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6- 修饰的双环核酸类似物
    本申请是申请号为 200780010566.0(PCT/US2007/061183)， 申请日为 2007 年 1 月 27 日的中国发明专利申请 “6- 修饰的双环核酸类似物” 的分案申请。
     与相关申请的交叉引用
     本申请主张于 2006 年 1 月 27 日提交的题为 “Substituted Bicyclic Nucleic Acid Analogs”的 美 国 临 时 申 请 60/762,722， 以 及 于 2006 年 6 月 23 日 提 交 的 题 为 “6-Substituted Bicyclic Nucleic Acid Analogs” 的美国临时申请 60/805,660 的优先 权， 这些披露的全文在此引用作为参考。
     技术领域
     本发明提供了 6- 修饰的双环核苷及由其制备的寡聚化合物和组合物。更具体而 言， 本发明提供了具有 2’ -O-C(H)(R)-4’ 桥的核苷以及由其制备得到的寡聚物和组合物。 在优选的实施方案中， R 具有形成 (R) 或 (S) 异构体的特定构型。在一些实施方案中， 本发 明的寡聚化合物和组合物与靶标 RNA 的一部分杂交以使该靶标 RNA 丧失正常的功能。 背景技术 反义技术是用于减少一种或多种特定基因产物表达的有效手段， 因而被证明在治 疗、 诊断和研究应用中具有独特的用途。化学修饰的核苷常用于整合入反义序列以增强一 种或多种属性， 例如核酸酶抗性。一类这样的化学修 饰包括双环核苷， 其中该核苷的呋喃 糖部分包含了连接呋喃糖上两个原子以形成双环状环系统的桥。 该种双环核苷具有各种名 称， 包括对于双环核酸或锁核酸分别具有 BNA 和 LNA 的名称。
     各种 BNA 已得到制备， 并报道于专利文献和科技文献， 例如参见 Singh 等人 ,Chem. Commun.,1998,4,455-456;Koshkin 等 人 ,Tetrahedron,1998,54,3607-3630;Wahlestedt 等 人 ,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638;Kumar 等 人 ,Bioorg.Med.Chem. Lett.,1998,8,2219-2222;Wengel 等 人 ,PCT 国 际 申 请 WO 98-DK393 19980914;Singh 等 人 ,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039， 各文献的全文在此引用作为参考。已授权的美 国专利和公布的申请的实例包括， 例如 ： 美国专利 7,053,207、 6,770,748、 6,268,490 和 6,794,499 以及公布的美国申请 20040219565、 20040014959、 20030207841、 20040192918、 20030224377、 20040143114 和 20030082807; 各文献的全文在此引用作为参考。
     许 多 LNA 具 有 毒 性。 例 如， 参 见 Swayze,E.E. ； Siwkowski,A.M. ； Wancewicz,E. V. ； Migawa,M.T. ； Wyrzykiewicz,T.K. ； Hung,G. ； Monia,B.P. ； Bennett,C.F.,Antisense oligonucleotides containing locked nucleic acid improve potency but cause significant hepatotoxicity in animals.Nucl.Acids Res.,doi:10.1093/nar/ gkll071(2006 年 12 月， 提前在线出版 )
     因此， 对通过反义机制特异性调节基因表达的药剂仍有着长期需求。本文公开了 可用于调节基因表达通路的 6- 取代的 BNA 和由其制备得到的反义化合物， 包括依赖于 RNA 酶 H、 RNAi 和 dsRNA 酶等作用机制， 以及基于靶标降解或靶标占用的其它反义机制的调节。
     本领域的技术人员在获知本公开内容后将能够在不进行过度实验的情况下鉴定、 制备反义 化合物和开发其用途。
     发明概述
     本发明提供了具有下式的双环核苷 ：
     其中 ： Bx 是杂环碱基部分 ； T1 是 H 或羟基保护基团 ； T2 是 H、 羟基保护基团或活性磷基团 ； Z 是 C1-C6 烷基、 C2-C6 烯基、 C2-C6 炔基、 取代的 C1-C6 烷基、 取代的 C2-C6 烯基、 取代的 C2-C6 炔基、 酰基、 取代的酰基、 或取代的酰胺。 在一实施方案中， 各被取代的基团独立地被任选被保护的取代基单或多取代， 所 述取代基独立地选自卤素、 氧代、 羟基、 OJ1、 NJ1J2、 SJ1、 N3、 OC(=X)J1、 OC(=X)NJ1J2、 NJ3C(=X) NJ1J2 和 CN， 其中各 J1、 J2 和 J3 独立地为 H 或 C1-C6 烷基， X 是 O、 S 或 NJ1。
     在一实施方案中， 各被取代的基团独立地被取代基单或多取代， 所述取代基独立 地选自卤素、 氧代、 羟基、 OJ1、 NJ1J2、 SJ1、 N 3、 OC(=X)J1 和 NJ3C(=X)NJJJ2 的， 其中各 J1、 J 2 和 J3 独立地为 H、 C1-C6 烷基或取代的 C1-C6 烷基， X 是 O 或 NJ1。
     在一实施方案中， Z 是 C1-C6 烷基或取代的 C1-C6 烷基。在另一实施方案中， Z是 C1-C6 烷基。在另一实施方案中， Z 是甲基 (CH3-)。在另一实施方案中， Z 是乙基 (CH3CH2-)。 在另一实施方案中， Z 是取代的 C1-C6 烷基。在另一实施方案中， Z 是取代的甲基。在另一 实施方案中， Z 是取代的乙基。
     在一实施方案中， 该取代基为 C1-C6 烷氧基 ( 例如， Z 是被一或多个 C1-C6 烷氧基取 代的 C1-C6 烷基 )。 在另一实施方案中， 该 C1-C6 烷氧基取代基为 CH3O-( 例如， Z 是 CH3OCH2-)。 在另一实施方案中， 该 C1-C6 烷氧基取代基可被进一步取代， 例如 N(J1J2)CH2O-( 例如， Z是 N(J1J2)CH2OCH2-)。在另一实施方案中， 该取代基团为卤素 ( 例如， Z 是被一或多个卤素取代 的 C1-C6 烷基 )。在另一实施方案中， 该卤素取代基为氟 ( 例如， Z 为 CH2FCH2-、 CHF2CH2- 或 CF3CH2-)。在另一实施方案中， 该取代基为羟基 ( 例如， Z 是被一或多个羟基取代的 C1-C6 烷 基 )。 在另一实施方案中， Z 是 HOCH2-。 在另一实施方案中， Z 是 CH3-、 CH3CH2-、 -CH2OCH3、 -CH2F 或 HOCH2-。
     在一实施方案中， Z 基团为被一个或多个 Xx 取代的 C1-C6 烷基， 其中各 Xx 独立为 OJ1、 NJ1J2、 SJ1、 N3、 OC(=X)J1、 OC(=X)NJ1J2、 NJ3C(=X)NJ1J2 或 CN ； 其中各 J1、 J2 和 J3 独立为 H 或 C1-C6 烷基， X 是 O、 S 或 NJ1。在另一实施方案中， Z 基团为被一或多个 Xx 取代的 C1-C6 烷基， 其中各 Xx 独立为卤素 ( 例如， 氟 )、 羟基、 烷氧基 ( 例如， CH3O-)、 取代的烷氧基或叠氮 基。在一实施方案中， Z 基团为 -CH2XX， 其中 Xx 为 OJ1、 NJ1J2、 SJ1、 N 3、 OC(=X)J1、 OC(=X) NJ1J2、 NJ3C(=X)NJ1J2 或 CN ； 其中各 J1、 J2 和 J3 独立为 H 或 C1-C6 烷基， X 是 O、 S 或 NJ1。在 X x 另一实施方案中， Z 基团为 -CH2X ， 其中 X 为卤素 ( 例如， 氟 )、 羟基、 烷氧基 ( 例如， CH3O-) 或叠氮基。
     在一实施方案中， Z 基团呈 (R)- 构型 ：
     在另一实施方案中， Z 基团呈 (S)- 构型 ：在一实施方案中， T1 和 T2 分别为羟基保护基团。羟基保护基团的优选列表包括苯 甲基、 苯甲酰基、 2,6- 二氯苯甲基、 叔丁基二甲基硅烷基、 叔丁基二苯基硅烷基、 甲磺酸、 甲 苯磺酸、 二甲氧基三苯甲基 (DMT)、 9- 苯基黄嘌呤 -9- 基 (Pixyl) 以及 9-( 对甲氧基苯基 ) 黄嘌呤 -9- 基 (MOX)。在一实施方案中， T1 为羟基保护基团， 该基团选自乙酰、 苯甲基、 叔丁 基二甲基硅烷基、 叔丁基二苯基硅烷基和二甲氧基三苯甲基， 其中更优选的羟基保护基团 T1 为 4,4’ - 二甲氧基三苯甲基。
     在一实施方案中， T2 为活性磷基团， 其中优选的活性磷基团包括二异丙基氰基乙 氧基亚磷酰胺和 H- 磷酸酯。在一优选的实施方案中， T1 为 4,4’ - 二甲氧基三苯甲基且 T2 为二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺。
     本发明还提供了寡聚化合物， 其具有至少一个具有下式的单体 ：
     或下式 ：
     或下式 ：其中 ：
     Bx 是杂环碱基部分 ；
     T3 为 H、 羟基保护基团、 联接的共轭基团或与核苷、 核苷酸、 寡核苷、 寡核苷酸、 单体 亚基或寡聚化合物连接的核苷间联接基团 ；
     T4 为 H、 羟基保护基团、 联接的共轭基团或与核苷、 核苷酸、 寡核苷、 寡核苷酸、 单体 亚基或寡聚化合物连接的核苷间联接基团 ；
     其中 T3 和 T4 中至少一个为与核苷、 核苷酸、 寡核苷、 寡核苷酸、 单体亚基或寡聚化 合物连接的核苷间联接基团 ； 且
     Z 是 C1-C6 烷基、 C2-C6 烯基、 C2-C6 炔基、 取代的 C1-C6 烷基、 取代的 C2-C6 烯基、 取代 的 C2-C6 炔基、 酰基、 取代的酰基、 取代的酰胺、 硫醇或取代的硫。
     在一实施方案中， 各被取代的基团被任选被保护的取代基单或多取代， 所述取代 基独立地选自卤素、 氧代、 羟基、 OJ1、 NJ1J2、 SJ1、 N3、 OC(=X)J1、 OC(=X)NJ1J2、 NJ3C(=X)NJ1J2 和 CN， 其中各 J1、 J2 和 J3 独立地为 H 或 C1-C6 烷基， X 是 O、 S 或 NJ1。
     在一实施方案中， 各被取代的基团独立地被取代基单或多取代， 所述取代基独立 地选自卤素、 氧代、 羟基、 OJ1、 NJ1J2、 SJ1、 N3、 OC(=X)J1、 OC(=X)NJ1J2、 和 NJ3C(=X)NJ1J2， 其中各 J1、 J2 和 J3 独立地为 H 或 C1-C6 烷基， X 是 O 或 NJ1。
     在一实施方案中， 至少一个 Z 为 C1-C6 烷基或取代的 C1-C6 烷基。在另一实施方案 中， 各 Z 独立地为 C1-C6 烷基或取代的 C1-C6 烷基。在另一实施方案 中， 至少一个 Z 为 C1-C6 烷基。在另一实施方案中， 各 Z 独立地为 C1-C6 烷基。在另一实施方案中， 至少一个 Z 为甲 基。在另一实施方案中， 各 Z 均为甲基。在另一实施方案中， 至少一个 Z 为乙基。在另一实 施方案中， 各 Z 均为乙基。在另一实施方案中， 至少一个 Z 为取代的 C1-C6 烷基。在另一实 施方案中， 各 Z 分别独立为取代的 C1-C6 烷基。在另一实施方案中， 至少一个 Z 为取代的甲 基。在另一实施方案中， 各 Z 均为取代的甲基。在另一实施方案中， 至少一个 Z 为取代的乙 基。在另一实施方案中， 各 Z 均为取代的乙基。
     在一实施方案中， 至少一个取代基为 C1-C6 烷氧基 ( 例如， 至少一个 Z 是被一或多 个 C1-C6 烷氧基取代的 C1-C6 烷基 )。在另一实施方案中， 各取代基独立为 C1-C6 烷氧基 ( 例 如， 各 Z 独立地为被一或多个 C1-C6 烷氧基取代的 C1-C6 烷基 )。
     在一实施方案中， 至少一个 C1-C6 烷氧基取代基为 CH3O-( 例如， 至少一个 Z 是 CH3OCH2-)。 在另一实施方案中， 各 C1-C6 烷氧基取代基均为 CH3O-( 例如， 各 Z 均为 CH3OCH2-)。
     在一实施方案中， 至少一个取代基为卤素 ( 例如， 至少一个 Z 是被一或多个卤素取 代的 C1-C6 烷基 )。在另一实施方案中， 各取代基独立地为卤素 ( 例如， 各 Z 独立地为被一 或多个卤素取代的 C1-C6 烷基 )。在另一实施方案中， 至少一个卤素取代基为氟 ( 例如， 至 少一个 Z 为 CH2FCH2-、 CHF2CH2- 或 CF3CH2-)。在另一实施方案中， 各卤素取代基均为氟 ( 例 如， 各 Z 独立地为 CH2FCH2-、 CHF2CH2- 或 CF3CH2-)。
     在一实施方案中， 至少一个取代基为羟基 ( 例如， 至少一个 Z 是被一或多个羟基取 代的 C1-C6 烷基 )。在另一实施方案中， 各取代基独立地为羟基 ( 例如，各 Z 独立地为被一 或多个羟基取代的 C1-C6 烷基 )。在另一实施方案中， 至少一个 Z 为 HOCH2-。在另一实施方 案中， 各 Z 均是 HOCH2-。
     在一实施方案中， 至少一个 Z 是 CH3-、 CH3CH2-、 CH2OCH3-、 CH2F- 或 HOCH2-。在另一 实施方案中， 各 Z 独立地为 CH3-、 CH3CH2-、 CH2OCH3-、 CH2F- 或 HOCH2-。
     在一实施方案中， 至少一个 Z 基团为被一或多个 Xx 取代的 C1-C6 烷基， 其中各 Xx 独 立地为 OJ1、 NJ1J2、 SJ1、 N3、 OC(=X)J1、 OC(=X)NJ1J2、 NJ3C(=X)NJ1J2 或 CN ； 其中各 J1、 J2 和 J3 独 立地为 H 或 C1-C6 烷基， X 是 O、 S 或 NJ1。在另一实施方案中， 至少一个 Z 基团为被一或多个 x x X 取代的 C1-C6 烷基， 其中各 X 独立地为卤素 ( 例如， 氟 )、 羟基、 烷氧基 ( 例如， CH3O-) 或 叠氮基。
     在一实施方案中， 各 Z 基团独立地为被一或多个 Xx 取代的 C1-C6 烷基， 其中各 Xx 独 立地为 OJ1、 NJ1J2、 SJ1、 N3、 OC(=X)J1、 OC(=X)NJ1J2、 NJ3C(=X)NJ1J2 或 CN ； 其中各 J1、 J2 和 J3 独 立地为 H 或 C1-C6 烷基， X 是 O、 S 或 NJ1。在另一实施方案中， 各 Z 基团独立地为被一或多个 x x X 取代的 C1-C6 烷基， 其中各 X 独立地为卤素 ( 例如， 氟 )、 羟基、 烷氧基 ( 例如， CH3O-) 或 叠氮基。 在一实施方案中， 至少一个 Z 基团为 -CH2XX， 其中 Xx 为 OJ1、 NJ1J2、 SJ1,、 N 3、 OC(=X) J1、 OC(=X)NJ1J2、 NJ3C(=X)NJ1J2 或 CN ； 其中各 J1、 J2 和 J3 独立地为 H 或 C1-C6 烷基， X 是 O、 S X x 或 NJ1。在另一实施方案中， 至少一个 Z 基团为 -CH2X ， 其中 X 为卤素 ( 例如， 氟 )、 羟基、 烷 氧基 ( 例如， CH3O-) 或叠氮基。
     在一实施方案中， 各 Z 基团独立地为 -CH2XX， 其中各 Xx 独立地为 OJ1、 NJ1J2、 SJ1、 N3、 OC(=X)J1、 OC(=X)NJ1J2、 NJ3C(=X)NJ1J2 或 CN ； 其中各 J1、 J2 和 J3 独立地为 H 或 C1-C6 烷基， X X x 是 O、 S 或 NJ1。在另一实施方案中， 各 Z 基团独立地为 -CH2X ， 其中各 X 独立地为卤素 ( 例 如， 氟 )、 羟基、 烷氧基 ( 例如， CH3O-) 或叠氮基。
     在一实施方案中， 至少一个 Z 为 CH3-。在另一实施方案中， 各 Z 均是 CH3-。
     在一实施方案中， 至少一个单体的 Z 基团是由下式表示的 (R)- 构型 ：
     或下式 ：
     或下式 ：
     在另一实施方案中， 具有所述式的各单体的 Z 基团均为 (R)- 构型。在一实施方案 中， 至少一个单体的 Z 基团是由下式表示的 (S)- 构型 ：
     或下式 ：
     或下式 ：在另一实施方案中， 具有所述式的各单体的 Z 基团为 (S)- 构型。
     在一实施方案中， T3 是 H 或羟基保护基团。在另一实施方案中， T4 是 H 或羟基保 护基团。在进一步的实施方案中， T3 是与核苷、 核苷酸或单体亚基连接的核苷间联接基团。 在另一实施方案中， T4 是与核苷、 核苷酸或单体亚基连接的核苷间联接基团。在另一实施 方案中， T3 是与寡聚核苷或寡聚核苷酸连接的核苷间联接基团。在进一步的实施方案中， T4 是与寡聚核苷或寡聚核苷酸连接的核苷间联接基团。在一实施方案中， T3 是与寡聚化合物 连接的核苷间联接基团。在进一步的实施方案中， T4 是与寡聚化合物连接的核苷间联接基 团。在更进一步的实施方案中， T3 和 T4 中至少一个包含了选自磷酸二酯或硫代磷酸酯的核 苷间联接基团。
     在一实施方案中， 寡聚化合物具有至少一个由至少两个具有下式的相邻单体构成 的区域 ：
     或下式 ：
     或下式 ：在另一实施方案中， 寡聚化合物包含至少两个由至少两个具有上式的相邻单体构 成的区域。在另一实施方案中， 该寡聚化合物包含了有间隙的 (gapped) 寡聚化合物。在另 一实施方案中， 该寡聚化合物包含至少一个由约 8 至约 14 个相邻 β-D-2’ - 脱氧核糖基核 苷构成的区域。在进一步的实施方案中， 该寡聚化合物包含至少一个由约 9 至约 12 个相邻 β-D-2’ - 脱氧核糖基核苷构成的区。
     在一实施方案中， 该寡聚化合物包含至少一个由 2 至 3 个具有上式的相邻单体构 成的区， 任选的由具有上式的 1 或 2 个相邻单体构成的第二区以及由 8 至 14 个 β-D-2’ -脱 氧核糖基核苷构成的第三区， 其中所述第三区位于该第一和该第二区之间。在另一实施方 案中， 该寡聚化合物包含 8 至 10 个 β-D-2’ - 脱氧核糖基核苷。
     在本发明的另一实施方案中， 提供了具有长度为约 8 至约 40 个核苷和 / 或修饰的 核苷或模拟物的寡聚化合物。在进一步的实施方案中， 寡聚化合物包含了约 8 至约 20 个核 苷和 / 或修饰的核苷或模拟物。 在更进一步的实施方案中， 寡聚化合物包含了约 10 至约 16 个核苷和 / 或修饰的核苷或模拟物。在另一实施方案中寡聚化合物包含了约 10 至约 14 个 核苷和 / 或修饰的核苷或模拟物。
     本发明还提供了抑制基因表达的方法， 其包括将一种或多种细胞、 组织或动物与 本发明的寡聚化合物接触。
     发明详述
     本发明提供了 6- 修饰的双环核苷、 由其制备的寡聚化合物及组合物、 新的合成中 间体， 以及该核苷、 寡聚化合物、 组合物和新合成中间体的制备方法。 更特定地， 本发明提供 了核苷， 其在具有式 2’ -O-C(H)(Z)-4’ 的核糖部分的 4’ 和 2’ 位之间具有桥， 以及由该核苷 制备的寡聚体和组合物。在优选的实施方案中， Z 具有可形成 (R) 或 (S) 异构体的特定构 型。在一些实施方案中， 本发明的寡聚化合物和组合物经设计与靶标 RNA 的部分杂交。在
     另一实施方案中， 本发明的寡聚化合物可用于设计适体， 该适体为能够在体内环境中结合 异常蛋白的寡聚化合物。
