基于噬菌体抗性选择的用于对食品进行质构化的乳酸细菌 技术领域 本发明涉及具有提高的噬菌体抗性的细菌细胞、 包含所述细胞的起子培养物以及 用所述起子培养物发酵的乳制品。
背景技术 食品工业使用多种细菌、 特别是乳酸细菌来改进食品的味道和质构， 以及延长这 些食品的保存期。在乳品工业的情况下， 广泛使用乳酸细菌来实现乳的酸化 ( 通过发酵 )， 以及对其所掺入的产品进行质构化。
在食品工业使用的乳酸细菌中， 可以提到链球菌属 (Streptococcus)、 乳球菌 属 (Lactococcus)、 乳 杆 菌 属 (Lactobacillus)、 明 串 珠 菌 属 (Leuconostoc)、 片球菌属 (Pediococcus) 和双歧杆菌属 (Bifidobacterium)。广泛地单独使用或与其它细菌组合使 用乳酸菌物种嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus) 来生产食品， 特别是发酵产品。 它们尤其在用于发酵乳 ( 例如酸奶 ) 生产中的酵素配制中使用。这些乳酸细菌中的某些在 发酵产品的质构的发展中起主要作用。这一特征与多糖的生产息息相关。在嗜热链球菌菌 株中， 可以区分质构化与非质构化菌株。
WO2007095958A1 公开了具有质构化性质的嗜热链球菌菌株。图 l 中， 可以看到质 构化程度最高的菌株 CHCC8833(DSMl7876) 具有约 59Pa 的剪切应力值。
为了满足行业要求， 提供乳酸细菌， 特别是嗜热链球菌的新颖质构化菌株以便对 食品进行质构化已经变得必要。特别需要一种嗜热链球菌的新颖质构化菌株， 其可与乳杆 菌属的菌株一起使用。行业的另一个需求是菌株对食品工业中通常发现的噬菌体具有抗 性。
发明内容
发明人已经提供了一组新颖的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌 (Lactobacillus bulgaricus) 的乳酸细菌， 该组新颖的乳酸细菌对噬菌体攻击的抗性高于其所来源的 ( 母 ) 菌株。此外， 已经意外地发现， 当使用细菌对乳进行发酵时， 这一组细菌所产生的剪切应力 和 / 或凝胶硬度要高于母菌株。
令人吃惊的是， 抗噬菌体突变株比母菌株产生更多的质构， 例如更高的剪切应力 和 / 或凝胶硬度 ( 当所述菌株用于对乳进行发酵时 )， 且特别令人吃惊的是， 在 galK 基因中 ( 还 ) 含有突变 ( 相对于野生型菌株 ) 的菌株的抗噬菌体突变株比母菌株产生更多的质构 ( 当所述菌株用于对乳进行发酵时 )。
根据以上惊人发现， 本发明涉及一种通过筛选母菌株的抗噬菌体突变株来制造质 构化乳酸细菌菌株的方法， 例如制造质构化乳酸细菌 ( 例如， 除了具有例如噬菌体抗性、 实 质性噬菌体抗性和 / 或与母菌株相比具有提高的噬菌体抗性以外， 质构化程度也高于母菌 株的细菌 ) 的方法， 所述方法包括以下步骤 ：
a) 提供乳酸细菌菌株 ( 母菌株 ) ； 和b) 分离母菌株的突变株， 所述突变株比母菌株耐受更多的噬菌体 ( 例如更多的噬 菌体类型或更多的噬菌体菌株 )。
此外， 本发明涉及质构化乳酸细菌菌株， 例如嗜热链球菌菌株或保加利亚乳杆 菌菌株， 这些菌株经过改造从而比母菌株耐受更多的噬菌体， 特别是噬菌体 CHPC658、 CHPC1057、 CHPC1089 和 CHPC1152 的其中一种。 附图说明 图 1 描绘用 StressTech 流变仪测量的半乳糖阳性菌株 CHCC11342 和半乳糖阳性 的抗噬菌体突变株 CHCC11977 的剪切应力。 剪切应力是在 37℃在乳中生长过夜后在凝固乳 中测量的。
图 2 描绘用 StressTech 流变仪测量的 CHCC10019 的抗噬菌体突变株的剪切应力。 剪切应力是在 37℃在乳中生长过夜后在凝固乳中测量的。
图 3 描绘用 StressTech 流变仪测量的 CHCC12339(CHCC9204 的抗噬菌体突变株 ) 的凝胶硬度。凝胶硬度是在 37℃在乳中生长过夜后在凝固乳中测量的。
图 4 描绘用 StressTech 流变仪测量的 CHCC13140(CHCC5086 的抗噬菌体突变株 ) 的剪切应力。剪切应力是在 37℃在乳中生长过夜后在凝固乳中测量的。
具体实施方式 在第一方面， 本发明涉及一种制造乳酸细菌 ( 其具有例如噬菌体抗性、 实质性噬 菌体抗性和 / 或与母菌株相比具有提高的噬菌体抗性， 或当使用细菌对乳进行发酵时， 所 产生的剪切应力和 / 或凝胶硬度高于母菌株 ) 的方法， 其包括以下步骤 ：
a) 提供乳酸细菌菌株 ( 母菌株 ) ； 和
b) 分离母菌株的突变株， 所述突变株比母菌株耐受更多的噬菌体 ( 例如更多的噬 菌体类型或更多的噬菌体菌株 )， 和 / 或所述突变株针对母菌株无抗性的噬菌体具有抗性 ( 在相同条件下 )。
在一个引人关注的方面， 本发明涉及一种制造乳酸细菌 ( 其具有例如噬菌体抗 性、 实质性噬菌体抗性和 / 或与母菌株相比具有提高的噬菌体抗性， 和 / 或当使用细菌对乳 进行发酵时， 所产生的剪切应力和 / 或凝胶硬度高于母菌株 ) 的方法， 其包括以下步骤 ：
a) 提供乳酸细菌菌株 ( 母菌株 ) ； 和
a1) 使乳酸细菌菌株暴露于噬菌体， 例如能够溶解母菌株的噬菌体， 例如选自由 CHPC658、 CHPC1057、 CHPC1089 和 CHPC1152 组成的群组的噬菌体 ； 以及
b) 分离母菌株的突变株， 所述突变株对噬菌体具有抗性 ( 或所述菌株没有被噬菌 体溶解 )。
另外， 本发明涉及一种方法， 其包括以下步骤 ：
a) 提供乳酸细菌菌株 ( 母菌株 ) ；
a1) 使乳酸细菌菌株暴露于噬菌体， 例如能够溶解母菌株的噬菌体， 例如选自由 CHPC658、 CHPC1057、 CHPC1089 和 CHPC1152 组成的群组的噬菌体 ；
a2) 在生长培养基中孵育经过暴露的细菌细胞 ； 和
b) 分离母菌株的突变株， 所述突变株没有被噬菌体溶解。
本发明的方法可以包括步骤
c) 例如在步骤 a1) 之前、 期间或之后， 使母菌株发生突变 ( 例如通过化学处理或辐 射处理， 或借助于基因工程技术 )。
本发明的任何方法还可以包括步骤
d) 例如在步骤 c) 之前、 期间或之后， 或在步骤 a1) 之前、 期间或之后， 在菌株的 galK 基因或 galK 调控序列 ( 例如启动子 ) 中引入突变 ( 例如通过化学处理或辐射处理， 或 借助于基因工程技术 )。
在一个引人关注的实施方案中， 本发明的方法包括以下步骤 ：
- 提供乳酸细菌菌株 ( 母菌株 ) ；
- 使母菌株发生突变 ( 例如通过化学处理或辐射处理， 或借助于基因工程技术 ) ；
- 使获得的乳酸细菌菌株暴露于噬菌体， 例如能够溶解母菌株的噬菌体， 例如选自 由 CHPC658、 CHPC1057、 CHPC1089 和 CHPC1152 组成的群组的噬菌体 ；
- 在生长培养基中孵育经过暴露的细菌细胞 ； 和
- 分离母菌株的突变株， 所述突变株没有被噬菌体溶解。
本发明的方法可以导致在 galK 基因的启动子区域中， 例如在 -10 区域 (Pribnow 盒 ) 中或在 Pribnow 盒与核糖体结合位点之间的区域中引入突变。 此外， 本发明的方法也可以导致与母菌株相比， 半乳糖发酵活性提高的突变。
所述突变可导致 galK 基因的 Pribnow 盒与核糖体结合位点之间的区域中的一个 或多个核苷酸的取代， 例如野生型 Pribnow 盒下游的序列 TTCAGT 中的 C 被选自由 A、 T和G 组成的群组的核苷酸取代。
在另一个实施方案中， 所述突变可导致 ：
-galK 基因的 Pribnow 盒与核糖体结合位点之间的区域中一个或多个核苷酸的取 代， 例如野生型 Pribnow 盒下游的序列 TTCAGT(SEQ ID NO ： 6) 中的 C 被选自由 A、 T和G组 成的群组的核苷酸取代 ； 和/或
- 野生型 -10 区域 (TACGAT， SEQ ID NO ： 7) 中的 C 和 G 中的一个或两个被独立选 自由 A 和 T 组成的群组的核苷酸取代 ； 和/或
- 野生型 -10 区域 (TACGAT， SEQ ID NO ： 7) 中的 C 被独立选自由 A 和 T 组成的群 组的核苷酸取代 ； 和/或
- 野生型 -10 区域 (TACGAT， SEQ ID NO ： 7) 中的 C 被 T 取代 ； 和/或
--10 区 域 具 有 核 苷 酸 序 列 TATGAT(SEQ ID NO ： 8)、 TATTAT(SEQ ID NO ： 9) 或 TACTAT(SEQ ID NO ： 10)。
应了解本发明的方法中所用的母菌株可以是 gal+ 菌株， 优选在 37℃在含有 2％半 乳糖 ( 半乳糖是作为唯一的碳水化合物加入 ) 的 M17 中孵育 16 小时之后能够使 pH 值降低 至少 1.0 的菌株， 所述菌株是以每毫升培养基至少 10E4 个细胞的量接种。所述菌株的实例 是以下菌株， 其中 ：
-galK 基因的 Pribnow 盒与核糖体结合位点之间的区域中的一个或多个核苷酸已 经被取代， 例如野生型 Pribnow 盒下游的序列 TTCAGT(SEQ ID NO ： 6) 中的 C 被选自由 A、 T 和 G 组成的群组的核苷酸取代 ； 和/或
- 野生型 -10 区域 (TACGAT， SEQ ID NO ： 7) 中的 C 和 G 中的一个或两个已经被独
立选自由 A 和 T 组成的群组的核苷酸取代 ； 和/或
- 野生型 -10 区域 (TACGAT， SEQ ID NO ： 7) 中的 C 已经被独立选自由 A 和 T 组成 的群组的核苷酸取代 ； 和/或
- 野生型 -10 区域 (TACGAT， SEQ ID NO ： 7) 中的 C 已经被 T 取代 ； 和/或
--10 区 域 具 有 核 苷 酸 序 列 TATGAT(SEQ ID NO ： 8)、 TATTAT(SEQ ID NO ： 9) 或 TACTAT(SEQ ID NO ： 10)。新颖的 gal+ 菌株是本发明的一部分。
本发明的方法可以包括一个或多个其它步骤， 所述其它步骤选自由以下各项组成 的群组 ：
c1) 筛选具有噬菌体抗性的突变株， 例如与母菌株相比提高的噬菌体抗性 ； 和
c2) 筛选具有 Gal+ 表型的突变株， 例如与母菌株相比提高的半乳糖降解活性。
本发明的方法的一个实施方案涉及一种制造乳酸细菌的方法， 其包括以下步骤 ：
- 提供乳酸细菌菌株 ( 母菌株 ) ；
- 任选地突变母菌株 ；
- 使任选突变的母菌株暴露于噬菌体， 例如能够溶解母菌株的噬菌体， 例如选自由 CHPC658、 CHPC1057、 CHPC1089 和 CHPC1152 组成的群组的噬菌体 ；
- 任选地在生长培养基中孵育经过暴露的细菌细胞 ； 和
- 筛选具有噬菌体抗性的突变株， 例如与母菌株相比提高的噬菌体抗性 ； 和 / 或筛 选具有 Gal+ 表型的突变株， 例如与母菌株相比提高的半乳糖降解活性。
通过本发明的方法获得的突变株可以是自发突变株、 通过利用例如化学处理或辐 射处理对母菌株进行诱变而获得的突变株、 或借助于基因工程技术获得的突变株。本发明 的一个引人关注的突变株是 CHCC6008 的突变株， 特别是 gal+ 和对 CHCP1152 具有抗性的突 变株。
在本发明的方法的一个实施方案中， 突变株具有噬菌体抗性、 实质性噬菌体抗性 和 / 或与母菌株相比具有提高的噬菌体抗性， 其中所述噬菌体选自由以下各项组成的群 组： 能够溶解母菌株的噬菌体、 CHPC658、 CHPC1057、 CHPC1089 和 CHPC1152。
目 前 优 选 的 是， 细菌 ( 母菌株 ) 选自由以下各项组成的群组的种 ： 乳球菌 属 (Lactococcus spp.)、 链 球 菌 属 (Streptococcus spp.)( 例 如 嗜 热 链 球 菌 )、 乳 杆 菌 属 (Lactobacillus spp.)、 明 串 珠 菌 属 (Leuconostoc spp.)、 伪明串珠菌属 (Pseudoleuconostoc spp.)、 片球菌属 (Pediococcus spp.)、 短杆菌属 (Brevibacterium spp.)、 肠球菌属 (Enterococcus spp.)、 丙酸杆菌属 (Propionibacterium spp.) 和双歧杆 菌属 (Bifidobacterium spp.)。
在本发明方法的一个引人关注的实施方案中， 细菌 ( 母菌株 ) 选自具有选自由以 下各项组成的群组的一个或多个特征的菌株 ： 对乳进行质构化的能力， 产生多糖 ( 例如胞 外多糖或荚膜多糖 ) 的能力， 当在乳中孵育时产生粘度的能力， 以及当在乳中孵育时增加 剪切应力的能力。
在另一方面， 本发明涉及一种通过本发明的方法可获得的乳酸细菌或菌株。
在另一方面， 本发明涉及一种乳酸细菌或菌株， 例如通过本发明的方法可获得的 细菌或菌株， 其在发酵乳中产生大于约 70Pa( 帕斯卡 )( 例如大于 73Pa、 大于 77Pa 或大于 79Pa 或大于 80Pa) 的粘度， 所述粘度是在 37℃生长 12 小时后作为剪切应力测量的， 所述乳酸细菌或菌株例如以每毫升乳至少 10E4 个细胞的量接种。相信可以获得在发酵乳中产生 高达 100Pa、 高达 120Pa、 高达 150Pa 或甚至高达 200Pa 的粘度的菌株。可获得的粘度的范 围的实例是 ： 70 到 200Pa、 75 到 150Pa、 78 到 120Pa、 79 到 100Pa 和 80 到 90Pa。特别地， 本 发明涉及一种嗜热链球菌菌株， 其能够在发酵乳中产生 79 到 100Pa 的粘度。
