对甘氨酸转运子具有抑制活性的新化合物 【技术领域】
本发明涉及对哺乳动物神经胶质细胞内甘氨酸转运子具有抑制活性的由微生物产生的新型化合物。
技术背景
近年来，研究证明神经分裂症患者脑内的谷氨酸受体数量明显增加。谷氨酸受体的激活需要存在于脑脊髓间隙中的甘氨酸与谷氨酸受体结合，而甘氨酸的数量由存在于神经胶质细胞中的甘氨酸转运子所调节，因此，甘氨酸转运子抑制剂可增加脑脊髓间隙中甘氨酸的数量，从而作为能够活化谷氨酸受体的神经分裂症治疗药物使用。
目前尚未发现与本发明化合物结构类似，且对甘氨酸转运子具有抑制活性的化合物。
【发明内容】
本发明的目的是提供一类对神经胶质细胞甘氨酸转运酶具有抑制活性的新型生理活性物质。
发明人进行各种研究，结果发现某些物质对神经胶质细胞的甘氨酸转运子具有优异的抑制活性，从而完成了本发明。
即，本发明是以式1表示地化合物
式中，R1、R2及R3分别为氢原子或甲基，R4为氢原子、羟基或甲氧基，R5为氢原子或甲基，具体的化合物的结构如下： R1 R2 R3 R4 R5 WSS2217 H H H OH H WSS2218 CH3 CH3 CH3 H H WSS2219 CH3 CH3 H OH H WSS2220 H H SO3H O＝ H WSS2221 H CH3 H OH H WSS2222 CH3 H H OH H WSS2227 CH3 CH3 H CH3O CH3
发明人为了完成前述目的，从土壤及植物中分离出多种菌株，并对这些菌株的代谢产物进行了各种研究，结果发现有的菌株产生的化合物对大鼠神经胶质细胞的甘氨酸摄取具有强烈的抑制活性，从而完成了本发明。
该菌株的细菌学性状列述如下。
产生WSS2217、WSS2218、WSS2219、WSS2220、WSS2221及WSS2222的菌株是发明人等从自然界分离获得的放线菌，下面分述其细菌学性状。
1.性状
由分支状基生菌丝上形成的气生菌丝。气生菌丝上生成钩状、弯状或螺旋状(1～3圈)的由4～15个孢子组成的短小孢子链。孢子的大小为1.0～1.3×1.4～2.0μm、其形状为卵形、表面有皱纹。未发现菌簇、孢子囊和类孢子囊的形成以及游动的孢子。
2.培养基的性质
在各种培养基内，30℃培养3周时，肉眼观察的结果列于表1。
表1 琼脂培养基 培养基内的 生长状态 气生菌丝 菌落内面 的颜色可溶性色素的产生形成颜色蔗糖-硝酸盐极弱---无葡萄糖-天冬酰胺极弱---无甘油-天冬酰胺弱极少-无色无淀粉-无机盐弱无-无色无酪氨酸弱极少-奶油色无普通营养中等程度无-土黄色无酵母-麦芽中等程度隆凸良好白色土黄色～淡褐色无燕麦中等程度弱白色奶油色无蛋白胨-酵母-铁盐弱无-土黄色无
3.生理学性质
1)生长温度范围
a.生长温度：16～39℃
b.最佳生长温度：32～34℃
2)各种性质
明胶的液化(30℃、2周)：阴性
脱脂牛奶的凝固(37℃、2周)：阴性
脱脂牛奶的胨化(30℃、2周)：阴性
产生黑色素样色素(30℃、2周)：阴性
淀粉水解(30℃、2周)：阴性
3)碳源的利用(琼脂培养基30℃、2周)
L-阿拉伯糖：弱；L-鼠李糖：弱；D-木糖：+；蜜山糖：+；D-葡萄糖：+；肌醇：+；D-果糖：+；D-甘露糖：+；蔗糖：+
4.化学分类学的性质
1)二氨基庚二酸是否存在及光学异构型：检测出内消旋型的二氨基庚二酸。
2)甲基萘醌的组成：MK-9(H2)、MK-9(H4)作为主要成分被检出。
3)菌体还原糖的种类：检测出核糖甘露糖及葡萄糖。
4)磷脂：检出含有未知氨基葡萄糖的磷脂，未检出磷脂酰甘油。
以上性状都是按照放线菌的分离和鉴定方法(日本放线菌学会编2001年)进行检索的，结果表明，本菌株可以归类于Nonomuraea菌属放线菌，所以被命名为Nonomuraea sp.AT-0426。
本菌株已由国家药品监督管理局四川抗菌素工业研究所于2002年8月28日申请中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心用于专利程序的微生物保存，保藏编号为CGMCC No.0792。