     本发明的双环核苷可用于增强整合了它们的寡聚化合物的所需性质。 本发明的寡 聚化合物还可用作诊断应用中的引物和探针。在优选的实施方案中， 本发明的 6- 修饰的双 环核苷具有如下显示的结构 ：
     一方面， 本发明提供了具有式 I 的双环核苷 ：
     其中 ：
     Bx 是杂环碱基部分 ；
     T1 是 H 或羟基保护基团 ；
     T2 是 H、 羟基保护基团或活性磷基团 ； 以及
     Z 是 C1-C6 烷基、 C2-C6 烯基、 C2-C6 炔基、 C1-C6 烷基茚基、 C3-C6 烯基茚基、 取代的 C1-C6 烷基、 取代的 C2-C6 烯基、 取代的 C2-C6 炔基、 取代的 C1-C6 烷基茚基、 取代的 C3-C6 烯基茚基、 酰基、 取代的酰基、 取代的酰胺、 硫醇、 或取代的硫。
     在一实施方案中， 各被取代的基团独立地被任选被保护的取代基单或多取代， 所 述取代基独立地选自卤素、 氧代、 羟基、 OJ1、 NJ1J2、 SJ1、 N3、 OC(=X)J1、 OC(=X)NJ1J2、 NJ3C(=X) NJ1J2 和 CN， 其中各 J1、 J2 和 J3 独立地为 H 或 C1-C6 烷基， X 是 O、 S 或 NJ1。
     在本发明的一方面中， 制备的双环核苷具有正交保护的活性基团并进一步包含活 性磷基团。该种双环核苷可用作寡聚体合成的单体。该种双环核苷单体的示范性例子具有 下式 ：
     其 中 由 虚 线 框 围 绕 的 基 团 是 可 变 的。 在 6 位 的 基 团 还 可 制 备 为 S 构 型 ( 注 意， 根 据 基 团 的 不 同 位 置， 对 R 和 S 的 指 定 可 因 之 而 变 化 )。 所 显 示 的 双 环 核 苷 单 体 一 般 被 称 为 二 甲 氧 基 三 苯 甲 基 亚 磷 酰 胺， 或 者 更 正 式 地 采 用 IUPAC 系 统 命 名 法 为 (1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 ( 二异丙基氨基 ) 膦酰基 ]-1-(4,4’ - 二甲氧基三苯 甲基氧甲基 )-3-( 尿嘧啶 -1- 基 )-6- 甲基 -2,5- 二氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷。
     本发明的 6- 修饰的双环核苷可用于在一个或多个位置修饰除此以外未经修饰的 寡聚化合物。该种修饰的寡聚化合物可描述为具有特定的基序。适用于本发明的基序包括 但不限于有间隙的基序、 半修饰 (hemimer) 基序、 阻断修饰 (blockmer) 基序、 全修饰基序、 定点修饰基序以及交替基序。 结合这些基序， 还可采用多种联接方式， 包括但不限于统一或 组合使用磷酸二酯和硫代磷酸酯联接。可简单优化 6- 修饰的双环核苷的定位和联接策略 的使用以针对特定靶标形成最佳活性。指导制备代表性基序的代表性美国专利包括但不 限 于， 5,013,830 ； 5,149,797 ； 5,220,007 ； 5,256,775 ； 5,366,878 ； 5,403,711 ； 5,491,133 ； 5,565,350 ； 5,623,065 ； 5,652,355 ； 5,652,356; 以及 5,700,922， 某些专利为与本申请共同 拥有的申请或专利， 其全文分别在此引用作为参考。基序还披露于 2005 年 6 月 2 日提交并 于 2005 年 12 月 22 日公布为 WO 2005/121371 的国际申请 PCT/US2005/019219 以及于 2005 年 6 月 2 日提交并于 2005 年 12 月 22 日公布为 WO 2005/121372 的 PCT/US2005/019220 ； 其全文分别在此引用作为参考。
     术语 “稳定的化合物” 和 “稳定的结构” 指具有足够稳固性可从反应混合物分离至 有用的纯度， 并制成有效的治疗剂的化合物。本发明仅预期稳定的化合物。
     此处描述的化合物中选定的取代基以递归度表示。 上下文中的 “递归取代基” 指一 个取代基可以引用其本身的另一实例。由于该种取代基的递归性， 理 论上， 在任意给定权 利要求中可出现大量取代基。 医药化学和有机化学领域的普通技术人员可理解该种取代基 的总数受到靶标化合物的预期属性的合理限定。该种属性包括， 例如但不限于， 分子量、 溶 解性或 log P 等物理属性， 靶向目的靶标的活性等应用属性， 以及合成容易度等操作属性。
     递归取代基为本发明的目标方面。 医药和有机化学领域的普通技术人员可以理解 这样的取代基的多功能性。在本发明的权利要求所示的递归取代基的程度下， 可根据上文 所述确定其总数。
     此处所用的术语 “烷基” 指含有最多二十四个碳原子的饱和直链或支链烃基。 烷基 基团的实例包括， 但不限于， 甲基、 乙基、 丙基、 丁基、 异丙基、 正己基、 辛基、 癸基、 十二烷基 等。烷基基团通常包含 1 至约 24 个碳原子， 更通常包含 1 至约 12 个碳原子 (C1-C12 烷基 )， 更优选包含 1 至约 6 个碳原子。此处所用的术语 “低级烷基” 包含 1 至约 6 个碳原子。此 处所用的烷基可任选地包含一个或多个进一步的取代基。
     此处所用的术语 “烯基” 指含有最多二十四个碳原子并至少具有一个碳 - 碳双 键的直链或支链烃基。烯基基团的实例包括， 但不限于， 乙烯基、 丙烯基、 丁烯基、 1- 甲 基 -2- 丁烯 -1- 基、 如 1,3- 丁二烯的二烯等。烯基基团通常包含 2 至约 24 个碳原子， 更通 常包含 2 至约 12 个碳原子， 更优选包含 2 至约 6 个碳原子。此处所用的烯基可任选地包含 一个或多个进一步的取代基。
     此处所用的术语 “炔基” 指含有最多二十四个碳原子并至少具有一个碳 - 碳三键 的直链或支链烃基。炔基基团的实例包括， 但不限于， 乙炔基、 1- 丙炔基、 1- 丁炔基等。炔 基基团通常包含 2 至约 24 个碳原子， 更通常包含 2 至约 12 个碳原子， 更优选包含 2 至约 6 个碳原子。此处所用的炔基可任选地包含一个或多个进一步的取代基。
     此处所用的术语 “氨烷基” 指氨基取代的烷基。该术语包括了在任何位置具有氨 基取代基的 C1-C12 烷基基团， 其中该烷基基团将氨烷基连接至母体分子。氨烷基基团的烷 基和 / 或氨基部分可以被取代基进一步取代。
     此处所用的术语 “脂肪族” 指最多包含二十四个碳原子的直链或支链烃基， 其中任 意两个碳原子之间的饱和度为单、 双或三键。脂肪族基团优选包含 1 至约 24 个碳原子， 更 通常包含 1 至约 12 个碳原子， 更优选包含 1 至约 6 个碳原子。脂肪族基团的直链或支链可 被包括氮、 氧、 硫和磷等的一个或多个杂原子所中断。 该种被杂原子中断的脂肪族基团包括 但不限于聚烷氧基， 例如聚亚烷基二醇、 聚胺和聚亚胺。 此处所用的脂肪族基团可任选地包 括其它取代基。
     术语 “脂环族的” 指环状的环系统， 其中该环为脂肪族环。该环系统可包含一个或 多个环， 其中至少一个环为脂肪族环。优选的脂肪环包括环中具有约 5 至约 9 个碳原子的 环。此处所用的脂肪环可任选地包括其它取代基团。
     此处所用的术语 “烷氧基” 指在烷基基团和氧原子之间形成的基， 其中该氧原子用 于连接烷氧基基团和母体分子。烷氧基基团的实例包括， 但不限于， 甲氧基、 乙氧基、 丙氧 基、 异丙氧基、 正丁氧基、 仲丁氧基、 叔丁氧基、 正戊氧基、 新戊氧基、 正己氧基等。此处所用 的烷氧基基团可任选地包括其它取代基团。
     此处所用的术语 “卤素” 指选自氟、 氯、 溴和碘的原子。
     此处所用的术语 “芳基” 和 “芳香族的” 指具有一个或多个芳环的单或多环碳环系 统的基团。芳基基团的例子包括， 但不限于， 苯基、 萘基、 四氢化萘基、 茚满基、 茚基等。优选 的芳基环系统在一个或多个环中具有约 5 至约 20 个碳原子。此处所用的芳基基团可任选 地包括其它取代基团。
     此处所用的术语 “芳烷基” 指在烷基基团和芳基基团之间形成的基， 其中该烷基基团可用于连接芳烷基基团和母体分子。例子包括， 但不限于， 苯甲基、 苯乙基等。此处所用 的芳烷基基团可任选地包括与烷基、 芳基或两者连接以形成基团的取代基。
     此处所用的术语 “杂环基” 指包括至少一个杂原子并且是不饱和、 部分饱和或完全 饱和的单或多环的环系统基团， 因而包括了杂芳基。 杂环还包括融合环系统， 其中一种或多 个融合环包含至少一个杂原子而其它环可包含一个或多个杂原子或任选地不包含杂原子。 杂环基团通常包括至少一个选自硫、 氮或氧的原子。杂环基团的实例包括， [1,3] 二恶茂 烷、 吡咯烷基、 吡唑啉基、 吡唑烷基、 咪唑啉基、 咪唑烷基、 哌啶基、 哌嗪基、 噁唑烷基、 异噁唑 烷基、 吗啉基、 四氢噻唑基、 异四氢噻唑基、 喹喔啉基、 哒嗪酮基、 四氢呋喃基等。 此处所用的 杂环基团可任选地包括其它取代基。
     此处所用的术语 “杂芳基” 和 “杂芳香族的” 指包含单或多环芳环、 环系统或融合环 系统的基， 其中至少一个环为芳环且包括一个或多个杂原子。杂芳基还包括例如融合环系 统， 其包含一个或多个不含杂原子的融合环的系统。 杂芳基通常包括选自硫、 氮或氧的一个 环原子。 杂芳基的例子包括， 但不限于， 吡啶基、 吡嗪基、 嘧啶基、 吡咯基、 吡唑基、 咪唑基、 噻 唑基、 噁唑基、 异噁唑基、 噻二唑基、 噁二唑基、 苯硫基、 呋喃基、 四氢喹啉基、 异四氢喹啉基、 苯并咪唑基、 苯并噁唑基、 喹喔啉基等。 杂芳基可直接或通过脂肪族基团或杂原子等连接部 分连接至母体分子。此处所用的杂芳基任选地包括其它取代基。
     此处所用的术语 “杂芳烷基” 指具有可将杂芳烷基基团连接至母体分子的烷基的 如前文定义的杂芳基。例子包括， 但不限于， 吡啶甲基、 嘧啶乙基、 萘啶基丙基等。此处所 用的杂芳烷基基团可在杂芳环或烷基部分的一个或两者上任选地包括其它取代基团。
     本发明中采用的术语 “单或多环结构” 包括具有融合或联接的环的单或多环的所 有环系统， 并包括独立选自脂肪族、 脂环族族、 芳基、 杂芳基、 芳烷基、 杂环、 杂芳基、 杂芳香 族、 杂芳烷基的单环和混合环系统。该种单或多环结构可包含一致或变化的饱和度 ( 包括 完全饱和、 部分饱和或完全不饱和 ) 的环。各个环可包含选自 C、 N、 O 和 S 的环原子以形成 杂环以及仅含有 C 环原子的环， 其可表示为混合基序， 例如， 苯并咪唑， 其中一个环仅具有 碳环原子而融合环具有两个氮原子。 单或多环结构可进一步被取代基取代， 例如， 具有连接 至其中一个环的两个 =O 基的邻苯二甲酰亚胺。在另一方面， 单或多环结构可直接通过环原 子， 通过取代基或双功能连接部分连接到母体分子。
     此处所用的术语 “酰基” 指从有机酸去除羟基基团并具有通式 -C(O)-X 的基团， 其 中 X 通常为脂肪族、 脂肪环族或芳香族。例子包括脂肪族羰基、 芳香羰基、 脂肪磺酰基、 芳香 亚磺酰基、 脂肪族亚磺酰基、 芳香磷酸酯、 脂肪族磷酸酯。此处所用的酰基基团可任选地包 括其它取代基。
     术语 “烃基” 包括包含 C、 O、 H 的基团。包括具有任意饱和度的直链、 支链和环状基 团。这样的烃基基团可包括一个或多个选自 N、 O 和 S 的杂原子并可进一步被一或多个取代 基单或多取代。
     此处所用的术语 “取代基” 包括通常添加至其它基团或母体化合物以增强所需性 质或产生所需效果的基团。取代基可以是保护的或未保护的， 并可添加至母体化合物的一 个或多个可能的位点。 取代基还可进一步被其它取代基所取代并且可以直接或通过联接基 团 ( 例如烷基或烃基基团 ) 连接至母体化合物。 该种基团包括但不限于卤素、 羟基、 烷基、 烯 基、 炔基、 酰基 (-C(O)Raa)、 羧基 (-C(O)O-Raa)、 脂肪族基团、 脂肪环族基团、 烷氧基、 取代的氧代 (-O-Raa)、 芳基、 芳烷基、 杂环基、 杂芳基、 杂芳烷基、 氨基 (-NRbbRcc)、 亚氨基 (=NRbb)、 氨 基 (-C(O)N-RbbRcc 或 -N(Rbb)C(O)Raa)、 叠氮基 (-N3)、 硝基 (-NO2)、 氰基 (-CN)、 脲基 (-OC(O) NRbbRcc 或 -N(Rbb)C(O)ORaa)、 脲 基 (-N(Rbb)C(O)NRbbRcc)、 硫 脲 基 (-N(Rbb)C(S)NRbbRcc)、 胍基 (-N(Rbb)C(=NRbb)NRbbRcc)、 amidinyl(-C(=NRbb)NRbbRcc 或 -N(Rbb)C(NRbb)Raa)、 硫醇 (-SRbb)、 亚 磺酰基 (-S(O)Rbb)、 磺酰基 (-S(O)2RH)、 磺酰氨基 (-S(O)2NRbbRcc 或 -N(RHbb)-S(O)2Rbb) 以及 共轭基团。其中 Raa、 Rbb 和 Rcc 分别独立为 H， 任选联接的化学功能基团或进一步的取代基， 其优选列表包括但不限于 H、 烷基、 烯基、 炔基、 脂肪族、 烷氧基、 酰基、 芳基、 芳烷基、 杂芳环、 脂环族、 杂环基和杂芳烷基。
     术语 “氧代” 指基团 (=O)。
     此 处 所 述 的 化 合 物 ( 例 如， 双 环 核 苷 ) 可 通 过 例 如， 如下文实施例所示的任 意有机合成的适用技术进行制备。众多该类技术已为本领域公知。多种已知技术列 举 于 Compendium of Organic Synthetic Methods(John Wiley&Sons,New York) 第 1 卷 ,Ian T.Harrison 和 Shuyen Harrison(1971); 第 2 卷 ,Ian T.Harrison 和 Shuyen Harrison(1974); 第 3 卷 ,Louis S.Hegedus 和 Leroy Wade(1977); 第 4 卷 ,Leroy G.Wade Jr.,(1980); 第 5 卷 ,Leroy G.Wade Jr.(1984); 和 第 6 卷 ,Michael B.Smith; 以 及 March,J.,Advanced Organic Chemistry, 第 3 版 ,John Wiley&Sons,New York(1985);Comprehensive Organic Synthesis.Selectivity,Strategy&Efficiency in Modern Organic Chemistry, 第 9 卷 中 ,Barry M.Trost 主 编 ,Pergamon Press,New York(1993);Advanced Organic Chemistry,Part B:Reactions and Synthesis, 第 4 版 ;Carey 和 Sundberg;Kluwer Academic/Plenum Publishers:New York(2001);Advanced Organic Chemistry, Reactions,Mechanisms,and Structure, 第 2 版 ,March,McGraw Hill(1977);Protecting Groups in Organic Synthesis, 第 2 版 ,Greene,T.W., 和 Wutz,P.G.M.,John Wiley &Sons,New York(1991); 以 及 Comprehensive Organic Transformations, 第 2 版 ,Larock,R.C.,John Wiley&Sons,New York(1999)。
     在本发明的一方面中， 寡聚化合物可通过共价连接一个或多个共轭基团进行修 饰。一般而言， 共轭基团可修饰所连接的寡聚化合物的一种或多种属性， 包括但不限于， 药 效动力学、 药代动力学、 结合、 吸收、 细胞分布、 细胞摄取、 储存和清除。 共轭基团常用于化学 领域并直接或通过任选联接部分或联接基团联接至诸如寡聚化合物等的母体化合物。 共轭 基团的优选列表包括但不限于， 嵌入剂、 报告分子、 多胺、 聚酰胺、 聚乙二醇、 硫醚、 聚醚、 胆 固醇、 硫胆固醇、 胆酸部分、 叶酸、 脂肪、 磷脂、 生物素、 吩嗪、 菲啶、 蒽醌、 金刚烷、 吖啶、 荧光 素、 若丹明、 香豆素和染料。
     如本领域技术人员所知的联接基团或双功能联接部分可适用于本发明。 联接基团 可用于将化学功能基团、 共轭基团、 报告基团和其它基团连接至如寡聚化合物等母体化合 物的选择性位点。一般而言， 双功能联接部分包含具有两个功能基团的烃部分。功能性基 团之一被选择用于结合母体分子或靶标化合物， 而另一基团被选择用于主要结合任意选定 基团， 例如化学功能性基团或共轭基团。在一些实施方案中， 该接头包含重复单元例如乙 二醇或氨基酸单元的链结构或寡聚体。在双功能联接部分中常用的功能基团的实例包括， 但不限于， 用于与亲核基团反应的亲电试剂以及用于与亲电基团反应的亲核试剂。在一些 实施方案中， 双功能联接部分包括氨基、 羟基、 羧酸、 硫醇、 不饱和性 ( 例如， 双或三键 ) 等。双功能联接部分的部分非限制性实例包括 8- 氨基 -3,6- 二氧杂辛酸 (ADO)、 琥珀酰亚胺 4-[N- 马来酰亚胺基甲基 ] 环己烷 -1- 羧酸 (SMCC) 以及 6- 氨基己酸 (AHEX 或 AHA)。其它 的联接基团包括但不限于， 取代的 C1-C10 烷基、 取代的或未取代的 C2-C10 烯基或取代的或未 取代的 C2-C10 炔基， 其中优选取代基的非限制性列表包括羟基、 氨基、 烷氧基、 羧基、 苯甲基、 苯基、 硝基、 硫醇、 硫烷氧基、 卤素、 烷基、 芳基、 烯基以及炔基。
     此处所用的术语 “保护性基团” 指如下所述的化学部分， 其在本领域中已知可针对 合成过程中不希望出现的反应来保护反应性基团 （包括但不限于羟基、 氨基和硫醇基等） 。 保护性基团通常可以选择性和 / 或正交采用以在其它活性位点的反应中保护位点， 并可 随后去除以留下不受保护的基团或供进一步反应。本领域已知的保护性基团一般描述于 Greene 和 Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis, 第 3 版 ,John Wiley&Sons,New York(1999)。
     基团可作为前体选择性地结合至本发明的寡聚化合物。例如氨基基团可作为叠 氮基团结合进本发明的化合物， 并可在合成中理想的时间点被化学转化为氨基基团。一般 来说， 基团可被保护或作为前体存在， 其对于修饰母体分子其它部位的反应呈现惰性， 以在 适当的时间转化成为其最终的基团。其它代表性保护或前体基团的讨论参见 Agrawal, 等 人 ,Protocols for Oligonucleotide Conjugates,Eds,Humana Press;New Jersey,1994; 第 26 卷， 第 1-72 页。 羟基保护基团的实例包括， 但不限于， 乙酰基、 叔丁基、 叔丁氧基甲基、 甲氧基甲 基、 四氢吡喃基、 1- 乙氧基乙基、 1-(2- 氯乙氧基 ) 乙基、 对氯苯基、 2,4- 二硝基苯基、 苯甲 基、 2,6- 二氯苯甲基、 二苯基甲基、 对硝基苯甲基、 二 (2- 乙酰氧基乙氧基 ) 甲基 (ACE)、 2- 三甲基硅烷基乙基、 三甲基硅烷基、 三乙基硅烷基、 叔丁基二甲基硅烷基、 叔丁基二苯基 硅烷基、 三苯甲基硅烷基、 [( 三异丙基硅烷基 ) 氧基 ] 甲基 (TOM)、 苯甲酰甲酸盐、 氯乙酰 基、 三氯乙酰基、 三 氟乙酰基、 特戊酰基、 苯甲酰基、 对苯基苯甲酰基、 9- 芴甲基碳酸盐、 甲 磺酸盐、 对甲苯磺酸盐、 三苯甲基 (trityl)、 单甲氧基三苯甲基、 二甲氧基三苯甲基 (DMT)、 三甲氧基三苯甲基、 1(2- 氟苯基 )-4- 甲氧基哌啶 -4- 基 (FPMP)、 9- 苯基黄嘌呤 -9- 基 (Pixyl) 以及 9-( 对甲氧基苯基 ) 黄嘌呤 -9- 基 (MOX)。 其中优选的羟基保护基团包括但不 限于， 苯甲基、 2,6- 二氯苯甲基、 叔丁基二甲基硅烷基、 叔丁基二苯基硅烷基、 苯甲酰基、 甲 磺酸盐、 对甲苯磺酸盐、 二甲氧基三苯甲基 (DMT)、 9- 苯基黄嘌呤 -9- 基 (Pixyl) 以及 9-( 对 甲氧基苯基 ) 黄嘌呤 -9- 基 (MOX)。
