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1、(10)申请公布号 CN 102668903 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102668903 A *CN102668903A* (21)申请号 201210142654.9 (22)申请日 2012.05.09 A01G 7/06(2006.01) (71)申请人 北京大学 地址 100871 北京市海淀区颐和园路 5 号 (72)发明人 朱玉贤 靳翔 逄宇 王慧 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 (54) 发明名称 DNA 甲基化修饰剂在调控棉花纤维长度中的 应用 (57) 摘要 本发明公开了一种 DNA 甲基化修。
2、饰剂在调控 棉花纤维长度中的应用。所述 DNA 甲基化修饰剂 为DNA甲基化抑制剂或DNA甲基化促进剂。 实验证 明， 使用DNA甲基化抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞苷 处理棉花胚珠， 当浓度为6mol/L时， 体外培养6 天后的棉花纤维长度与对照相比， 增长受到的促 进作用最高， 是对照的2.39倍 ； DNA甲基化促进剂 S- 腺苷甲硫氨酸处理棉花胚珠， 在浓度未达到产 生毒性致死胚珠的前提下， 当浓度为 15mol/L 时， 体外培养 6 天后的棉花纤维长度与对照相比， 增长受到的抑制作用最高， 是对照的 23.3%。本发 明在生产中可用于调控棉花纤维的长度以获得符 合实际需要的棉花， 具有。
3、重大的经济价值和广阔 的应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1.DNA 甲基化修饰剂在调控棉花纤维长度中的应用 ； 所述 DNA 甲基化修饰剂为 DNA 甲 基化抑制剂或 DNA 甲基化促进剂。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于 ： 所述DNA甲基化抑制剂为5-杂氮-2 -脱 氧胞苷 ； 所述 DNA 甲基化促进剂为 S- 腺苷甲硫氨酸。 3. 一种调控棉花纤维长度的方法， 其特征在于 ： 所述方法包括用 DNA 甲基化抑制剂处 理棉花胚。
4、珠或植株以促进棉花纤维伸长的步骤。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于 ： 所述DNA甲基化抑制剂为5-杂氮-2 -脱 氧胞苷。 5. 一种调控棉花纤维长度的方法， 其特征在于 ： 所述方法包括用 DNA 甲基化促进剂处 理棉花胚珠或植株以抑制棉花纤维伸长的步骤。 6. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于 ： 所述 DNA 甲基化促进剂为 S- 腺苷甲硫氨 酸。 7. 根据权利要求 3-6 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述处理的时期为所述棉花开 花后的 24-144 小时内。 8. 根据权利要求 4 或 7 所述的方法， 其特征在于 ： 使用所述 DNA 甲基化抑制剂处。
5、理棉 花胚珠中， 所述DNA甲基化抑制剂为5-杂氮-2-脱氧胞苷时， 其使用浓度为0.5-12mol/ L。 9. 根据权利要求 6 或 7 所述的方法， 其特征在于 ： 使用所述 DNA 甲基化促进剂处理棉 花胚珠中， 所述 DNA 甲基化促进剂为 S- 腺苷甲硫氨酸时， 其使用浓度为 0.5-15mol/L。 10. 根据权利要求 1-9 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述棉花为陆地棉。 权 利 要 求 书 CN 102668903 A 2 1/4 页 3 DNA 甲基化修饰剂在调控棉花纤维长度中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种 DNA 甲基化修饰剂在调控棉花纤维长度中的应。
6、用。 背景技术 0002 棉花纤维是从胚珠外表皮细胞分化而来的单细胞结构。 棉花纤维是纺织工业的主 要原料， 具有重要的经济价值。纤维质量取决于其最终的长度与强度。同时， 棉纤维细胞也 是研究细胞伸长、 分化和细胞壁合成等重要生物学现象的理想系统。 所以， 研究纤维伸长有 重要的经济价值和理论意义。 0003 棉花纤维细胞的发育过程是细胞超常伸长和细胞壁超常加厚的过程。 陆地棉终长 度约为 3.0cm 左右， 细胞壁直径为 11-22m， 即长宽比为 1000-3000。棉花纤维细胞的发育 过程一般可以分为四个相互重叠的时期 ： 纤维起始， 细胞伸长 （初生壁形成） 、 次生壁合成和 成熟期。。
