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1、(10)申请公布号 CN 102690837 A (43)申请公布日 2012.09.26 CN 102690837 A *CN102690837A* (21)申请号 201210025653.6 (22)申请日 2012.02.07 C12N 15/82(2006.01) C12N 15/66(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院棉花研究所 地址 455000 河南省安阳市开发区黄河大道 38 号 申请人 江苏省农业科学院 (72)发明人 刘方 张保龙 王坤波 陈天子 蔡小彦 (74)专利代理机构 北京法思腾知识产权代理有 限公司 11318。
2、 代理人 高宇 (54) 发明名称 沉默两个抗性基因防治烟灰虱的方法 (57) 摘要 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及沉默两 个抗性基因防治烟灰虱的方法。根据本发明的方 法包括以下步骤 ： 选取烟粉虱抗药性 CYP6CM1 基 因和coe1基因为RNAi靶基因 ； 通过Overlap PCR 将CYP6CM1基因和coe1基因的部分序列嵌合并以 之构建反向重复序列的RNAi载体 ； RNAi载体转化 目的植物， 获得具有防治烟粉虱的转基因植物。 本 发明是对以杀虫剂为主的烟粉虱防治方法的重要 补充。 本发明利用RNAi技术干扰烟粉虱体内的抗 药性相关基因的表达， 为防治烟粉虱提供了技术 支持。
3、。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 1 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 沉默两个抗性基因防治烟灰虱的方法， 其特征在于， 所述方法包括以下步骤 ： 1) 选取烟粉虱抗药性 CYP6CM1 基因和 coe1 基因为 RNAi 靶基因 ； 2) 通过 Overlap PCR 将 CYP6CM1 基因和 coe1 基因的部分序列嵌合并以之构建反向重 复序列的 RNAi 载体 ； 3)RNAi 载体通转化目的植物， 获得具有防治烟粉虱。
4、效果的转基因植物。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述方法包括以下步骤 ： 1) 根据烟粉虱 CYP6CM1 基因和 coe1 基因序列， 分别设计下列两对引物 F1/R1 和 F2/ R2 ； F1 ATGGCGGCAGCTATTGACA R1 GTTTGGCTTGAACCTGGATGGGATGCCAGAAATCA F2 TTCTGGCATCCCATCCAGGTTCAAGCCAAACTCCA R2 GCCATACTTTTTCAGCAGGCT 2)提取烟粉虱RNA并反转录获得cDNA， 以步骤1)引物通过Overlap PCR获得CYP6CM1 基因和 coe1 基因的嵌。
5、合基因， 嵌合基因序列如 SEQ NO.1 所示， 纯化后与 pGEM-T Easy Vector 连接， 转化大肠杆菌 JM109， 测序吻合， 提取质粒 DNA ； 3) 以步骤 2) 质粒 DNA 为模板， 利用下列 F3/R3 引物进行 PCR 扩增， 将 PCR 产物和中间 载体 Hurricane 分别用 BamHI 和 HindIII 酶切， 酶切片段再进行连接， 得到 Hurricane-T， F3 CAAGGATCCATGGCGGCAGCTATTGACATG R3 TCCAAGCTTTTTCAGCAGGCTGTACCGT ； 4) 以步骤 2) 质粒 DNA 为模板， 利用下。
6、列 F4/R4 引物进行 PCR 扩增， 将 PCR 产物和 Hurricane-T 分别以 XhoI 和 SacI 酶切， 酶切片段再进行连接， 得到 Hurricane-RNAi， F4 CAACTCGAGCAGGCTGTACCGTGAATGAG R4 CAAGAGCTCATGGCGGCAGCTATTGACATG ； 5) 用 BamHI 和 SacI 分别酶切植物表达载体 pBI121 和 Hurricane-RNAi， 回收酶切的目 的片段， 用 T4-DNA 连接酶连接， 获得 RNAi 载体 ； 6) 农杆菌介导法将 RNAi 载体转化烟草， 通过硫酸卡那霉素筛选， 抗性再生苗生根。