     氨基保护基团的实例包括但不限于， 氨基甲酸盐保护基团， 例如， 2- 三甲基硅烷基 乙氧基羰基 (Teoc)、 1- 甲基 -1-(4- 联苯基 )- 乙氧基羰基 (Bpoc)、 叔丁氧基羰基 (BOC)、 烯 丙氧基羰基 (Alloc)、 9- 芴甲基甲基氧基羰基 (Fmoc)、 以及苯甲基氧基羰基 (Cbz) ； 酰胺保 护基团， 例如甲酰基、 乙酰基、 三卤代乙酰基、 苯甲酰基、 以及硝基苯基乙酰基 ； 磺酰胺保护 基团， 例如 2- 硝基苯磺酰基 ； 以及亚胺和环状酰亚胺保护基团， 例如苯二甲酰亚胺和二硫 琥珀酰基。
     硫醇保护基团的实例包括， 但不限于， 三苯甲基 (trityl)、 苯甲基 (Bn) 等。
     在一些优选的实施方案中， 可以用任选被保护的含磷核苷间联接来连接核苷从而 制备寡聚化合物。含磷核苷间联接 ( 例如磷酸二酯和硫代磷酸酯联接 ) 的代表性保护基团 包括 β- 氰乙基、 二苯基硅烷基乙基、 δ- 氰丁烯基、 氰对二甲苯基 (CPX)、 N- 甲基 -N- 三氟
     乙酰乙基 (META)、 乙酰氧基苯氧基乙基 (APE) 以及丁烯 -4- 基基团。例如参见美国专利号 4,725,677 以 及 Re.34,069(β- 氰 乙 基 );Beaucage,S.L. 和 Iyer,R.P.,Tetrahedron,49 No.10, 第 1925-1963 页 (1993);Beaucage,S.L. 和 Iyer,R.P.,Tetrahedron,49 No.46, 第 10441-10488 页 (1993);Beaucage,S.L. 和 Iyer,R.P.,Tetrahedron,48 No.12, 第 2223-2311 页 (1992)。
     此处所用的术语 “正交保护” 指以不同类别的保护性基团保护的功能基团， 其中各 类保护性基团可以按任意顺序并在所有其它类别存在的情况下去除 ( 例如， Barany,G. 和 Merrifield,R.B.,J.Am.Chem.Soc,1977,99,7363;idem,1980,102,3084.)。正交保护已在 例如自动寡核苷酸合成等领域得到了广泛应用。 功能基团可在一种或多种不受去阻断过程 影响的其它被保护功能基团的存在下被去阻断。该被去阻断的功能基团以某种形式反应， 且在某一时间点另一正交保护性基团在一组不同反应条件下被去除。 这使得可以用选择性 化学法获得所需的化合物或寡聚化合物。
     本发明提供了具有可用于形成核苷间联接 ( 包括例如磷酸二酯和硫代磷酸酯核 苷间联接 ) 的活性磷基团的化合物。该种活性磷基团已为本领域所知并包含处于 PIII 或 PV 价态的磷原子， 包括但不限于亚磷酰胺、 H- 磷酸酯、 磷酸三酯和含磷手性助剂。优选的合成 III 的固相合成采用亚磷酰胺 (P 化学 ) 作为反应性亚磷酸。在优选的实施方案中， 中间体亚 v 磷酸化合物随后通过已知的方法被氧化至 P 状态以获得磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷酸间 联接。其它的活性磷酸酯和亚磷酸披露于 Tetrahedron Report Number 309(Beaucage 和 Iyer,Tetrahedron,1992,48,2223-2311)。
     可用于本发明的寡聚化合物的特定实例包括含有修饰的例如非天然的核苷间联 接的寡核苷酸。通过磷原子的存在或缺失可定义核苷间联接的两个主要类别。具有磷原子 的修饰的核苷间联接包括， 但不限于， 硫代磷酸酯、 手性硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯、 磷酸三 酯、 氨基烷基磷酸三酯、 甲基和其它烷基磷酸酯包括 3’ - 亚烃基磷酸酯、 5’ - 亚烃基磷酸酯 以及手性磷酸酯、 亚磷酸酯、 氨基磷酸酯包括 3’ - 氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、 硫羰基氨基磷酸酯、 硫羰基烷基磷酸酯， 硫羰基烷基磷酸三酯、 具有正常 3’ -5’ 键的硒代 磷 酸酯和硼代磷酸酯、 它们的 2’ -5’ 联接的类似物， 以及具有反转极性的硒代磷酸酯和硼代磷 酸酯， 其中一种或多种核苷酸间联接为 3’ 至 3’ 、 5’ 至 5’ 或 2’ 至 2’ 联接。具有反转极性 的寡核苷酸可在 3’ - 最末端核苷酸间联接包含单个 3’ 至 3’ 联接， 即， 可能是无碱基 ( 核苷 碱基缺失或该位置被羟基取代 ) 的单个反转核苷残基。可包括多种盐、 混合盐和游离酸的 形式。
     指 导 制 备 上 述 含 磷 联 接 的 代 表 性 美 国 专 利 包 括 但 不 限 于， 美国专利号 ： 3,687,808 ； 4,469,863 ； 4,476,301 ； 5,023,243 ； 5,177,196 ； 5,188,897 ； 5,264,423 ； 5,276,019 ； 5,278,302 ； 5,286,717 ； 5,321,131 ； 5,399,676 ； 5,405,939 ； 5,453,496 ； 5,455,233 ； 5,466,677 ； 5,476,925 ； 5,519,126 ； 5,536,821 ； 5,541,306 ； 5,550,111 ； 5,563,253 ； 5,571,799 ； 5,587,361 ； 5,194,599 ； 5,565,555 ； 5,527,899 ； 5,721,218 ； 5 ,672,697 以及 5,625,050， 其中某些专利为与本申请共同拥有的专利， 各专利全文在此引 用作为参考。
     不具有磷原子的修饰的核苷间联接包括但不限于， 由短链烷基或环烷基核苷间联 接、 混合杂原子和烷基或环烷基核苷间联接， 或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间联接构成的核苷间联接。 这包括具有硅氧烷骨架 ； 硫化物， 亚砜和砜骨架 ; 甲缩醛和硫甲缩醛 骨架 ; 亚甲基甲缩醛和硫甲缩醛骨架 ; 核糖乙酰骨架 ; 含烯烃骨架 ; 氨基磺酸盐骨架 ; 亚 甲基亚胺和亚甲基肼基骨架 ; 磺酸盐和磺酰胺骨架 ; 酰胺骨架 ; 和其它具有混合的 N， O， S 和 CH2 的组成部分的核苷间联接。
     指 导 制 备 上 述 寡 核 苷 酸 的 代 表 性 美 国 专 利 包 括 但 不 限 于， 美国专利号 ： 5,034,506 ； 5,166,315 ； 5,185,444 ； 5,214,134 ； 5,216,141 ； 5,235,033 ； 5,264,562 ； 5,264,564 ； 5,405,938 ； 5,434,257 ； 5,466,677 ； 5,470,967 ； 5,489,677 ； 5,541,307 ； 5,561,225 ； 5,596,086 ； 5,602,240 ； 5,610,289 ； 5,602,240 ； 5,608,046 ； 5,610,289 ； 5,618,704 ； 5,623,070 ； 5,663,312 ； 5,633,360 ； 5,677,437 ； 5,792,608 ； 5,646,269 以 及 5,677,439， 其中某些专利为与本申请共同拥有的专利， 各专利全文在此引用作为参考。
     此处描述的化合物包含一个或多个不对称中心， 并因此形成了对映体、 非对映 体以及其它立体异构形式， 其从绝对立体化学的角度可定义为 (R)- 或 (S)-、 α 或 β、 或 (D)- 或 (L)-（如氨基酸） 。本发明意在包括所有这些可能的异构体， 以及它们的外消 旋和光学纯形式。光学异构体可通过上述的过程由其相应的光学活性前体制备， 或通过 拆分外消旋混合物进行制备。该种拆分可在拆分剂的存在下， 通过色谱或重复结晶或本 领域技术人员已知的这些技术的组合进行。有关拆分进一步的细节可参见 Jacques, 等 人 ,Enantiomers,Racemates,and Resolutions(John Wiley&Sons,1981)。 当此处所述的化 合物包含烯烃双键、 其它不饱和性或其它几何不对称中心时， 除非另行指明， 该化合物意在 同时包括 E 和 Z 几何异构体或顺式 - 和反式 - 异构体。同样地， 同样意在包括所有的互变 异构形式。此处所示的任意碳 - 碳双键的构型仅为便利目的选择， 若非文中指明， 并非意在 指定特定的构型 ； 因此， 此处任意描述的碳 - 碳双键或碳 - 杂原子双键可以是顺式、 反式或 任意比例的两者的混合物。
     本发明的上下文中的术语 “寡聚化合物” 指具有至少一个能与核酸分子杂交的区 域的聚合物。术语 “寡聚化合物” 包括寡核苷酸、 寡核苷酸类似物和寡核苷以及核苷酸模拟 物和 / 或包含核酸和非核酸成分的混合聚合物。寡聚化合物通常可线性制备， 但可连接或 以其它方式制备成环状， 且还可包括分支。寡聚化合物可形成双链构建体， 例如， 杂交形成 双链组合物的双链。该双链组合物可连接或分离并可在末端包含悬端 (overhangs)。一般 而言， 寡聚化合物包含联接的单体亚基的骨架， 其中每个联接的单体亚基直接或间接地连 接至杂 环碱基部分。 寡聚化合物还可包括未联接至杂环碱基部分的单体亚基， 从而提供非 碱基位点。这些联接连接单体亚基、 糖部分或替代物， 且该杂环碱基部分可被独立修饰。包 括或不包括杂环碱基的联接 - 糖单元可被肽核酸单体等模拟物取代。在寡聚化合物的各个 位点修饰或取代部分或全部单体的能力可形成大量可能的基序。
     如本领域所知， 核苷是碱基 - 糖组合。核苷的碱基部分通常为杂环碱基部分。该 种杂环碱基最常见的两种类别为嘌呤和嘧啶。 核苷酸为进一步包括了共价联接至核苷糖部 分的磷酸基团的核苷。对于包含了呋喃戊糖的核苷， 该磷酸基团可被联接至糖的 2’ 、 3’ 或 5’ 羟基部分。在形成聚核苷酸时， 该磷酸基团共价联接彼此相邻的核苷以形成线性聚合化 合物。该线性聚合结构的相应末端可被连接以通过杂交或通过形成共价键得到环状结构， 然而， 通常希望开放的线性结构。 在寡核苷酸结构中， 磷酸基团通常形成寡核苷酸的核苷间 联接。RNA 和 DNA 的常见核苷间联接为 3’ 至 5’ 磷酸二酯联接。在本发明的上下文中， 术语 “寡核苷酸” 指核糖核酸 (RNA) 或脱氧核糖核酸 (DNA) 的寡聚体或聚合物。该术语包括由天然存在的核苷碱基、 糖和共价核苷间联接构成的寡核 苷酸。术语 “寡核苷酸类似物” 指具有一个或多个非天然存在部分的寡核苷酸。该种非天 然存在的寡核苷酸由于其具有理想的性质而通常比天然存在的形式更理想， 例如， 提高的 细胞摄取， 对核酸靶标增强的亲和力以及在核酸酶存在下提高的稳定性。
     在本发明的上下文中， 术语 “寡核苷” 指由不带磷原子的核苷间联接连接的核苷序 列。 该种类型的核苷间联接包括短链烷基、 环烷基、 混合杂原子烷基、 混合杂原子环烷基、 一 或多种短链杂原子以及一或多种短链杂环。这些核苷间联接包括， 但不限于， 硅氧烷、 硫化 物、 亚砜、 砜、 乙酰基、 甲缩醛、 硫 甲缩醛、 亚甲基甲缩醛、 硫甲缩醛、 烯基、 氨基磺酸盐、 亚甲 基亚胺基、 亚甲基肼基、 磺酸盐、 磺酰胺、 酰胺和其它具有混合的 N、 O、 S 和 CH2 的组成部分的 核苷间联接。
     指 导 制 备 上 述 寡 核 苷 酸 的 代 表 性 美 国 专 利 包 括 但 不 限 于， 美国专利号 ： 5,034,506 ； 5,166,315 ； 5,185,444 ； 5,214,134 ； 5,216,141 ； 5,235,033 ； 5,264,562 ； 5,264,564 ； 5,405,938 ； 5,434,257 ； 5,466,677 ； 5,470,967 ； 5,489,677 ； 5,541,307 ； 5,561,225 ； 5,596,086 ； 5,602,240 ； 5,610,289 ； 5,602,240 ； 5,608,046 ； 5,610,289 ； 5,618,704 ； 5,623,070 ； 5,663,312 ； 5,633,360 ； 5,677,437 ； 5,792,608 ； 5,646,269 以 及 5,677,439， 其中某些专利为与本申请共同拥有的专利， 各专利全文在此引用作为参考。
     此处所用的术语 “核苷碱基” 或 “杂环碱基部分” 意在与 “核酸碱基或其模拟物” 同 义。一般而言， 核苷碱基为含有一个或多个能与核酸碱基氢联接结合的原子或原子组合的 任意结构。
     此处所用的 “未修饰的” 或是 “天然的” 核苷碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤 (A) 和鸟嘌 呤 (G)， 以及嘧啶碱基胸腺嘧啶 (T)、 胞嘧啶 (C) 和尿嘧啶 (U)。 修饰的核苷碱基包括其它合 成的和天然的核苷碱基， 例如， 5- 甲基胞嘧啶 (5-me-C)、 5- 羟甲基胞嘧啶、 黄嘌呤、 次黄嘌 呤、 2- 氨基腺嘌呤、 腺嘌呤和鸟嘌呤的 6- 甲基和其它烷基衍生物、 腺嘌呤和鸟嘌呤的 2- 丙 基和其它烷基衍生物、 2- 硫代尿嘧啶、 2- 硫代胸腺嘧啶和 2- 硫代胞嘧啶、 5- 卤代尿嘧啶和 胞嘧啶、 5- 丙炔基 (-C ≡ C-CH3) 尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、 6- 偶氮 尿嘧啶、 胞嘧啶和胸腺嘧啶、 5- 尿嘧啶 ( 假尿嘧啶 )、 4- 硫代尿嘧啶、 8- 卤代、 8- 氨基、 8- 硫 醇、 8- 硫代烷基、 8- 羟基和其它 8- 取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、 5- 卤代特别是 5- 溴、 5- 三氟甲 基和其它 5- 取代的尿嘧啶和胞嘧啶、 7- 甲基鸟嘌呤和 7- 甲基腺 嘌呤、 2-F- 腺嘌呤、 2- 氨 基 - 腺嘌呤、 8- 氮杂鸟嘌呤和 8- 氮杂腺嘌呤、 7- 去氮鸟嘌呤和 7- 去氮腺嘌呤、 3- 去氮鸟 嘌呤和 3- 去氮腺嘌呤、 通用碱基、 疏水碱基、 混杂碱基、 大小扩增碱基以及此处定义的氟化 碱基。其它修饰的核苷碱基包括三环嘧啶如吩噁嗪胞啶 (1H- 嘧啶并 [5,4-b][1,4] 苯并 噁嗪 -2(3H)- 酮 )、 吩噻嗪胞啶 (1H- 嘧啶并 [5,4-b][l,4] 苯并噻嗪 -2(3H)- 酮 )、 G 型夹 (G-clamps) 例如取代的吩噁嗪胞啶 ( 例如 9-(2- 氨基乙氧基 )-H- 嘧啶并 [5,4-b][l,4] 苯并噁嗪 -2(3H)- 酮 )、 咔唑胞啶 (2H- 嘧啶并 [4,5-b] 吲哚 -2- 酮 )、 吡啶吲哚胞啶 (H- 吡 啶 [3’ ,2’ :4,5] 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -2- 酮 )。修饰的核苷碱基还可包括以其它杂环取 代嘌呤或嘧啶碱基的核苷碱基， 例如 7- 去氮 - 腺嘌呤、 7- 去氮鸟苷、 2- 氨基吡啶和 2- 吡 啶酮。其它的核苷碱基包括披露于美国专利 3,687,808 的核苷碱基， 披露于 The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 第 858-859 页 ,Kroschwitz,J.I. 编， John Wiley&Sons,1990 的 核 苷 碱 基 ；披 露 于 Englisch 等 人 ,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613 的核苷碱基 ； 以及披露于 Sanghvi,Y.S., 第 15 章 ,Antisense Research and Applications, 第 289-302 页 ,Crooke,S.T. 和 Lebleu,B. 编 ,CRC Press,1993 的核苷碱基。
     修饰的核苷碱基包括， 但不限于， 此处定义的通用碱基、 疏水碱基、 混杂碱基、 大小 扩增碱基以及氟化碱基。 这些核苷碱基中部分可特别用于提高本发明的寡聚化合物的结合 亲和力。这包括 5- 取代的嘧啶、 6- 氮杂嘧啶以及 N-2、 N-6 和 O-6 取代的嘌呤， 包括 2- 氨 基丙基腺嘌呤、 5- 丙炔基尿嘧啶和 5- 丙炔基胞嘧啶。5- 甲基胞嘧啶取代基已显示可以提 高核酸双链稳定性 0.6-1.2 ℃ (Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T. 和 Lebleu,B. 编 ,Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993, 第 276-278 页 ) 并且是目前优 选的碱基取代基， 特别是在与 2’ -O- 甲氧基乙基糖修饰组合时。
     指导制备某些上述提到的修饰核苷碱基以及其它修饰的核苷碱基的代表性美 国专利包括， 但不限于， 上述美国专利 3,687,808 以及美国专利 ： 4,845,205 ； 5,130,302 ； 5,134,066 ； 5,175,273 ； 5,367,066 ； 5,432,272 ； 5,457,187 ； 5,459,255 ； 5,484,908 ； 5,502,177 ； 5,525,711 ； 5,552,540 ； 5,587,469 ； 5,594,121 ； 5,596,091 ； 5,614,617 ； 5,645,985 ； 5,830,653 ； 5,763,588 ； 6,005,096 ； 以及 5,681,941， 其中某些专利为与本申请 共同拥有的专利， 各专利全文在此引用作为参考 ； 以及美国专利 5,750,692， 其为与本申请 共同拥有的专利， 并在此引用作为参考。
     本发明的寡聚化合物还可包含一种或多种具有修饰糖部分的核苷。 呋喃基糖环可 以多种方式修饰， 包括以取代基取代， 桥连形成 BNA 以及以 S 或 N(R) 等杂原子取代 4’ -O。 指导该种修饰糖的制备的部分代表性美国专利包括， 但不限于， 美国专利 ： 4,981,957 ； 5,118,800 ； 5,319,080 ； 5,359,044 ； 5,393,878 ； 5,446,137 ； 5,466,786 ； 5,514,785 ； 5,519,134 ； 5,567,811 ； 5,576,427 ； 5,591,722 ； 5,597,909 ； 5,610,300 ； 5,627,053 ； 5,639,873 ； 5,646,265 ； 5,658,873 ； 5,670,633 ； 5,792,747 ； 5,700,920 ； 6,600,032 以 及 于 2005 年 6 月 2 日提交并于 2005 年 12 月 22 日公布为 WO 2005/121371 的国际申请 PCT/ US2005/019219， 其中一部分为与本申请共同拥有的申请或专利， 各文献全文在此引用作为 参考。优选的修饰糖的代表性列表包括但不限于具有 2’ -F、 2’ -OCH2 或 2’ -O(CH2)2-OCH3 取 代基的取代糖 ； 4’ - 硫代修饰的糖以及双环修饰的糖。