根据产生一般发酵产物的情形，WS2217～WSS2222的产生应在含有各种营养物质的培养基中，于好气性条件下，培养TF-菌株。
主要使用液体培养基，培养基由碳源、氮源及无机盐构成，根据需要可以加入维生素、前体物质及消沫剂，pH调节至7.0，碳源如葡萄糖、甘油和淀粉等可单独或混合使用；氮源如肉汤、麦片粥、酵母汁、大豆粉、胨、尿素及铵盐等可单独或混合使用；无机盐如磷酸钠、硫酸镁、氯化纳和碳酸钾等可单独或混合使用；消沫剂可以使用含羟基和硅化合物。
培养方法使用振动培养、通风搅拌培养等好气性培养，pH＝4～10，温度25～35℃，时间2～5天，最好是pH＝6～7，温度25～28℃，培养4天。
本发明的化合物可以用常规方法从发酵产物中精制得到。即，培养结束后，采用离心分离或过滤得到培养滤液，使之吸附于HP-20(商品名，三菱化学公司制造)等聚乙烯树脂，用低级醇及丙酮等有机溶剂洗脱。菌体用低级醇和丙酮等有机溶剂提取。随后，将菌体的提取液及吸附树脂的洗脱液合并，减压浓缩，除去有机溶剂，将残留物用醋酸乙酯、氯仿及正丁醇等非水溶性有机溶剂中萃取，将有机相浓缩成糊状。将该糊状物再次溶解于苯、醋酸乙酯、丙酮、甲醇及氯仿等有机溶剂中。由硅胶层析柱、凝胶过滤层析柱及反相ODS填充柱进行柱层析及高效液相层析完成对本发明化合物的精制和分离。
WSS8027可以用如下记述的方法合成。即，查奈尔·奥布·吉，美国化学会志[J.Am.Chem.Soc.第97卷3802页(1975)]所收载的方法，将WSS2219用碘甲烷处理进行合成。
通过对经上述方法所得物质WSS2217～WSS2222及WSS8027的紫外吸收光谱1H-NMR、13C-NMR核磁共振谱等进行解析，确证其化学结构。
WSS2217理化性质如下：
1、外观：白色粉末；
2、分子量：474；
3、分子式：C25H38N4O5；
4、HR-TOF质谱仪；
实测值：497.2736；理论值：497.2740(根据C25H38N4O5Na进行计算)；
5、比旋度：[α]D25：-169.4(c0.062，二噁烷)；
6、紫外吸收光谱：λMAXnm(loge)二噁烷：206.5(4.27)，223.5(sh，3.58)；
7、1H-NMR核磁共振谱：氘代硫酸二甲酯中以500MHz进行测定，其结果示于图1。
8、13C-NMR核磁共振谱：氘代硫酸二甲酯中以125MHz进行测定，其结果示于图2。
9、溶解度：溶于二氧六环、硫酸二甲酯、二甲基甲酰胺，难溶于氯仿，不溶于水、己烷、甲醇、乙醚、丙酮和醋酸乙酯。
10、酸碱度：中性
WSS2218理化性质如下：
1、外观：白色粉末
2、分子量：486
3、分子式：C27H42N4O4
4、HR-TOF质谱仪：
实测值：509.3099；理论值：509.3104(根据C27H38N4O4Na进行计算)
5、比旋度：[α]D25：-46.2(c0.081，二噁烷)
6、紫外吸收光谱：λMAXnm(loge)二噁烷：206.0(4.26)，223.5(sh，3.58)
7、1H-NMR核磁共振谱：氘代甲醇中以500MHz进行测定，其结果示于图1。
8、13C-NMR核磁共振谱：氘代甲醇中以125MHz进行测定，其结果示于图2。
9、溶解度：溶于二氧六环、硫酸二甲酯、二甲基甲酰胺，难溶于氯仿和甲醇，不溶于水、己烷、乙醚、丙酮和醋酸乙酯。
10、酸碱度：中性
WSS2219理化性质如下：
1、外观：白色粉末
2、分子量：502
3、分子式：C27H42N4O5
4、HR-TOF质谱仪：
实测值：525.3044；理论值：525.3053(根据C27H42N4O5Na进行计算)
5、比旋度：[α]D25：-182.6(c0.068，二噁烷)
6、紫外吸收光谱：λMAXnm(loge)二噁烷：206.5(4.26)，223.0(sh，3.58)
7、1H-NMR核磁共振谱：氘代硫酸二甲酯中以500MHz进行测定，其结果示于图1。