本 发 明 的 菌 株 的 实 例 是 属 于 嗜 热 链 球 菌 的 细 菌 菌 株， 其选自由以下各项组 成 的 群 组： CHCC11342(DSM 22932)、 CHCC11977(DSM22935)、 CHCC12339(DSM24090) 和 CHCC13140(DSM 24023)， 以及它们任一种的突变株和变异株。 此外， 本发明涉及本文提及的 所有新颖菌株， 以及它们的突变株和变异株。具体来说， 本发明涉及菌株 CHCC11977 和其突 变株。
在另一方面， 本发明涉及一种本发明的乳酸细菌或菌株， 其在发酵乳中产生大于 约 70Pa( 例如大于 73Pa、 大于 77Pa 或大于 80Pa) 的剪切应力， 所述剪切应力是在 37 ℃生 长 12 小时后测量的， 所述乳酸细菌或菌株例如以每毫升乳至少 10E4 个细胞的量接种。细 菌或菌株可属于嗜热链球菌种或德氏乳杆菌保加利亚亚种 (Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)。
本 发 明 还 涉 及 一 种 属 于 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种 的 细 菌 菌 株， 例如选自由 CHCC12813(DSM24074) 和 CHCC12841 以及它们的突变株和变异株组成的群组的菌株。引人 关注的菌株是在发酵乳中产生大于约 60Pa( 例如大于 65Pa、 大于 69Pa 或大于 72Pa) 的剪 切应力的那些菌株， 所述剪切应力是在 37℃生长 12 小时后测量的， 所述菌株例如以每毫升 乳至少 10E4 个细胞的量接种。特别引人关注的是在发酵乳中产生从 60 到 100Pa( 例如 65 到 90Pa、 69 到 85Pa 或 72 到 80Pa) 范围内的剪切应力的那些菌株， 所述剪切应力是在 37℃ 生长 12 小时后测量的， 所述菌株例如以每毫升乳至少 10E4 个细胞的量接种。
在另一方面， 本发明涉及一种本发明的乳酸细菌或菌株或突变株或变异株， 其在 发酵乳中产生大于约 110Pa( 例如大于 115Pa、 大于 120Pa 或大于 125Pa) 的凝胶硬度， 所述 凝胶硬度是在 37℃生长 12 小时后测量的， 所述乳酸细菌或菌株或突变株或变异株例如以 每毫升乳至少 10E4 个细胞的量接种。目前优选的是凝胶硬度在 110 到 200Pa 的范围内， 或 更优选在 120 到 190Pa 或 125 到 180Pa 的范围内。细菌或菌株可属于嗜热链球菌种或德 氏乳杆菌保加利亚亚种。 特别地， 本发明涉及一种嗜热链球菌菌株， 其能够在发酵乳中产生 125 到 175Pa 的凝胶硬度。
在一个引人关注的实施方案中， 本发明涉及一种乳酸细菌或菌株， 其属于德氏 乳杆菌保加利亚亚种。关于这个实施方案的引人关注的实例是在发酵乳中产生大于约 60Pa( 例如大于 65Pa、 大于 69Pa 或大于 72Pa) 的粘度的细菌或菌株， 所述粘度是在 37℃生 长 12 小时后作为剪切应力测量的， 所述细菌或菌株例如以每毫升乳至少 10E4 个细胞的量 接种， 和 / 或在发酵乳中产生从 60 到 100Pa( 例如 65 到 90Pa、 69 到 85Pa 或 72 到 80Pa) 范 围内的粘度的细菌或菌株， 所述粘度是在 37℃生长 12 小时后作为剪切应力测量的， 所述细 菌或菌株例如以每毫升乳至少 10E4 个细胞的量接种。
在另一方面， 本发明涉及一种包含本发明的乳酸细菌或菌株 ( 例如属于菌株 CHCC11977 或其突变株的细菌 ) 的组合物。优选的是所述组合物包含至少 10exp10CFU( 细 胞形成单位 ) 的所述细菌。
在一个实施方案中， 组合物可包含呈混合物形式或组件试剂盒 (kit-of-parts)形式的以下菌株
- 属于乳杆菌属的菌株， 例如德氏乳杆菌保加利亚亚种 ( 同义词 ： 保加利亚乳杆 菌 )、 约氏乳杆菌 (L.johnsonii) 或发酵乳杆菌 (L.fermentum) ； 和
- 本 发 明 的 乳 酸 细 菌 的 菌 株， 例 如 属 于 嗜 热 链 球 菌 的 菌 株， 例如选自由 CHCC11342(DSM 22932)、 CHCC11977(DSM22935)、 CHCC12339 和 CHCC13140(DSM 24023) 以及 它们任一种的突变株和变异株组成的群组的菌株，
例如其中属于乳杆菌属的菌株是属于产多糖 ( 例如杂多糖、 同多糖 ) 和 / 或产果 糖基转移酶的乳杆菌属的菌株的组合物。
本发明的组合物可包含至少 10exp10 CFU( 细胞形成单位 ) 属于乳杆菌属的菌株 ； 和 / 或至少 10exp10 CFU 的属于嗜热链球菌的菌株。
在一个引人关注的实施方案中， 本发明的组合物包含至少 10exp10 CFU( 细胞形 成单位 ) 的属于产多糖 ( 例如同多糖 ) 和 / 或产糖基转移酶的乳杆菌属的菌株 ； 和至少 10exp10 CFU 属于嗜热链球菌的菌株。
组合物可用作起子培养物， 且可采取冷冻、 冻干或液体形式。
在另一方面， 本发明涉及一种生产发酵乳制品的方法， 其包括用本发明的乳酸细 菌、 本发明的菌株或本发明的组合物对乳底物 ( 例如牛奶 ) 进行发酵。 这种方法可进一步包括用属于乳杆菌属的菌株对乳底物进行发酵， 所述菌株例如 保加利亚乳杆菌或发酵乳杆菌的菌株， 例如选自由 CHCC10019、 CHCC10935 或 CHCC3984 以及 这些菌株中任一种的突变株和变异株组成的群组的菌株。举例来说， 在用属于乳杆菌属的 菌株发酵之前、 期间或之后， 用本发明的组合物、 菌株或细菌 ( 例如属于嗜热链球菌种的菌 株 ) 对乳底物进行发酵， 或者在用属于产多糖乳杆菌的菌株发酵期间， 用属于嗜热链球菌 的菌株或细菌对乳底物进行发酵。
用于生产发酵乳制品的本发明的方法可包括在发酵之前、 期间和 / 或之后向乳底 物中加入酶， 例如选自由以下各项组成的群组的酶 ： 能交联蛋白质的酶、 转谷氨酰胺酶、 天 冬氨酸蛋白酶、 凝乳酶 (chymosin) 和粗制凝乳酶 (rennet)。
在另一方面， 本发明涉及一种通过以上本发明的方法可获得的乳制品， 例如发 酵乳制品 ( 例如酸奶或白脱奶 ) 或乳酪 ( 例如新鲜乳酪或帕斯塔费拉塔乳酪 (pasta filata))。发酵乳制品可以是例如搅拌型产品、 可饮用产品或静置型 (set-type) 产品。本 发明的乳制品可任选地包含选自由以下各项组成的群组的成分 ： 水果浓缩汁、 糖浆、 益生菌 培养物、 着色剂、 增稠剂、 调味剂和防腐剂。
因此， 本发明涉及一种通过本发明的方法可获得的发酵乳制品， 其任选地包含选 自由以下各项组成的群组的成分 ： 水果浓缩汁、 糖浆、 益生菌培养物、 着色剂、 增稠剂、 调味 剂和防腐剂 ； 和 / 或其任选地采取搅拌型产品、 静置型产品或可饮用产品的形式。
本 发 明 还 涉 及 一 种 乳 制 品， 其可用本发明的乳酸细菌 ( 例如属于嗜热链球 菌的菌株， 例如 DSM 22884) 和选自保加利亚乳杆菌和发酵乳杆菌的乳酸细菌 ( 例如 CHCC10019(DSM19252)、 CHCC3984(DSM19251) 和 CHCC2008(DSM22584)) 对乳底物 ( 例如牛 奶 ) 进行发酵来制备。
在一个引人关注的实施方案中， 本发明的乳制品具有大于 100Pa( 例如大于 102Pa 或大于 104Pa) 的粘度 / 质构， 所述粘度 / 质构是例如在 37℃在乳中生长 12 小时后作为剪
切应力测量的。在一个目前优选的实施方案中， 大于 100Pa 的粘度是通过单独的细菌细胞 生长获得， 但更高的粘度值可通过加入例如淀粉、 明胶、 卡拉胶 (carrageenan) 等化合物来 获得。
在另一个实施方案中， 本发明的乳制品具有在 100 到 200Pa 范围内， 例如在 100 到 150Pa 范围内或在 105 到 125Pa 范围内的粘度 / 质构， 其是作为剪切应力测量的。
在另一个实施方案中， 本发明的乳制品是可饮用产品， 例如饮用酸奶。
本发明还涉及可用于本发明的方法中的新颖噬菌体， 例如选自由以下各项组成的 群组的噬菌体 ： CHPC658(DSM 23961)、 CHPC1057、 CHPC1089 和 CHPC1152(DSM 23994) 以及它 们的突变株和变异株， 例如能够溶解本文所提及的菌株 ( 例如菌株 CHCC6008) 的突变株和 变异株。
此外， 本发明涉及在本发明的方法中可用作母菌株的新颖细菌菌株， 例如选自 由 CHCC11342(DSM22932)、 CHCC10019(DSM19252)、 CHCC11379(DSM22884)、 CHCC11976(DSM 22934) 和其突变株组成的群组的菌株。
如本文所用， 术语 “乳酸细菌” 指示革兰氏阳性的微需氧或厌氧细菌， 其发酵糖， 同 时产生酸， 包括乳酸 ( 作为主要产生的酸 )、 乙酸和丙酸。 工业上最有用的乳酸细菌属于 “乳 杆菌” 目， 包括乳球菌属、 链球菌属、 乳杆菌属、 明串珠菌属、 伪明串珠菌属、 片球菌属、 短杆 菌属、 肠球菌属和丙酸杆菌属。此外， 属于严格厌氧菌双歧杆菌 ( 即双歧杆菌属 ) 群组的产 乳酸细菌一般包含在乳酸细菌的群组中。 这些乳酸细菌经常单独或与其它乳酸细菌组合用 作食品培养物。 包括乳杆菌属某种和嗜热链球菌的细菌在内的乳酸细菌通常以冷冻或冻干 培养物的形式供应给乳品业， 以用于生产用制曲 (bulk starter propagation)， 或以称为 “直投式菌种 (Direct Vat Set ； DVS)” 培养物的形式供应给乳品业， 所述培养物用于直接接 种到发酵容器或桶中用于制造乳制品， 例如发酵乳产品。所述培养物总体称为 “起子培养 物” 或 “起子” 。
术语 “乳” 应理解为通过对任何哺乳动物 ( 例如奶牛、 绵羊、 山羊、 水牛或骆驼 ) 挤 奶而获得的乳分泌物。在一个优选实施方案中， 乳是牛奶。术语 “乳” 还包括由植物材料制 造的蛋白质 / 脂肪溶液， 例如豆奶。
术语 “乳底物” 可以是可根据本发明的方法经历发酵的任何未加工和 / 或加工过 的乳材料。因此， 可用的乳底物包括但不限于包含蛋白质的任何乳或乳状产品的溶液 / 悬 浮液， 所述乳或乳状产品例如是全脂奶或低脂奶、 脱脂奶、 白脱奶、 复原奶粉、 炼乳、 奶粉、 乳 清、 乳清渗透物、 乳糖、 由乳糖结晶获得的母液、 乳清蛋白浓缩物或奶油。显然， 乳底物可来 源于任何哺乳动物， 例如是基本上纯的哺乳动物乳或复原奶粉。
优选地， 乳底物中的至少部分蛋白质是在乳中天然存在的蛋白质， 例如酪蛋白或 乳清蛋白。然而， 部分蛋白质可能不是乳中天然存在的蛋白质。
术语 “乳” 应理解为通过对任何哺乳动物例如奶牛、 绵羊、 山羊、 水牛或骆驼挤奶而 获得的乳分泌物。在一个优选实施方案中， 乳是牛奶。
在发酵之前， 乳底物可根据所属领域中已知的方法进行均质化和巴氏灭菌。
本文所用的 “均质化” 意思是彻底混合以获得可溶的悬浮液或乳液。如果均质化 在发酵之前进行， 那么其将乳脂肪破碎成较小尺寸以便其不再与乳分离。这可以通过在高 压下迫使乳通过小孔来实现。本文所用的 “巴氏灭菌” 意思是处理乳底物以减少或消除例如微生物等活有机体 的存在。优选地， 巴氏灭菌是通过将指定温度维持指定时段来实现。指定温度通常通过加 热来实现。可选择温度和持续时间以便杀死或灭活特定细菌， 例如有害细菌。随后可进行 快速冷却步骤。
本发明的方法中的 “发酵” 意思是通过微生物作用将碳水化合物转化为醇类或酸 类。优选地， 本发明的方法中的发酵包含乳糖至乳酸的转化。
用于生产发酵乳制品的发酵方法是众所周知的， 且所属领域技术人员将了解如何 选择合适的工艺条件， 例如温度、 氧、 微生物的量和特征以及加工时间。 显然， 可选择发酵条 件以便实现本发明， 即获得固态或液态的乳制品 ( 发酵乳制品 )。
术语 “搅拌型产品” 特定地是指在发酵之后维持机械处理的发酵乳制品， 导致发酵 阶段形成的凝结物结构破坏和液化。机械处理典型地但不排他地通过对凝胶进行搅拌、 抽 吸、 过滤或均质化， 或通过与其它成分一起混合来实现。 搅拌型产品典型地但不排他地具有 9％到 15％的乳固体非脂含量 (milk solid non-fat content)。
术语 “静置型产品” 包括基于已经用例如起子培养物接种的乳的产品， 其在接种步 骤后包装， 然后在包装中发酵。
术语 “可饮用产品” 包括例如 “饮用酸奶” 等饮料。术语 “饮用酸奶” 典型地涵盖用 乳杆菌属与嗜热链球菌组合发酵而制造的乳制品。饮用酸奶典型地具有 8％或以上的乳固 体非脂含量。此外， 饮用酸奶饮品的活培养物计数典型地是每毫升至少 10E6 细胞形成单位 (CFU)。
根据本发明的 “可饮用产品” 包括基于酸化乳底物的任何可饮用产品， 因此包括发 酵乳饮品和液体酸奶饮品。 在本发明的方法中， 酸化是以利用微生物进行发酵来进行的， 任 选地加入酸， 例如有机酸 ( 例如乳酸、 乳糖酸或 GDL)。
根据本发明的可饮用产品在其呈现液态且作为饮料被消费的意义上是可饮用的， 也就是其适用于饮用， 而不是用调羹进食。 “呈现液态” 意思是产品处于流体物态， 因此展现 容易流动的特征。 因此， 液体的形状通常是由其填充的容器决定， 这与例如柔软但无法自由 流动的胶状物质 ( 例如酸奶或布丁 ) 相反。根据本发明的可饮用产品的粘度允许消费者在 期望时用吸管饮用产品。
根据本发明的可饮用产品的 pH 可小于 4.6， 优选小于 4.4， 更优选小于 4.2 且甚至 更优选是约 pH 4 或以下。在一个方面， 可饮用产品的 pH 小于 3.8， 例如小于 3.6。
根据本发明的可饮用产品的脂肪含量可以是 0 到 2％， 优选低于 1.5％、 低于 1％或 低于 0.5％， 更优选是约 0.1％或以下。可饮用产品的乳固体非脂含量可小于 20％， 优选小 于 8.5％、 小于 8％、 小于 7.5％、 小于 7％、 小于 6.5％或小于 6％， 且更优选是约 5％。