7、、 移 栽， PCR 鉴定获取转基因烟草。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述 RNAi 载体含有 SEQ ID NO.1 所示的 部分或全部核苷酸序列。 权 利 要 求 书 CN 102690837 A 2 1/7 页 3 沉默两个抗性基因防治烟灰虱的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及沉默两个抗性基因防治烟灰虱的方法。 背景技术 0002 烟粉虱 Bemisia tabaci(Gennadius) 属同翅目， 粉虱科， 小粉虱属， 又名棉粉虱或 甘薯粉虱， 在亚洲、 欧洲、 非洲、 南美洲、 中北美洲、 大洋洲等大陆地区均有分布。 烟粉虱寄主 。
8、范围十分广泛， 主要危害十字花科、 茄科、 葫芦科、 豆科、 菊科、 锦葵科等植物。烟粉虱的危 害主要来自于其成虫和若虫。烟粉虱成虫、 若虫将口针穿过寄主植物细胞间隙深入韧皮部 取食， 直接刺吸植物汁液， 导致寄主作物生长受阻， 植株弱小 ； 成虫产卵时卵柄直接插入叶 组织内造成伤口为害 ； 其若虫和成虫分泌蜜露， 诱发煤污病， 密度高时， 叶片呈现黑色， 严重 影响光合作用。此外， 烟粉虱还传播 70 种以上的病毒病， 引起寄主作物病毒病流行， 给农 业生产造成了巨大的经济损失 (A.Rami Horowitz， Yehezkel Antignus and Dan Gerling. Mana。
9、gement of Bemisia tabaci Whiteflies.The Whitefly， Bemisia tabaci(Homoptera ： Aleyrodidae)Interaction with Geminivirus-Infected Host Plants， 2011， 293-322， DOI ： 10.1007/978-94-007-1524-0_11)。 0003 目前， 杀虫剂是控制烟粉虱危害的重要手段。现在防治烟粉虱的常规药剂主要包 括有机磷类 ( 如毒死蜱、 乙酰甲胺磷等 )、 氨基甲酸酯类 ( 如灭多威、 丁硫克百威等 )、 新烟 酰类(吡虫啉、 啶虫脒、 烯。
10、啶虫胺等)以及昆虫生长调节剂(噻嗪酮、 蚊蝇醚)等杀虫剂。 由 于烟粉虱本身的生物学特性、 杀虫剂用药的频繁性和盲目性等原因， 烟粉虱在世界范围内 已经对多种化学农药产生了抗性 (Palumbo JC， Horowitz AR， Prabhaker N.Insecticidal control and resistance management for Bemisia tabaci.Crop Prot， 2001， 20 ： 739-765)。对不同类型的杀虫剂， 烟粉虱有着不同的抗药性分子机制。对抗吡虫啉的 B 型 和 Q 型烟粉虱进行荧光定量 PCR 检测发现， 烟粉虱体内的一个 P450。
11、 基因 (CYP6CM1) 表达 量增加了 17 倍， 从而使其对包括吡虫啉在内的新烟碱类杀虫剂产生抗性 (Iris Karunker， Juergen Benting， Bettina Lueke， et al.Over-expression of cytochrome P450 CYP6CM1 is associated with high resistance to imidacloprid in the B and Q biotypes of Bemisia tabaci(Hemiptera ： Aleyrodidae).Insect Biochemistry and Molecula。