     此处所用的术语 “核苷模拟物” 意在包括那些用于替换寡聚化合物的一个或多个 位点的糖或非联接的糖和碱基的结构， 例如， 具有吗啉或双环 [3.1.0] 己基糖模拟物 ( 例 如， 具有磷酸二酯联接的非呋喃糖 ) 的核苷模拟物。术语 “糖替代物” 与含义更广的术语 “核苷模拟物” 略微重叠， 但仅指糖单元 ( 呋喃糖环 ) 的替换。术语 “核苷酸模拟物” 意在 包括用于替换寡聚化合物的一个或多个位点 的核苷和联接的结构， 例如， 肽核酸或吗啉 ( 被 -N(H)-C(=O)-O- 或其它非 - 磷酸二酯联接的吗啉 )。
     如本发明所述的寡聚化合物可包含长度从约 8 至约 80 个的核苷和 / 或修饰核苷 或模拟物。本领域的普通技术人员将可理解本发明包含长度为 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79 或 80 个或其中任意范围的核苷和 / 或修饰核苷或模拟物的寡聚化合物。
     在另一实施方案中， 本发明的寡聚化合物为长度 8 至 40 个的核苷和 / 或修饰核苷 或模拟物。本领域普通技术人员将可理解其可具体为长度是 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39 或 40 个或 其中任意范围的核苷和 / 或修饰核苷或模拟物的寡聚化合物。
     在另一实施方案中， 本发明的寡聚化合物为长度 8 至 20 个的核苷和 / 或修饰核苷 或模拟物。本领域普通技术人员将可理解其可具体为长度是 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 或 20 个或其中任意范围的核苷和 / 或修饰核苷或模拟物的寡聚化合物。
     在另一实施方案中， 本发明的寡聚化合物为长度 10 至 16 个的核苷和 / 或修饰核 苷或模拟物。本领域普通技术人员将可理解其可具体为长度是 10、 11、 12、 13、 14、 15 或 16 或其中任意范围的核苷和 / 或修饰核苷或模拟物的寡聚化合物。
     在另一实施方案中， 本发明的寡聚化合物为长度 10 至 14 个的核苷和 / 或修饰核 苷或模拟物。本领域普通技术人员将可理解其可具体为长度是 10、 11、 12、 13 或 14 个或其 中任意范围的核苷和 / 或修饰核苷或模拟物的寡聚化合物。
     嵌合寡聚化合物在两个或多个位置具有不同的修饰的核苷并通常定义为具有基 序。 本发明的嵌合寡聚化合物可形成上述两个或多个寡核苷酸、 寡核苷酸类似物、 寡聚核苷 和 / 或寡核苷酸模拟物的复合结构。指导制备这样杂交结构的代表性美国专利包括， 但不 限 于， 美国专利： 5,013,830 ； 5,149,797 ； 5,220,007 ； 5,256,775 ； 5,366,878 ； 5,403,711 ； 5,491,133 ； 5,565,350 ； 5,623,065 ； 5,652,355 ； 5,652,356; 以 及 5,700,922， 其中某些专 利为与本申请共同拥有的专利， 各专利全文在此引用作为参考。
     本 发 明 的 一 方 面 中， 修饰和未修饰的核苷及其模拟物可参照文献描述的针 对 DNA(Protocols for Oligonucleotides and Analogs,Ed.Agrawal(1993),Humana Press) 和 / 或 RNA(Scaringe,Methods(2001),23,206-217;Gait 等 人 ,Applications of Chemically synthesized RNA in RNA:Protein Interactions,Ed. Smith(1998),1-36;Gallo 等 人 ,Tetrahedron(2001),57,5707-5713) 合 成 的 适 当 方 法 进行寡聚。固相合成的其它方法可参见 Caruthers 的美国专利 4,415,732 ； 4,458,066 ； 4,500,707 ； 4,668,777 ； 4,973,679; 和 5,132,418 ； 以及 Koster 的美国专利 4,725,677 和 Re.34,069。
     常规用于基于支持基质合成寡聚化合物和相关化合物的的商业可获取设备已由 多家供应商出售， 包括， 例如 Applied Biosystems(Foster City,CA)。 本领域已知的任何其 它该类合成方法均可另外或替代性采用。适用的固相技术 ( 包括自动合成技术 ) 的描述可 见 F.Eckstein( 编 ),Oligonucleotides and Analogues,a Practical Approach,Oxford University Press,New York(1991)。
     随着对 RNAi 投入的增加， RNA 和相关类似物的合成相对于 DNA 和相关类似物的合 成也逐渐增加。 目前在商业上采用的初级 RNA 合成策略包括 5’ -O-DMT-2’ -O- 叔丁基二甲基 硅烷基 (TBDMS)、 5’ -O-DMT-2’ -O-[1(2- 氟苯基 )-4- 甲氧基哌啶 -4- 基 ](FPMP)、 2’ -O-[( 三 异丙基硅烷基 ) 氧基 ] 甲基 (2’ -O-CH2-O-Si(iPr)3(TOM)、 以及 5’ -O- 硅醚 -2’ -ACE(5’ -O- 二 ( 三甲基硅氧基 ) 环十二烷氧基硅醚 (DOD)-2’ -O- 二 (2- 乙酰氧基乙氧基 ) 甲基 (ACE)。 目前提供 RNA 产品的主要的公司包括 Pierce Nucleic Acid Technologies、 DharmaconResearch 公 司、 Ameri Biotechnologies 公 司 和 Integrated DNA Technologies 公 司。 Princeton Separations 公司正在推广 RNA 合成活化剂， 该活化剂据宣传可以特别针对 TOM 和 TBDMS 化学法减少偶合次数。该种活化剂也适用于本发明。
     用于商业 RNA 合成的初级基团为 ：
     TBDMS=5’ -O-DMT-2’ -O- 叔丁基二甲基硅烷基 ；
     TOM=2’ -O-[( 三异丙基硅烷基 ) 氧基 ] 甲基 ；
     DOD/ACE=(5’ -O- 二 ( 三甲基硅氧基 ) 环十二烷氧基硅醚 -2’ -O- 二 (2- 乙酰氧基 乙氧基 ) 甲基
     FPMP=5’ -O-DMT-2’ -O-[1(2- 氟苯基 )-4- 甲氧基哌啶 -4- 基 ]。
     所有前述的 RNA 合成策略均适用于本发明。上述策略的混合 ( 例如， 采用一种策 略中的 5’ - 保护基团和另一策略中的 2’ -O- 保护基团 ) 通常可根据本发明而调整。
     在本发明的上下文中， “杂交” 指寡聚化合物互补链的配对。在本发明中， 一种配 对机制涉及寡聚化合物链的互补核苷或核苷酸碱基 ( 核苷碱基 ) 之间的氢键结合， 其可以 是 Watson-Crick、 Hoogsteen 或反向 Hoogsteen 氢键结合。 例如， 腺嘌呤和胸腺嘧啶为通 过形成氢键进行配对的互补核苷碱基。杂交可在多种条件下进行。 当寡聚化合物与靶标核酸的结合干扰靶标核酸的正常功能引起活性损失， 且当具 有足够程度的互补性以在希望产生特定结合的条件下 ( 即， 在体内测定或治疗时在生理条 件下， 以及在进行体外测定时在测定条件下 ) 避免寡聚化合物和非靶标核酸序列的非特异 性结合时， 寡聚化合物具有特异可杂交性。
     此处所用的 “互补性” 指两个核苷碱基无论其所在位置精确配对的能力。例如， 如 果在寡聚化合物某位置的核苷碱基能够与靶标核酸 ( 该靶标核酸为 DNA、 RNA 或寡核苷酸分 子 ) 某位置的核苷碱基氢键结合， 则寡核苷酸和靶标核酸之间的氢键结合的位置被认为是 互补性位置。当各分子中的互补性位置被可以彼此以氢键结合的核苷碱基占据时， 该寡聚 化合物和该 DNA、 RNA 或寡核苷酸分子彼此具有互补性。术语 “特异可杂交性” 和 “互补性” 是用于表示足够数量的核苷碱基中有足够精确的配对或互补程度、 由此在寡核苷酸和靶标 核酸之间形成稳定和特异性结合的术语。
     在本领域中可以理解寡聚化合物的序列不需要对其靶标核酸具有 100% 的互补性 以达到特异可杂交性。此外， 寡核苷酸可在一个或多个片段上杂交从而使中间的或邻近的 片段不参与杂交 ( 例如， 环结构或发夹结构 )。本发明的寡聚化合物对其靶向的靶标核酸 序列中的靶标区域具有至少约 70%、 至少约 80%、 至少约 90%、 至少约 95% 或至少约 99% 的序 因而该寡聚化合 列互补性。例如， 当寡聚化合物中 20 个核苷中有 18 个与靶标区域互补， 物具有特异杂交性， 则该寡聚化合物具有 90% 互补性。在该实例中， 剩余的非互补性核苷 碱基可以成簇或散布在互补性核苷碱基中， 不需要彼此邻近或与互补性核苷碱基邻近。同 样地， 具有 4( 四 ) 个非互补性核苷碱基 ( 其侧翼连接两个与靶标 核酸完全互补的区域 ) 的长度为 18 个核苷碱基的寡聚化合物对靶标核酸具有 77.8% 的总体互补性， 并因此在本 发明的范围之内。寡聚化合物与靶标核酸区域的互补性百分比可通过本领域已知的 BLAST 程序 ( 基本局部比对搜索工具 ) 和 PowerBLAST 程序常规测定 (Altschul 等人 ,J.Mol. Biol.,1990,215,403-410;Zhang 和 Madden,Genome Res.,1997,7,649-656)。
     本发明进一步包括了如反义寡聚化合物、 反义寡核苷酸、 核酶、 外部指导序列
     (EGS) 寡核苷酸、 选择性剪切体、 引物、 探针等寡聚化合物， 以及与靶标核酸的至少一个部分 杂交的其它寡聚化合物。因此， 这些寡聚化合物可以以单链、 双链、 环状或发夹寡聚化合物 的形式引入， 并可包含例如内部或末端突起或环的结构元件。本发明的寡聚化合物在引入 系统后可引发一种或多种酶或结构蛋白的作用以实现对靶标核酸的修饰。
     该种酶的非限制性实例之一为 RNA 酶 H， 一种裂解 RNA:DNA 双链的 RNA 链的细胞内 切酶。本领域已知 “类 DNA” 单链寡聚化合物引发 RNA 酶 H。RNA 酶 H 的激活可导致 RNA 靶 标的裂解， 从而大大增强寡核苷酸 - 介导的基因表达抑制的效率。其它的核糖核酸酶 ( 例 如属于 RNA 酶 III 和核糖核酸酶 L 酶家族的核糖核酸酶 ) 也假定具有类似的作用。
     尽管寡聚化合物的一种形式为单链反义寡核苷酸， 在许多物种中已显示引入双链 结构 ( 例如双链 RNA(dsRNA) 分子 ) 可以导致基因或其相关基因产物功能的强效和特异性 反义介导的减少。该现象同时存在于植物和动物， 并被认为与病毒防御和转座子沉默具有 进化联系。
     在一些实施方案中， 在筛选可以调节所选定蛋白表达的其它寡聚化合物中可采用 “适当的靶标片段” 。 “调节剂” 为降低或提高编码蛋白的核酸分子表达、 并且至少包含与适 当靶标片段互补的 8- 核苷碱基部分的寡聚化合物。该 筛选方法包括将编码蛋白的核酸分 子的适当靶标片段与一种或多种候选调节剂接触， 并选择一种或多种提高或降低编码蛋白 的核酸分子表达的候选调节剂的步骤。 一旦显示候选调节剂能够调节 ( 例如， 提高或降低 ) 编码肽的核酸分子表达， 该调节剂可进一步用于肽功能的研究， 或如本发明所述用作研究、 诊断或治疗剂。
     本发明的适当靶标片段还可与其相应的本发明互补性反义寡聚化合物组合 形成稳定的双链寡核苷酸。本领域已显示该种双链寡核苷酸部分可通过反义机制调 节靶标表达并调节翻译和 RNA 加工。此外， 对该双链部分还可进行化学修饰 (Fire 等 人 ,Nature,1998,391,806-811;Timmons 和 Fire,Nature 1998,395,854;Timmons 等 人 ,Gene,2001,263,103-112;Tabara 等 人 ,Science,1998,282,430-431;Montgom ery 等 人 ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998,95,15502-15507;Tuschl 等 人 ,Genes Dev.,1999,13,3191-3197;Elbashir 等 人 ,Nature,2001,411,494-498;Elbashir 等 人 ,Genes Dev.2001,15,188-200)。 例 如， 这种双链部分已显示可通过双链的 反 义 链 与 靶 标 进 行 经 典 杂 交 从 而 引 发 靶 标 的 酶 降 解 来 抑 制 靶 标 (Tijsterman 等 人 ,Science,2002,295,694-697)。
     本发明的寡聚化合物还可用于药物开发和靶标确证领域。本发明包含了在药物 开发中使用本发明的寡聚化合物和靶标以阐明蛋白和疾病状态、 表型或症状之间存在的关 系。这些方法包括检测或调节靶标肽， 包括将样本、 组织、 细胞或生物体与本发明的寡聚化 合物接触， 在处理后一定时间检测靶标核酸或蛋白水平和 / 或相关的表型或化学终点， 并 任选地将测量值与未处理样本或以本发明其它寡聚化合物处理的样本进行比较。 这些方法 可以平行进行或与其它实验组合进行， 以确定靶标确证过程中未知基因的功能， 或者测定 特定基因产物作为治疗或预防特定疾病、 症状或表型的靶标的有效性。
     核 苷 修 饰 对 RNAi 活 性 的 作 用 参 照 现 有 文 献 进 行 了 评 估 (Elbashir 等 人 ,Na ture(2001),411,494-498;Nishikura 等 人 ,Cell(2001),107,415-416; 以 及 Bass 等 人 ,Cell(2000),101,235-238)。本发明的寡聚化合物可用于诊断、 治疗、 预防， 并可作为研究试剂和试剂盒。 此外， 能特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸也常被本领域的普通技术人员用来阐明特定基因 的功能或区分生物通路各种组分的功能。
     对于试剂盒或诊断应用， 单独或与其它寡聚化合物或治疗剂联合使用的本发明寡 聚化合物可用作差异性和 / 或组合分析的工具， 以阐明在细胞和组织内表达的基因的部分 或完整互补体的表达模式。
     作为一个非限制性实例， 以一种或多种寡聚化合物处理的细胞或组织的表达模式 可与未以寡聚化合物处理的对照细胞或组织进行比较， 并分析各模式基因表达的差异水 平， 它们与例如疾病关联性、 信号转导途径、 细胞定位、 以及所检测基因的表达水平、 大小、 结构或功能有关。这些分析可在影响表达模式的其它化合物和 / 或寡聚化合物存在或不存 在的情况下对刺激或未刺激细胞进行。
     本 领 域 已 知 的 基 因 表 达 分 析 方 法 的 实 例 包 括 DNA 阵 列 或 微 阵 列 (Brazma 和 Vilo,FEBS Lett.,2000,480,17-24;Celis 等人 ,FEBS Lett.,2000,480,2-16)、 SAGE( 基因 表达系列分析 )(Madden 等人 ,Drug Discov.Today,2000,5,415-425)、 READS( 消化的 cDNA 的限制性酶扩增 )(Prashar 和 Weissman,Methods Enzymol.,1999,303,258-72)、 TOGA( 总 基 因 表 达 分 析 )(Sutcliffe 等 人 ,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,1976-81)、 蛋 白 阵 列 和 蛋 白 组 学 (Celis 等 人 ,FEBS Lett.,2000,480,2-16;Jungblut 等 人 ,Electrophoresis,1999,20,2100-10)、 表 达 序 列 标 记 (EST) 序 列 (Celis 等 人 ,FEBS Lett.,2000,480,2-16; Larsson 等 人 ,J.Biotechnol.,2000,80,143-57)、 消 减 RNA 指 纹 (SuRF)(Fuchs 等 人 ,Anal.Biochem.,2000,286,91-98;Larson 等 人 ,Cytometry,2000,41,203-208)、 消减克隆、 差异展示 (DD)(Jurecic 和 Belmont,Curr. Opin.Microbiol.,2000,3,316-21)、 比 较 基 因 组 杂 交 (Carulli 等 人 ,J.Cell Biochem. Suppl.,1998,31,286-96)、 FISH( 荧 光 原 位 杂 交 ) 技 术 (Going 和 Gusterson,Eur. J.Cancer,1999,35,1895-904) 以 及 质 谱 方 法 (To,Comb.Chem.High Throughput Screen,2000,3,235-41)。
     本发明的寡聚化合物可用于研究和诊断， 因为这些寡聚化合物可与编码蛋白的核 酸杂交。例如， 可在此处披露的条件下以在此披露的效率杂交从而成为有效蛋白抑制剂的 寡核苷酸将在有利于基因扩增或检测的条件下分别作为有效的引物或探针。 这些引物和探 针可用于需要特异性检测编码蛋白的核酸分子的方法， 并可用于核酸分子扩增以供检测或 在进一步研究中使用。本发明的反义寡核苷酸， 特别是引物和探针与核酸的杂交可通过本 领域已知的方法进行检测。该种方法可包括将酶偶联至寡核苷酸， 对该寡核苷酸放射性标 记或任何其它适用的检测方法。 还可制备使用这些检测手段检测样本中选定蛋白水平的试 剂盒。
     本发明已根据其一些实施方案进行了具体描述， 以下实施例仅用于阐述本发明， 并非意在对其进行限制。
     实施例 1
     尿苷 6-(R)- 甲基 BNA 亚磷酰胺 ,(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 ( 二异丙基 氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ - 二甲氧三苯甲基氧基甲基 )-3-( 尿嘧啶 -1- 基 )-6- 甲基 -2,5- 二 氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷 (15) 的制备示 意 结 构 流 程 1(a)TBSCl,Et3N,DMAP,CH2Cl2, 室 温 ,16 小 时 , 来 自 3 的 产 率 为 59%;(b)Swern 氧 化 (c)MeMgBr,CeCl3,THF,-78 ℃，来 自 3 的 产 率 为 80%;(d) MsCl,Et3N,DMAP,CH2Cl2, 室 温 ,16 小 时 ,91%;(e)AcOH,Ac2O,H2SO4, 室 温 ,16 小 时 ,88%;(f) 尿 嘧 啶 ,BSA,TMSOTf,CH3CN, 回 流 ,2 小 时 ;(g)K2CO3,MeOH, 室 温 ,16 小 时 ;(h)TBDPSCI,Et3N,DMAP,CH2Cl2, 室 温 ,16 小 时 , 来 自 8 的 产 率 为 79%;(i) BCl3,CH2Cl2,-15℃ ,60%;(j)Et3N.3HF,Et3N,THF, 室温 ,16 小时 ;(k)DMTCl, 嘧啶 , 室温 ,16 小时 , 来自 12 的产率为 89%;(l)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 四唑 ,NMI,DMF。
     A)5-O-( 叔 丁 基 二 甲 基 硅 烷 基 )-3-O- 苯 甲 基 -1,2-O- 异 亚 丙 基 -4-C- 羟 甲 基 -α-D- 赤式 - 戊呋喃糖 (3)
     通过加料漏斗在 10 分钟内向含有二醇 2(12g,38.8mmol, 参照 Mo ffatt 等人 ,J.