根据本发明的可饮用产品的蛋白质含量可介于 0.5％与 4％之间。在一个优选方 面， 可饮用产品的蛋白质含量低于 1％。在另一个优选方面， 可饮用产品的蛋白质含量介于 2％与 3％之间。
根据本发明的可饮用产品的保存期可以超过 7 天， 优选超过 14 天， 更优选超过 28 天， 例如超过 3 个月。
根据本发明的可饮用产品可具有提高的沉降稳定性。 所述稳定性可以在可饮用产 品储存适当天数后， 通过测量因为脱水收缩作用而在表面上聚集的乳清的高度来测定。所述稳定性也可以在被加速的脱水收缩作用例如通过离心之后测定。
对于可饮用产品、 例如饮用酸奶来说， 在发酵之后通常需要高剪切力处理 ( 例如 均质化 ) 以破坏蛋白质网络， 以便获得流畅、 均质且可饮用的产品。网络被破坏意味着饮用 酸奶的沉降稳定性下降， 导致保存期内蛋白质沉降到底部。高脂肪含量和高蛋白质含量提 高沉降稳定性， 而具有低蛋白质含量 (1-2.5％ ) 的低脂肪产品 (0-0.5％脂肪 ) 则通常需要 加入稳定剂以避免蛋白质沉降。
如本文所用的术语 “噬菌体” 具有其在所属领域中被理解的常规含义， 也就是选择 性地感染一种或多种细菌的病毒。许多噬菌体对特定的细菌属或种或菌株具有特异性。术 语 “噬菌体 (bacteriophage)” 与术语 “噬菌体 (phage)” 同义。噬菌体可包括但不限于属 于任何以下病毒科的噬菌体 ： 被盖病毒科 (Corticoviridae)、 囊病毒科 (Cystoviridae)、 丝状病毒科 (Inoviridae)、 轻小病毒科 (Leviviridae)、 微病毒科 (Microviridae)、 肌病毒 科 (Myoviridae)、 短尾病毒科 (Podoviridae)、 长尾病毒科 (Siphoviridae) 或复层病毒科 (Tectiviridae)。噬菌体可以是裂解性噬菌体或溶原性噬菌体。裂解性噬菌体是通过完成 裂解周期来实现裂解路径， 而不是进入溶原路径的噬菌体。 裂解性噬菌体经历病毒复制， 其 导致细胞膜被裂解、 细胞被破坏以及释放能够感染其它细胞的子代噬菌体粒子。溶原性噬 菌体是能够进入溶原路径的噬菌体， 在所述溶原路径中噬菌体在其裂解周期完成之前变成 细胞基因组的休眠、 惰性部分。
在一个实施方案中， 根据本发明的乳酸细菌对一种或多种噬菌体或一组或多组的 噬菌体具有抗性， 在另一个实施方案中， 根据本发明的乳酸细菌对根据本发明保藏的菌株 有抗性的相同噬菌体具有抗性。在本发明的上下文中， 术语 “噬菌体稳固性” 与术语 “噬菌 体抗性” 互换使用。
在本发明的上下文中， 术语 “突变株” 应理解为通过例如基因工程、 辐射和 / 或化 学处理而从本发明的菌株 ( 或母菌株 ) 衍生或可以衍生的菌株。突变株优选是功能相等的 突变株， 例如具有与母菌株基本上相同或改进的性质 ( 例如关于质构、 剪切应力、 粘度、 凝 胶硬度、 口腔包覆感、 风味、 后酸化、 酸化速度和 / 或噬菌体稳固性 ) 的突变株。所述突变株 是本发明的一部分。特别地， 术语 “突变株” 是指使本发明的菌株经历任何常规使用的诱变 处理 ( 包括用例如乙烷甲烷磺酸盐 (EMS) 或 N- 甲基 -N′ - 硝基 -N- 硝基胍 (NTG) 等化学 诱变剂、 UV 光处理 ) 而获得的菌株， 或自发产生的突变株。突变株可以已经经历若干诱变 处理 ( 单次处理应理解为一个诱变步骤和随后的一个筛选 / 选择步骤 )， 但目前优选的是 进行不超过 20、 或不超过 10、 或不超过 5 次处理 ( 或筛选 / 选择步骤 )。在一个目前优选 的突变株中， 相比母菌株， 细菌基因组中小于 5％或小于 1％或甚至小于 0.1％的核苷酸被 另一种核苷酸取代或被缺失。在本发明的上下文中， 术语 “变异株” 应理解为功能与本发明 的菌株功能等同的菌株， 例如具有基本上相同或改进的性质 ( 例如关于质构、 剪切应力、 粘 度、 凝胶硬度、 口腔包覆感、 风味、 后酸化、 酸化速度和 / 或噬菌体稳固性 )。 所述变异株可使 用适当的筛选技术鉴别， 是本发明的一部分。
在本发明的上下文中， “质构” 是在 37℃生长 12 小时后作为剪切应力测量。剪切 应力和凝胶硬度的 SI 单位是帕斯卡 (Pa)。
用于分析质构的分析 ：
孵育次日， 使发酵乳达到 13℃并用配备有钻孔圆盘 (bored disc) 的棒子轻轻搅拌， 直到样品变得均匀为止。 在配备有 C25 同轴测量系统的流变仪 (StressTech， Reologica Instruments， 瑞典 ) 上评估样品的流变性质。利用在 21 步中从 0.27 到 300l/s 变化的剪 切速率进行粘度测试。先增加后降低剪切速率， 并记录剪切应力和表观粘度的上升和下降 曲线。延迟时间和积分时间分别是 5s 和 10s。
除非本文另外指定或上下文明显矛盾， 否则在描述本发明的上下文中 ( 特别是在 以下权利要求书的上下文中 ) 使用的术语 “一 (“a” 和 “an” )” 和 “所述” 和类似指代应解 释为涵盖单数和复数。除非另外指出， 否则术语 “包含” 、 “具有” 、 “包括” 和 “含有” 应解释 为开放式术语 ( 即意思是 “包括但不限于” )。除非本文另外指定， 否则本文叙述的值的范 围仅旨在用作各个提及落在所述范围内的每一单独值的简化方法， 且每一单独值都被纳入 说明书中， 就如同其在本文中各个叙述一样。 除非本文中另外指出或上下文明显矛盾， 否则 本文所述的所有方法都可按任何合适次序进行。除非另外主张， 本文提供的任何和所有实 施例或示例性修辞 ( 例如 “诸如” ) 的使用仅用于更好地阐明本发明， 并且不对本发明的范 围施加限制。 说明书中的任何语言都不应被解释成表示任何未请求保护的要素对于本发明 的实施是必要的。
实验 实施例 1 ： 具有改进的质构性质的抗噬菌体嗜热链球菌菌株的开发
CHCC11977 的开发
母菌株 CHCC11342 是如实施例 5 中所述来获得。所述菌株是 CHCC6008 的突变株 且被视为发酵半乳糖的嗜热链球菌菌株。
一起涂布 0.1ml 的 CHCC11342 的 M17 过夜培养物与每毫升含有 10E09(10exp9) 个 噬菌体粒子的 0.1ml 噬菌体 CHPC1152， 并在 37℃孵育 2 天之后， 在 M17 琼脂平板上分离菌 株 CHCC11977。 将称为 CHCC11977 的一个突变体进行菌落纯化三次， 并在 M17 琼脂平板上在 37℃使用噬菌体 CHPC1152 在空斑试验中重新测试， 其中证实了噬菌体抗性 ( 没有观察到单 一空斑 )。
所述突变株然后也在 M17 肉汤中在 37℃在存在噬菌体 CHPC1152 的情况下进行了 测试。CHCC11977 在液体培养物中也保持了其噬菌体抗性， 而 CHCC11342 和预期一样受到 CHPC1152 攻击。
还在乳中在不同温度下测试了 CHCC11977( 未加入感染性噬菌体 )， 显示酸化活性 与母菌株 CHCC11342 相当。
发酵乳中 CHCC11342 质构的分析
孵育次日， 使发酵乳达到 13℃并用配备有钻孔圆盘的棒子轻轻搅拌， 直到样品变 得均匀为止。 在配备有 C25 同轴测量系统的流变仪 (StressTech， Reologica Instruments， 瑞典 ) 上评估样品的流变性质。
利用在 21 步中从 0.27 到 300l/s 变化的剪切速率进行粘度测试。先增加后降低 剪切速率， 并记录剪切应力和表观粘度的上升和下降曲线。
延迟时间和积分时间分别是 5s 和 10s。 为进行进一步分析， 选择 300s-1 的剪切应 力。
流变仪结果显示， CHCC11342 的剪切应力值是 73.0Pa， 而 CHCC6008 的剪切应力值 是 68.0Pa， 参看图 1。
发酵乳中 CHCC11977 质构的分析 如上文对于 gal 阳性的抗噬菌体突变株所描述， 获得发酵乳， 并分析质构相关的性质。 流 变 仪 结 果 显 示， CHCC11977 的 剪 切 应 力 值 与 CHCC11342 相 比 提 高 了 10 ％ (CHCC11977 的剪切应力值是 80.0Pa， 母菌株 CHCC11342 是 73.0Pa， 参看图 1)。
此 外， 抗 噬 菌 体 突 变 株 CHCC11977 的 凝 胶 硬 度 (G*) 的 值 是 126.0Pa， 与 CHCC11342( 凝胶硬度 104.0Pa) 相比增加了 20％。因此， 通过从半乳糖阳性母菌株中分离 抗噬菌体突变株有可能显著改进重要的流变学参数， 即剪切应力和凝胶硬度。
来自 CHCC11342 的 galK 启动子区域的测序
为了揭示半乳糖阳性突变株 CHCC11342 的突变类型， 对 galK 基因 ( 编码来自嗜热 链球菌的半乳糖激酶 ) 的开端进行测序。
对于 CHCC11342， 鉴别了 galK 启动子区域中的突变 ( 参看以下序列 )。galK 基因 的 -10 启动子盒下游的三个核苷酸发生了突变， 导致 C 至 A 的核苷酸变化。
CHCC11342 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTAAGTATAAACAAAAAGAATAA GTGAGATACATC SEQ ID No ： 1
CHCC6008 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAA GTGAGATACATC SEQ ID No ： 2
AY704368 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAA GTGAGATACATC SEQ ID No ： 3
共同序列 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAA GTGAGATACATC SEQ ID No ： 4
-35 -10 RBS
来自 CHCC11342 的 galK 基因的启动子区域。 用灰色代码标识 CHCC11342galk 启动 子区域内的点突变。 标记来自嗜热链球菌 ST111(Genbank 登记号 AY704368) 的公开的 galK 序列用于比较。-35 ： -35 启动子盒 ； -10 ： -10 启动子盒 ； RBS ： 核糖体结合位点。
其它抗噬菌体突变株
为了揭示噬菌体抗性与半乳糖阳性表型之间的可能关系， 在 M17 半乳糖琼脂平 板上从菌株 CHCC6008(gal-) 分离另外 5 种抗噬菌体性突变株， 所述菌株 CHCC6008(gal-) 是 CHCC11342(gal+) 的 母 菌 株。 所 有 5 种 抗 噬 菌 体 性 突 变 株 CHCC11396、 CHCC11397、 CHCC11398、 CHCC11399 和 CHCC11340( 对 噬 菌 体 CHPC1152 具 有 抗 性 ) 都 不 能 使 半 乳 糖 发 酵， 意 味 着 gal+ 表 型 与 噬 菌 体 抗 性 没 有 直 接 关 系。 另 一 方 面， 空斑分析证实了 CHCC11342(gal+) 对噬菌体 CHPC1152 仍然敏感。
实施例 2 ： 具有改进的质构性质的抗噬菌体德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的开发
从母菌株 CHCC10019(DSM19252) 如下分离抗噬菌体突变株 ：
一起涂布 0.1ml 的 CHCC10019 的 MRS 过夜培养物与每毫升含有 10E06 个噬菌体粒 子的 0.1ml CHPC658 噬菌体溶菌产物， 并在 37℃厌氧孵育 2 天之后， 从含有 10mM CaCl2/10mM MgCl2 的 MRS 琼脂平板挑选突变株。分离 30 株突变株， 并在针对噬菌体 CHPC658 的交叉划 线法 (cross-streaking) 中进行测试。 29 株突变株在交叉划线测试中表现抗性， 随后在 MRS
琼脂平板上在 37℃对这些突变株进行菌落纯化三次。
在微量滴定板中测试这 29 株突变株的酸化特性和噬菌体抗性。用乳制备两个微 量滴定板， 每个滴定板都用 2％的各自突变株接种。将 2％蛋白胨 - 盐稀释剂 ( 对照物 ) 加 入一个滴定板的每个孔中， 并且向另一个微量滴定板中加入每毫升含有 10E06 个噬菌体粒 子的 2％ CHPC658。将两个滴定板在 37℃孵育 2 天， 每 12 分钟记录每个孔的 pH。与被噬菌 体 CHPC658 攻击的母菌株 CHCC10019 相比， 所有突变株都具有噬菌体抗性。
基于在 MRS 和乳中的酸化特性 ( 类似于母菌株 ) 以及菌株的粘度选出 12 株突变 株。
CHCC10019 抗噬菌体突变株在发酵乳中的质构性质的分析
使 12 株突变株和母菌株 CHCC10019 在乳中于 37℃孵育过夜， 然后将发酵乳调节到 13℃， 并用配备有钻孔圆盘的棒子轻轻搅拌， 直到每个样品变得均匀为止。在配备有 C25 同 轴测量系统的流变仪 (StressTech， Reologica Instruments， 瑞典 ) 上评估每个样品的流 变性质。
利用在 21 步中从 0.27 到 300l/s 变化的剪切速率进行粘度测试。先增加后降低 剪切速率， 并记录剪切应力和表观粘度的上升和下降曲线。延迟时间和积分时间分别是 5s 和 10s。为进行进一步分析， 选择 300s-1 的剪切应力。
流变学测量的结果显示， 所有 12 株突变株 ( 例如 CHCC12813 和 CHCC12841) 与 CHCC10019 相比都具有提高的粘度， 其是作为剪切应力测量的。CHCC12841 获得了最高的剪 切应力值 (74.0Pa)， 而 CHCC10019 的剪切应力值则为 58.0Pa， 参看图 2。在该图中， 显示了 这 12 株抗噬菌体突变株的流变学数据。与 CHCC10019 相比， 所有突变株的剪切应力都有增 加， 范围从 10％一直到 28％。
