述制备的每盆土壤分别取出 100g 加入 250ml 三角瓶中， 加入 10ml 实施例 2 中 制备的液体菌剂， 以加入同等剂量的死菌体为对照组， 每个实验组设三个平行， 充分混匀后 25培养 28 天， 按照每克干土加入 8 ml 浓度为 1M 的 MgCl2 (pH 7.0) 溶液， (251)， 150rpm 振荡提取 1h， 8000rpm 离心 15 分钟， 取上清液用火焰原子吸收光谱法测定土壤中可 交换态Pb的含量。 结果表明 ： 加入活菌。

43、剂组与对照组相比能够明显降低土壤中可溶性铅的 含量， 在0、 400、 800、 1200mg Pb2+ /kg土壤的剂量组中， 加活菌剂组土壤中可交换性Pb的含 量比对照组分别降低了 4.28、 11.67、 4.88 和 5.86 倍， 菌剂对可交换性 Pb 的固定效率高达 77%-91.4%， 结果见附图 7。 0030 实施例 7 ： RKMC-7 接种玉米对土壤中铅污染的修复作用 将实施例 6 步骤 1） 制备的盆栽土壤每个铅剂量组分为加菌剂组和对照组， 每组设三 个平行， 加菌剂组按照 5g 固体菌剂 /kg 土壤的剂量加入实施例三制备的固体菌剂， 对照组 加入同等剂量的死菌体， 。

44、充分混匀后， 每盆播种 8 粒玉米种子， 定苗时每盆保留 3 株。 0031 玉米收获后将根、 茎、 叶、 子粒分别处理， 用硝酸 - 高氯酸消化后用火焰原子分光 光度计测定各自的铅含量。每盆盆栽土壤按照每克干土加入 8 ml 浓度为 1M 的 MgCl2 (pH 7.0) 溶液， 251， 150rpm 振荡提取 1h， 8000rpm 离心 15 分钟， 取上清液用火焰原子吸收 光谱法测定土壤中可交换态 Pb 的含量。 0032 结果表明 ： 加菌剂能够显著增加玉米根部的铅含量， 而茎、 叶和子粒中铅的含量与 对照组相比大幅下降。玉米根部铅含量测定结果如附图 8A 所示 ： 加活菌剂组玉米。

45、根部的 铅含量与对照组相比明显增加， 在0、 400、 800、 1200mgPb2+ /kg土壤的剂量组中， 加活菌剂组 玉米根部的铅含量分别是相应的对照组的 2.04、 2.04、 2.13 和 1.85 倍 ； 玉米茎部铅含量测 定结果如附图 8B 所示 ： 加活菌剂组玉米茎部的铅含量与对照组相比明显降低， 加活菌剂 组玉米茎部的铅含量分别比相应的对照组降低了 1.19、 3.15、 1.88 和 2.38 倍 ； 玉米叶部铅 含量测定结果如附图 8C 所示 ： 加活菌剂组玉米叶部的铅含量与对照组相比明显降低， 加活 菌剂组玉米叶部的铅含量分别比相应的对照组降低了 1.47、 1.52、。

46、 1.47 和 3.44 倍 ； 玉米子 粒铅含量测定结果如附图 8D 所示 ： 加活菌剂组玉米子粒的铅含量与对照组相比明显降低， 加活菌剂组玉米子粒的铅含量分别比相应的对照组降低了1.0、 4.33、 7.43和5.83倍， 子粒 铅含量全部符合国家规定的粮食卫生标准 （ 0.2mg/kg,GB2715-2005） ； 玉米子粒的产量结 果如附图 8E 所示 ： 加活菌剂组玉米产量比相应的对照组有较大的提高， 加活菌剂组玉米子 粒的产量分别比相应的对照组增加了 25.6%、 10%、 46.3% 和 51.4% ； 盆栽完成后土壤中可交 换态 Pb 的含量结果如附图 8F 所示 ： 加活菌剂。

47、组土壤中可交换态 Pb 的含量比对照组明显 降低， 加活菌剂组土壤中可交换态 Pb 的含量比对照组分别降低了 1.30、 24.3、 5.05 和 6.56 说 明 书 CN 102690763 A 10 8/8 页 11 倍。因此， 该菌剂对铅污染的土壤具有很好的修复效果， 对提高粮食的产量、 安全性和土壤 的修复具有重要的意义。 说 明 书 CN 102690763 A 11 1/6 页 12 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102690763 A 12 2/6 页 13 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102690763 A 13 3/6 页 14 图 7 图 8A 说 明 书 附 图 CN 102690763 A 14 4/6 页 15 图 8B 图 8C 说 明 书 附 图 CN 102690763 A 15 5/6 页 16 图 8D 图 8E 说 明 书 附 图 CN 102690763 A 16 6/6 页 17 图 8F 说 明 书 附 图 CN 102690763 A 17 。