     Org.Chem.1979,44,1301, 参考 1 的方法进行制备 )、 三乙胺 (11.44mL,81.5mmol) 以及 4- 二 甲基氨乙基嘧啶 (0.47g,3.9mmol) 的 CH2Cl2(184mL) 冷 (0℃ ) 溶液中添加叔丁基二甲基硅 烷基氯 (6.24g,40.7mmol) 的二氯甲烷 (10mL) 溶液。添加完成后， 将反应逐渐加热至室温， 并继续搅拌 16 小时。用 CH2Cl2 稀释反应物， 依次以 5%HCl 水溶液、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 10% 至 30% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化产生白 色固体的醇 3(11.53g,59%) 和醇 4(3.93g,22%)。
     B) 醇 (6)
     将二甲基亚砜 (3.36mL,47.5mmol) 逐滴加入含有草酰氯 (2.08mL,23.7mmol) 的 CH2Cl2 冷 (-78℃ ) 溶液 (130mL)。搅拌 30 分钟后， 向反应中添加醇 3(6.7g,15.8mmol) 的 CH2Cl2 溶液 (20mL)。 在 -78℃继续搅拌 45 分钟并向反应中添加三乙胺 (10.0mL,71.2mmol)。 在 -78℃下将反应物搅拌 15 分钟， 随后取走冰浴， 并在 45 分钟内对反应物逐渐加温。然后 将反应物倒入 CH2Cl2 中， 有机相先后以 5%HCl 水溶液、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩以提供醛 5， 其在不作进一步纯化下使用。
     将氯化铈 III(5.84g,23.7mmol) 的 THF(130mL) 悬浮液在室温下搅拌 90 分钟。在 冰浴中冷却反应物， 在 5 分钟内添加甲基溴化镁 (17.0mL 的 1M 甲基溴化镁的 THF 溶液 )， 继续搅拌 90 分钟。将含有粗制醛 5( 由前面获得 ) 的 THF(20mL) 加入反应物中。继续搅拌 90 分钟后， 以饱和 NH4Cl 溶液淬灭反应并将反应物倒入 EtOAc。依次以 5%HCl 水溶液、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机层， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 15% 的 EtOAc/ 己烷 洗脱 ) 纯化提供醇 6(5.52g, 来自 3 的产率为 80%)。
     C) 甲磺酸 (7)
     向 含 有 醇 6(2.77g,6.4mmol)、 三 乙 胺 (1.1mL,7.7mmol) 和 4- 二 甲 基 氨 基 嘧 啶 (84mg,0.7mmol) 的 CH2Cl2(14mL) 冰 (0℃ ) 溶液添加甲烷磺酰氯 (0.55mL,7.0mmol)。室温 搅拌 1 小时后， 将反应物倒入 CHCl3， 有机层依次以 5%HCl 水溶液、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 15% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供甲磺酸 7(2.97g,91%)。
     D) 三乙酸酯 (8)
     将 浓 H2SO4(3 滴 ) 加 入 甲 磺 酸 7(2.97g,5.8mmol) 的 冰 醋 酸 (29mL) 和 乙 酸 酐 (5.8mL) 溶液。室温搅拌 1 小时后， 将反应物倒入 EtOAc， 有机层依次以水、 饱和 NaHCO3、 盐 水洗涤， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 33% 至 50% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化 1 提供三乙酸酯 8(2.48g,88%)。 H NMR(CDCl3,β 异头体 ):δ7.39-7.30(m,5H),6.23(s,1H) ,5.37(d,1H),5.19(q,1H),4.62(d,1H),4.52(d,1H),4.38(s,1H),4.34(d,1H),3.98(d,1H) ,2.91(s,3H),2.12(s,3H),2.08(s,3H),2.06(s,3H),1.55(d,3H)。LCMS ： 保留时间 1.35 分 钟； M+23 计算值 511.1， 实测值 511.0。
     E) 核苷 (11)
     向三乙酸酯 8(2.47g,5.0mmol) 和尿嘧啶 (0.70g,6.3mmol) 的 CH3CN(15mL) 悬浮 液添加 N,O- 二 ( 三甲基硅烷基 ) 乙酰胺 (4.9mL,20.0mmol)。在 40℃下加热 15 分钟以获 得澄清溶液， 向反应中添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸盐 (1.18mL,6.5mmol)。回流 2 小时 后， 将反应冷却至室温并倒入 EtOAc。以饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机层， 干燥 (Na2SO4) 并真 空浓缩以提供粗制核苷 9， 其可在不作任何纯化下使用。向核苷 9( 由前面获得 ) 的 MeOH(50mL) 溶液添加 K2CO3(2.07g,15mmol)。在室温 下搅拌 16 小时后， 真空去除溶剂并在 25% 嘧啶 /EtOAc 和盐水中分配残留物。收集有机相， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩提供 10， 其在不作进一步纯化下使用。1H NMR(MeOD) ： δ7.74(d, 2H),7.29-7.14(m,5H),5.53(d,1H),5.38(s,1H),4.48(s,2H),4.18(s,1H),4.14(sm,1H),3. 92(s,1H),3.66(s,2H),1.08(d,3H)。LCMS ： 保留时间 2.40 分钟 ； M+H 计算值 360.1， 实测值 361.0。
     向 核 苷 10( 由 前 面 获 得 )、 三 乙 胺 (1.4mL,10.0mmol) 和 4- 二 甲 基 氨 基 嘧 啶 (80mg,0.7mmol) 的 CH2Cl2(9mL) 冰 (0 ℃ ) 溶 液 中 添 加 叔 丁 基 二 苯 基 硅 烷 基 氯 (1.73mL,6.7mmol)。室温搅拌 16 小时后， 将反应物倒入 EtOAc， 依次以 5%HCl 水溶液、 饱和 NaHCO3 洗涤有机相， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 50% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供白色固体的核苷 11(2.02g, 来自 8 的产率为 79%)。
     F) 核苷 (12)
     将 三 氯 化 硼 (1M 三 氯 化 硼 的 16.7mL CH2Cl2 溶 液 ) 小 心 加 入 核 苷 11(2.0g,3.3mmol) 的 CH2Cl2(40mL) 冷 (-15 ℃ ) 溶液。在 -15 ℃下搅拌 1 小时后， 将反应 物冷却至 -78℃并通过添加 MeOH/CH2Cl2(1:1,10mL) 小心淬灭反应。继续搅拌 10 分钟后， 将反应物倒入 CH2Cl2， 依次以 5%HCl 水溶液、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机相， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 50% 至 80% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供白色固体的核苷 12(1.02g,60%)。
     G) 核苷 (13)
     在 聚 丙 烯 管 中 向 核 苷 12(1.86g,3.7mmol) 和 三 乙 胺 (1.03mL,7.3mmol) 的 THF(36mL) 溶液中添加三乙胺三氢氟酸盐 (2.98mL,18.3mmol)。室温搅拌 16 小时后， 真 空浓缩反应物并将残留物溶解于 EtOAc。依次以水、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机相， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 15% 的 MeOH/CHCl3 洗脱 ) 纯化提供白色固体核苷 13(1.31g， 产物中掺杂了三乙胺 )。
     H) 核苷 (14)
     向核苷 13( 由前面获得 ) 的嘧啶 (18mL) 溶液添加 4,4’ - 二甲氧基三苯甲基氯 (DMTCl)(1.23g,3.7mmol)。室温搅拌 16 小时后， 向反应添加额外的 DMTCl(0.12g)， 继续搅 拌 8 小时。然后将反应物倒入 EtOAc， 随后以盐水萃取有机相， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱 层析 (SiO2， 以 15% 的丙酮 /CHCl3 洗脱 ) 纯化提供白色泡沫状的核苷 14(1.85g,89%)。1H δ8.03(d,1H),7.44-2.28(m,14H),6.86(d,4H),5.63(d,1H),5.60(s,1H),4.3 NMR(CDCl3) ： 2(m,1H),4.13(s,1H),3.81(s,6H),3.49(d,1H),3.37(d,1H),1.18(d,3H)。
     I) 亚 磷 酰 胺 ,(1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2- 氰 基 乙 氧 基 -( 二 异 丙 基 氨 基 ) 膦 氧 基 ]-1-(4,4’ - 二甲氧三苯甲基氧基甲基 )-3-( 尿嘧啶 -1- 基 )-6- 甲基 -2,5- 二氧杂 - 双 环 [2.2.1] 庚烷 (15) 的制备
     将 2- 氰 乙 基 四 异 丙 基 亚 磷 二 酰 胺 (0.69mL,2.2mmol) 加 入 核 苷 14(0.83g,1.4mmol)、 四 唑 (80mg,1.2mmol) 和 N- 甲 基 咪 唑 (29μL,0.36mmol) 的 DMF(7.2mL) 溶液中。 室温搅拌 8 小时后， 将反应物倒入 EtOAc， 依次以 90% 盐水、 盐水洗涤有 机层， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。将残留物溶解于最少量的 EtOAc 中， 将该溶液添加至己烷中。 收集所得的沉淀物， 进一步通过柱层析 (SiO2， 以 66% 至 75% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供白色固体亚磷酰胺 15(1.04g,94%)。31PNMR(CDCl3)δ:149.21,149.79。
     实施例 2
     尿苷 N-Bz- 胞嘧啶 -6-(R)- 甲基 BNA 亚磷酰胺 ,(1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2- 氰基乙 氧基 -( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ - 二甲氧三苯甲基氧基甲基 )-3-(4-N- 苯甲酰胞 嘧啶 -1- 基 )-6- 甲基 -2,5- 二氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷 (21) 的制备
     示 意 结 构 流 程 2(a)TBSCI, 咪 唑 ,DMF, 室 温 ,16 小 时， 99%;(b)POCl3,1,2,4- 三 唑 ,Et3N,CH3CN, 室温 ,4 小时 ;(c)NH3 水溶液 ,1,4- 二恶烷 , 室温 ,16 小时 ;(d)Bz2O,DMF, 室 温 ,16 小 时 , 来 自 15 的 产 率 为 90%;(e)Et3N.3HF,Et3N,THF, 室 温 ,16 小 时 ,93%;(f) CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 四唑 ,NMI,DMF,95%。
     A) 核苷 (16)
     将叔丁基二甲基硅烷基氯 (0.79g,5.2mmol) 添加至核苷 14(1.0g,1.7mmol) 和咪 唑 (0.70g,10.4mmol) 的 DMF(3.5mL) 溶液。室温搅拌 16 小时后， 将反应物倒入 EtOAc， 以盐 水萃取有机相， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 50% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化 提供白色固体的核苷 16(1.17g,99%)。
     B) 核苷 (19)
     将 三 氯 氧 磷 (1.27mL,13.6mmol) 添 加 至 1,2,4- 三 唑 (4.0g,58.0mmol) 的 CH3CN(21mL) 冷 (0℃ ) 悬浮液中。 搅拌 15 分钟后， 向反应中添加三乙胺 (9.57 mL,68mmol)， 继续搅拌 30 分钟。在 0℃下向反应中添加核苷 16(1.17g,1.7mmol) 的 CH3CN(10mL) 溶液。 搅拌 10 分钟后， 去除冰浴并在室温下搅拌反应物 4 小时。真空去除溶剂， 在 EtOAc 和水之 间分配残留物。 然后以饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机层， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩以提供粗产 物 17， 其可在不作任何纯化下使用。
     将氨水 (4mL) 添加至核苷 17( 由前面获得 ) 的二恶烷 (20mL) 溶液中。在室温下 搅拌 16 小时， 真空浓缩反应物并在高度真空下干燥 8 小时以提供核苷 18， 其可在不作任何
     纯化下使用。
     向核苷 18( 由前面获得 ) 的 DMF(3mL) 溶液添加苯甲酸酐 (0.65g,2.9mmol)。室 温搅拌 16 小时后， 将反应物倒入 EtOAc， 以饱和 NaHCO3、 盐水萃取有机相， 干燥 (Na2SO4) 并 真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 50% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供白色固体的核苷 19(1.2g, 来自 16 的产率为 90%)。
     C) 核苷 (20)
     在 聚 丙 烯 管 中 向 核 苷 19(1.86g,3.7mmol) 和 三 乙 胺 (1.03mL,7.3mmol) 的 THF(15mL) 溶液添加三乙胺三氢氟酸盐 (1.48mL,9.1mmol)。室温下搅拌 16 小时后， 真空浓 缩反应物并将残留物溶解于 EtOAc， 依次以水、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机相， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。 柱层析 (SiO2， 以 5%MeOH/CHCl3 洗脱 ) 纯化提供白色固体核苷 20(0.91g,90%)。 1 H NMR(MeOD)δ ： 8.62(d,1H),8.02(d.IH),7.63(m,6H),7.38(m,7H),6.96(d,4H),6.65s,1 H),4.49(s,1H),4.36(s,1H),4.25(m,1H),3.53(d,1H),3.41(d,1H),1.18(d,3H)。
     D)(1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 ( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ -二 甲氧三苯甲基氧基甲基 )-3-(4-N- 苯甲酰胞嘧啶 -1- 基 )-6- 甲基 -2,5- 二氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷 (21)
     将 2- 氰 乙 基 四 异 丙 基 亚 磷 二 酰 胺 (0.63mL,2.0mmol) 加 入 含 有 核 苷 20(0.89g,1.3mmol)、 四 唑 (73mg,1.1mmol) 和 N- 甲 基 咪 唑 (26μL,0.33mmol) 的 DMF(6.6mL) 溶液中。室温搅拌 8 小时后， 将反应物倒入 EtOAc， 依次以 90% 盐水、 盐水洗涤 有机相， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。将残留物溶解于最少量的 EtOAc， 将该溶液添加至己烷。收 集所得的沉淀物， 进一步通过柱层析 (SiO2， 以 75% 至 90% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供白 31 色固体亚磷酰胺 21(1.1g,95%)。 P NMR(CDCl3)δ:149.34,149.77。
     实施例 3
     尿 苷 -6-(S)- 甲 基 BNA 亚 磷 酰 胺 ,(1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2- 氰 基 乙 氧 基 -( 二 异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ - 二甲氧三苯甲基氧基甲基 )-3-( 尿嘧啶 -1- 基 )-6- 甲 基 -2,5- 二氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷 (38) 的制备
     示意结构流程 3(a)NaH, 溴化萘， DMF, 室温 ,2h,98%;(b) 醋酸 ,H2O, 室温 ,16 小 时 ;(c)NaIO4, 二恶烷 ,H2O, 室温 ,90 分钟 ;(d)HCHO,NaOH,THF,H2O, 室温 ,16 小时 , 由 22 为 80%;(e)TBDPSCl,Et3N,DMAP,CH2Cl2, 室温 ,16 小时 ,61%;(f) 草酰氯 ,DMSO,Et3N,-78℃ ;(g) MeMgBr,CeCl3, 来 自 26 的 产 率 为 89%;(h) 草 酰 氯 ,DMSO,Et3N,-78 ℃ ;(i) DiBAL,CH2Cl2,-78℃ ;(j)MsCl,Et3N,DMAP,CH2Cl2, 室温 ,1 小时 ;(k)Ac2O,AcOH,H2SO4, 由 28 为 58%;(l)BSA, 尿嘧啶 ,TMSOTf,MeCN, 回流 ,2 小时 ;(m)K2CO3,MeOH, 室温 ,16 小时 , 来自 34 的产率为 76%;(n)DDQ,CH2Cl2,H2O, 室温 ,8 小时 ,80%;(o)Et3N.3HF,Et3N,THF, 定量 ;(p) DMTCl, 嘧啶 , 室温 ,16 小时 ,86%;(q)CN(CH2)2OP(NiPr2)2, 四唑 ,NMI,DMF,97%。
     A) 醇 (22)
     将氢化钠 (2.39g,59.8mmol) 小心添加至可从市场购得的 1,2:5,6- 二 -O- 异亚丙 基 -α-D- 呋喃阿洛糖 1(12.0g,46mmol) 的 DMF(75mL) 冷 (0℃ ) 溶液中。搅拌 20 分钟后， 向反应中添加溴化萘 (11.12g,50.8mmol) 并继续搅拌 2 小时。以 H2O 小心淬灭反应并将其 倒入 EtOAc， 以水、 盐水洗涤有机层， 干燥并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 10% 至 33% 的 EtOAc/ 己 烷洗脱 ) 纯化提供白色固体醇 22(18.1g,98%)。
     B) 二醇 (25)
     将醇 22(18g,46mmol) 溶解于冰醋酸 (150mL) 和 H2O(60mL)。在室温下搅拌反应物 16 小时， 然后将其真空浓缩。然后将残留物溶解于 EtOAc， 以饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机层， 干燥并浓缩得到粗品 23， 其在不作进一步纯化下使用。
     将高碘酸钠 (48mmol,10g) 水溶液 (350mL) 添加至上面获得的粗产品二醇 23 的 1,4- 二恶烷 (140mL) 的溶液。室温搅拌 90 分钟后， 以 EtOAc 萃取反应物， 以水、 盐水进一步 洗涤有机层， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩得到醛 24， 其可不作进一步纯化下使用。
     将由前面获得的粗品醛 24 溶解于 THF:H2O(1:1,100mL) 混合物， 并将反应物在冰 浴中冷却。向反应中添加甲醛 (25mL,35%w/w) 和 1N NaOH(100mL)。室温搅拌 16 小时后， 向反应添加甲醛 (5mL) 并继续搅拌 32 小时。将反应物浓缩至干燥， 在 EtOAc 和水之间分 配残留物。分层并以另外的 1N NaOH、 水、 盐水洗涤有机相， 干燥并浓缩得到白色固体二醇 25(12.96g,80%, 三步 )。
     C) 醇 (26)
     将叔丁基二苯基硅烷基氯 (0.75mL,2.9mmol) 添加至二醇 25(1g,2.8mmol) 和三乙 胺 (0.45mL,3.2mmol) 的冷 (0℃ ) 溶液。室温搅拌 16 小时后， 将反应物倒入 EtOAc， 并依次 用 5%HCl、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机相， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 10% 至 40% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供油状的醇 26(1.02g,61%)( 还分离得到 0.42g 区域异构硅保 护的二醇 )。
     D) 醇 (28)
     将 二 甲 基 亚 砜 (1.6mL,22.4mmol) 逐 滴 加 入 草 酰 氯 (0.98mL,11.2mmol) 的 CH2Cl2(70mL) 冷 (-78 ℃ ) 溶液。搅拌 30 分钟后， 向反应中添加醇 26(4.8g,8.0mmol) 的 CH2Cl2(20mL) 溶液。 在 -78℃继续搅拌 45 分钟并向反应中添加三乙胺 (4.72mL,33.7mmol)。 在 -78℃下将反应物搅拌 15 分钟， 随后取走冰浴， 并在 45 分钟内对反应物逐渐加温。然后 将反应物倒入 CH2Cl2， 依次以 5%HCl 水溶液、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓 缩以提供醛 27， 其可在不作进一步纯化下使用。
     将 氯 化 铈 III(2.96g,12.0mmol) 的 THF(50mL) 悬 浮 液 在 室 温 下 搅 拌 90 分 钟。 在冰浴中冷却反应物， 历经 5 分钟添加甲基溴化镁 (1.4M 甲基溴化镁的 8.6mL THF 的溶 液 ,12mmol)， 继续搅拌 90 分钟， 然后将反应冷却至 -78 ℃。将粗醛 27( 由前面获得 ) 的 THF(20mL) 溶液加入反应物。 继续搅拌 90 分钟后， 以饱和 NH4Cl 溶液淬灭反应并倒入 EtOAc。 依次以 5%HCl 水溶液、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机层， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 20% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供醇 28(4.37g, 来自 26 的产率为 89%)。
     E) 二乙酸 (32)