7、 0004 DNA 甲 基 化 （DNA methylation） 是 指 生 物 体 在 DNA 甲 基 转 移 酶 （DNA methyltransferase,DNMT） 的催化下， 以 S- 腺苷甲硫氨酸 （SAM） 为甲基供体将甲基转移到 特定的碱基上的过程。 DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一， 甲基化的主要形式 有 5- 甲基胞嘧啶、 6- 甲基腺嘌呤和 7- 甲基鸟嘌呤， 在真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。 大量研究表明， 在高等植物中 DNA 甲基化能引起染色质结构、 DNA 构象、 DNA 稳定性及 DNA 与 蛋白质相互作用方式的改变， 从而参与调控许多重要的生。
8、物学现象和发育过程。本发明的 研究小组发现， DNA 甲基化参与调控棉花纤维细胞的伸长发育过程。 发明内容 0005 本发明的目的是提供 DNA 甲基化修饰剂在调控棉花纤维长度中的应用， 所述 DNA 甲基化修饰剂为 DNA 甲基化抑制剂或 DNA 甲基化促进剂 ； 0006 所述 DNA 甲基化修饰剂是指调节 DNA 甲基化水平的试剂， 分为抑制 DNA 甲基化修 饰或降低 DNA 甲基化水平的 DNA 甲基化抑制剂和促进 DNA 甲基化修饰或提高 DNA 甲基化水 平的 DNA 甲基化促进剂。 0007 在上述应用中， 所述 DNA 甲基化抑制剂可为 5- 杂氮 -2- 脱氧胞苷， 也可为。
9、其它 DNA 甲基化抑制剂 ； 所述 DNA 甲基化促进剂可为 S- 腺苷甲硫氨酸 （SAM） ， 也可为其它 DNA 甲 基化促进剂。 0008 本发明的另一个目的是提供一种调控棉花纤维长度的方法， 该方法包括用 DNA 甲 基化抑制剂处理棉花胚珠或植株以促进棉花纤维伸长的步骤。 0009 所述 DNA 甲基化抑制剂可为 5- 杂氮 -2- 脱氧胞苷， 也可为其它 DNA 甲基化抑制 剂。 0010 本发明的还提供另一种调控棉花纤维长度的方法， 该方法包括用 DNA 甲基化促进 剂处理棉花胚珠或植株以抑制棉花纤维伸长的步骤。 0011 所述 DNA 甲基化促进剂可为 S- 腺苷甲硫氨酸， 也。
10、可为其它 DNA 甲基化促进剂。 说 明 书 CN 102668903 A 3 2/4 页 4 0012 在上述两种方法中， 所述处理的时期可为所述棉花开花后的 24-144 小时， 如 24-48 小时 ； 棉花开花后的 24-144 小时为棉花纤维细胞的伸长期 ； 本发明的实施例选取开 花 24-48 小时的棉花胚珠进行处理是为了保证实验结果的一致性。 0013 在上述两种方法中， 使用所述DNA甲基化抑制剂处理棉花胚珠中， 所述DNA甲基化 抑制剂为 5- 杂氮 -2- 脱氧胞苷时， 其使用浓度可为 0.5-12mol/L， 或 2-12mol/L， 具体 可为 2mol/L、 6mol。
11、/L 或 12mol/L ； 使用所述 DNA 甲基化促进剂处理棉花胚珠中， 所述 DNA甲基化促进剂为S-腺苷甲硫氨酸时， 其使用浓度可为0.5-15mol/L， 或5-15mol/L， 具体可为 5mol/L、 10mol/L 或 15mol/L。 0014 在上述两种方法中， 所述处理棉花胚珠可按照包括如下步骤的方法进行 ： 将所述 棉花胚珠置于含有所述DNA甲基化抑制剂或所述DNA甲基化促进剂的棉花胚珠培养基中进 行培养， 所述培养的温度和光照条件如下 ： 30、 黑暗。 0015 本发明所述棉花可应用于不同的栽培棉种， 尤其适合于陆地棉品种。 0016 实验证明， 使用 DNA 甲基。
12、化抑制剂 5- 杂氮 -2 - 脱氧胞苷处理棉花胚珠， 当浓度 为6mol/L时， 体外培养6天后的棉花纤维长度与对照相比， 增长受到的促进作用最高， 是 未经 5- 杂氮 -2 - 脱氧胞苷处理 （对照） 的 2.39 倍 ； DNA 甲基化促进剂 S- 腺苷甲硫氨酸处 理棉花胚珠， 在浓度未达到产生毒性致死胚珠的前提下， 当浓度为 15mol/L 时， 体外培养 6 天后的棉花纤维长度与对照相比， 增长受到的抑制作用最高， 是未经 S- 腺苷甲硫氨酸处 理 （对照） 的 23.3%。本发明在生产中可用于调控棉花纤维的长度以获得符合实际需要的棉 花， 具有重大的经济价值和广阔的应用前景。 具。