8、13C-NMR核磁共振谱：氘代硫酸二甲酯中以125MHz进行测定，其结果示于图2。
9、溶解度：溶于二氧六环、硫酸二甲酯、二甲基甲酰胺，难溶于氯仿，不溶于水、己烷、甲醇、乙醚、丙酮和醋酸乙酯。
10、酸碱度：中性
WSS2220理化性质如下：
1、外观：白色粉末
2、分子量：579
3、分子式：C27H39N4O8S
4、HR-TOF质谱仪：
实测值：625.2023；理论值：625.2284(根据C27H39N4O8SNa2进行计算)
5、比旋度：[α]D25：-190.8(c0.104，二噁烷)
6、紫外吸收光谱：λMAXnm(loge)二噁烷：207.5(4.25)，223.5(sh，3.58)
7、1H-NMR核磁共振谱：氘代硫酸二甲酯中以500MHz进行测定，其结果示于图1。
8、13C-NMR核磁共振谱：氘代硫酸二甲酯中以125MHz进行测定，其结果示于图2。
9、溶解度：
溶于二氧六环、硫酸二甲酯、二甲基甲酰胺，难溶于氯仿，不溶于水、己烷、甲醇、乙醚、丙酮和醋酸乙酯。
10、酸碱度：中性
WSS2221理化性质如下：
1、外观：白色粉末
2、分子量：488
3、分子式：C26H40N4O5
4、HR-TOF质谱仪
实测值：511.6034；理论值：511.6155(根据C27H38N4O5Na进行计算)
5、比旋度：[α]D25：-182.6(c0.068，二噁烷)
6、紫外吸收光谱：λMAXnm(loge)二噁烷：206.5(4.26)，223.0(sh，3.58)
7、1H-NMR核磁共振谱：氘代硫酸二甲酯中以500MHz进行测定，其结果示于图9。
8、13C-NMR核磁共振谱：氘代硫酸二甲酯中以125MHz进行测定，其结果示于图10。
9、溶解度：溶于二氧六环、硫酸二甲酯、二甲基甲酰胺，难溶于氯仿，不溶于水、己烷、甲醇、乙醚、丙酮和醋酸乙酯。
10、酸碱度：中性
WSS2222理化性质如下：
1、外观：白色粉末
2、分子量：488
3、分子式：C26H40N4O5
4、HR-TOF质谱仪
实测值：511.6048；理论值：511.6155(根据C25H38N4O5Na进行计算)
5、比旋度：[α]D25：-182.6(c0.068，二噁烷)
6、紫外吸收光谱：λMAXnm(loge)二噁烷：206.5(4.26)，223.0(sh，3.57)
7、1H-NMR核磁共振谱：氘代硫酸二甲酯中以500MHz进行测定，其结果示于图11。
8、13C-NMR核磁共振谱：氘代硫酸二甲酯中以125MHz进行测定，其结果示于图12。
9、溶解度：
溶于二氧六环、硫酸二甲酯、二甲基甲酰胺，难溶于氯仿，不溶于水、己烷、甲醇、乙醚、丙酮和醋酸乙酯。
10、酸碱度：中性
WSS8027理化性质如下：
1、外观：白色粉末
2、分子量：558
3、分子式：C31H50N4O5
4、HR-TOF质谱仪
实测值：581.7433；理论值：581.7496(根据C31H50N4O5Na进行计算)
5、比旋度：[α]D25：-160.4(c0.04，二噁烷)
6、紫外吸收光谱：λMAXnm(loge)二噁烷：206.5(4.26)，223.0(sh，3.58)
7、1H-NMR核磁共振谱：氘代硫酸二甲酯中以500MHz进行测定，其结果示于图13。
8、13C-NMR核磁共振谱：氘代硫酸二甲酯中以125MHz进行测定，其结果示于图14。
9、溶解度：溶于二氧六环、硫酸二甲酯、二甲基甲酰胺，难溶于氯仿，不溶于水、己烷、甲醇、乙醚、丙酮和醋酸乙酯。
10、酸碱度：中性
本发明化合物对在神经胶质细胞中发现的甘氨酸转氨酶具有抑制作用。所以，对精神分裂症的治疗有用。
【附图说明】
图1表示在氘代硫酸二甲脂中以500MHz测定的WSS2217的1H-NMR谱
图2表示在氘代硫酸二甲脂中以125MHz测定的WSS2217的13C-NMR谱
图3表示在氘代硫酸二甲脂中以500MHz测定的WSS2218的1H-NMR谱
图4表示在氘代硫酸二甲脂中以125MHz测定的WSS2218的13C-NMR谱