基于突变株与其它菌株在共同培养中生长时的酸化活性和流变学数据， 选出 CHCC12813 作为被分离的突变株中最有前景的候选者， 用于进一步应用性测试。
这个实验证实， 通过分离菌株的抗噬菌体突变株， 细菌菌株的重要流变学参数剪 切应力将得到显著提高。
实施例 3 ： 嗜热链球菌菌株 CHCC9204 的抗噬菌体突变株的分离
从母菌株 CHCC9204( 登记在 Chr.Hansen 培养物保藏中心 ) 分离抗噬菌体突变株。 一起涂布 0.1ml 的 CHCC9204 的 M17 乳糖过夜培养物与每毫升含有 1x10exp09 个噬菌体粒 子的 0.1ml 噬菌体 CHPC1057， 并在 37℃孵育过夜之后， 在含有 10mM MgCl2/CaCl2 的 M17-2％ 乳糖琼脂平板上分离突变株。
在几个突变株中， 对称为 CHCC12339 的一个突变株进行菌落纯化三次， 并在 M17 乳糖琼脂平板上在 37 ℃使用噬菌体 CHPC1057 在空斑试验中针对噬菌体攻击进行重新 测试， 并且证实了噬菌体抗性 ( 在空斑试验中没有观察到单一空斑 )。还在乳中测试了 CHCC12339， 显示酸化活性与母菌株相当。
抗噬菌体突变株 CHCC12339 在发酵乳中的质构性质的分析
使突变株 CHCC12339 和母菌株 CHCC9204 在 37℃在乳中孵育过夜之后， 使发酵乳达 到 13℃， 并用配备有钻孔圆盘的棒子轻轻搅拌， 直到每个样品变得均匀为止。在配备有 C25 同轴测量系统的流变仪 (StressTech， Reologica Instruments， 瑞典 ) 上评估每个样品的 流变性质。利用在 21 步中从 0.27 到 300l/s 变化的剪切速率进行粘度测试。先增加后降低 剪切速率， 并记录剪切应力和表观粘度的上升和下降曲线。延迟时间和积分时间分别是 5s 和 10s。为进行进一步分析， 选择 300s-1 的剪切应力。
流变学测量的结果显示， 突变株 CHCC12339 导致凝胶硬度 (G*) 与 CHCC9204 相比 增加了 22 ％， 参看图 3。在该图中， 比较了抗噬菌体突变株 CHCC12339(78.0Pa) 和母菌株 CHCC9204(64.0Pa) 的凝胶硬度值 (G*)。
实施例 4 ： 嗜热链球菌菌株 CHCC5086 的抗噬菌体突变株的分离
从母菌株 CHCC5086( 登记在 Chr.Hansen 培养物保藏中心 ) 分离抗噬菌体突变株。
一起涂布 0.1ml 的 CHCC5086 的 M17-2％乳糖过夜培养物与每毫升含有 1x10exp08 个噬菌体粒子的 0.1ml 噬菌体 CHPC1089， 并在 37℃孵育过夜之后， 在含有 10mM MgCl2/CaCl2 的 M17-2％乳糖琼脂平板上分离突变株。
在几个突变株中， 将称为 CHCC13140 的一个突变株进行菌落纯化三次， 并在 M17 乳 糖琼脂平板上在 37℃使用噬菌体 CHPC1089 针对噬菌体攻击在空斑中进行重新测试， 并且 证实了噬菌体抗性 ( 在空斑试验中没有观察到单一空斑 )。
也在乳的酸化试验中测试了 CHCC13140， 显示酸化活性与母菌株相当。
抗噬菌体突变株 CHCC13140 在发酵乳中的质构性质的分析
使突变株 CHCC13140 和母菌株 CHCC5086 在乳中 37℃下孵育过夜之后， 使发酵乳达 到 13℃， 并用配备有钻孔圆盘的棒子轻轻搅拌， 直到每个样品变得均匀为止。在配备有 C25 同轴测量系统的流变仪 (StressTech， Reologica Instruments， 瑞典 ) 上评估每个样品的 流变性质。
利用在 21 步中从 0.27 到 300l/s 变化的剪切速率进行粘度测试。先增加后降低 剪切速率， 并记录剪切应力和表观粘度的上升和下降曲线。延迟时间和积分时间分别是 5s 和 10s。为进行进一步分析， 选择 300s-1 的剪切应力。
流变学测量的结果显示， 突变株 CHCC13140 导致剪切应力与 CHCC5086 相比增加了 14％， 参看图 4。 在该图中， 比较了抗噬菌体突变株 CHCC13140( 剪切应力 33.0Pa) 和母菌株 CHCC5086(28.0Pa) 的剪切应力数据。
实施例 5 ： 链球菌菌株的半乳糖阳性突变株的制备
获得 gal+ 菌株的一般方法
在分离突变株之前， 将母菌株 ( 例如 CHCC6008) 划线于含有 2％半乳糖的 M17 琼脂 平板 (M17-gal 平板 ) 上。 CHCC6008 在作为唯一的碳水化合物源的半乳糖上不生长， 因此母 菌株被视为 gal-。
然后将母菌株的过夜培养物涂布于 M17-gal 平板上， 并且在 37℃生长两天后可分 离若干菌落。
在 M17-gal 平板上纯化若干突变株， 并在含有 2％半乳糖作为唯一碳水化合物的 M17 肉汤中重新测试。
突变株可通过例如基因工程、 辐射和 / 或化学处理来获得， 或者突变株可以是自 发突变株。
在含有 2％半乳糖 ( 半乳糖作为唯一的碳水化合物加入 ) 的 M17 中在 37℃孵育 16 小时之后， 如果 pH 值降低至少 1.0 的值， 那么突变株被视为半乳糖阳性， 所述突变株是以每毫升培养基至少 10E4 个细胞的量接种。
CHCC6008 没有显著降低 M17-gal 肉汤的 pH， 但纯化的突变株之一 CHCC11342 在 37℃生长 16 小时后达到 pH 5.4， 因此被视为 CHCC6008 的半乳糖发酵 (gal+) 突变株。
半乳糖发酵菌株的分离
分离作为嗜热链球菌菌株 CHCC6008( ＝ ST6008， DSM18111) 的半乳糖发酵突变株 的突变株。在突变株分离步骤之前既不用任何诱变化合物也不用 UV 光对 CHCC6008 细胞进 行诱变。分离的菌株因此类似于 CHCC6008 的自发半乳糖阳性突变株。
在分离突变株之前， 将 CHCC6008 划线于含有 2％半乳糖的 M17 琼脂平板 (M17-gal 平板 ) 上。CHCC6008 在作为唯一碳水化合物源的半乳糖上不生长。
然后将 CHCC6008 的过夜培养物涂布于 M17-gal 平板上， 且在 37℃生长两天后可分 离若干菌落。 在 M17-gal 平板上纯化若干突变株， 并在含有 2％半乳糖作为唯一的碳水化合 物的 M17 肉汤中重新测试。
CHCC6008 没有显著降低 M17-gal 肉汤的 pH， 但纯化的突变株之一 CHCC11379 在 37℃生长 10 小时后达到 pH 5.3， 因此被视为 CHCC6008 的半乳糖发酵突变株。
菌株 CHCC11342 和 CHCC11976 按同样的方法分离。
通过基因工程分离突变株
半乳糖阳性突变株也可通过定点诱变来产生。
使用在 galK-10 启动子盒内携带突变核苷酸的寡核苷酸， 利用 PCR 对特定 DNA 片 段进行扩增。将携带期望突变的 PCR 片段克隆到载体质粒中并转化到嗜热链球菌目标菌株 中， 并且将突变整合到染色体中并通过重组来交换野生型 galK 启动子区域。菌株的分离如 上进行。
发酵乳中的质构分析
孵育次日， 使发酵乳达到 13℃并用配备有钻孔圆盘的棒子轻轻搅拌， 直到样品变 得均匀为止。 在配备有 C25 同轴测量系统的流变仪 (StressTech， Reologica Instruments， 瑞典 ) 上评估样品的流变性质。
利用在 21 步中从 0.27 到 300l/s 变化的剪切速率进行粘度测试。先增加后降低 剪切速率， 并记录剪切应力和表观粘度的上升和下将曲线。
延迟时间和积分时间分别是 5s 和 10s。 为进行进一步分析， 选择 300s-1 的剪切应 力。流变仪结果显示， CHCC11379 的剪切应力与 CHCC6008 相比提高了 10％ (CHCC11379 的 剪切应力值为 74.0Pa( 帕斯卡 )， 母菌株 CHCC6008 为 67.5Pa)。
乳中的质构分析
在另一个实验中， 使用 CHCC11379 作为酸奶培养物的一部分， 其中来自嗜热链球 菌的菌株在脱脂奶中在 43℃与来自德氏乳杆菌保加利亚亚种的菌株共同培养。 当酸奶生产 中的唯一区别是使用 CHCC11379 而不是野生型 CHCC6008 时， 剪切应力也增加了 10％ ( 含 CHCC11379 的酸奶培养物的剪切应力为 105.0Pa， 而含 CHCC6008 的酸奶培养物的剪切应力 为 94.7Pa)。
来自 CHCC11379 的 galK 启动子区域的测序
为了揭示 gal 阳性突变株 CHCC11379 的突变类型， 对 galK 基因 ( 编码来自嗜热链 球菌的半乳糖激酶 ) 的开端进行测序。对于 CHCC11379， 鉴别了 galK 启动子区域中的突变 ( 见下文 )。各个的突变将最 可能导致与母菌株 6008 相比提高的启动子活性， 这对观察到的 gal 阳性表型进行了解释。 这是基于以下事实 ： -10 启动子盒的共同序列是 “TATAAT” ， 且 CHCC6008 的 -10 盒 ( 区域 ) (“TACGAT” ) 的核苷酸 3 的突变导致与 CHCC11379 中的共同序列 (“TATGAT” ) 相似度更高 的 -10 盒。
CHCC11379 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTATGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAG TGAGATACATC SEQ ID NO ： 5
CHCC6008 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAG TGAGATACATC SEQ ID NO ： 2
AY704368 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAG TGAGATACATC SEQ ID NO ： 3
共同序列 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAG TGAGATACATC SEQ ID NO ： 4
-35 -10 RBS
来自 CHCC11379 的 galK 基因的启动子区域。用灰色代码标识 CHCC11379galk 启 动子内的点突变。标记来自嗜热链球菌 ST111(Genbank 登记号 AY704368) 的公开的 galK 序列以用于比较。-35 ： -35 启动子区域 ； -10 ： -10 启动子区域 ； RBS ： 核糖体结合位点。
本文描述了本发明的优选实施方案， 包括发明人已知的实施本发明的最佳模式。 对于所属领域的一般技术人员来说， 在阅读以上描述后， 那些优选实施方案的变化可变得 显而易见。发明人预期普通技术人员使用适当的此类变化， 且发明人意图以本文具体说明 以外的方式实施本发明。因此， 本发明包括随附权利要求书中陈述的主题的适用法律所允 许的所有修改和等同方式。 此外， 除非本文另外指出或上下文另外明显矛盾， 否则本发明涵 盖上述要素在其所有可能变化中的任何组合。
保藏和专家解决方案
嗜 热 链 球 菌 菌 株 CHCC11977 和 CHCC11342 分 别 在 2009 年 9 月 8 日 以 保 藏 号 DSM22935 和 DSM22932 保 藏 于 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH， Inhoffenstr.7B， D-38124Braunschweig， Germany)。CHCC6008 已经在 2006 年 3 月 29 日以保藏号 DSM18111 保藏于 DSMZ。
噬菌体 CHPC658、 CHPC1057 和 CHPC1152 于 2010 年 8 月 27 日保藏于 DSMZ， 并被分 别赋予保藏号 DSM23961、 DSM23962 和 DSM23994。
在 DSMZ 的其它保藏物 ：
CHCC10019(DSM19252) 和 CHCC3984(DSM19251) ： 保藏日期 2007 年 4 月 3 日，
CHCC2008(DSM22584) 和 CHCC5086(DSM22587) ： 保藏日期 2009 年 5 月 19 日，
CHCC11379(DSM22884) ： 保藏日期 2009 年 8 月 26 日，
CHCC11976(DSM22934) ： 保藏日期 2009 年 9 月 8 日，
CHCC13140(DSM 24023)、 CHCC12813(DSM24074) 和 CHPC1089(DSM24022) ： 保藏日 期 2010 年 9 月 29 日 ；
CHCC12339(DSM24090) ： 保藏日期 2010 年 10 月 14 日。嗜热链球菌 CHCC5086(DSM22587) ： 保藏日期 ： 2009 年 5 月 19 日。
CHCC9204(DSM19243) ： 保藏日期 2007 年 3 月 29 日。
已经根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约 (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure) 的条款进行了保藏。
申请人要求保藏的微生物的样品只能供申请人批准的专家使用。
参考文献
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WO2008/040734A1 ，WO2007/025097A2 ，US7241610B2 ，WO2007/144770A2 ， WO2004/085607A， WO2008/148561A， WO11000879A， WO11000883A， WO10023178A
背景技术 食品工业使用多种细菌、 特别是乳酸细菌来改进食品的味道和质构， 以及延长这 些食品的保存期。在乳品工业的情况下， 广泛使用乳酸细菌来实现乳的酸化 ( 通过发酵 )， 以及对其所掺入的产品进行质构化。