     将 二 甲 基 亚 砜 (1.41mL,19.9mmol) 逐 滴 加 入 草 酰 氯 (0.87mL,10.0mmol) 的 CH2Cl2(70mL) 冷 (-78℃ ) 溶液。搅拌 30 分钟后， 向反应中添加醇 28(4.35g,7.1 mmol) 的CH2Cl2(20mL) 溶液。 在 -78℃继续搅拌 45 分钟并向反应中添加三乙胺 (4.20mL,30.0mmol)。 在 -78℃下将反应物搅拌 15 分钟， 随后取走冰浴， 并在 45 分钟内对反应物逐渐加温。然后 将反应物倒入 CH2Cl2， 先后以 5%HCl 水溶液、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓 缩以提供醛 29， 其可在不作进一步纯化下使用。
     将二异丁基氢化铝 (13.7mL 1M 二异丁基氢化铝的 CH2Cl2 溶液 ,13.7mmol) 添加至 酮 29( 由前面获得 ) 的 CH2Cl2(15mL) 冷溶液。 在 -78℃下搅拌 2 小时后， 添加饱和 NH4Cl 淬灭 反应并将其倒入 CHCl3。然后以 5%HCl 水溶液、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机层， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩以提供醇 30， 其可在不作任何纯化下使用。
     向含有醇 30( 由前面获得 )、 三乙胺 (1.77mL,10.5mmol) 和 4- 二甲基氨基嘧啶 (85mg,0.7mmol) 的 CH2Cl2(21mL) 冷 (0℃ ) 溶液添加甲烷磺酰氯 (0.11mL,1.4mmol)。室温 搅拌 1 小时后， 将反应物倒入 CHCl3， 依次以 5%HCl 水溶液、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机层， 干 燥 (Na2SO4) 并真空浓缩以提供甲磺酸 31， 其在不作任何纯化下使用。
     将浓 H2SO4(2 滴 ) 加入甲磺酸 31( 由前面获得 ) 的冰醋酸 (15mL) 和乙酸酐 (3.0mL) 溶液。室温搅拌 1 小时后， 将反应物倒入 EtOAc， 依次以水、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机相， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 20% 至 33% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供二 乙酸 32(3.0g, 由 28 为 58%)。 F) 核苷 (34)
     向二乙酸 32(3.0g,4.1mmol) 和尿嘧啶 (0.57g,5.1mmol) 的 CH3CN(20mL) 悬浮液 添加 N,O- 二 ( 三甲基硅烷基 ) 乙酰胺 (3.45mL,14.0mmol)。在 40℃下加热 15 分钟以获得 澄清溶液后， 向反应中添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸盐 (0.95mL,5.3mmol)。回流 2 小时 后， 将反应冷却至室温并倒入 EtOAc。以饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机层， 干燥 (Na2SO4) 并真 空浓缩以提供粗制核苷 33， 其可在不作任何纯化下使用。
     向核苷 33( 由前面获得 ) 的 MeOH(40mL) 溶液添加 K2CO3(1.66g,12.0mmol)。室温 下搅拌 16 小时后， 真空浓缩反应物并将残留物溶解于 25% 嘧啶 /EtOAc， 以盐水萃取， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 40% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供白色固体核苷 34(2.0g, 来自 32 的产率为 76%)。
     G) 核苷 (35)
     向核苷 34(2.0g,3.1mmol) 的二氯甲烷 (30mL) 和 H2O(1.5mL) 溶液添加 2,3- 二 氯 -5,6- 二氰 -1,4- 苯醌 (DDQ)(1.4g,6.2mmol)。室温下搅拌 3 小时， 再次向反应添加 DDQ(0.5g)。再搅拌 10 分钟后， 真空浓缩反应物并将残留物溶解于 EtOAc。依次以水、 水: 盐水洗涤有机层， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 80% 的 EtOAc/ 己 饱和 NaHCO3(1:1)、 烷 ) 纯化提供白色固体核苷 35(1.25g,80%)。
     H) 核苷 (36)
     在 聚 丙 烯 管 中 向 核 苷 35(1.25g,2.5mmol) 和 三 乙 胺 (1.0mL,7.4mmol) 的 THF(25mL) 溶液添加三乙胺三氢氟酸盐 (2.4mL,14.7mmol)。室温搅拌 24 小时后， 真空浓 缩反应物并将残留物溶解于 EtOAc。依次以水、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机层， 干燥并浓缩 (Na2SO4)。 柱层析 (SiO2， 以 5% 至 10% 的 MeOH/CHCl3 洗脱 ) 纯化提供白色固体核苷 36(0.88g) ( 产物混有 Et3N)。
     I) 核苷 (37)
     向 核 苷 36( 由 前 面 获 得 ) 的 嘧 啶 (12mL) 溶 液 添 加 二 甲 氧 基 三 苯 甲 基 氯 (0.91g,2.7mmol)。室温搅拌 16 小时后， 将反应物倒入 EtOAc， 以盐水洗涤有机层，干燥并 浓缩。柱层析 (SiO2， 以 90% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供白色固体核苷 37(1.28g, 来自 36 的产率为 86%)。
     J)(1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 -( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ -二 甲氧三苯甲基氧基甲基 )-3-( 尿嘧啶 -1- 基 )-6- 甲基 -2,5- 二氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷 (38)
     将 2- 氰 乙 基 四 异 丙 基 亚 磷 二 酰 胺 (0.46mL,1.5mmol) 加 入 含 有 核 苷 37(0.59g,1.0mmol)、 四唑 (57mg,1.1mmol) 和 N- 甲基咪唑 (20μL,0.25mmol) 的 DMF(5mL) 溶液。室温搅拌 8 小时后， 将反应物倒入 EtOAc， 依次以 90% 盐水、 盐水洗涤有机层， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 66% 至 75% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供白色固体亚 31 磷酰胺 38(0.75g,97%)。 P NMR(CDCl3)δ ： 149.36,149.53。
     实施例 4
     N-Bz- 胞嘧啶 -6-(R)- 甲基 BNA 亚磷酰胺 ,(1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2- 氰基乙氧 基 -( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ - 二甲氧三苯甲基氧基甲基 )-3-(4-N- 苯甲酰胞嘧 啶 -1- 基 )-6- 甲基 -2,5- 二氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷 (44) 的制备
     示 意 结 构 流 程 4(a)TBSCl,Et3N,DMAP,CH2Cl2, 室 温 ,16 小 时 97%;(b) POCl3,1,2,4- 三唑 ,Et3N,CH3CN, 室温 ,4 小时 ;(c)NH3 水溶液 ,1,4- 二恶烷 , 室温 ,16 小 时 ;(d)Bz2O,DMF, 室温 ,16 小时 , 来自 39 的产率为 91%;(e)Et3N.3HF,Et3N,THF, 室温 ,16 小时 ,87%;(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 四唑 ,NMI,DMF,90%。
     A) 核苷 (39)
     将叔丁基二甲基硅烷基氯 (0.45g,5.2mmol) 添加至核苷 37(0.59g,1.0mmol) 和咪 唑 (0.41g,6.0mmol) 的 DMF(2mL) 溶液中。室温搅拌 16 小时后， 将反应物倒入 EtOAc， 随后 以盐水萃取有机相， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 50% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供白色固体的核苷 39(0.68g,97%)。
     B) 核苷 (42)
     将 三 氯 氧 化 磷 (0.74mL,8.0mmol) 添 加 至 1,2,4- 三 唑 (2.35g,34.0mmol) 的 CH3CN(16mL) 冷 (0℃ ) 悬浮液。搅拌 15 分钟后， 向反应添加三乙胺 (5.6mL,40mmol)， 继续 搅拌 30 分钟。在 0℃下向反应添加核苷 39(0.68g,1.0mmol) 的 CH3CN(7mL) 溶液。搅拌 10 分钟后， 去除冰浴并在室温下搅拌反应物 4 小时。 真空去除溶剂， 在 EtOAc 和水之间分配 残留物。然后以饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机层， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩以提供粗产物 40， 其可在不作任何纯化下使用。
     将氨水 (2.5mL) 添加至核苷 40( 由前面获得 ) 的二恶烷 (12mL) 溶液。在室温下 搅拌 16 小时， 真空浓缩反应物并在高度真空下干燥 8 小时以提供核苷 41， 其可在不作任何 纯化下使用。
     向核苷 41( 由前面获得 ) 的 DMF(25mL) 溶液添加苯甲酸酐 (0.38g,1.7mmol)。室 温搅拌 16 小时后， 将反应物倒入 EtOAc， 以饱和 NaHCO3、 盐水萃取有机层， 干燥 (Na2SO4) 并 真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 50% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供白色固体的核苷 42(0.72g, 来自 39 的产率为 91%)。
     C) 核苷 (43)
     在聚丙烯管中向含有核苷 42(0.72g,0.91mmol) 和三乙胺 (0.30mL,2.2mmol) 的 THF(9mL) 溶液添加三乙胺三氢氟酸盐 (0.89mL,5.5mmol)。室温下搅拌 16 小时后， 真空浓 缩反应物并将残留物溶解于 EtOAc， 依次以水、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机层， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 25% 至 40% 的丙酮 /CHCl3 洗脱 ) 纯化提供白色固体核苷 1 43(0.53g,87%)。 H NMR(CDCl3):δ8.34(s,br,1H),8.33(d,1H),7.83(d,1H),7.57-7.26(m ,16H),6.89(d,4H),5.72(s,1H),4.75(s,1H),4.22(s,1H),4,14(m,1H),3.83(s,6H),3.63( d,1H),3.46(s,1H),1.20(d,3H)。
     D)(1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 ( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ -二 甲氧基三苯甲基氧基甲基 )-3-(4-N- 苯甲酰胞嘧啶 -1- 基 )-6- 甲基 -2,5- 二氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷 (44)
     将 2- 氰 乙 基 四 异 丙 基 亚 磷 二 酰 胺 (0.37mL,1.2mmol) 加 入 含 有 核 苷 43(0.89g,1.3mmol)、 四 唑 (43mg,0.63mmol) 和 N- 甲 基 咪 唑 (16μL,0.20mmol) 的 DMF (4mL) 溶液。室温搅拌 8 小时后， 将反应物倒入 EtOAc， 依次以 90% 盐水、 盐水洗涤有机层， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 75% 至 90% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供白色固 体亚磷酰胺 44(0.61g,90%)。
     实施例 5
     (1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 ( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ -二 甲氧基三苯甲基氧基甲基 )-3-(6-N- 苯甲酰腺嘌呤 -9- 基 )-6- 甲基 -2,5- 二氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷 (51)
     示 意 结 构 流 程 5(a)6-N- 苯 甲 酰 腺 嘌 呤 ,BSA,TMSOTf,DCE, 回 流 ,8 小 时 ;(b) K2CO3,MeOH, 室温 ,16 小时 , 来自 32 的产率为 73%;(c)Bz2O,DMF, 室温 ;(d)DDQ,CH2Cl2,H2O, 室 温 ;(e)Et3N.3HF,Et3N,THF, 室 温 ,16 小 时 ;(f)DMTCl, 嘧 啶 , 室 温 ,16 小 时 ;(g) CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 四唑 ,NMI,DMF。
     A) 核苷 (46)
     向 二 乙 酸 32(1.0g,1.4mmol) 和 6-N- 苯 甲 酰 腺 嘌 呤 (0.48g,2.0mmol) 的 二 氯 乙 烷 (14mL) 悬 浮 液 添 加 N,O- 二 ( 三 甲 基 硅 烷 基 ) 乙 酰 胺 (1.1mL,4.50mmol)。 反 应 混合物在回流 45 分钟后变澄清， 并在冰浴中冷却， 添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸盐 (0.49mL,2.7mmol)。回流 8 小时后， 将反应冷却至室温并倒入 EtOAc。以饱和 NaHCO3 和盐 水洗涤有机相， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩以提供粗制核苷 45， 其可在不作纯化下使用。
     向 核 苷 45( 由 前 面 获 得 ) 的 MeOH(14mL) 溶 液 添 加 K2CO3(0.38g,2.7mmol)。 室 温搅拌 24 小时后将反应物真空浓缩。将残留物悬浮于 EtOAc， 用水和盐水萃取， 然后干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 1% 至 2.5% 的 MeOH/CHCl3 洗脱 ) 纯化提供白色固体 核苷 46(0.69g, 来自 32 的产率为 73%)。
     B) 核苷 47
     核苷 47 可由核苷 46 通过与干 DMF 中的苯甲酸酐 (1.5-2 当量 ) 反应进行制备。
     C) 亚磷酰胺 51
     亚磷酰胺 51 可通过实施例 3 所示的由核苷 34 得到亚磷酰胺 38 的方法由核苷 47 进行制备。
     实施例 6
     (1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 -( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ -二 甲氧基三苯甲基氧基甲基 )-3-(6-N- 苯甲酰腺嘌呤 -9- 基 )-6- 甲基 -2,5- 二氧杂 - 双环
     [2.2.1] 庚烷 (60)
     示 意 结 构 流 程 6(a)MsCl,Et3N,DMAP,CH2Cl2, 室 温 ,4 小 时 ;(b)Ac2O,AcOH, 催 化 量 H2SO4, 室温 ,3 小时 , 来自 28 的产率为 87%;(c)6-N- 苯甲酰腺嘌呤 ,BSA,TMSOTf,DCE, 回 流 ,2 小 时 ;(d)K2CO3,MeOH, 室 温 ,16 小 时 ;(e)Bz2O,DMF, 室 温 ;(f)DDQ,CH2Cl2,H2O, 室 温 ;(g)Et3N.3HF,Et3N,THF, 室 温 ,16 小 时 ;(h)DMTCl, 嘧 啶 , 室 温 ,16 小 时 ;(i) CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 四唑 ,NMI,DMF。
     A) 二乙酸 (52)
     向 含 有 醇 28(7.37g,12.0mmol)、 三 乙 胺 (2.82mL,20.2mmol) 和 DMAP(0.20g,1.1mmol) 的 二 氯 甲 烷 (25mL) 冷 溶 液 (0 ℃ ) 逐 滴 添 加 甲 烷 磺 酰 氯 (1.33mL,16.8mmol)。室温下搅拌 2 小时后， 以二氯甲烷稀释反应物， 以 5%HCl、 饱和碳酸氢 钠溶液、 盐水洗涤有机相， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。由此获得粗品甲磺酸 52， 其可在不作纯化 下使用。
     B) 二乙酸 (53)
     将浓硫酸 (10 滴 ) 加入甲磺酸 52( 由前面获得 ) 的乙酸酐 (7.2mL) 和醋酸 (36mL) 溶液。室温搅拌 2 小时后将反应物在高度真空下浓缩。将残留物溶解于乙酸乙酯， 以水、 饱 和碳酸氢钠溶液 ( 直至 pH>8) 和盐水小心洗涤有机层， 然后干燥 (Na2SO4) 并浓缩。以柱层 析 (SiO2, 以 25% 至 35%EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化残留物以提供粘性油二乙酸 53(7.66g, 来 自 28 的产率为 87%)。
     C) 亚磷酰胺 (60)
     亚磷酰胺 60 可通过实施例 3 所示的由二乙酸 32 得到亚磷酰胺 51 的方法由二乙 酸 53 进行制备。
     实施例 7
     (1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 ( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ -二 甲氧基三苯甲基氧基甲基 )-3-(2-N- 异丁酰鸟嘌呤 -9- 基 )-6- 甲基 -2,5- 二氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷 (67)
     示意结构流程 7(a)2- 氨基 -6- 氯嘌呤 ,BSA,TMSOTf,DCE, 回流 ,2 小时 ;(b)3- 羟 基 丙 腈 ,NaH,THF,4 小 时 , 来 自 32 的 产 率 为 82%;(c) 异 丁 酸 酐 ,DMAP,DMF,60C,24 小 时 ,71%;(d)DDQ,CH2Cl2,H2O, 室 温 ,16 小 时 ,91%;(e)Et3N.3HF,Et3N,THF, 室 温 ,16 小 时 ,97%;(f)DMTCl, 嘧啶 , 室温 ,16 小时 ,85%;(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 四唑 ,NMI,DMF。
     A) 核苷 (61)
     向 二 乙 酸 32(3.44g,4.7mmol) 和 2- 氨 基 -6- 氯 嘌 呤 (1.18g,7.0mmol) 的 二 氯 乙 烷 (46mL) 悬 浮 液 添 加 N,O- 二 ( 三 甲 基 硅 烷 基 ) 乙 酰 胺 (3.8mL,15.5mmol)。 回 流 45 分钟得到澄清溶液后， 在冰浴中冷却反应物并添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸盐 (1.69mL,9.4mmol)。回流 8 小时后， 将反应冷却至室温并倒入氯仿。以饱和 NaHCO3 和盐水 洗涤有机层， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩以提供粗制核苷 61， 其可在不作纯化下使用。
     B) 核苷 (62)
     向 氢 化 钠 (1.07g,27.0mmol,60%w/w) 的 干 THF(10mL) 搅 拌 悬 浮 液 逐 滴 添 加 3- 羟基丙腈 (1.67mL,24.5mmol)。搅拌 20 分钟后， 添加粗品核苷 61( 由前面获得 ) 的干 THF(25mL) 溶液。室温下继续搅拌 5 小时， 然后通过添加饱和氯化铵溶液小心淬灭反应。然 后将反应物倒入乙酸乙酯， 以盐水萃取有机层， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。以柱层析 (SiO2, 以
     CHCl3 至 2.5%MeOH/CHCl3 洗脱 ) 纯化残留物以提供浅棕色固体的核苷 62(3.18g, 来自 32 的 产率为 82%)。
     C) 核苷 (63)
     将异丁酸酐 (1.5mL,9.3mmol) 添加至核苷 62(3.19g,4.6mmol) 和 4- 二甲氨基甲 基嘧啶 (0.11g,0.93mmol) 的 DMF(27mL) 溶液。在 60℃下搅拌 14 小时后， 向反应再加入异 丁酸酐 (1.5mL,9.3mmol)， 继续在 60℃下搅拌 12 小时。将反应冷却至室温， 以 EtOAc 稀释， 并以水、 饱和碳酸氢钠溶液、 盐水洗涤 有机层， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 5% 至 15% 的丙酮 /CHCl3 洗脱 ) 纯化提供黄色泡沫状的核苷 63(2.5g,71%)。
     D) 核苷 (64)
     向 核 苷 63(2.5g,3.3mmol) 的 二 氯 甲 烷 (33mL) 和 H2O(1.7mL) 溶 液 添 加 DDQ(1.12g,5.0mmol)。在室温下搅拌 2 小时后再次添加 DDQ(1.0g)。继续在室温下搅拌 6 小时， 然后将反应物在冰箱 (4℃ ) 中储存 16 小时。 然后真空浓缩反应物并将残留物溶解于 乙酸乙酯。以水、 10% 亚硫酸氢钠溶液 (2×)、 饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤有机层， 然后干 燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 5%MeOH/CHCl3 洗脱 ) 纯化提供核苷 64(1.84g,91%)。
     E) 核苷 (65) 在 聚 丙 烯 管 中 向 核 苷 64(1.84g,3.0mmol) 和 三 乙 胺 (1.25mL,8.9mmol) 的 THF(30mL) 溶液添加三乙胺三氢氟酸盐 (2.88mL,17.9mmol)。室温搅拌 24 小时后， 真空 浓缩反应物并将残留物溶解于 EtOAc。依次以水、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机层， 然后干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 5% 至 10% 的 MeOH/CHCl3 洗脱 ) 纯化提供白色固体的核 苷 65(1.05g,97%)。
     F) 核苷 (66)
     向 核 苷 65(1.00g,2.7mmol) 的 嘧 啶 (13mL) 溶 液 添 加 二 甲 氧 基 三 苯 甲 基 氯 (1.07g,3.2mmol)。室温搅拌 16 小时后， 将反应物倒入 EtOAc， 以盐水洗涤有机层， 干燥 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 2.5% 至 5% 的 MeOH/CHCl3 洗脱 ) 纯化提供白色泡沫状的核苷 66(1.52g,85%)。