图5表示在氘代硫酸二甲脂中以500MHz测定的WSS2219的1H-NMR谱
图6表示在氘代硫酸二甲脂中以125MHz测定的WSS2219的13C-NMR谱
图7表示在氘代硫酸二甲脂中以500MHz测定的WSS2220的1H-NMR谱
图8表示在氘代硫酸二甲脂中以125MHz测定的WSS2220的13C-NMR谱
图9表示在氘代硫酸二甲脂中以500MHz测定的WSS2221的1H-NMR谱
图10表示在氘代硫酸二甲脂中以125MHz测定的WSS2221的13C-NMR谱
图11表示在氘代硫酸二甲脂中以500MHz测定的WSS2222的1H-NMR谱
图12表示在氘代硫酸二甲脂中以125MHz测定的WSS2222的13C-NMR谱
图13表示在氘代吡啶中以500MHz测定的WSS8027的1H-NMR谱
图14表示在氘代吡啶中以125MHz测定的WSS8027的13C-NMR谱
【具体实施方式】
以下列举实施例及实验例对本专利的具体说明。
实施例1 WSS2217、WSS2218、WSS2219及WS2220的制备。
1、将含有2.5％的可溶性淀粉、1％葡萄糖、0.5％鱼粉、0.3％棉籽粉、0.3％NZ CASE、0.2％酵母汁、0.2％碳酸钙的液体培养基置于三角瓶中，于121℃、灭菌20分钟。然后，在该无菌培养基上接种Nonomuraea sp.TA-0426菌株，于28℃、200rpm振摇培养三天，作为种子培养液。
接着，将由2％玉米粉、1.0％的甘油、0.5％葡萄糖、0.5％棉籽粉、0.5％麦芽汁、0.3％多胨、0.05％硫酸镁及0.3％的碳酸钙组成的100ml无菌液体培养基装入500ml的三角瓶内。将前述种子培养液4ml加入其中，制备100瓶，28℃、180rpm摇振培养14天。
培养结束后，将所得培养液10L加入5L正丁醇，搅拌、离心分离，减压浓缩正丁醇组分得到褐色油状物质6.03克。
2、将前述褐色油状物质6.03克溶于10ml氯仿，上硅胶柱[SilicaGel60(Merck公司制造)200ml：层析柱f＝40mm]吸附。用400ml氯仿洗脱，以氯仿—甲醇(98∶2～50∶50)的混合溶剂进行梯度洗脱后，将其中氯仿—甲醇(95∶5)的组分合并，减压浓缩至干，得到272.8mg的馏分1。将氯仿—甲醇(90∶10)的组分合并，减压浓缩至干，得到172.5mg的馏分2。再将氯仿—甲醇(80∶20)的组分合并，减压浓缩至干，得到398.0mg的馏分3。
3、将前项馏分1溶于少量的甲醇中，用乙腈-0.02％的三氟醋酸水溶液(65∶35)作为流动相进行高效液相色谱分离[仪器]：瓦特公司制，层析柱：瓦埃姆公司制ODS-AM(Φ10×250mm)]，于210nm检测，流速2.5ml/min，收集保留时间为13～16分钟的馏分。减压浓缩该馏分，除去乙腈后，用等体积的乙酸乙酯分2次抽提。合并有机相，用无水硫酸纳脱水后，减压浓缩至干，得到15.2mg的WSS2218。
4、将前项馏分2溶于少量的甲醇中，用乙腈-0.01％的三氟醋酸水溶液(45∶65)作为流动相进行高效液相色谱分离[仪器：瓦特公司制，层析柱：瓦埃姆公司制ODS-AM(Φ10×250mm)]，于210nm检测，流速2.5ml/min，收集保留时间9.5～10分和15～16分钟的馏分。分别合并分离的两个组分，减压浓缩，除去乙腈后，用等体积的乙酸乙酯分2次抽提。合并有机相，用无水硫酸纳脱水后，减压浓缩至干，得到3.5mg的WSS2217及13.4mg的WSS2219。
5、将前项馏分3溶于少量的甲醇中，将30％的乙腈作为流动相进行高效液相色谱分离[仪器：瓦特公司制，层析柱：瓦埃姆公司制ODS-AM(Φ10×250mm)]，于210nm检测，流速10ml/min，收集保留时间8.0～9.0分的馏分。将分离馏分减压浓缩至干，得到8.8mg的WSS2220。
实施例2 WSS2221及WSS2222的制备