在食品工业使用的乳酸细菌中， 可以提到链球菌属 (Streptococcus)、 乳球菌 属 (Lactococcus)、 乳 杆 菌 属 (Lactobacillus)、 明 串 珠 菌 属 (Leuconostoc)、 片球菌属 (Pediococcus) 和双歧杆菌属 (Bifidobacterium)。广泛地单独使用或与其它细菌组合使 用乳酸菌物种嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus) 来生产食品， 特别是发酵产品。 它们尤其在用于发酵乳 ( 例如酸奶 ) 生产中的酵素配制中使用。这些乳酸细菌中的某些在 发酵产品的质构的发展中起主要作用。这一特征与多糖的生产息息相关。在嗜热链球菌菌 株中， 可以区分质构化与非质构化菌株。
WO2007095958A1 公开了具有质构化性质的嗜热链球菌菌株。图 l 中， 可以看到质 构化程度最高的菌株 CHCC8833(DSMl7876) 具有约 59Pa 的剪切应力值。
为了满足行业要求， 提供乳酸细菌， 特别是嗜热链球菌的新颖质构化菌株以便对 食品进行质构化已经变得必要。特别需要一种嗜热链球菌的新颖质构化菌株， 其可与乳杆 菌属的菌株一起使用。行业的另一个需求是菌株对食品工业中通常发现的噬菌体具有抗 性。
发明内容
发明人已经提供了一组新颖的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌 (Lactobacillus bulgaricus) 的乳酸细菌， 该组新颖的乳酸细菌对噬菌体攻击的抗性高于其所来源的 ( 母 ) 菌株。此外， 已经意外地发现， 当使用细菌对乳进行发酵时， 这一组细菌所产生的剪切应力 和 / 或凝胶硬度要高于母菌株。
令人吃惊的是， 抗噬菌体突变株比母菌株产生更多的质构， 例如更高的剪切应力 和 / 或凝胶硬度 ( 当所述菌株用于对乳进行发酵时 )， 且特别令人吃惊的是， 在 galK 基因中 ( 还 ) 含有突变 ( 相对于野生型菌株 ) 的菌株的抗噬菌体突变株比母菌株产生更多的质构 ( 当所述菌株用于对乳进行发酵时 )。
根据以上惊人发现， 本发明涉及一种通过筛选母菌株的抗噬菌体突变株来制造质 构化乳酸细菌菌株的方法， 例如制造质构化乳酸细菌 ( 例如， 除了具有例如噬菌体抗性、 实 质性噬菌体抗性和 / 或与母菌株相比具有提高的噬菌体抗性以外， 质构化程度也高于母菌 株的细菌 ) 的方法， 所述方法包括以下步骤 ：
a) 提供乳酸细菌菌株 ( 母菌株 ) ； 和b) 分离母菌株的突变株， 所述突变株比母菌株耐受更多的噬菌体 ( 例如更多的噬 菌体类型或更多的噬菌体菌株 )。
此外， 本发明涉及质构化乳酸细菌菌株， 例如嗜热链球菌菌株或保加利亚乳杆 菌菌株， 这些菌株经过改造从而比母菌株耐受更多的噬菌体， 特别是噬菌体 CHPC658、 CHPC1057、 CHPC1089 和 CHPC1152 的其中一种。 附图说明 图 1 描绘用 StressTech 流变仪测量的半乳糖阳性菌株 CHCC11342 和半乳糖阳性 的抗噬菌体突变株 CHCC11977 的剪切应力。 剪切应力是在 37℃在乳中生长过夜后在凝固乳 中测量的。
图 2 描绘用 StressTech 流变仪测量的 CHCC10019 的抗噬菌体突变株的剪切应力。 剪切应力是在 37℃在乳中生长过夜后在凝固乳中测量的。
图 3 描绘用 StressTech 流变仪测量的 CHCC12339(CHCC9204 的抗噬菌体突变株 ) 的凝胶硬度。凝胶硬度是在 37℃在乳中生长过夜后在凝固乳中测量的。
图 4 描绘用 StressTech 流变仪测量的 CHCC13140(CHCC5086 的抗噬菌体突变株 ) 的剪切应力。剪切应力是在 37℃在乳中生长过夜后在凝固乳中测量的。
具体实施方式 在第一方面， 本发明涉及一种制造乳酸细菌 ( 其具有例如噬菌体抗性、 实质性噬 菌体抗性和 / 或与母菌株相比具有提高的噬菌体抗性， 或当使用细菌对乳进行发酵时， 所 产生的剪切应力和 / 或凝胶硬度高于母菌株 ) 的方法， 其包括以下步骤 ：
a) 提供乳酸细菌菌株 ( 母菌株 ) ； 和
b) 分离母菌株的突变株， 所述突变株比母菌株耐受更多的噬菌体 ( 例如更多的噬 菌体类型或更多的噬菌体菌株 )， 和 / 或所述突变株针对母菌株无抗性的噬菌体具有抗性 ( 在相同条件下 )。
在一个引人关注的方面， 本发明涉及一种制造乳酸细菌 ( 其具有例如噬菌体抗 性、 实质性噬菌体抗性和 / 或与母菌株相比具有提高的噬菌体抗性， 和 / 或当使用细菌对乳 进行发酵时， 所产生的剪切应力和 / 或凝胶硬度高于母菌株 ) 的方法， 其包括以下步骤 ：
a) 提供乳酸细菌菌株 ( 母菌株 ) ； 和
a1) 使乳酸细菌菌株暴露于噬菌体， 例如能够溶解母菌株的噬菌体， 例如选自由 CHPC658、 CHPC1057、 CHPC1089 和 CHPC1152 组成的群组的噬菌体 ； 以及
b) 分离母菌株的突变株， 所述突变株对噬菌体具有抗性 ( 或所述菌株没有被噬菌 体溶解 )。
另外， 本发明涉及一种方法， 其包括以下步骤 ：
a) 提供乳酸细菌菌株 ( 母菌株 ) ；
a1) 使乳酸细菌菌株暴露于噬菌体， 例如能够溶解母菌株的噬菌体， 例如选自由 CHPC658、 CHPC1057、 CHPC1089 和 CHPC1152 组成的群组的噬菌体 ；
a2) 在生长培养基中孵育经过暴露的细菌细胞 ； 和
b) 分离母菌株的突变株， 所述突变株没有被噬菌体溶解。
本发明的方法可以包括步骤
c) 例如在步骤 a1) 之前、 期间或之后， 使母菌株发生突变 ( 例如通过化学处理或辐 射处理， 或借助于基因工程技术 )。
本发明的任何方法还可以包括步骤
d) 例如在步骤 c) 之前、 期间或之后， 或在步骤 a1) 之前、 期间或之后， 在菌株的 galK 基因或 galK 调控序列 ( 例如启动子 ) 中引入突变 ( 例如通过化学处理或辐射处理， 或 借助于基因工程技术 )。
在一个引人关注的实施方案中， 本发明的方法包括以下步骤 ：
- 提供乳酸细菌菌株 ( 母菌株 ) ；
- 使母菌株发生突变 ( 例如通过化学处理或辐射处理， 或借助于基因工程技术 ) ；
- 使获得的乳酸细菌菌株暴露于噬菌体， 例如能够溶解母菌株的噬菌体， 例如选自 由 CHPC658、 CHPC1057、 CHPC1089 和 CHPC1152 组成的群组的噬菌体 ；
- 在生长培养基中孵育经过暴露的细菌细胞 ； 和
- 分离母菌株的突变株， 所述突变株没有被噬菌体溶解。
本发明的方法可以导致在 galK 基因的启动子区域中， 例如在 -10 区域 (Pribnow 盒 ) 中或在 Pribnow 盒与核糖体结合位点之间的区域中引入突变。 此外， 本发明的方法也可以导致与母菌株相比， 半乳糖发酵活性提高的突变。
所述突变可导致 galK 基因的 Pribnow 盒与核糖体结合位点之间的区域中的一个 或多个核苷酸的取代， 例如野生型 Pribnow 盒下游的序列 TTCAGT 中的 C 被选自由 A、 T和G 组成的群组的核苷酸取代。
在另一个实施方案中， 所述突变可导致 ：
-galK 基因的 Pribnow 盒与核糖体结合位点之间的区域中一个或多个核苷酸的取 代， 例如野生型 Pribnow 盒下游的序列 TTCAGT(SEQ ID NO ： 6) 中的 C 被选自由 A、 T和G组 成的群组的核苷酸取代 ； 和/或
- 野生型 -10 区域 (TACGAT， SEQ ID NO ： 7) 中的 C 和 G 中的一个或两个被独立选 自由 A 和 T 组成的群组的核苷酸取代 ； 和/或
- 野生型 -10 区域 (TACGAT， SEQ ID NO ： 7) 中的 C 被独立选自由 A 和 T 组成的群 组的核苷酸取代 ； 和/或
- 野生型 -10 区域 (TACGAT， SEQ ID NO ： 7) 中的 C 被 T 取代 ； 和/或
--10 区 域 具 有 核 苷 酸 序 列 TATGAT(SEQ ID NO ： 8)、 TATTAT(SEQ ID NO ： 9) 或 TACTAT(SEQ ID NO ： 10)。
应了解本发明的方法中所用的母菌株可以是 gal+ 菌株， 优选在 37℃在含有 2％半 乳糖 ( 半乳糖是作为唯一的碳水化合物加入 ) 的 M17 中孵育 16 小时之后能够使 pH 值降低 至少 1.0 的菌株， 所述菌株是以每毫升培养基至少 10E4 个细胞的量接种。所述菌株的实例 是以下菌株， 其中 ：
-galK 基因的 Pribnow 盒与核糖体结合位点之间的区域中的一个或多个核苷酸已 经被取代， 例如野生型 Pribnow 盒下游的序列 TTCAGT(SEQ ID NO ： 6) 中的 C 被选自由 A、 T 和 G 组成的群组的核苷酸取代 ； 和/或
- 野生型 -10 区域 (TACGAT， SEQ ID NO ： 7) 中的 C 和 G 中的一个或两个已经被独
立选自由 A 和 T 组成的群组的核苷酸取代 ； 和/或
- 野生型 -10 区域 (TACGAT， SEQ ID NO ： 7) 中的 C 已经被独立选自由 A 和 T 组成 的群组的核苷酸取代 ； 和/或
- 野生型 -10 区域 (TACGAT， SEQ ID NO ： 7) 中的 C 已经被 T 取代 ； 和/或
--10 区 域 具 有 核 苷 酸 序 列 TATGAT(SEQ ID NO ： 8)、 TATTAT(SEQ ID NO ： 9) 或 TACTAT(SEQ ID NO ： 10)。新颖的 gal+ 菌株是本发明的一部分。
本发明的方法可以包括一个或多个其它步骤， 所述其它步骤选自由以下各项组成 的群组 ：
c1) 筛选具有噬菌体抗性的突变株， 例如与母菌株相比提高的噬菌体抗性 ； 和
c2) 筛选具有 Gal+ 表型的突变株， 例如与母菌株相比提高的半乳糖降解活性。
本发明的方法的一个实施方案涉及一种制造乳酸细菌的方法， 其包括以下步骤 ：
- 提供乳酸细菌菌株 ( 母菌株 ) ；
- 任选地突变母菌株 ；
- 使任选突变的母菌株暴露于噬菌体， 例如能够溶解母菌株的噬菌体， 例如选自由 CHPC658、 CHPC1057、 CHPC1089 和 CHPC1152 组成的群组的噬菌体 ；
- 任选地在生长培养基中孵育经过暴露的细菌细胞 ； 和
- 筛选具有噬菌体抗性的突变株， 例如与母菌株相比提高的噬菌体抗性 ； 和 / 或筛 选具有 Gal+ 表型的突变株， 例如与母菌株相比提高的半乳糖降解活性。
通过本发明的方法获得的突变株可以是自发突变株、 通过利用例如化学处理或辐 射处理对母菌株进行诱变而获得的突变株、 或借助于基因工程技术获得的突变株。本发明 的一个引人关注的突变株是 CHCC6008 的突变株， 特别是 gal+ 和对 CHCP1152 具有抗性的突 变株。
在本发明的方法的一个实施方案中， 突变株具有噬菌体抗性、 实质性噬菌体抗性 和 / 或与母菌株相比具有提高的噬菌体抗性， 其中所述噬菌体选自由以下各项组成的群 组： 能够溶解母菌株的噬菌体、 CHPC658、 CHPC1057、 CHPC1089 和 CHPC1152。
目 前 优 选 的 是， 细菌 ( 母菌株 ) 选自由以下各项组成的群组的种 ： 乳球菌 属 (Lactococcus spp.)、 链 球 菌 属 (Streptococcus spp.)( 例 如 嗜 热 链 球 菌 )、 乳 杆 菌 属 (Lactobacillus spp.)、 明 串 珠 菌 属 (Leuconostoc spp.)、 伪明串珠菌属 (Pseudoleuconostoc spp.)、 片球菌属 (Pediococcus spp.)、 短杆菌属 (Brevibacterium spp.)、 肠球菌属 (Enterococcus spp.)、 丙酸杆菌属 (Propionibacterium spp.) 和双歧杆 菌属 (Bifidobacterium spp.)。
在本发明方法的一个引人关注的实施方案中， 细菌 ( 母菌株 ) 选自具有选自由以 下各项组成的群组的一个或多个特征的菌株 ： 对乳进行质构化的能力， 产生多糖 ( 例如胞 外多糖或荚膜多糖 ) 的能力， 当在乳中孵育时产生粘度的能力， 以及当在乳中孵育时增加 剪切应力的能力。
在另一方面， 本发明涉及一种通过本发明的方法可获得的乳酸细菌或菌株。
在另一方面， 本发明涉及一种乳酸细菌或菌株， 例如通过本发明的方法可获得的 细菌或菌株， 其在发酵乳中产生大于约 70Pa( 帕斯卡 )( 例如大于 73Pa、 大于 77Pa 或大于 79Pa 或大于 80Pa) 的粘度， 所述粘度是在 37℃生长 12 小时后作为剪切应力测量的， 所述乳酸细菌或菌株例如以每毫升乳至少 10E4 个细胞的量接种。相信可以获得在发酵乳中产生 高达 100Pa、 高达 120Pa、 高达 150Pa 或甚至高达 200Pa 的粘度的菌株。可获得的粘度的范 围的实例是 ： 70 到 200Pa、 75 到 150Pa、 78 到 120Pa、 79 到 100Pa 和 80 到 90Pa。特别地， 本 发明涉及一种嗜热链球菌菌株， 其能够在发酵乳中产生 79 到 100Pa 的粘度。
本 发 明 的 菌 株 的 实 例 是 属 于 嗜 热 链 球 菌 的 细 菌 菌 株， 其选自由以下各项组 成 的 群 组： CHCC11342(DSM 22932)、 CHCC11977(DSM22935)、 CHCC12339(DSM24090) 和 CHCC13140(DSM 24023)， 以及它们任一种的突变株和变异株。 此外， 本发明涉及本文提及的 所有新颖菌株， 以及它们的突变株和变异株。具体来说， 本发明涉及菌株 CHCC11977 和其突 变株。