12、r Biology， 2008， 38 ： 634-644)。烟粉虱对机磷类杀虫剂的分子抗性机制则可能涉及到羧酸 酯酶介导的水解代谢作用的增强和乙酰胆碱酯酶发生点突变而对杀虫剂的敏感性降低。 在抗有机磷类杀虫剂的 B 型烟粉虱中， 羧酸酯酶基因 (coe1) 的表达量提高了 4 倍， 同时， 乙酰胆碱酯酶基因 (ace1) 在酰基的活性位点发生了突变， 最终导致烟粉虱的抗药性增强 (Alon M， Alon F， Nauen R， et al.Organophosphates resistance in the B-biotype of Bemisia tabaci(Hemiptera ： A。
13、leyrodidae)is associated with a point mutation in an ace1-type acetylcholinesterase and overexpression of carboxylesterase.Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2008， 38 ： 940-949)。 0004 RNA 干扰 (RNA interference， RNAi) 是指在进化过程中高度保守的、 由双链 说 明 书 CN 102690837 A 3 2/7 页 4 RNA(double-stranded RNA， d。
14、sRNA) 诱发的、 同源 mRNA 高效特异性降解的现象。其作用 机制是双链 RNA 被特异的核酸酶降解， 产生干扰小 RNA(siRNA)， 这些 siRNA 与同源的靶 RNA 互补结合， 特异性酶降解靶 RNA， 从而抑制、 下调基因表达。RNAi 是普遍存在于动物 和植物界的一种防御反应， 已经发展成为基因治疗、 基因功能研究和植物新种质创制的 有效的方法。Mao 等 (Mao Ying-bo， Cai Wen-juan， Wang Jia-wei， et al.Silencing a cotton bollworm P450 monooxygenase gene by plant-。
15、mediated RNAi impairs larval tolerance of gossypol.Nat Biotechnol， 2007， 25 ： 1307-1313) 构建 P450CYP6AE14 基因 的 RNAi 载体转化烟草， 转基因烟草叶片喂食棉铃虫幼虫后发现 CYP6AE14 转录水平明显下 降， 并且幼虫对棉酚的敏感性增强， 棉铃虫的生长明显被抑制。Turner 等 (Turner C T， Davymw， MacDiarmid R M， et al.RNA interference in the light brown apple moth， Epiphyas pos。
16、tvittana(Walker)induced by double-stranded RNA feeding.Insect Mol Biol， 2006， 15 ： 383-391) 利用 RNAi 技术对苹果褐卷蛾 Epiphyas postvittana(Walker) 羧 酸酯酶基因 (EposCXE1) 实现了有效沉默， 喂食外源性 dsRNA 2 d 后， 苹果褐卷蛾幼虫中肠 EposCXE1 转录水平小于对照组的 1/2。这些研究表明， 通过 RNAi 技术干扰昆虫体内 P450 基因和羧酸酯酶基因等部分抗药性基因的表达， 可以实现精确抗虫， 对农业生产具有重大 指导意义。 发明内。
17、容 0005 本发明的目的是针对烟粉虱严重危害农业生产的现状， 以烟粉虱抗药性基因为靶 标， 提供一种沉默两个抗性基因防治烟灰虱的方法。 0006 根据本发明的沉默两个抗性基因防治烟灰虱的方法， 包括以下步骤 ： 0007 1) 选取烟粉虱抗药性 CYP6CM1 基因和 coe1 基因为 RNAi 靶基因 ； 0008 2) 通过 Overlap PCR 将 CYP6CM1 基因和 coe1 基因的部分序列嵌合并以之构建反 向重复序列的 RNAi 载体 ； 0009 3)RNAi 载体转化目标植物， 获得具有防治烟粉虱的转基因植物。 0010 根据本发明的具体实施方式， 所述方法包括步骤如下 。