1、将含有2.5％的可溶性淀粉、1％葡萄糖、0.5％鱼粉、0.3％棉籽粉、0.3％NZ CASE、0.2％酵母汁及0.2％碳酸钙的液体培养基60ml加入三角瓶中，121℃、灭菌20分钟。然后，在该无菌培养基上接种Nonomuraea sp.TA-0426菌株，于28℃、200rpm振摇培养三天，作为种子培养液。
接着，将由2％玉米粉、1.0％的甘油、0.5％葡萄糖、0.5％棉籽粉、0.5％麦芽汁、0.3％多胨、0.05％硫酸镁及0.3％的碳酸钙组成的无菌液体培养基100ml装入500ml的三角瓶内。将前述种子培养液4ml加入其中，制备150瓶，28℃、180rpm振摇培养14天。
培养结束后，将所得培养液15L加入5L正丁醇，搅拌、离心分离，将正丁醇组分减压浓缩，加入用醋酸调pH3.0的水500ml，搅拌，用500ml醋酸乙酯提取两次。将该醋酸乙酯提取组分合并，减压浓缩，得褐色油状物质2.83g。
2、前项油状物质2.83克溶于10ml氯仿，上硅胶柱[SilicaGel60(Merck公司制造)200ml：层析柱f＝40mm]吸附。用400ml氯仿洗脱，以氯仿—甲醇(99∶1～50∶50)进行梯度洗脱。将其中以氯仿-甲醇(90∶10)的组分与(80∶20)的组分合并，减压浓缩至干，得褐色油状物质864mg。
3、将前项褐色物质864mg溶于少量的甲醇中，用乙腈-0.01％的三氟醋酸水溶液(45∶55)作为流动相进行高效液相色谱分离[仪器：瓦特公司制，层析柱：瓦埃姆公司制ODS-AM(Φ20×250mm)]，于210nm检测，流速10ml/min，分别收集合并保留时间12～12.5分和13～14分钟的馏分。分别减压浓缩至干，即得5mg的WSS2221及3.7mg的WSS2222。
实施例3 WSS8027的制备
在氮气流下，向氢氧化纳(100.6mg)中加入1ml二甲基甲酰胺，冷却、搅拌。向其中加入溶有WSS2219(12.9mg)的二甲基甲酰胺1ml，再加入碘甲烷(300ml)，室温下搅拌1小时。反应结束后，冰浴冷却下加入水和醋酸乙酯，减压浓缩醋酸乙酯层。浓缩物用高效液相色谱[流动相：乙腈-0.02％三氟醋酸水溶液(80∶20)、装置：瓦特公司，层析柱：瓦埃姆公司制ODS-AM(Φ10×150mm)]系统分离，在210nm处检测，流速为2.5ml/min。将分离的组分减压浓缩至干，即得4.4mg的WSS8027。
实验例1
对大鼠神经胶质细胞甘氨酸转运酶的抑制实验
检体
将WSS2217、WSS2218、WSS2219、WSS2220、WSS2221、WSS2222及WSS8027分别溶解于二甲基亚砜并配制成10mg/ml的浓度，用灭菌水稀释成所需浓度待用。
试验细胞
大鼠神经胶质细胞C6。
试验方法
在含有液体闪烁液的平底96孔平板(Cytostar-T：阿马西公司制)，以5×104细胞/皿接种C6细胞于含有10％小牛血清(义布柯公司制)的培养基中，置于5％CO2培养箱中于37℃培养24小时。然后，将用由10mM磷酸缓冲液比比斯(pH7.4)、150mM氯化纳、1mM氯化钙、1mM氯化纳、1mM氯化镁及10mM葡萄糖组成的缓冲剂置换培养基。加入浓度药品溶液0.01ml及375K Bq/ml的[14C]甘氨酸0.01ml，于30℃培养50分钟。培养后，弃去缓冲液，室温下干燥5小时。然后用(TopCount；巴卡公司制)测定其放射活性。将对照组的放射活性作为0％，添加过量甘氨酸(10mM)的试验组作为100％，以下式计算各组的抑制率。
抑制率(％)＝[(药物试验组的数据-过量甘氨酸试验组的数据)/(未添加药物试验组的数据-过量甘氨酸试验组的数据)]×100
以引起显示50％抑制率的化合物浓度作为IC50(μM)，各化合物及甘氨酸的IC50列于表2。同时求出Glycine的抑制率。
表2 化合物名 IC50 WSS2217 0.019 WSS2218 0.452 WSS2219 0.007 WSS2220 0.025 WSS2221 0.013 WSS2222 0.028 WSS8027 20 Glycine 123