在另一方面， 本发明涉及一种本发明的乳酸细菌或菌株， 其在发酵乳中产生大于 约 70Pa( 例如大于 73Pa、 大于 77Pa 或大于 80Pa) 的剪切应力， 所述剪切应力是在 37 ℃生 长 12 小时后测量的， 所述乳酸细菌或菌株例如以每毫升乳至少 10E4 个细胞的量接种。细 菌或菌株可属于嗜热链球菌种或德氏乳杆菌保加利亚亚种 (Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)。
本 发 明 还 涉 及 一 种 属 于 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种 的 细 菌 菌 株， 例如选自由 CHCC12813(DSM24074) 和 CHCC12841 以及它们的突变株和变异株组成的群组的菌株。引人 关注的菌株是在发酵乳中产生大于约 60Pa( 例如大于 65Pa、 大于 69Pa 或大于 72Pa) 的剪 切应力的那些菌株， 所述剪切应力是在 37℃生长 12 小时后测量的， 所述菌株例如以每毫升 乳至少 10E4 个细胞的量接种。特别引人关注的是在发酵乳中产生从 60 到 100Pa( 例如 65 到 90Pa、 69 到 85Pa 或 72 到 80Pa) 范围内的剪切应力的那些菌株， 所述剪切应力是在 37℃ 生长 12 小时后测量的， 所述菌株例如以每毫升乳至少 10E4 个细胞的量接种。
在另一方面， 本发明涉及一种本发明的乳酸细菌或菌株或突变株或变异株， 其在 发酵乳中产生大于约 110Pa( 例如大于 115Pa、 大于 120Pa 或大于 125Pa) 的凝胶硬度， 所述 凝胶硬度是在 37℃生长 12 小时后测量的， 所述乳酸细菌或菌株或突变株或变异株例如以 每毫升乳至少 10E4 个细胞的量接种。目前优选的是凝胶硬度在 110 到 200Pa 的范围内， 或 更优选在 120 到 190Pa 或 125 到 180Pa 的范围内。细菌或菌株可属于嗜热链球菌种或德 氏乳杆菌保加利亚亚种。 特别地， 本发明涉及一种嗜热链球菌菌株， 其能够在发酵乳中产生 125 到 175Pa 的凝胶硬度。
在一个引人关注的实施方案中， 本发明涉及一种乳酸细菌或菌株， 其属于德氏 乳杆菌保加利亚亚种。关于这个实施方案的引人关注的实例是在发酵乳中产生大于约 60Pa( 例如大于 65Pa、 大于 69Pa 或大于 72Pa) 的粘度的细菌或菌株， 所述粘度是在 37℃生 长 12 小时后作为剪切应力测量的， 所述细菌或菌株例如以每毫升乳至少 10E4 个细胞的量 接种， 和 / 或在发酵乳中产生从 60 到 100Pa( 例如 65 到 90Pa、 69 到 85Pa 或 72 到 80Pa) 范 围内的粘度的细菌或菌株， 所述粘度是在 37℃生长 12 小时后作为剪切应力测量的， 所述细 菌或菌株例如以每毫升乳至少 10E4 个细胞的量接种。
在另一方面， 本发明涉及一种包含本发明的乳酸细菌或菌株 ( 例如属于菌株 CHCC11977 或其突变株的细菌 ) 的组合物。优选的是所述组合物包含至少 10exp10CFU( 细 胞形成单位 ) 的所述细菌。
在一个实施方案中， 组合物可包含呈混合物形式或组件试剂盒 (kit-of-parts)形式的以下菌株
- 属于乳杆菌属的菌株， 例如德氏乳杆菌保加利亚亚种 ( 同义词 ： 保加利亚乳杆 菌 )、 约氏乳杆菌 (L.johnsonii) 或发酵乳杆菌 (L.fermentum) ； 和
- 本 发 明 的 乳 酸 细 菌 的 菌 株， 例 如 属 于 嗜 热 链 球 菌 的 菌 株， 例如选自由 CHCC11342(DSM 22932)、 CHCC11977(DSM22935)、 CHCC12339 和 CHCC13140(DSM 24023) 以及 它们任一种的突变株和变异株组成的群组的菌株，
例如其中属于乳杆菌属的菌株是属于产多糖 ( 例如杂多糖、 同多糖 ) 和 / 或产果 糖基转移酶的乳杆菌属的菌株的组合物。
本发明的组合物可包含至少 10exp10 CFU( 细胞形成单位 ) 属于乳杆菌属的菌株 ； 和 / 或至少 10exp10 CFU 的属于嗜热链球菌的菌株。
在一个引人关注的实施方案中， 本发明的组合物包含至少 10exp10 CFU( 细胞形 成单位 ) 的属于产多糖 ( 例如同多糖 ) 和 / 或产糖基转移酶的乳杆菌属的菌株 ； 和至少 10exp10 CFU 属于嗜热链球菌的菌株。
组合物可用作起子培养物， 且可采取冷冻、 冻干或液体形式。
在另一方面， 本发明涉及一种生产发酵乳制品的方法， 其包括用本发明的乳酸细 菌、 本发明的菌株或本发明的组合物对乳底物 ( 例如牛奶 ) 进行发酵。 这种方法可进一步包括用属于乳杆菌属的菌株对乳底物进行发酵， 所述菌株例如 保加利亚乳杆菌或发酵乳杆菌的菌株， 例如选自由 CHCC10019、 CHCC10935 或 CHCC3984 以及 这些菌株中任一种的突变株和变异株组成的群组的菌株。举例来说， 在用属于乳杆菌属的 菌株发酵之前、 期间或之后， 用本发明的组合物、 菌株或细菌 ( 例如属于嗜热链球菌种的菌 株 ) 对乳底物进行发酵， 或者在用属于产多糖乳杆菌的菌株发酵期间， 用属于嗜热链球菌 的菌株或细菌对乳底物进行发酵。
用于生产发酵乳制品的本发明的方法可包括在发酵之前、 期间和 / 或之后向乳底 物中加入酶， 例如选自由以下各项组成的群组的酶 ： 能交联蛋白质的酶、 转谷氨酰胺酶、 天 冬氨酸蛋白酶、 凝乳酶 (chymosin) 和粗制凝乳酶 (rennet)。
在另一方面， 本发明涉及一种通过以上本发明的方法可获得的乳制品， 例如发 酵乳制品 ( 例如酸奶或白脱奶 ) 或乳酪 ( 例如新鲜乳酪或帕斯塔费拉塔乳酪 (pasta filata))。发酵乳制品可以是例如搅拌型产品、 可饮用产品或静置型 (set-type) 产品。本 发明的乳制品可任选地包含选自由以下各项组成的群组的成分 ： 水果浓缩汁、 糖浆、 益生菌 培养物、 着色剂、 增稠剂、 调味剂和防腐剂。
因此， 本发明涉及一种通过本发明的方法可获得的发酵乳制品， 其任选地包含选 自由以下各项组成的群组的成分 ： 水果浓缩汁、 糖浆、 益生菌培养物、 着色剂、 增稠剂、 调味 剂和防腐剂 ； 和 / 或其任选地采取搅拌型产品、 静置型产品或可饮用产品的形式。
本 发 明 还 涉 及 一 种 乳 制 品， 其可用本发明的乳酸细菌 ( 例如属于嗜热链球 菌的菌株， 例如 DSM 22884) 和选自保加利亚乳杆菌和发酵乳杆菌的乳酸细菌 ( 例如 CHCC10019(DSM19252)、 CHCC3984(DSM19251) 和 CHCC2008(DSM22584)) 对乳底物 ( 例如牛 奶 ) 进行发酵来制备。
在一个引人关注的实施方案中， 本发明的乳制品具有大于 100Pa( 例如大于 102Pa 或大于 104Pa) 的粘度 / 质构， 所述粘度 / 质构是例如在 37℃在乳中生长 12 小时后作为剪
切应力测量的。在一个目前优选的实施方案中， 大于 100Pa 的粘度是通过单独的细菌细胞 生长获得， 但更高的粘度值可通过加入例如淀粉、 明胶、 卡拉胶 (carrageenan) 等化合物来 获得。
在另一个实施方案中， 本发明的乳制品具有在 100 到 200Pa 范围内， 例如在 100 到 150Pa 范围内或在 105 到 125Pa 范围内的粘度 / 质构， 其是作为剪切应力测量的。
在另一个实施方案中， 本发明的乳制品是可饮用产品， 例如饮用酸奶。
本发明还涉及可用于本发明的方法中的新颖噬菌体， 例如选自由以下各项组成的 群组的噬菌体 ： CHPC658(DSM 23961)、 CHPC1057、 CHPC1089 和 CHPC1152(DSM 23994) 以及它 们的突变株和变异株， 例如能够溶解本文所提及的菌株 ( 例如菌株 CHCC6008) 的突变株和 变异株。
此外， 本发明涉及在本发明的方法中可用作母菌株的新颖细菌菌株， 例如选自 由 CHCC11342(DSM22932)、 CHCC10019(DSM19252)、 CHCC11379(DSM22884)、 CHCC11976(DSM 22934) 和其突变株组成的群组的菌株。
如本文所用， 术语 “乳酸细菌” 指示革兰氏阳性的微需氧或厌氧细菌， 其发酵糖， 同 时产生酸， 包括乳酸 ( 作为主要产生的酸 )、 乙酸和丙酸。 工业上最有用的乳酸细菌属于 “乳 杆菌” 目， 包括乳球菌属、 链球菌属、 乳杆菌属、 明串珠菌属、 伪明串珠菌属、 片球菌属、 短杆 菌属、 肠球菌属和丙酸杆菌属。此外， 属于严格厌氧菌双歧杆菌 ( 即双歧杆菌属 ) 群组的产 乳酸细菌一般包含在乳酸细菌的群组中。 这些乳酸细菌经常单独或与其它乳酸细菌组合用 作食品培养物。 包括乳杆菌属某种和嗜热链球菌的细菌在内的乳酸细菌通常以冷冻或冻干 培养物的形式供应给乳品业， 以用于生产用制曲 (bulk starter propagation)， 或以称为 “直投式菌种 (Direct Vat Set ； DVS)” 培养物的形式供应给乳品业， 所述培养物用于直接接 种到发酵容器或桶中用于制造乳制品， 例如发酵乳产品。所述培养物总体称为 “起子培养 物” 或 “起子” 。
术语 “乳” 应理解为通过对任何哺乳动物 ( 例如奶牛、 绵羊、 山羊、 水牛或骆驼 ) 挤 奶而获得的乳分泌物。在一个优选实施方案中， 乳是牛奶。术语 “乳” 还包括由植物材料制 造的蛋白质 / 脂肪溶液， 例如豆奶。
术语 “乳底物” 可以是可根据本发明的方法经历发酵的任何未加工和 / 或加工过 的乳材料。因此， 可用的乳底物包括但不限于包含蛋白质的任何乳或乳状产品的溶液 / 悬 浮液， 所述乳或乳状产品例如是全脂奶或低脂奶、 脱脂奶、 白脱奶、 复原奶粉、 炼乳、 奶粉、 乳 清、 乳清渗透物、 乳糖、 由乳糖结晶获得的母液、 乳清蛋白浓缩物或奶油。显然， 乳底物可来 源于任何哺乳动物， 例如是基本上纯的哺乳动物乳或复原奶粉。
优选地， 乳底物中的至少部分蛋白质是在乳中天然存在的蛋白质， 例如酪蛋白或 乳清蛋白。然而， 部分蛋白质可能不是乳中天然存在的蛋白质。
术语 “乳” 应理解为通过对任何哺乳动物例如奶牛、 绵羊、 山羊、 水牛或骆驼挤奶而 获得的乳分泌物。在一个优选实施方案中， 乳是牛奶。
在发酵之前， 乳底物可根据所属领域中已知的方法进行均质化和巴氏灭菌。
本文所用的 “均质化” 意思是彻底混合以获得可溶的悬浮液或乳液。如果均质化 在发酵之前进行， 那么其将乳脂肪破碎成较小尺寸以便其不再与乳分离。这可以通过在高 压下迫使乳通过小孔来实现。本文所用的 “巴氏灭菌” 意思是处理乳底物以减少或消除例如微生物等活有机体 的存在。优选地， 巴氏灭菌是通过将指定温度维持指定时段来实现。指定温度通常通过加 热来实现。可选择温度和持续时间以便杀死或灭活特定细菌， 例如有害细菌。随后可进行 快速冷却步骤。
本发明的方法中的 “发酵” 意思是通过微生物作用将碳水化合物转化为醇类或酸 类。优选地， 本发明的方法中的发酵包含乳糖至乳酸的转化。
用于生产发酵乳制品的发酵方法是众所周知的， 且所属领域技术人员将了解如何 选择合适的工艺条件， 例如温度、 氧、 微生物的量和特征以及加工时间。 显然， 可选择发酵条 件以便实现本发明， 即获得固态或液态的乳制品 ( 发酵乳制品 )。
术语 “搅拌型产品” 特定地是指在发酵之后维持机械处理的发酵乳制品， 导致发酵 阶段形成的凝结物结构破坏和液化。机械处理典型地但不排他地通过对凝胶进行搅拌、 抽 吸、 过滤或均质化， 或通过与其它成分一起混合来实现。 搅拌型产品典型地但不排他地具有 9％到 15％的乳固体非脂含量 (milk solid non-fat content)。
术语 “静置型产品” 包括基于已经用例如起子培养物接种的乳的产品， 其在接种步 骤后包装， 然后在包装中发酵。
术语 “可饮用产品” 包括例如 “饮用酸奶” 等饮料。术语 “饮用酸奶” 典型地涵盖用 乳杆菌属与嗜热链球菌组合发酵而制造的乳制品。饮用酸奶典型地具有 8％或以上的乳固 体非脂含量。此外， 饮用酸奶饮品的活培养物计数典型地是每毫升至少 10E6 细胞形成单位 (CFU)。
根据本发明的 “可饮用产品” 包括基于酸化乳底物的任何可饮用产品， 因此包括发 酵乳饮品和液体酸奶饮品。 在本发明的方法中， 酸化是以利用微生物进行发酵来进行的， 任 选地加入酸， 例如有机酸 ( 例如乳酸、 乳糖酸或 GDL)。
根据本发明的可饮用产品在其呈现液态且作为饮料被消费的意义上是可饮用的， 也就是其适用于饮用， 而不是用调羹进食。 “呈现液态” 意思是产品处于流体物态， 因此展现 容易流动的特征。 因此， 液体的形状通常是由其填充的容器决定， 这与例如柔软但无法自由 流动的胶状物质 ( 例如酸奶或布丁 ) 相反。根据本发明的可饮用产品的粘度允许消费者在 期望时用吸管饮用产品。
根据本发明的可饮用产品的 pH 可小于 4.6， 优选小于 4.4， 更优选小于 4.2 且甚至 更优选是约 pH 4 或以下。在一个方面， 可饮用产品的 pH 小于 3.8， 例如小于 3.6。
根据本发明的可饮用产品的脂肪含量可以是 0 到 2％， 优选低于 1.5％、 低于 1％或 低于 0.5％， 更优选是约 0.1％或以下。可饮用产品的乳固体非脂含量可小于 20％， 优选小 于 8.5％、 小于 8％、 小于 7.5％、 小于 7％、 小于 6.5％或小于 6％， 且更优选是约 5％。
根据本发明的可饮用产品的蛋白质含量可介于 0.5％与 4％之间。在一个优选方 面， 可饮用产品的蛋白质含量低于 1％。在另一个优选方面， 可饮用产品的蛋白质含量介于 2％与 3％之间。
根据本发明的可饮用产品的保存期可以超过 7 天， 优选超过 14 天， 更优选超过 28 天， 例如超过 3 个月。