18、： 0011 1) 根据烟粉虱 CYP6CM1 基因和 coe1 基因序列， 分别设计下列两对引物 F1/R1 和 F2/R2 ； 0012 F1 ATGGCGGCAGCTATTGACA 0013 R1 GTTTGGCTTGAACCTGGATGGGATGCCAGAAATCA 0014 F2 TTCTGGCATCCCATCCAGGTTCAAGCCAAACTCCA 0015 R2 GCCATACTTTTTCAGCAGGCT 0016 2) 提取烟粉虱 RNA 并反转录获得 cDNA， 以步骤 1) 引物通过 Overlap PCR 获得 CYP6CM1基因和coe1基因的嵌合基因(嵌合基因序列为S。
19、EQ NO.1所示)， 纯化后与pGEM-T Easy Vector 连接， 转化大肠杆菌 JM109， 测序吻合， 提取质粒 DNA。 0017 3) 以步骤 2)DNA 为模板， 利用下列 F3/R3 引物 ( 下划线所示为引入的酶切位点 ) 进行 PCR 扩增， 将 PCR 产物和中间载体 Hurricane 用 BamHI 和 HindIII 酶切， 酶切片段进行 连接， 得到 Hurricane-T ； 0018 F3 CAAGGATCCATGGCGGCAGCTATTGACATG 说 明 书 CN 102690837 A 4 3/7 页 5 0019 R3 TCCAAGCTTTTTC。
20、AGCAGGCTGTACCGT 0020 4) 以步骤 2)DNA 为模板， 利用下列 F4/R4 引物 ( 下划线所示为引入的酶切位点 ) 进行 PCR 扩增， 将 PCR 产物和 Hurricane-T 以 XhoI 和 SacI 酶切， 酶切片段进行连接， 得到 Hurricane-RNAi ； 0021 F4 CAACTCGAGCAGGCTGTACCGTGAATGAG 0022 R4 CAAGAGCTCATGGCGGCAGCTATTGACATG 0023 5) 用 BamHI 和 SacI 酶切植物表达载体 pBI121 和 Hurricane-RNAi， 回收酶切的目 的片段， 用 。
21、T4-DNA 连接酶连接， 获得 RNAi 载体。 0024 6) 农杆菌介导法将 RNAi 载体转化烟草， 通过硫酸卡那霉素筛选， 抗性再生苗生 根、 移栽， PCR 鉴定获取转基因烟草。 0025 7) 将转基因烟草置于独立防虫温室内， 饲养烟粉虱， 调查烟粉虱体内抗药性基因 的表达水平和施用杀虫剂后烟粉虱死亡率， 以饲喂非转基因烟草的烟粉虱为对照。 0026 本发明是对以杀虫剂为主的烟粉虱防治方法的重要补充， 利用 RNAi 干扰烟粉虱 抗药性基因的表达， 烟粉虱进食 RNAi 转基因烟草后， 其体内的抗药基因 CYP6CM1 基因和 coe1 基因表达量分别为进食非转基因烟草烟粉虱的 。
22、13.34-43.44和 13.25-42.99 ； 施 用新烟碱类杀虫剂后， RNAi 转基因烟草上的烟粉虱死亡率为 96.33， 明显高非转基因烟 草上的烟粉虱死亡率75.45； 施用有机磷类杀虫剂后， RNAi转基因烟草上的烟粉虱死亡率 89.01， 明显高非转基因烟草上的烟粉虱死亡率 43.12。 附图说明 0027 图 1 为 BamHI/SacI 双酶切验证 RNAi 载体的结果， M ： Marker ； 1 ： 未酶切的 RNAi 载 体 ； 2 ： 酶切后产生的 RNAi 片段和 pBI121 质粒片段。 0028 图2显示CYP6CM1基因和coe1基因嵌合的dsRNA发夹。
23、结构， LB ： T-DNA左边界 ； RB ： T-DNA 右边界 ； NOS-T ： NOS 终止子 ； NOS-P ： NOS 启动子 ； c-C ： coe1 基因和 CYP6CM1 基因的嵌 合序列 ； FAD2intron ： 拟南芥FAD2基因的内含子 ； 35S-P ： CaMV35S启动子 ； NPTII ： 抗卡那霉 素性的选择标记基因。 0029 图 3 为 PCR 检测转基因烟草中的嵌合基因和 FAD intron 间的序列片段的结果， M ： Marker ； CK ： 非转基因烟草 ； 1-6 ： 独立的转基因烟草株系。 0030 图 4 显示饲喂转基因烟草的烟粉虱。