     G)(1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 -( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ -二 甲氧基三苯甲基氧基甲基 )-3-(2-N- 异丁酰鸟嘌呤 -9- 基 )-6- 甲基 -2,5- 二氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷 (67)
     将 2- 氰 乙 基 四 异 丙 基 亚 磷 二 酰 胺 (1.06mL,3.4mmol) 加 入 含 有 核 苷 66(1.52g,2.2mmol)、四 唑 (0.12g,1.7mmol) 和 N- 甲 基 咪 唑 (45μL,0.56mmol) 的 DMF(11mL) 溶液。室温搅拌 8 小时后， 将反应物倒入 EtOAc， 依次以 90% 盐水、 盐水洗涤有机 层， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 2.5% 的 MeOH/CHCl3 洗脱 ) 纯化提供白色固体 31 亚磷酰胺 67(1.65g,84%)。 P NMR(CDCl3)δ:148.70,145.81。
     实施例 8
     (1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 -( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ -二 甲氧基三苯甲基氧基甲基 )-3-(2-N- 异丁酰鸟嘌呤 -9- 基 )-6- 甲基 -2,5- 二氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷 (74)
     示意结构流程 8(a)2- 氨基 -6- 氯嘌呤 ,BSA,TMSOTf,DCE, 回流 ,2 小时 ;(b)3- 羟 基丙腈 ,NaH,THF,4 小时 ;(c) 异丁酸酐 ,DMAP,DMF,60C,24 小时 ;(d)DDQ,CH2Cl2,H2O, 室 温 ,16 小时 ;(e)Et3N.3HF,Et3N,THF, 室温 ,16 小时 ;(f)DMTCl, 嘧啶 , 室温 ,16 小时 ;(g) CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 四唑 ,NMI,DMF。
     亚磷酰胺 74 可通过与所示的由二乙酸 32 得到亚磷酰胺 67 的相同方法由二乙酸 53 进行制备。
     实施例 9
     (1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 -( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ - 二甲 氧基三苯甲基氧基甲基 )-3-( 尿嘧啶 -1- 基 )-6- 甲氧基甲基 -2,5- 二氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷 (83)
     示 意 结 构 流 程 9(a) 草 酰 氯 ,DMSO,Et3N,CH2Cl2,-78 ℃ ;(b) MeOCH2Br,Mg,HgCl2,THF,-20 ℃ , 由 26 为 >95%;(c)MsCl,Et3N,DMAP,CH2Cl2,85%;(d) Ac2O,AcOH,H2SO4, 室 温 ,3 小 时 ,84%;(e) 尿 嘧 啶 ,BSA,TMSOTf,MeCN, 回 流 ,2 小 时 ;(f) K2CO3,MeOH, 来 自 77a-b 的 产 率 为 89%;(g)DDQ,CH2Cl2,H2O,8 小 时 , 室 温 ,80a 和 80b 的 联 合 产 率 为 98%;(h)Et3N.3HF,Et3N,THF, 室 温 ,16 小 时 ;(i)DMTCl, 嘧 啶 ,16 小 时 , 室 温 ,90%;(J)CN(CH2)2OP(N-iPr2)2, 四唑 ,NMI,DMF,96%。
     A) 醇 (75a-b)
     在 -78℃下向草酰氯 (2.2mL,25.0mmol) 的二氯甲烷 (130mL) 溶液添加二甲亚砜 (3.5mL,50.0mmol)。搅拌 30 分钟后， 在 10 分钟向反应中添加醇 26(10.0g,16.7mmol) 的二 氯甲烷 (30mL) 溶液。继续搅拌 45 分钟后， 向反应中缓慢添加三乙胺 (10.5mL,75.0mmol)。 添加完成后， 去除冰浴并将反应逐渐升温至 0℃ ( 约 1 小时 ) 并转移至分液漏斗。先后以 5%HCl、 饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤有机层， 然后干燥 (Na2SO4) 并浓缩以提供醛 27， 其在 高度真空下干燥 (18 小时 ) 并可在不作纯化下使用。
     以干 THF(5mL) 覆盖镁带 (2.5g,102.8mmol) 和氯化汞 (II)(93mg,0.34mmol) 的混 合物， 并将反应物冷却至 -20℃。滴入数滴纯甲氧基甲基溴以起始反应。等待数分钟后， 经 大约 3 小时向反应加入甲氧基甲基溴 (9.33mL,102.8mmol) 的 THF(12mL) 溶液 (1mL/10 分 钟， 通过注射器 )。在添加过程中外部浴的温度小心维持在 -20 和 -25℃之间。间歇 ( 在 3 小时内 ) 加入少量的干 THF(5mL) 以促进搅拌。添加溴化物完毕后， 在 -25℃下搅拌反应物 100 分钟， 然后添加粗品醛 (27) 的 THF(30mL) 溶液。在 -20℃下搅拌 45 分钟后， 通过 TLC 未检测到起始材料醛 27。以饱和氯化铵溶液小心淬灭反应并用乙酸乙酯稀释。以 5%HCl、
     饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤有机层， 然后干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 25% 至 30% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供混合物醇 75a-b( 定量 )( 约 1:1 的异构体 )。
     B) 甲磺酸 (76a-b)
     向 溶 于 三 乙 胺 (5.3mL,37.9mmol) 的 醇 75a-b(13.38g,20.8mmol) 和 DMAP(0.36g,2.9mmol) 的 二 氯 甲 烷 (42mL) 冷 溶 液 (0 ℃ ) 添 加 甲 烷 磺 酰 氯 (2.3mL,29.2mmol)。 搅 拌 2 小 时 后 另 外 加 入 甲 烷 磺 酰 氯 (0.5mL)。 继 续 搅 拌 1 小 时， 以氯仿稀释反应物。先后以 5%HCl、 饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤有机 层， 然后干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 20% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供粘性油状的甲磺酸 76a-b(12.8g,85%)。
     C) 二乙酸 (77a-b)
     将浓硫酸 (6 滴 ) 加入甲磺酸 76a-b(12.8g,17.8mmol) 的醋酸 (50mL) 和乙酸酐 (10mL) 溶液。 室温下搅拌 3 小时后以 LCMS 对反应物进行完全鉴定， 并在高度真空下挥发掉 大部分溶剂。用乙酸乙酯稀释浓缩的混合物， 以水、 饱和碳酸氢钠溶液 ( 直至 pH>10) 和盐 水洗涤有机相， 然后干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 20% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化 提供粘性油状的二乙酸 77a-b 的异头体混合物 (11.44g,84%)。
     D) 核苷 (79a-b)
     向二乙酸 77a-b(11.44g,15.0mmol) 和尿嘧啶 (3.35g,29.9mmol) 的 CH3CN(75mL) 悬浮液添加 N,O- 二 ( 三甲基硅烷基 ) 乙酰胺 (14.76mL,59.9mmol)。 40℃加热 15 分钟得到澄 清溶液后， 在冰浴中冷却反应物并添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸盐 (4.06mL,22.5mmol)。 回流 2 小时后， 将反应冷却至室温并倒入 EtOAc。以半饱和碳酸氢钠和盐水洗涤有机层， 干 燥 (Na2SO4) 并真空浓缩以提供粗品核苷 78a-b， 其可在不作纯化下使用。
     向核苷 78a-b( 由前面获得 ) 的甲醇 (130mL) 溶液添加碳酸钾 (5.30g,38.4mmol)。 室温搅拌 16 小时后将反应物真空浓缩。将残留物溶剂于乙酸乙酯， 用水和盐水萃取， 然后 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 5 至 7.5% 的丙酮 / 氯仿洗脱 ) 纯化提供白色 固体的核苷 79a-b(9.0g, 来自 77a-b 的产率为 89%)。
     E) 核苷 (80a 和 80b)
     向 核 苷 79a-b(9.0g,13.3mmol) 的 二 氯 甲 烷 (130mL) 和 水 (6.5mL) 溶 液 添 加 DDQ(20.0mmol,4.5g)。将两相反应物在室温下搅拌 2 小时， 然后再次添加 DDQ( 向反应添加 2.75g)。 另外 2 小时后再次向反应添加 DDQ(1.1g)， 继续搅拌 4 小时， 然后将反应物在冰箱中 贮存 16 小时。 第二日早， LCMS 显示了痕量的核苷 79a-b， 因此再次向反应中加入 DDQ(0.9g)， 继续搅拌 2 小时， 此时通过 TLC 和 LCMS 再未检测到核苷 79a-b。真空挥发溶剂， 并在乙酸乙 酯和水之间分配残留物。以亚硫酸氢钠溶液 (2×)、 饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤有机层， 然后干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 10 至 20% 的丙酮 / 氯仿洗脱 ) 纯化分别提供 核苷 80a( 洗脱较慢的点 ) 和 80b( 洗脱较快的点 )(7.0g, 联合产率为 98%)。
     F) 核苷 (81)
     向核苷 80a(6.7g,12.5mmol) 和三乙胺 (5.2mL,37.4mmol) 的 THF(120mL) 溶液添 加三乙胺三氢氟酸盐 (12.2mL,74.8mmol)。室温搅拌 16 小时后将反应物真空浓缩至干燥。 柱层析 (SiO2， 以 7.5 至 12.5% 的 MeOH/CHCl3 洗脱 ) 纯化提供核苷 81( 混有三乙胺 . 氢氟 酸盐 , 产率 >100%)， 其可在不作进一步纯化下使用。G) 核苷 (82)
     向核苷 81( 约 12.5mmol) 的嘧啶 (75mL) 溶液添加 4,4’ - 二甲氧基三苯甲基氯 (DMTCl,4.8g,14.3mmol)。在室温下搅拌 16 小时后再次向反应添加 DMTCl(2.4g)。继续 搅拌 4 小时后添加 MeOH(10mL)。搅拌 30 分钟后， 以乙酸乙酯稀释反应物， 并以水和盐水洗 涤有机相， 然后干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 60 至 75% 的 EtOAc/ 己烷 ) 纯化提供 白色泡沫状的核苷 82(6.73g,90%)。 H)(1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 ( 二异丙基 氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ - 二甲氧三苯甲基氧基甲基 )-3-( 尿嘧啶 -1- 基 )-6- 甲氧基甲 基 -2,5- 二氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷 (83)
     将 2- 氰 乙 基 四 异 丙 基 亚 磷 二 酰 胺 (1.58mL,5.0mmol) 加 入 核 苷 82(2.0g,3.3mmol)、 四唑 (0.19g,2.6mmol) 和 N- 甲基咪唑 (68μL,0.83mmol) 的 DMF(16mL) 溶液。室温搅拌 8 小时后将反应物倒入 EtOAc。依次以 90% 盐水和盐水洗涤有机层， 然后干 燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 66% 至 75% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供白色固体 31 亚磷酰胺 83(2.54g,96%)。 P NMR(CDCl3)δ:149.78,149.44。
     实施例 10
     (1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 ( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ - 二甲 氧基三苯甲基氧基甲基 )-3-( 尿嘧啶 -1- 基 )-6- 甲氧基甲基 -2,5- 二氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷 (86)
     示意结构流程 10(a)Et3N.3HF,Et3N,THF, 室温 ,16 小时 ;(i)DMTCl, 嘧啶 ,16 小 时 , 室温 ,91%;(j)CN(CH2)2OP(N-iPr2)2, 四唑 ,NMI,DMF,96%。
     A) 核苷 (84)
     向核苷 80b(6.43g,12.0mmol) 和三乙胺 (5.0mL,35.7mmol) 的 THF(125mL) 溶液 添加三乙胺三氢氟酸盐 (11.6mL,71.5mmol)。室温搅拌 16 小时后将反应物真空浓缩至干 燥。柱层析 (SiO2， 以 7.5 至 12.5% 的 MeOH/CHCl3 洗脱 ) 纯化残留物提供核苷 84( 混有三
     乙胺 . 氢氟酸盐 , 产率 >100%)， 其可在不作进一步纯化下使用。
     B) 核苷 (85)
     向核苷 84( 约 12.0mmol) 的嘧啶 (72mL) 溶液添加 4,4’ - 二甲氧基三苯甲基氯 (DMTCl,4.6g,13.8mmol)。在室温下搅拌 16 小时后再次向反应添加 DMTCl(2.3g)。继续搅 拌 4 小时后添加 MeOH(10mL)。搅拌 30 分钟后， 以乙酸乙酯稀释反应物， 并以水和盐水洗涤 有机相， 然后干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 60 至 75% 的 EtOAc/ 己烷 ) 纯化提供白 色泡沫状的核苷 85(6.52g,91%)。C)(1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 -( 二异丙基氨 基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ - 二甲氧基三苯甲基氧基甲基 )-3-( 尿嘧啶 -1- 基 )-6- 甲氧基甲 基 -2,5- 二氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷 (86)
     将 2- 氰 乙 基 四 异 丙 基 亚 磷 二 酰 胺 (1.58mL,5.0mmol) 加 入 核 苷85(2.0g,3.3mmol)、 四唑 (0.19g,2.7mmol) 和 N- 甲基咪唑 (68μL,0.83mmol) 的 DMF(17mL) 溶液。室温搅拌 8 小时后将反应物倒入 EtOAc。依次以 90% 盐水和盐水洗涤有机层， 然后干 燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 66% 至 75% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供白色固体 31 亚磷酰胺 86(2.55g,96%)。 P NMR(CDCl3)δ:149.97,149.78。
     实施例 11
     (1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 ( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ - 二甲 氧基三苯甲基氧基甲基 )-3-(4-N- 苯甲酰胞嘧啶 -1- 基 )-6- 甲氧基甲基 -2,5- 二氧杂 - 双 环 [2.2.1] 庚烷 (92)
     示 意 结 构 流 程 11(a)TBSCl,Et3N,DMAP,CH2Cl2, 室 温 ,16 小 时 98%;(b) POCl3,1,2,4- 三唑 ,Et3N,CH3CN, 室温 ,4 小时 ;(c)NH3 水溶液 ,1,4- 二恶烷 , 室温 ,16 小 时 ;(d)Bz2O,DMF, 室温 ,16 小时 , 来自 82 的产率为 91%;(e)Et3N.3HF,Et3N,THF, 室温 ,16 小时 ,94%;(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 四唑 ,NMI,DMF,84%。
     A) 核苷 (87)
     将叔丁基二甲基硅烷基氯 (2.40g,15.9mmol) 添加至核苷 82(3.20g,5.3mmol) 和 咪唑 (2.16g,31.8mmol) 的 DMF(10.6mL) 溶液。室温搅拌 16 小时后将反应物倒入 EtOAc。 以盐水萃取有机相， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 50% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供白色固体核苷 87(3.70g,98%)。
     B) 核苷 (90)
     将 三 氯 氧 磷 (3.86mL,41.4mmol) 添 加 至 1,2,4- 三 唑 (12.15g,176.1mmol) 的 CH3CN(80mL) 冷悬浮液 (0℃ )。搅拌 15 分钟后加入三乙胺 (29.0mL,207.2mmol)， 继续搅拌 30 分钟。在 0℃下向反应混合物添加核苷 87(3.70g,5.2mmol) 的 CH3CN(20mL) 溶液。搅拌
     10 分钟后， 去除冰浴并在室温下搅拌反应物 4 小时。然后真空去除溶剂， 在 EtOAc 和之间 分配残留物。然后以饱和 NaHCO3 和盐水洗涤有机相， 然后干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩以提供 粗产物 88， 其可在不作任何纯化下使用。
     将氨水 (10mL) 添加至核苷 88( 由前面获得 ) 的二恶烷 (50mL) 溶液。在室温下搅 拌 16 小时后， 真空浓缩反应物并在高度真空下干燥 8 小时以提供核苷 89， 其可在不作纯化 下使用。
     向核苷 89( 由前面获得 ) 的 DMF(10mL) 溶液添加苯甲酸酐 (1.99g,8.8mmol)。室 温搅拌 16 小时后将反应物倒入 EtOAc。依次以饱和 NaHCO3 和盐水萃取有机层， 然后干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 50% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供白色固体的核 苷 90(3.86g, 来自 87 的产率为 91%)。
     C) 核苷 (91)
     在 聚 丙 烯 管 中 向 核 苷 90(3.81g,4.7mmol) 和 三 乙 胺 (1.56mL,11.2mmol) 的 THF(46mL) 溶液添加三乙胺三氢氟酸盐 (4.54mL,27.9mmol)。室温搅拌 16 小时后， 真空 干燥反应物并将残留物溶解于 EtOAc。依次以水、 饱和 NaHCO3 和盐水洗涤有机层， 然后干 燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 5%MeOH/CHCl3 洗脱 ) 纯化提供白色固体核苷 91(3.07g,94%)。
     D)(1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 ( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ -二 甲氧基三苯甲基氧基甲基 )-3-(4-N- 苯甲酰胞嘧啶 -l- 基 )-6- 甲基 -2,5- 二氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷 (92)
     将 2- 氰 乙 基 四 异 丙 基 亚 磷 二 酰 胺 (0.90mL,4.3mmol) 加 入 核 苷 91(2.0g,2.8mmol)、 四唑 (0.16g,2.3mmol) 和 N- 甲基咪唑 (58μL,0.71mmol) 的 DMF(14mL) 溶液。室温搅拌 8 小时后将反应物倒入 EtOAc。依次以 90% 盐水和盐水洗涤有机层， 然后干 燥 (Na2SO4) 并浓缩。将残留物溶解于最小量的 EtOAc， 将该 溶液添加至己烷。收集所得的 沉淀物， 进一步通过柱层析 (SiO2， 以 75% 至 90% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供白色固体亚 31 磷酰胺 92(2.14g,84%)。 P NMR(CDCl3)δ:149.82。
     实施例 12
     (1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 ( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-l-(4,4’ - 二甲 氧三苯甲基氧基甲基 )-3-(4-N- 苯甲酰胞嘧啶 -1- 基 )-6- 甲氧基甲基 -2,5- 二氧杂 - 双 环 [2.2.1] 庚烷 (98)
     示 意 结 构 流 程 12(a)TBSCl,Et3N,DMAP,CH2Cl2, 室 温 ,16 小 时 ,97%;(b) POCl3,1,2,4- 三唑 ,Et3N,CH3CN, 室温 ,4 小时 ;(c)NH3 水溶液 ,1,4- 二恶烷 , 室温 ,16 小 时 ;(d)Bz2O,DMF, 室温 ,16 小时 , 来自 93 的产率为 89%;(e)Et3N.3HF,Et3N,THF, 室温 ,16 小时 ,89%;(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 四唑 ,NMI,DMF,84%。
     A) 核苷 (93)
     将叔丁基二甲基硅烷基氯 (2.25g,15.0mmol) 添加至核苷 85(3.0g,5.0mmol) 和咪 唑 (2.03g,29.9mmol) 的 DMF(10mL) 溶液。室温搅拌 16 小时后将反应物倒入 EtOAc。以盐 水萃取有机相， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 50% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化 提供白色固体核苷 93(3.45g,97%)。
     B) 核苷 (96)
     将 三 氯 氧 磷 (3.59mL,38.5mmol) 添 加 至 1,2,4- 三 唑 (11.3g,163.9mmol) 的 CH3CN(80mL) 冷悬浮液 (0℃ )。搅拌 15 分钟后向反应中加入三乙胺 (27.0mL,192.8mmol)， 继续搅拌 30 分钟。在 0℃下向反应中添加核苷 93(3.45g,4.82mmol) 的 CH3CN(20mL) 溶液。 搅拌 10 分钟后， 去除冰浴并在室温下搅拌反应物 4 小时。真空去除溶剂， 在 EtOAc 和之间 分配残留物。然后以 NaHCO3 饱和溶液和盐水洗涤有机相， 然后干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩以 提供粗产物 94， 其在不作任何纯化下使用。