根据本发明的可饮用产品可具有提高的沉降稳定性。 所述稳定性可以在可饮用产 品储存适当天数后， 通过测量因为脱水收缩作用而在表面上聚集的乳清的高度来测定。所述稳定性也可以在被加速的脱水收缩作用例如通过离心之后测定。
对于可饮用产品、 例如饮用酸奶来说， 在发酵之后通常需要高剪切力处理 ( 例如 均质化 ) 以破坏蛋白质网络， 以便获得流畅、 均质且可饮用的产品。网络被破坏意味着饮用 酸奶的沉降稳定性下降， 导致保存期内蛋白质沉降到底部。高脂肪含量和高蛋白质含量提 高沉降稳定性， 而具有低蛋白质含量 (1-2.5％ ) 的低脂肪产品 (0-0.5％脂肪 ) 则通常需要 加入稳定剂以避免蛋白质沉降。
如本文所用的术语 “噬菌体” 具有其在所属领域中被理解的常规含义， 也就是选择 性地感染一种或多种细菌的病毒。许多噬菌体对特定的细菌属或种或菌株具有特异性。术 语 “噬菌体 (bacteriophage)” 与术语 “噬菌体 (phage)” 同义。噬菌体可包括但不限于属 于任何以下病毒科的噬菌体 ： 被盖病毒科 (Corticoviridae)、 囊病毒科 (Cystoviridae)、 丝状病毒科 (Inoviridae)、 轻小病毒科 (Leviviridae)、 微病毒科 (Microviridae)、 肌病毒 科 (Myoviridae)、 短尾病毒科 (Podoviridae)、 长尾病毒科 (Siphoviridae) 或复层病毒科 (Tectiviridae)。噬菌体可以是裂解性噬菌体或溶原性噬菌体。裂解性噬菌体是通过完成 裂解周期来实现裂解路径， 而不是进入溶原路径的噬菌体。 裂解性噬菌体经历病毒复制， 其 导致细胞膜被裂解、 细胞被破坏以及释放能够感染其它细胞的子代噬菌体粒子。溶原性噬 菌体是能够进入溶原路径的噬菌体， 在所述溶原路径中噬菌体在其裂解周期完成之前变成 细胞基因组的休眠、 惰性部分。
在一个实施方案中， 根据本发明的乳酸细菌对一种或多种噬菌体或一组或多组的 噬菌体具有抗性， 在另一个实施方案中， 根据本发明的乳酸细菌对根据本发明保藏的菌株 有抗性的相同噬菌体具有抗性。在本发明的上下文中， 术语 “噬菌体稳固性” 与术语 “噬菌 体抗性” 互换使用。
在本发明的上下文中， 术语 “突变株” 应理解为通过例如基因工程、 辐射和 / 或化 学处理而从本发明的菌株 ( 或母菌株 ) 衍生或可以衍生的菌株。突变株优选是功能相等的 突变株， 例如具有与母菌株基本上相同或改进的性质 ( 例如关于质构、 剪切应力、 粘度、 凝 胶硬度、 口腔包覆感、 风味、 后酸化、 酸化速度和 / 或噬菌体稳固性 ) 的突变株。所述突变株 是本发明的一部分。特别地， 术语 “突变株” 是指使本发明的菌株经历任何常规使用的诱变 处理 ( 包括用例如乙烷甲烷磺酸盐 (EMS) 或 N- 甲基 -N′ - 硝基 -N- 硝基胍 (NTG) 等化学 诱变剂、 UV 光处理 ) 而获得的菌株， 或自发产生的突变株。突变株可以已经经历若干诱变 处理 ( 单次处理应理解为一个诱变步骤和随后的一个筛选 / 选择步骤 )， 但目前优选的是 进行不超过 20、 或不超过 10、 或不超过 5 次处理 ( 或筛选 / 选择步骤 )。在一个目前优选 的突变株中， 相比母菌株， 细菌基因组中小于 5％或小于 1％或甚至小于 0.1％的核苷酸被 另一种核苷酸取代或被缺失。在本发明的上下文中， 术语 “变异株” 应理解为功能与本发明 的菌株功能等同的菌株， 例如具有基本上相同或改进的性质 ( 例如关于质构、 剪切应力、 粘 度、 凝胶硬度、 口腔包覆感、 风味、 后酸化、 酸化速度和 / 或噬菌体稳固性 )。 所述变异株可使 用适当的筛选技术鉴别， 是本发明的一部分。
在本发明的上下文中， “质构” 是在 37℃生长 12 小时后作为剪切应力测量。剪切 应力和凝胶硬度的 SI 单位是帕斯卡 (Pa)。
用于分析质构的分析 ：
孵育次日， 使发酵乳达到 13℃并用配备有钻孔圆盘 (bored disc) 的棒子轻轻搅拌， 直到样品变得均匀为止。 在配备有 C25 同轴测量系统的流变仪 (StressTech， Reologica Instruments， 瑞典 ) 上评估样品的流变性质。利用在 21 步中从 0.27 到 300l/s 变化的剪 切速率进行粘度测试。先增加后降低剪切速率， 并记录剪切应力和表观粘度的上升和下降 曲线。延迟时间和积分时间分别是 5s 和 10s。
除非本文另外指定或上下文明显矛盾， 否则在描述本发明的上下文中 ( 特别是在 以下权利要求书的上下文中 ) 使用的术语 “一 (“a” 和 “an” )” 和 “所述” 和类似指代应解 释为涵盖单数和复数。除非另外指出， 否则术语 “包含” 、 “具有” 、 “包括” 和 “含有” 应解释 为开放式术语 ( 即意思是 “包括但不限于” )。除非本文另外指定， 否则本文叙述的值的范 围仅旨在用作各个提及落在所述范围内的每一单独值的简化方法， 且每一单独值都被纳入 说明书中， 就如同其在本文中各个叙述一样。 除非本文中另外指出或上下文明显矛盾， 否则 本文所述的所有方法都可按任何合适次序进行。除非另外主张， 本文提供的任何和所有实 施例或示例性修辞 ( 例如 “诸如” ) 的使用仅用于更好地阐明本发明， 并且不对本发明的范 围施加限制。 说明书中的任何语言都不应被解释成表示任何未请求保护的要素对于本发明 的实施是必要的。
实验 实施例 1 ： 具有改进的质构性质的抗噬菌体嗜热链球菌菌株的开发
CHCC11977 的开发
母菌株 CHCC11342 是如实施例 5 中所述来获得。所述菌株是 CHCC6008 的突变株 且被视为发酵半乳糖的嗜热链球菌菌株。
一起涂布 0.1ml 的 CHCC11342 的 M17 过夜培养物与每毫升含有 10E09(10exp9) 个 噬菌体粒子的 0.1ml 噬菌体 CHPC1152， 并在 37℃孵育 2 天之后， 在 M17 琼脂平板上分离菌 株 CHCC11977。 将称为 CHCC11977 的一个突变体进行菌落纯化三次， 并在 M17 琼脂平板上在 37℃使用噬菌体 CHPC1152 在空斑试验中重新测试， 其中证实了噬菌体抗性 ( 没有观察到单 一空斑 )。
所述突变株然后也在 M17 肉汤中在 37℃在存在噬菌体 CHPC1152 的情况下进行了 测试。CHCC11977 在液体培养物中也保持了其噬菌体抗性， 而 CHCC11342 和预期一样受到 CHPC1152 攻击。
还在乳中在不同温度下测试了 CHCC11977( 未加入感染性噬菌体 )， 显示酸化活性 与母菌株 CHCC11342 相当。
发酵乳中 CHCC11342 质构的分析
孵育次日， 使发酵乳达到 13℃并用配备有钻孔圆盘的棒子轻轻搅拌， 直到样品变 得均匀为止。 在配备有 C25 同轴测量系统的流变仪 (StressTech， Reologica Instruments， 瑞典 ) 上评估样品的流变性质。
利用在 21 步中从 0.27 到 300l/s 变化的剪切速率进行粘度测试。先增加后降低 剪切速率， 并记录剪切应力和表观粘度的上升和下降曲线。
延迟时间和积分时间分别是 5s 和 10s。 为进行进一步分析， 选择 300s-1 的剪切应 力。
流变仪结果显示， CHCC11342 的剪切应力值是 73.0Pa， 而 CHCC6008 的剪切应力值 是 68.0Pa， 参看图 1。
发酵乳中 CHCC11977 质构的分析 如上文对于 gal 阳性的抗噬菌体突变株所描述， 获得发酵乳， 并分析质构相关的性质。 流 变 仪 结 果 显 示， CHCC11977 的 剪 切 应 力 值 与 CHCC11342 相 比 提 高 了 10 ％ (CHCC11977 的剪切应力值是 80.0Pa， 母菌株 CHCC11342 是 73.0Pa， 参看图 1)。
此 外， 抗 噬 菌 体 突 变 株 CHCC11977 的 凝 胶 硬 度 (G*) 的 值 是 126.0Pa， 与 CHCC11342( 凝胶硬度 104.0Pa) 相比增加了 20％。因此， 通过从半乳糖阳性母菌株中分离 抗噬菌体突变株有可能显著改进重要的流变学参数， 即剪切应力和凝胶硬度。
来自 CHCC11342 的 galK 启动子区域的测序
为了揭示半乳糖阳性突变株 CHCC11342 的突变类型， 对 galK 基因 ( 编码来自嗜热 链球菌的半乳糖激酶 ) 的开端进行测序。
对于 CHCC11342， 鉴别了 galK 启动子区域中的突变 ( 参看以下序列 )。galK 基因 的 -10 启动子盒下游的三个核苷酸发生了突变， 导致 C 至 A 的核苷酸变化。
CHCC11342 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTAAGTATAAACAAAAAGAATAA GTGAGATACATC SEQ ID No ： 1
CHCC6008 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAA GTGAGATACATC SEQ ID No ： 2
AY704368 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAA GTGAGATACATC SEQ ID No ： 3
共同序列 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAA GTGAGATACATC SEQ ID No ： 4
-35 -10 RBS
来自 CHCC11342 的 galK 基因的启动子区域。 用灰色代码标识 CHCC11342galk 启动 子区域内的点突变。 标记来自嗜热链球菌 ST111(Genbank 登记号 AY704368) 的公开的 galK 序列用于比较。-35 ： -35 启动子盒 ； -10 ： -10 启动子盒 ； RBS ： 核糖体结合位点。
其它抗噬菌体突变株
为了揭示噬菌体抗性与半乳糖阳性表型之间的可能关系， 在 M17 半乳糖琼脂平 板上从菌株 CHCC6008(gal-) 分离另外 5 种抗噬菌体性突变株， 所述菌株 CHCC6008(gal-) 是 CHCC11342(gal+) 的 母 菌 株。 所 有 5 种 抗 噬 菌 体 性 突 变 株 CHCC11396、 CHCC11397、 CHCC11398、 CHCC11399 和 CHCC11340( 对 噬 菌 体 CHPC1152 具 有 抗 性 ) 都 不 能 使 半 乳 糖 发 酵， 意 味 着 gal+ 表 型 与 噬 菌 体 抗 性 没 有 直 接 关 系。 另 一 方 面， 空斑分析证实了 CHCC11342(gal+) 对噬菌体 CHPC1152 仍然敏感。
实施例 2 ： 具有改进的质构性质的抗噬菌体德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的开发
从母菌株 CHCC10019(DSM19252) 如下分离抗噬菌体突变株 ：
一起涂布 0.1ml 的 CHCC10019 的 MRS 过夜培养物与每毫升含有 10E06 个噬菌体粒 子的 0.1ml CHPC658 噬菌体溶菌产物， 并在 37℃厌氧孵育 2 天之后， 从含有 10mM CaCl2/10mM MgCl2 的 MRS 琼脂平板挑选突变株。分离 30 株突变株， 并在针对噬菌体 CHPC658 的交叉划 线法 (cross-streaking) 中进行测试。 29 株突变株在交叉划线测试中表现抗性， 随后在 MRS
琼脂平板上在 37℃对这些突变株进行菌落纯化三次。
在微量滴定板中测试这 29 株突变株的酸化特性和噬菌体抗性。用乳制备两个微 量滴定板， 每个滴定板都用 2％的各自突变株接种。将 2％蛋白胨 - 盐稀释剂 ( 对照物 ) 加 入一个滴定板的每个孔中， 并且向另一个微量滴定板中加入每毫升含有 10E06 个噬菌体粒 子的 2％ CHPC658。将两个滴定板在 37℃孵育 2 天， 每 12 分钟记录每个孔的 pH。与被噬菌 体 CHPC658 攻击的母菌株 CHCC10019 相比， 所有突变株都具有噬菌体抗性。
基于在 MRS 和乳中的酸化特性 ( 类似于母菌株 ) 以及菌株的粘度选出 12 株突变 株。
CHCC10019 抗噬菌体突变株在发酵乳中的质构性质的分析
使 12 株突变株和母菌株 CHCC10019 在乳中于 37℃孵育过夜， 然后将发酵乳调节到 13℃， 并用配备有钻孔圆盘的棒子轻轻搅拌， 直到每个样品变得均匀为止。在配备有 C25 同 轴测量系统的流变仪 (StressTech， Reologica Instruments， 瑞典 ) 上评估每个样品的流 变性质。
利用在 21 步中从 0.27 到 300l/s 变化的剪切速率进行粘度测试。先增加后降低 剪切速率， 并记录剪切应力和表观粘度的上升和下降曲线。延迟时间和积分时间分别是 5s 和 10s。为进行进一步分析， 选择 300s-1 的剪切应力。
流变学测量的结果显示， 所有 12 株突变株 ( 例如 CHCC12813 和 CHCC12841) 与 CHCC10019 相比都具有提高的粘度， 其是作为剪切应力测量的。CHCC12841 获得了最高的剪 切应力值 (74.0Pa)， 而 CHCC10019 的剪切应力值则为 58.0Pa， 参看图 2。在该图中， 显示了 这 12 株抗噬菌体突变株的流变学数据。与 CHCC10019 相比， 所有突变株的剪切应力都有增 加， 范围从 10％一直到 28％。
基于突变株与其它菌株在共同培养中生长时的酸化活性和流变学数据， 选出 CHCC12813 作为被分离的突变株中最有前景的候选者， 用于进一步应用性测试。
这个实验证实， 通过分离菌株的抗噬菌体突变株， 细菌菌株的重要流变学参数剪 切应力将得到显著提高。
实施例 3 ： 嗜热链球菌菌株 CHCC9204 的抗噬菌体突变株的分离