24、体内 CYP6CM1 基因和 coe1 基因的相对表达量， CK ： 饲喂非转基因烟草的烟粉虱 ； T1-T6 ： 饲喂 1-6 号独立转基因烟草株系的烟粉虱。 0031 图 5 显示饲喂转基因烟草的烟粉虱施用艾美乐 ( 新烟碱类杀虫剂 ) 后的死亡率。 0032 图 6 显示饲喂转基因烟草的烟粉虱施用乐果 ( 有机磷类杀虫剂 ) 后的死亡率。 具体实施方式 0033 实施例 1 0034 1、 以 CYP6CM1 基因和 coe1 基因为靶基因的 RNAi 载体构建 0035 (1) 选 取 CYP6CM1 基 因 (Iris Karunker， Juergen Benting， Betti。
25、na Lueke， et al.Over-expression of cytochrome P450 CYP6CM1 is associated with high resistance to imidacloprid in the B and Q biotypes of Bemisia tabaci(Hemiptera ： 说 明 书 CN 102690837 A 5 4/7 页 6 Aleyrodidae).Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2008， 38 ： 634-644)和coe1 基因(Alon M， Alon F， Nauen。
26、 R， et al.Organophosphatesresistance in the B-biotype of Bemisia tabaci(Hemiptera ： Aleyrodidae)is associated with a point mutation in an ace1-type acetylcholinesterase and overexpression of carboxylesterase. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2008， 38 ： 940-949) 为 RNAi 靶基因， 并分 别根据其序列设计 Over。
27、lap PCR 引物 F1/R1 和 F2/R2 ： 0036 F1 ATGGCGGCAGCTATTGACA 0037 R1 GTTTGGCTTGAACCTGGATGGGATGCCAGAAATCA 0038 F2 TTCTGGCATCCCATCCAGGTTCAAGCCAAACTCCA 0039 R2GCCATACTTTTTCAGCAGGCT 0040 (2) 收集烟粉虱， 以 TaKaRa RNAiso Reagent(TaKaRa 公司 ) 提取烟粉虱 RNA， 用 TaKaRa M-MLV reverse transcriptase(TaKaRa 公司 ) 合成 cDNA 第一链。 004。
28、1 (3) 以引物 F1/R1 和 F2/R2 分别扩增 CYP6CM1 基因 (424bp)、 coe1 基因 (523bp)， PCR 反应条件 ： 94预变性 3min， (94变性 30sec， 57退火 30sec， 72延伸 60sec)35 个 循环， 72继续延伸 10min。PCR 产物在 1.0的琼脂糖凝胶电泳分离， 用 Axygen DNA gel extraction kit(Axygen 公司 ) 回收纯化目的片段。 0042 (4) 将步骤 (3) 纯化的目的片段混合做模板， 以上述引物 F1 和 R2 进行 PCR 扩增。 PCR 反应条件 ： 94预变性 3mi。
29、n， (94变性 30sec， 57退火 30sec， 72延伸 60sec)35 个 循环， 72继续延伸 10min。PCR 产物 (916bp) 在 1.0的琼脂糖凝胶电泳分离， 用 Axygen DNA gel extraction kit(Axygen 公司 ) 回收纯化嵌合基因。 0043 (5) 将步骤 (4) 纯化的嵌合基因与 pGEM-T Easy Vector(Promega 公司 ) 连接， 反 应体系如下 ： 2Buffer 5.0l、 pGEM-T Easy Vector 0.7l、 PCR 产物 3.3l、 T4DNA 连 接酶 1.0l， 上述成分混匀后 16连接。