13、体实施方式 0017 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0018 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0019 下述实施例中的百分含量， 如无特别说明均为质量百分含量。 0020 下述实施例中所用到的材料和试剂具体如下 ： 0021 陆地棉品种徐州 142（Gossypium hirsutum Xuzhou-142） ： 中国农业科学院棉花 研究所科技贸易公司 ； 0022 5- 杂 氮 -2- 脱 氧 胞 苷 （5-aza-2-deoxycytidine） ： DNA 甲 基 化 抑 制 剂， SIGMA-ALDRICH ； 0。
14、023 S- 腺苷甲硫氨酸 （SAM） ： DNA 甲基化促进剂， SIGMA-ALDRICH。 0024 实施例 1、 DNA 甲基化抑制剂调控棉花纤维长度 0025 一、 实验材料 ： 5- 杂氮 -2 - 脱氧胞苷 ； 陆地棉品种徐州 142。 0026 二、 实验方法 0027 对棉花胚珠进行体外培养， 在培养液中分别添加不同浓度的 5- 杂氮 -2- 脱氧胞 苷， 以未添加 5- 杂氮 -2 - 脱氧胞苷为对照 （CK1） 。每个浓度的处理设 3 个重复， 每个重复 20 个胚珠。体外培养 6 天后， 测量棉花胚珠纤维长度。 0028 上述棉花胚珠体外培养及纤维长度测量的步骤具体如下。
15、 ： 0029 1、 按照下表 1 配制棉花胚珠体外培养的培养液。使用前， 用 KOH 调 PH 值至 6.0， 121、 15 分钟高压灭菌， 备用。 说 明 书 CN 102668903 A 4 3/4 页 5 0030 表 1. 棉花胚珠体外培养的培养液配方 0031 0032 2、 胚珠的体外培养 （参照文献 “Beasley and Irwin,1973” 的方法） ： 0033 1） 摘取在温室中开花 24-48 小时的棉花花朵， 剥去苞片、 萼片、 花瓣后浸泡于 10% 次氯酸钠溶液中消毒 15 分钟。 0034 2） 用无菌 ddH2O 洗 5-6 次， 洗去次氯酸钠， 防止次。
16、氯酸钠接触到胚珠。 0035 3） 在无菌条件下， 用手术刀和镊子小心地剥开棉铃子房 （不能碰伤胚珠） ， 取出胚 珠， 轻轻放置于装有培养液的三角瓶中， 使胚珠漂浮于液体的表面。 0036 4） 30恒温、 黑暗、 静置培养。 0037 3、 棉花纤维长度的测量 0038 1） 将上述体外培养 6 天的棉花胚珠从培养液中取出， 放入 70% 酒精中浸泡 5-10 分 钟， 除去酚类、 糖类等粘性较大的物质。 0039 2） 小心用尖头镊子取出胚珠， 在 ddH2O 中轻轻晃动洗去酒精。 0040 3） 将胚珠置于涂有甘氨酸涂层的载玻片上， 在体视镜下用解剖针轻轻的将纤维梳 开呈扇形。 说 明。
17、 书 CN 102668903 A 5 4/4 页 6 0041 4） 在体视镜中观察并测量梳平纤维的长度。 0042 三、 实验结果 0043 不同浓度的 5- 杂氮 -2- 脱氧胞苷处理棉花胚珠后， 棉花纤维的长度变化见表 2。 0044 表 2、 添加不同浓度的 5- 杂氮 -2- 脱氧胞苷对棉花纤维长度的影响 （mm） 0045 0046 表 2 的结果表明 ： DNA 甲基化抑制剂 5- 杂氮 -2- 脱氧胞苷可促进棉花纤维的伸 长 ； 当在棉花胚珠的体外培养液中添加 6mol/L 的 5- 杂氮 -2 - 脱氧胞苷时， 棉花纤维最 长， 是对照的 2.39 倍。 0047 实施例 。
18、2、 DNA 甲基化促进剂调控棉花纤维长度 0048 一、 实验材料 ： S- 腺苷甲硫氨酸 （SAM） ； 陆地棉品种徐州 142。 0049 二、 实验方法 0050 对棉花胚珠进行体外培养， 在培养液中分别添加不同浓度的 SAM， 以未添加 SAM 为 对照 （CK2） 。每个浓度的处理设 3 个重复， 每个重复 20 个胚珠。体外培养 6 天后， 测量棉花 胚珠纤维长度。 0051 棉花胚珠体外培养及纤维长度测量的方法与实施例 1 相同。 0052 三、 实验结果 0053 不同浓度的 SAM 处理棉花胚珠后， 棉花纤维的长度变化如表 3 所示。 0054 表 3、 添加不同浓度的 SAM 对棉花纤维长度的影响 （mm） 0055 0056 表 3 的结果表明 ： DNA 甲基化促进剂 SAM 可抑制棉花纤维的伸长， 在浓度未达到产 生毒性致死胚珠的前提下， SAM 的浓度越高， 抑制效果越明显。当在棉花胚珠的体外培养液 中添加 15mol/L 的 SAM 时， 棉花纤维最短， 是对照的 23.3%。 说 明 书 CN 102668903 A 6 。