从母菌株 CHCC9204( 登记在 Chr.Hansen 培养物保藏中心 ) 分离抗噬菌体突变株。 一起涂布 0.1ml 的 CHCC9204 的 M17 乳糖过夜培养物与每毫升含有 1x10exp09 个噬菌体粒 子的 0.1ml 噬菌体 CHPC1057， 并在 37℃孵育过夜之后， 在含有 10mM MgCl2/CaCl2 的 M17-2％ 乳糖琼脂平板上分离突变株。
在几个突变株中， 对称为 CHCC12339 的一个突变株进行菌落纯化三次， 并在 M17 乳糖琼脂平板上在 37 ℃使用噬菌体 CHPC1057 在空斑试验中针对噬菌体攻击进行重新 测试， 并且证实了噬菌体抗性 ( 在空斑试验中没有观察到单一空斑 )。还在乳中测试了 CHCC12339， 显示酸化活性与母菌株相当。
抗噬菌体突变株 CHCC12339 在发酵乳中的质构性质的分析
使突变株 CHCC12339 和母菌株 CHCC9204 在 37℃在乳中孵育过夜之后， 使发酵乳达 到 13℃， 并用配备有钻孔圆盘的棒子轻轻搅拌， 直到每个样品变得均匀为止。在配备有 C25 同轴测量系统的流变仪 (StressTech， Reologica Instruments， 瑞典 ) 上评估每个样品的 流变性质。利用在 21 步中从 0.27 到 300l/s 变化的剪切速率进行粘度测试。先增加后降低 剪切速率， 并记录剪切应力和表观粘度的上升和下降曲线。延迟时间和积分时间分别是 5s 和 10s。为进行进一步分析， 选择 300s-1 的剪切应力。
流变学测量的结果显示， 突变株 CHCC12339 导致凝胶硬度 (G*) 与 CHCC9204 相比 增加了 22 ％， 参看图 3。在该图中， 比较了抗噬菌体突变株 CHCC12339(78.0Pa) 和母菌株 CHCC9204(64.0Pa) 的凝胶硬度值 (G*)。
实施例 4 ： 嗜热链球菌菌株 CHCC5086 的抗噬菌体突变株的分离
从母菌株 CHCC5086( 登记在 Chr.Hansen 培养物保藏中心 ) 分离抗噬菌体突变株。
一起涂布 0.1ml 的 CHCC5086 的 M17-2％乳糖过夜培养物与每毫升含有 1x10exp08 个噬菌体粒子的 0.1ml 噬菌体 CHPC1089， 并在 37℃孵育过夜之后， 在含有 10mM MgCl2/CaCl2 的 M17-2％乳糖琼脂平板上分离突变株。
在几个突变株中， 将称为 CHCC13140 的一个突变株进行菌落纯化三次， 并在 M17 乳 糖琼脂平板上在 37℃使用噬菌体 CHPC1089 针对噬菌体攻击在空斑中进行重新测试， 并且 证实了噬菌体抗性 ( 在空斑试验中没有观察到单一空斑 )。
也在乳的酸化试验中测试了 CHCC13140， 显示酸化活性与母菌株相当。
抗噬菌体突变株 CHCC13140 在发酵乳中的质构性质的分析
使突变株 CHCC13140 和母菌株 CHCC5086 在乳中 37℃下孵育过夜之后， 使发酵乳达 到 13℃， 并用配备有钻孔圆盘的棒子轻轻搅拌， 直到每个样品变得均匀为止。在配备有 C25 同轴测量系统的流变仪 (StressTech， Reologica Instruments， 瑞典 ) 上评估每个样品的 流变性质。
利用在 21 步中从 0.27 到 300l/s 变化的剪切速率进行粘度测试。先增加后降低 剪切速率， 并记录剪切应力和表观粘度的上升和下降曲线。延迟时间和积分时间分别是 5s 和 10s。为进行进一步分析， 选择 300s-1 的剪切应力。
流变学测量的结果显示， 突变株 CHCC13140 导致剪切应力与 CHCC5086 相比增加了 14％， 参看图 4。 在该图中， 比较了抗噬菌体突变株 CHCC13140( 剪切应力 33.0Pa) 和母菌株 CHCC5086(28.0Pa) 的剪切应力数据。
实施例 5 ： 链球菌菌株的半乳糖阳性突变株的制备
获得 gal+ 菌株的一般方法
在分离突变株之前， 将母菌株 ( 例如 CHCC6008) 划线于含有 2％半乳糖的 M17 琼脂 平板 (M17-gal 平板 ) 上。 CHCC6008 在作为唯一的碳水化合物源的半乳糖上不生长， 因此母 菌株被视为 gal-。
然后将母菌株的过夜培养物涂布于 M17-gal 平板上， 并且在 37℃生长两天后可分 离若干菌落。
在 M17-gal 平板上纯化若干突变株， 并在含有 2％半乳糖作为唯一碳水化合物的 M17 肉汤中重新测试。
突变株可通过例如基因工程、 辐射和 / 或化学处理来获得， 或者突变株可以是自 发突变株。
在含有 2％半乳糖 ( 半乳糖作为唯一的碳水化合物加入 ) 的 M17 中在 37℃孵育 16 小时之后， 如果 pH 值降低至少 1.0 的值， 那么突变株被视为半乳糖阳性， 所述突变株是以每毫升培养基至少 10E4 个细胞的量接种。
CHCC6008 没有显著降低 M17-gal 肉汤的 pH， 但纯化的突变株之一 CHCC11342 在 37℃生长 16 小时后达到 pH 5.4， 因此被视为 CHCC6008 的半乳糖发酵 (gal+) 突变株。
半乳糖发酵菌株的分离
分离作为嗜热链球菌菌株 CHCC6008( ＝ ST6008， DSM18111) 的半乳糖发酵突变株 的突变株。在突变株分离步骤之前既不用任何诱变化合物也不用 UV 光对 CHCC6008 细胞进 行诱变。分离的菌株因此类似于 CHCC6008 的自发半乳糖阳性突变株。
在分离突变株之前， 将 CHCC6008 划线于含有 2％半乳糖的 M17 琼脂平板 (M17-gal 平板 ) 上。CHCC6008 在作为唯一碳水化合物源的半乳糖上不生长。
然后将 CHCC6008 的过夜培养物涂布于 M17-gal 平板上， 且在 37℃生长两天后可分 离若干菌落。 在 M17-gal 平板上纯化若干突变株， 并在含有 2％半乳糖作为唯一的碳水化合 物的 M17 肉汤中重新测试。
CHCC6008 没有显著降低 M17-gal 肉汤的 pH， 但纯化的突变株之一 CHCC11379 在 37℃生长 10 小时后达到 pH 5.3， 因此被视为 CHCC6008 的半乳糖发酵突变株。
菌株 CHCC11342 和 CHCC11976 按同样的方法分离。
通过基因工程分离突变株
半乳糖阳性突变株也可通过定点诱变来产生。
使用在 galK-10 启动子盒内携带突变核苷酸的寡核苷酸， 利用 PCR 对特定 DNA 片 段进行扩增。将携带期望突变的 PCR 片段克隆到载体质粒中并转化到嗜热链球菌目标菌株 中， 并且将突变整合到染色体中并通过重组来交换野生型 galK 启动子区域。菌株的分离如 上进行。
发酵乳中的质构分析
孵育次日， 使发酵乳达到 13℃并用配备有钻孔圆盘的棒子轻轻搅拌， 直到样品变 得均匀为止。 在配备有 C25 同轴测量系统的流变仪 (StressTech， Reologica Instruments， 瑞典 ) 上评估样品的流变性质。
利用在 21 步中从 0.27 到 300l/s 变化的剪切速率进行粘度测试。先增加后降低 剪切速率， 并记录剪切应力和表观粘度的上升和下将曲线。
延迟时间和积分时间分别是 5s 和 10s。 为进行进一步分析， 选择 300s-1 的剪切应 力。流变仪结果显示， CHCC11379 的剪切应力与 CHCC6008 相比提高了 10％ (CHCC11379 的 剪切应力值为 74.0Pa( 帕斯卡 )， 母菌株 CHCC6008 为 67.5Pa)。
乳中的质构分析
在另一个实验中， 使用 CHCC11379 作为酸奶培养物的一部分， 其中来自嗜热链球 菌的菌株在脱脂奶中在 43℃与来自德氏乳杆菌保加利亚亚种的菌株共同培养。 当酸奶生产 中的唯一区别是使用 CHCC11379 而不是野生型 CHCC6008 时， 剪切应力也增加了 10％ ( 含 CHCC11379 的酸奶培养物的剪切应力为 105.0Pa， 而含 CHCC6008 的酸奶培养物的剪切应力 为 94.7Pa)。
来自 CHCC11379 的 galK 启动子区域的测序
为了揭示 gal 阳性突变株 CHCC11379 的突变类型， 对 galK 基因 ( 编码来自嗜热链 球菌的半乳糖激酶 ) 的开端进行测序。对于 CHCC11379， 鉴别了 galK 启动子区域中的突变 ( 见下文 )。各个的突变将最 可能导致与母菌株 6008 相比提高的启动子活性， 这对观察到的 gal 阳性表型进行了解释。 这是基于以下事实 ： -10 启动子盒的共同序列是 “TATAAT” ， 且 CHCC6008 的 -10 盒 ( 区域 ) (“TACGAT” ) 的核苷酸 3 的突变导致与 CHCC11379 中的共同序列 (“TATGAT” ) 相似度更高 的 -10 盒。
CHCC11379 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTATGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAG TGAGATACATC SEQ ID NO ： 5
CHCC6008 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAG TGAGATACATC SEQ ID NO ： 2
AY704368 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAG TGAGATACATC SEQ ID NO ： 3
共同序列 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAG TGAGATACATC SEQ ID NO ： 4
-35 -10 RBS
来自 CHCC11379 的 galK 基因的启动子区域。用灰色代码标识 CHCC11379galk 启 动子内的点突变。标记来自嗜热链球菌 ST111(Genbank 登记号 AY704368) 的公开的 galK 序列以用于比较。-35 ： -35 启动子区域 ； -10 ： -10 启动子区域 ； RBS ： 核糖体结合位点。
本文描述了本发明的优选实施方案， 包括发明人已知的实施本发明的最佳模式。 对于所属领域的一般技术人员来说， 在阅读以上描述后， 那些优选实施方案的变化可变得 显而易见。发明人预期普通技术人员使用适当的此类变化， 且发明人意图以本文具体说明 以外的方式实施本发明。因此， 本发明包括随附权利要求书中陈述的主题的适用法律所允 许的所有修改和等同方式。 此外， 除非本文另外指出或上下文另外明显矛盾， 否则本发明涵 盖上述要素在其所有可能变化中的任何组合。
保藏和专家解决方案
嗜 热 链 球 菌 菌 株 CHCC11977 和 CHCC11342 分 别 在 2009 年 9 月 8 日 以 保 藏 号 DSM22935 和 DSM22932 保 藏 于 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH， Inhoffenstr.7B， D-38124Braunschweig， Germany)。CHCC6008 已经在 2006 年 3 月 29 日以保藏号 DSM18111 保藏于 DSMZ。
噬菌体 CHPC658、 CHPC1057 和 CHPC1152 于 2010 年 8 月 27 日保藏于 DSMZ， 并被分 别赋予保藏号 DSM23961、 DSM23962 和 DSM23994。
在 DSMZ 的其它保藏物 ：
CHCC10019(DSM19252) 和 CHCC3984(DSM19251) ： 保藏日期 2007 年 4 月 3 日，
CHCC2008(DSM22584) 和 CHCC5086(DSM22587) ： 保藏日期 2009 年 5 月 19 日，
CHCC11379(DSM22884) ： 保藏日期 2009 年 8 月 26 日，
CHCC11976(DSM22934) ： 保藏日期 2009 年 9 月 8 日，
CHCC13140(DSM 24023)、 CHCC12813(DSM24074) 和 CHPC1089(DSM24022) ： 保藏日 期 2010 年 9 月 29 日 ；
CHCC12339(DSM24090) ： 保藏日期 2010 年 10 月 14 日。嗜热链球菌 CHCC5086(DSM22587) ： 保藏日期 ： 2009 年 5 月 19 日。
CHCC9204(DSM19243) ： 保藏日期 2007 年 3 月 29 日。
已经根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约 (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure) 的条款进行了保藏。
申请人要求保藏的微生物的样品只能供申请人批准的专家使用。
参考文献
Appl.Environ.Microbiol.71， 7， 第 3659-67 页 (2005) ；
International Journal of Food Microbiology 113(2007)195-200 ；
Applied And Environmental Microbiology， 2002 年 2 月， 第 784-790 页 ；
J Dairy Sci 92 ： 477-482(2009)
WO2008/040734A1 ，WO2007/025097A2 ，US7241610B2 ，WO2007/144770A2 ， WO2004/085607A， WO2008/148561A， WO11000879A， WO11000883A， WO10023178A
本专利文件中所引用的所有参考文献皆以引用的方式以其整体并入本文中。22CN 102770527 A
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