30、过夜。连接产物转化大肠杆菌 JM109( 生工生物工 程(上海)有限公司)， 步骤如下 ： 取一管-70保存的感受态细胞， 冰盒上融化， 加入10l 连接产物， 轻摇混匀， 冰浴30min ； 42热激90sec后迅速置冰浴2min， 加入400l液体LB， 37 100rpm 振荡培养 1h ； 取 200l 培养液均匀涂布于涂有 4lIPTG(200mg/ml) 和 40l X-GAL(20mg/ml) 的氨苄青霉素 (50mg/l) 平板上， 37静置培养 12h。挑取平板上长出的单 克隆， 在含有氨苄青霉素(50mg/l)的LB液体培养基中37、 220rpm培养16h， 经引物F1和。
31、 R2进行PCR鉴定为阳性克隆后进行序列测定， 916bp全部序列吻合， 随后用Axygen Plasmid Miniprep Kit(Axygen 公司 ) 提取质粒 DNA。 0044 (6)以步骤(5)质粒DNA为模板， 利用F3-CAAGGATCCATGGCGGCAGCTATTGACATG和和 R3-TCCAAGCTTTTTCAGCAGGCTGTACCGT引物(下划线所示为引入的酶切位点)进行PCR扩增， PCR 反应条件 ： 94预变性 3min， (94变性 30sec， 57退火 30sec， 72延伸 60sec)35 个 循环， 72继续延伸 10min。PCR 产物 (92。
32、5bp) 在 1.0的琼脂糖凝胶电泳分离， 用 Axygen DNA gel extraction kit(Axygen 公司 ) 回收纯化 PCR 产物， 用 BamHI 和 HindIII 酶切 PCR 产物和中间载体 Hurricane(Peter A.Stoutjesdijk， Surinder P.Singh， Qing Liu， et al.hpRNA-Mediated Targeting of the Arabidopsis FAD2 Gene Gives Highly Efficient and Stable Silencing.Plant Physiology， 2002， 。
33、129 ： 1723-1731. 由 澳 大 利 亚 CSIRO Plant Industry 提供， 改造自文中的 iHP construct)， 酶切产物用 T4-DNA 酶 (TaKaRa 公 说 明 书 CN 102690837 A 6 5/7 页 7 司 ) 进行连接， 连接产物转化大肠杆菌 JM109( 生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司 )， 挑取平 板上长出的单克隆， 在含有卡那霉素的 LB 液体培养基中 37、 220rpm 培养 16h， 经引物 F3/ R3进行PCR鉴定为阳性克隆后， 用Axygen Plasmid Miniprep Kit(Axygen公司)提取质粒。
34、 DNA， 命名为 Hurricane-T。 0045 (7) 以步骤 (5) 质粒 DNA 为模板， 利用 F4-CAACTCGAGCAGGCTGTACCGTGAATGAG 和 R4 -CAAGAGCTCATGGCGGCAGCTATTGACATG引物(下划线所示为引入的酶切位点)进行PCR扩增， PCR 反应条件 ： 94预变性 3min， (94变性 30sec， 57退火 30sec， 72延伸 60sec)35 个 循环， 72继续延伸 10min。PCR 产物 (919bp) 在 1.0的琼脂糖凝胶电泳分离， 用 Axygen DNA gel extraction kit(Axyge。
35、n 公司 ) 回收纯化 PCR 产物， 以 XhoI 和 SacI 酶切 PCR 产 物和 Hurricane-T， 酶切产物用 T4-DNA 酶 (TaKaRa 公司 ) 进行连接， 连接产物转化大肠杆 菌JM109， 挑取平板上长出的单克隆， 在含有卡那霉素的LB液体培养基中37、 220rpm培养 16h， 经引物 F4/R4 进行 PCR 鉴定为阳性克隆后， 用 Axygen Plasmid Miniprep Kit(Axygen 公司 ) 提取质粒 DNA， 命名为 Hurricane-RNAi。 0046 (8) 用 BamHI 和 SacI 酶 切 植 物 表 达 载 体 pBI。
36、121(Clontech 公 司 ) 和 Hurricane-RNAi， 酶 切 产 物 在 0.8 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离， 用 Axygen DNA gel extraction kit(Axygen 公司 ) 回收纯化目的片段， 用 T4-DNA 连接酶 (TaKaRa 公司 ) 连 接， 连接产物转化大肠杆菌 JM109( 生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司 )。挑取平板上长出 的单克隆， 在含有卡那霉素的 LB 液体培养基中 37、 220rpm 培养 16h， 用 Axygen Plasmid Miniprep Kit(Axygen公司)提取质粒DNA， 经Bam。
37、HI/SacI双酶切验证后(图1)， 获得植物 表达的 RNAi 载体 ( 图 2)。 0047 2、 农杆菌介导转化烟草 0048 2.1 农杆菌感受态细胞的制备 0049 取-70保存农杆菌EHA105(北京Biovector公司)划线于LB(含有20mg/l rif) 平板， 28培养 2d。挑单菌落培养于 50ml 液体 LB( 含 20mg/l rif)， 140rpm， 28培养至 OD6000.5 ； 农杆菌菌液转入无菌50ml离心管， 4000rpm离心4min， 弃上清液， 加入5ml预冷 0.15M NaCl 悬浮细胞， 4000rpm 离心 4min， 去上清液 ； 再用。
38、 0.15M NaCl 悬浮细胞， 4000rpm 离心 4min， 去上清液 ； 加入 3ml 预冷 20mM CaCl2溶液， 轻轻悬浮细胞， 冰上放置 30min， 加入 终浓度为 15甘油， 混匀后每管分装 100l， 立即冻存于 -70。 0050 2.2RNAi 载体转化农杆菌 0051 取 1g 左右的 RNAi 质粒 DNA 加入到 100l 农杆菌感受态细胞中， 混匀后， 冰浴 30min ； 液氮冷冻1min， 取出后37水浴2min， 冰浴2min ； 加入1ml液体LB， 28、 140rpm摇 培 2-3h ； 离心， 100l 液体 LB 重悬后涂在含 50mg/l。
39、 Kan LB 平板上， 28培养到形成单菌 落 ； 单菌落培养于 50mg/l Kan 液体 LB， 28、 140rpm 摇培 16h， 取 2l 菌液进行 PCR 验证， 阳性克隆保存备用。 0052 2.3 农杆菌转化烟草 0053 农杆菌介导的叶盘法转化烟草为本领域的常规技术， 本发明中的转基因烟草参照 以下方法获得 ： 0054 (1) 将健康烟草叶片置于大培养皿， 用 75乙醇浸泡灭菌 1min， 0.1升汞浸泡灭 菌 8 分钟， 用灭菌水冲洗 5 次。 说 明 书 CN 102690837 A 7 6/7 页 8 0055 (2) 灭菌滤纸吸去烟叶表面水， 用刀片切成小块。 0。
40、056 (3) 农杆菌 28下培养至 OD600 0.6， 浸染叶盘 5min。 0057 (4) 将叶盘转移到灭菌吸水纸上， 吸干表面菌液后转移到诱导培养基 (MS 培养基 +0.1mg/LNAA+1mg/L 6-BA+3蔗糖 +2.5g/L phytagel， pH5.8)， 21暗培养两天 0058 (5) 将叶盘转移到选择培养基 (MS 培养基 +0.1mg/LNAA+1mg/L 6-BA+3蔗糖 +2.5g/L phytagel+500mg/L头孢霉素+100mg/L卡那霉素， pH5.8)光照培养一个月左右， 保 持 28 30， 每 15 天更换一次分化培养基。 0059 (6)。
41、分化出小苗后， 将苗转移到生根培养基(1/2MS培养基+0.1mg/L NAA+250mg/L 头孢霉素 )， 25光照 16h。生根后将卡那霉素抗性苗移栽到土壤。 0060 2.4 转基因烟草的 DNA 提取 0061 利用 CTAB 法提取再生烟草植株叶片 DNA， 具体步骤如下 ： 取 0.1-0.5g 新鲜叶片， 液氮研磨成粉末， 转入1.5ml离心管， 加入600l预热CTAB裂解液(表1)， 涡旋混匀， 65 水浴 1h， 加入 600l 氯仿 - 异戊醇 (24 1)， 颠倒 50 次混匀， 10000rpm 离心 15min， 取上 清于新 1.5ml 离心管， 加入等体积的预。
42、冷异丙醇， 充分混匀， -20放置 30min， 12000rpm 离 心 15min， 弃上清， 加入 1ml 75酒精洗涤 DNA 沉淀， 弃酒精， 风干， 加 100l TE 溶解 DNA， 4储存备用。 0062 表 1CTAB 裂解液组成 0063 0064 2.5 转基因烟草的 PCR 检测 0065 用 特 异 引 物 Carb-Mono-409F ： CAGGTTCAAGCCAAACTCCA 和 FAD-intron96R ： TATCGTGAGCGGAGAAATTC 进行 PCR 检测 RNAi 载体中的内含子部分序列， 目的片段大小为 600bp 左右， 非转基因烟草为对照。
43、。PCR 扩增程序如下 ： 95预变性 5min ； 94变性 30sec， 56退火 30sec， 72延伸 50sec， 30 个循环 ； 72延伸 5min。PCR 产物经 1琼脂糖凝胶电 泳， 电泳检测结果显示 ： 转基因烟草植株能扩增出 400bp 大小的片段， 而非转基因植株没有 扩增到特异条带 ( 图 3)， 证明 RNAi 框架已经整合至转基因烟草基因组。 0066 3、 转基因烟草防治烟粉虱的效果 0067 3.1 饲喂转基因烟草的烟粉虱体内 CYP6CM1 基因和 coe1 基因表达水平检测 0068 将转基因烟草置于独立防虫温室内， 饲养烟粉虱。烟粉虱进食 5 天后， 收。
44、集 烟粉虱， 以 TaKaRa RNAiso Reagent(TaKaRa 公司 ) 提取烟粉虱 RNA， 用 TaKaRa M-MLV 说 明 书 CN 102690837 A 8 7/7 页 9 reverse transcriptase(TaKaRa 公司 ) 合成 cDNA 第一链。定量 PCR 检测 CYP6CM1 基 因 ( 引 物 ACGGAGCCTTTCAAGTTACCAGA 和 CGTCTCCGAAAGGCAAATAGGT) 和 coe1 基 因 ( 引 物 GATGTCTCACGGCAACTTTACCC 和 GCCAACTCTGTAATTGAATGTGACA) 的表达水平，。
45、 内参为 actin 基 因 ( 引物 TCAGGGTGTAATGGTCGGTA 和 TGATGATACCGTGCTCGATGG)。以饲喂非转基因烟草的烟 粉虱为对照， 饲喂转基因烟草的烟粉虱体内CYP6CM1基因和coe1基因相对表达水平分别为 13.34-43.44和 13.25-42.99 ( 图 4)。 0069 3.2 饲喂转基因烟草的烟粉虱对杀虫剂的敏感性检测 0070 将转基因烟草置于独立防虫温室内， 饲养烟粉虱。烟粉虱进食 5 天后， 分别施用新 烟碱类杀虫剂 (70艾美乐水分散粒剂， 购于杭州拜耳作物科技公司 ) 和有机磷类杀虫剂 (40乐果乳剂， 购于江苏东进农药化工厂销售。
46、公司 )， 调查烟粉虱死亡率， 以饲喂非转基因 烟草的烟粉虱为对照。用药 3 天后， RNAi 转基因烟草上的烟粉虱在施用艾美乐 ( 新烟碱类 杀虫剂 ) 后死亡率为 96.33， 明显高于非转基因烟草上的烟粉虱死亡率 75.45 ( 图 5)， 在施用乐果(有机磷类杀虫剂)后死亡率为89.01， 明显高于非转基因烟草上的烟粉虱死 亡率 43.12 ( 图 6)。 说 明 书 CN 102690837 A 9 1/1 页 10 0001 序 列 表 CN 102690837 A 10 1/2 页 11 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102690837 A 11 2/2 页 12 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102690837 A 12 。