     将氨水 (10mL) 添加至核苷 94( 由前面获得 ) 的二恶烷 (50mL) 溶液。在室温下搅 拌 16 小时， 真空浓缩反应物并在高度真空下干燥 8 小时以提供核苷 95， 其在不作纯化下使 用。
     向核苷 95( 由前面获得 ) 的 DMF(9mL) 溶液添加苯甲酸酐 (1.63g,7.2mmol)。室
     温搅拌 16 小时后将反应物倒入 EtOAc。依次以饱和 NaHCO3 和盐水萃取有机层， 然后干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 50% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供白色固体核苷 96(3.53g, 来自 93 的产率为 89%)。
     C) 核苷 (97)
     在 聚 丙 烯 管 中 向 核 苷 96(3.53g,4.3mmol) 和 三 乙 胺 (1.43mL,10.3mmol) 的 THF(43mL) 溶液添加三乙胺三氢氟酸盐 (4.20mL,25.8mmol)。室温搅拌 16 小时后， 真空干 燥反应物并将残留物溶解于 EtOAc。依次以水、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机相， 然后干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩。柱层析 (SiO2， 以 25% 至 40% 的丙酮 /CHCl3 洗脱 ) 纯化提供白色固体 的核苷 97(2.87g,95%)。
     D)(1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 ( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ -二 甲氧基三苯甲基氧基甲基 )-3-(4-N- 苯甲酰胞嘧啶 -1- 基 )-6- 甲基 -2,5- 二氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷 (98)
     将 2- 氰 乙 基 四 异 丙 基 亚 磷 二 酰 胺 (1.35mL,4.3mmol) 加 入 核 苷 97(2.0g,2.8mmol)、四 唑 (0.16mg,2.3mmol) 和 N- 甲 基 咪 唑 (58μL,0.71mmol) 的 DMF(14mL) 溶液。室温搅拌 8 小时后， 将反应物倒入 EtOAc， 依次以 90% 盐水和盐水洗涤有 机相， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 75% 至 90% 的 EtOAc/ 己烷洗脱 ) 纯化提供白 31 色固体核苷 98(2.15g,84%)。 P NMR(CDCl3)δ:150.33。
     实施例 13
     (1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 -( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ - 二甲 氧基三苯甲基氧基甲基 )-3-(6-N- 苯甲酰腺嘌呤 -9- 基 )-6- 甲氧基甲基 -2,5- 二氧杂 - 双 环 [2.2.1] 庚烷 (105)
     示 意 结 构 流 程 13(a)6-N- 苯 甲 酰 腺 嘌 呤 ,BSA,TMSOTf,CH3CN, 回 流 ,8 小 时 ;(b)K2CO3,MeOH, 室 温 ,16 小 时 ;(c)Bz2O,DMF, 室 温 ;(d)DDQ,CH2Cl2,H2O, 室 温 ;(e)Et3N.3HF,Et3N,THF, 室 温 ,16 小 时 ;(f)DMTCl, 嘧 啶 , 室 温 ,16 小 时 ;(g) CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 四唑 ,NMI,DMF。
     亚磷酰胺 105 通过所示的由二乙酸混合物 77a-b 合成亚磷酰胺 83 的方法由二乙 酸 77a-b 制备。
     实施例 14
     (1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 ( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ -二 甲氧基三苯甲基氧基甲基 )-3-(6-N- 苯甲酰腺嘌呤 -9- 基 )-6- 甲基 -2,5- 二氧杂 - 双环 [2.2.1] 庚烷 (108)
     示意结构流程 14(a)Et3N.3HF,Et3N,THF, 室温 ,16 小时 ;(b)DMTCl, 嘧啶 , 室温 ,16 小时 ;(c)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 四唑 ,NMI,DMF。
     亚磷酰胺 108 通过所示的由 80b 合成亚磷酰胺 86 的方法由核苷 102b 制备。
     实施例 15
     (1S,3R,4R,6R,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 ( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ - 二甲 氧三苯甲基氧基甲基 )-3-(2-N- 异丁酰鸟嘌呤 -9- 基 )-6- 甲氧基甲基 -2,5- 二氧杂 - 双 环 [2.2.1] 庚烷 (114)
     示 意 结 构 流 程 15(a)2- 氨 基 -6- 氯 嘌 呤 ,BSA,TMSOTf,CH3CN, 回 流 ,2 小 时 ;(b)3- 羟 基 丙 腈 ,NaH,THF,4 小 时 ;(c) 异 丁 酸 酐 ,DMAP,DMF,60 ℃ ,24 小 时 ;(d) DDQ,CH2Cl2,H2O, 室温 ,16 小时 ;(e)Et3N.3HF,Et3N,THF, 室温 ;(f)DMTCl, 嘧啶 , 室温 ;(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 四唑 ,NMI,DMF。
     亚磷酰胺 114 通过所示的由二乙酸混合物 77a-b 合成亚磷酰胺 83 的方法由二乙 酸 77a-b 制备。
     实施例 16
     (1S,3R,4R,6S,7S)-7-[2- 氰基乙氧基 ( 二异丙基氨基 ) 膦氧基 ]-1-(4,4’ - 二甲 氧基三苯甲基氧基甲基 )-3-(2-N- 异丁酰鸟嘌呤 -9- 基 )-6- 甲氧基甲基 -2,5- 二氧杂 - 双 环 [2.2.1] 庚烷 (117)
     示意结构流程 16(a)Et3N.3HF,Et3N,THF, 室温 ,16 小时 ;(b)DMTCl, 嘧啶 , 室温 ,16 小时 ;(c)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2, 四唑 ,NMI,DMF。
     亚磷酰胺 117 通过所示的由 80b 合成亚磷酰胺 86 的方法由核苷 111b 制备。
     实施例 17
     6-CH2OH BNA 合成
     示 意 结 构 流 程 17(a) 草 酰 氯 ,DMSO,Et3N,CH2Cl2,-78 至 0 ℃ ;(b) Ph3PCH2Br,nBuLi,THF,-78 ℃ 至 室 温 , 来 自 26 的 产 率 为 97%;(c)TBAF,THF, 室 温 ,16 小 时 ,97%;(d)NaH,BnBr,DMF, 室温 ,1 小时 , 定量 ;(e)OsO4,NMO,95% 丙酮水溶液 , 室温 ,48 小时 ,87%;(f)TBSCl, 嘧啶 ,0 ℃ ,4 小时 , 定量 ;(g)MsCl,Et3N,DMAP,CH2Cl2, 室温 ,16 小 时 , 分别为 44% 和 40% 收率 ;(h)Et3N.3HF,Et3N,THF, 定量 ;(i)PivCl,DIPEA,DMAP,CH2Cl2, 室 温 ,16 小 时 ;(j)AcOH,Ac2O, 催 化 量 H2SO4, 来 自 125 的 产 率 为 92%;(k)BSA, 尿 嘧 啶 ,TMSOTf,CH3CN, 回流 2 小时 ;(I)K2CO3,MeOH, 来自 127 的产率为 74%。
     A) 核苷 118
     将 二 甲 基 亚 砜 (1.77mL,25.0mmol) 逐 滴 加 入 草 酰 氯 (1.10mL,12.5mmol) 的 二 氯 甲 烷 (60mL) 冷 溶 液 (-78 ℃ )。 搅 拌 30 分 钟 后， 向 反 应 中 添 加 醇 26(5.0g,8.4mmol) 的二氯甲烷 (20mL) 溶液。在 78 ℃下继续搅拌 45 分钟， 然后逐滴向反应中添加三乙胺 (5.05mL,37.5mmol)。 搅拌 10 分钟后， 去除冰浴并将反应 逐渐升温至约 0℃， 此时 TLC 显示 没有起始醇。以二氯甲烷稀释反应物， 并先后以 10%HCl、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机相， 干 燥 (Na2SO4) 并浓缩以提供醛 27， 其不经纯化用于下一步骤。
     B) 核苷 118
     向三苯基溴化磷 (3.88g,10.9mmol) 的干 THF(60mL) 冷搅拌溶液 (0℃ ) 逐滴添加 nBuLi(2.5M,4.34mL,10.9mmol)。 搅拌 1 小时后， 将红色溶液冷却至 -78℃， 并逐滴向反应中 添加由前面获得的醛 27(8.4mmol) 的干 THF(15mL) 溶液。将反应物逐渐加热至室温， 继续
     搅拌 16 小时。使用饱和 NH4Cl 小心淬灭反应， 且反应物在 EtOAc 和水之间分配。然后以盐 水洗涤有机层， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 10%EtOAc 的己烷溶液洗脱 ) 纯化提 供无色油状的烯烃 118(4.84g, 由 26 为 97%)。
     C) 核苷 119
     将 氟 化 四 丁 基 铵 (1M 存 在 于 THF 中， 10.00mL,10.0mmol) 添 加 至 烯 烃 118(4.83g,8.1mmol) 的 THF(35mL) 溶液。室温搅拌反应物 16 小时后， 真空去除溶剂并将 残留物溶解于 EtOAc。然后以水、 盐水洗涤有机层， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 40%EtOAc 的己烷溶液洗脱 ) 纯化提供无色油状的醇 119(2.79g,97%)。
     D) 核苷 120
     将氢化钠 (60%w/w 存在于矿物油中， 0.4g,10mmol) 添加入醇 119(1.44g,4.1mmol) 和苯甲基溴 (0.71mL,6.0mmol) 的 DMF(16mL) 冷溶液 (0℃ )。在 0℃下搅拌 1 小时后， 用水 小心淬灭反应并在 EtOAc 和水之间分配。以盐水分离并洗涤有机相， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。 柱层析 (SiO2， 以 10 至 25%EtOAc 的己烷溶液洗脱 ) 纯化提供无色油状的烯烃 120(1.84g， 定量 )。
     E) 核苷 121
     将 四 氧 化 锇 (25%OsO4 的 iPrOH 溶 液， 1mL) 添 加 至 烯 烃 120(1.80g,4.0mmol) 和 N- 甲基吗啉 -N- 氧化物 (NMO,0.94g,8.0mmol) 的 95% 丙酮 / 水 (25mL) 溶液。在室温下搅 拌 16 小时后， 向反应中再度添加 OsO4 溶液 (0.5mL) 和 NMO(0.40g)。搅拌总计 48 小时后， 以 EtOAc 稀释反应物并以 10%NaHSO3、 盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。 柱层析 (SiO2， 以 40% 至 50%EtOAc 的己烷溶液洗脱 ) 纯化提供无色油状的二醇 121(1.68g,87%, 约 1:1 的异构体 混合物 )。
     F) 核苷 122 和 123
     将 TBSCl(0.66g,4.4mmol) 添加至二醇 121(1.63g,3.4mmol) 的嘧啶 (17mL) 冷溶 液 (0 ℃ )。在 0 ℃下搅拌 4 小时后， 以 EtOAc 稀释反应物， 以水、 盐水洗涤有机层， 干燥并 浓缩。柱层析 (SiO2， 以 10 至 20%EtOAc 的己烷溶液洗脱 ) 纯化提供无色油状的醇 122 和 123(0.90g 和 1.117g， 未指定绝对立体化学 )。
     G) 核苷 124
     向 醇 123( 未 指 定 绝 对 立 体 化 学 ,0.9g,1.5mmol)、 三 乙 胺 (0.46mL,3.3mmol) 和二甲基氨基嘧啶 (37mg,0.3mmol) 的二氯甲烷 (5mL) 冷溶液 (0 ℃ ) 添加甲烷磺酰氯 (0.24mL,3.0mmol)。在室温下 7 小时后， 再向反应中添加甲基磺酰氯 (0.12mL) 和三乙胺 (0.23mL)。室温下搅拌 9 小时后， 将反应物倒入 EtOAc， 以 10%HCl、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有 机相， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 10% 至 15%EtOAc 的己烷溶液洗脱 ) 纯化提供 甲磺酸 124(0.44g,44%) 和起始的二醇 123(0.32g,40%)。
     H) 核苷 125
     向甲磺酸 124(0.44g,0.6mmol) 和三乙胺 (0.23mL,1.7mmol) 的 THF(7mL) 溶液添 加三乙胺三氢氟酸盐 (0.64mL,4.0mmol)。室温下搅拌 16 小时后， 以 EtOAc 稀释反应物， 并 以饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机相， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 50%EtOAc 的己烷 溶液洗脱 ) 纯化提供醇 125(0.40g, 定量 )。
     I) 核苷 127向 醇 125(0.72mmol,0.4g)、 二 异 丙 基 乙 基 胺 (DIPEA,0.17mL,1.0mmol) 和 二 甲 基 氨 基 嘧 啶 (12mg,0.1mmol) 的 二 氯 甲 烷 (2mL) 的 冷 溶 液 (0 ℃ ) 逐 滴 添 加 特 戊 酰 氯 (0.12mL,1.0mmol)。 去 除 冰 浴， 在 室 温 下 搅 拌 反 应 物 2 小 时， 然后再向反应中添加 DIPEA(0.17mL) 和新戊酰氯 (0.12mL)， 并在室温下搅拌 16 小时。 然后以 EtOAc 稀释反应物， 以 10%HCl、 饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机层， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩得到粗品 pivaloate 126， 其 在不作进一步纯化下使用。
     将浓硫酸 (2 滴 ) 加入粗品 pivaloate 126( 由前面获得 ) 的冰醋酸 (2.5mL) 和 乙酸酐 (0.5mL) 溶液。在室温下搅拌 2 小时后在高度真空下去除溶剂并将残留物溶解 于 EtOAc， 以饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机层， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 以 10 至 15%EtOAc 的己烷溶液洗脱 ) 纯化提供无色油状的二乙酸 127(0.45g, 来自 125 的产率为 92%)( 异构体混合物 )。
     J) 核苷 129a
     向二乙酸 127(0.45g,0.65mmol) 和尿嘧啶 (0.15g,1.3mmol) 的 CH3CN(3.5mL) 悬 浮液添加 N,O- 二 ( 三甲基硅烷基 ) 乙酰胺 (0.8mL,3.3mmol)。在 40℃下加热 15 分钟以获 得澄清溶液后， 向反应中添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸盐 (0.24mL,1.3mmol)。回流 2 小 时后， 将反应冷却至室温并倒入 EtOAc。以饱和 NaHCO3、 盐水洗涤有机层， 干燥 (Na2SO4) 并 真空浓缩以提供粗制核苷 128a， 其在不作任何纯化下使用。
     向核苷 128a(0.11g,0.15mmol) 的 MeOH(1.5mL) 溶液添加 K2CO3(40mg,0.3mmol)。 在室温下搅拌 16 小时后， 真空去除溶剂并在 EtOAc 和盐水之间分配残留物。收集有机相， 干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩， 提供 129a( 未确定绝对立体化学 )。柱层析 (SiO2， 以 35% 丙酮 1 的 CHCl3 溶液洗脱 ) 纯化提供核苷 129a(57mg, 由 127 为 74%)。 H NMR(CDCl3):δ9.37(s, 1H),7.92-7.61(m,5H),7.55-7.23(m,9H),5.58(s,1H),5.43(d,1H,J=8.1),4.79(d,1H,J-1 1.7),4.66(d,1H,J=11.7),4.58(m,2H),4.51(s,1H),4.44(m,1H),4.05(s,1H),3.95-3.72( m,4H)。LCMS ： 保留时间 3.34min;M+H 计算值 517.19， 实测值 517.1。
     实施例 18
     示 意 结 构 流 程 18(a)N-Bz- 胞 嘧 啶 或 6-N-Bz- 腺 嘌 呤 或 2- 氨 基 -6- 氯 嘌 呤 ,BSA,TMSOTf,MeCH, 回流 ;(b)K2CO3,MeOH, 室温 ,16 小时 ( 对于 129b-c);(c)NaH,3- 羟 基丙腈 , 室温 ( 对于 129d);(d)TMSCl, 嘧啶 ,BzCl 或 Bz2O,DMF( 对于 130b-c);(e)TMSCl, 嘧啶 , 异丁酰氯 ( 对于 130d)
     核 苷 128b、 128c 和 128d 可 分 别 采 用 N-Bz- 胞 嘧 啶， 6-N-Bz- 腺 嘌 呤 和 2- 氨 基 -6- 氯嘌呤通过 Vorbrugen 反应由糖前体 127 制备得到 ( 示意结构流程 18)。以 K2CO3 和 MeOH 处理 128b 和 128c 可分别提供核苷 129b 和 129c。以氢化钠和 3- 羟基丙腈处理 128d 可提供核苷 129d。以 TMSCl 瞬时保护羟基基团然后与苯甲酰氯反应可分别提供核苷 130b 和 130c。可选择地， 上述转化也可通过以 DMF 为溶剂， 将核苷 129b 和 129c 与苯甲酸酐反应 来实现。核苷 130d 可通过以存在于嘧啶中的过量 TMSCl 瞬时保护， 再与异丁酰氯反应制备 得到。
     实施例 19
     6’ - 取代类似物的制备
     示意结构流程 19
     R、 R1 和 R2 分别独立为 H、 烷基、 烯基、 炔基、 取代的烷基、 取代的烯基、 取代的炔基或 保护性基团
     可以使用二氯甲烷为溶剂， 通过如 DAST 等氟化剂处理核苷 130 制备得到核苷 131。 核苷 132 可通过首先以 Dess-Martin 高价碘或在 Swern 条件下氧化 130 的伯羟基， 然后以 DAST 处理所得的醛制备得到。核苷 133 可通过首先以 Dess-Martin 高价碘或在 Swern 条件 下氧化 130 的伯羟基， 然后在冰醋酸和还原剂 ( 例如， 硼氢化氰钠 ) 存在下以伯胺或仲胺将 所得的醛还原胺化制备得 到。 核苷 134 可通过先将 130 的羟基基团转化为离去基团 ( 甲磺 酸、 甲苯磺酸、 卤化物 )， 然后与过量的叠氮化钠加热制备得到。 核苷 135 可通过先将 130 的 伯醇氧化为羧酸， 然后在 HATU 或任意其它肽偶合剂的存在下与胺反应制备得到。核苷 136 可通过先以羰基二咪唑活化 130 的羟基基团， 然后与胺反应制备得到。核苷 137 可通过先 以适当的碱将 130 的羟基基团去质子化， 然后以烷基化试剂淬灭阴离子制备得到。 核苷 138
     可通过先将 130 的羟基基团转化为离去基团， 然后以硫醇亲核试剂取代制备得到。 核苷 139 可通过还原 134 的叠氮基团， 然后与异氰酸酯或异硫氰酸酯反应制备得到。核苷 140 可通 过还原 134 的叠氮基团并与 FmocNCS 反应提供活化的硫脲进行制备。fmoc 活化的硫醇在 EDC 存在下进一步与胺反应可提供取代胍。去除 fmoc 保护性基团释放核苷 140。
     实施例 20
     6- 取代的 BNA 亚磷酰胺核苷的制备
     示意结构流程 20
     可通过催化氢化去除核苷 130-140 的 3’ - 和 5’ -O 保护基团制备得到核苷 142。 或者， 可通过首先以 DDQ 去除 130-140 的 3’ O-Nap 基团， 然后催化氢化去除 5’ O- 苯甲基基 团制备得到 142。将 5’ 羟基基团后续保护为二甲氧基三甲苯基醚， 然后通过亚磷酰化反应 可提供亚磷酰胺 143。
     实施例 21
     6-CH2F 核苷的制备
     示意结构流程 23(a)DAST,CH2Cl2,-78℃至室温 ,16 小时 ,52%(b)DDQ,CH2Cl2,H2O,室温 ,8 小时 , 定量 ,(e)10%Pd/C,H2 气球 ,50%(d)DMTCl, 嘧啶 ,55%(e)(iPr2)2NPOCH2CH2CN, 四唑 ,NMI,DMF
     A) 核苷 (131a)
     将二乙基氨基三氟化硫 (DAS T,0.16mL,1.4mmol) 加入核苷 129a(0.1g,0.2mmol) 的二氯甲烷 (2mL) 的冷溶液 (-50℃ )。将反应逐渐加热至室温并搅拌 16 小时， 然后以饱和 NaHCO3 溶液小心淬灭反应。在 EtOAc 和盐水之间分配反应物， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层 析 (SiO2， 33%EtOAc 的己烷溶液 ) 纯化提供核苷 131a(51mg,52%, 混有 15-20% 的开环杂质 ) 的异构体混合物。19F NMR (CDCl3):δ-227.98(m) 和 -231.07(m)。LCMS ： 保留时间 3.84 分 钟； M+H 计算值 519.19， 实测值 519.1， 以及 3.89min ； M+H 计算值 519.19, 实测值 519.1。
     B) 核苷 (141a)
     向 核 苷 131a(51mg,0.1mmol) 的 二 氯 甲 烷 (1mL) 和 水 (2 滴 ) 溶 液 添 加 DDQ(44mg,0.2mmol)。室温下搅拌 8 小时后， 以 EtOAc 稀释反应物， 并以 10%NaHSO3 溶液、 饱和 NaHCO3 溶液、 盐水洗涤有机相， 干燥 (Na2SO4) 并浓缩。柱层析 (SiO2， 30% 丙酮的氯仿 19 溶液 ) 纯化提供核苷 141a(41mg, 作为异构体混合物定量 )。 F NMR(CDCl3):δ-229.3(m) 和 -230.97(m)。LCMS ： 保留时间 2.66 分钟 ;M+H 计算值 379.12， 实测值 379.0。
     C) 核苷 (142a)
     使用氢气球氢化核苷 141a(41mg, 由前面获得 ) 和 10% 钯炭 (10mg) 在甲醇 (2mL) 中的混合物。3 小时后， 所有的起始核苷 141a 被耗尽 ( 通过对反应混合物的 LCMS 分析 显示 )。以硅藻土过滤反应物并减压浓缩滤除液。柱层析 (SiO2， 10 至 20% 甲醇的氯仿溶 19 液 ) 纯化提供作为异构体混合物的核苷 142a(14mg,50%)。 F NMR(CDCl3):δ-231.45(t) 和 -232.88(dt)。LCMS ： 保留时间 1.72 分钟 ;M+Na 计算值 311.08， 实测值 311.0。
     D) 核苷 (142aa)
     向 核 苷 142a(14mg,0.049mmol) 的 嘧 啶 (0.25mL) 溶 液 添 加 DMTCl(24mg,0.07mmol)。 室 温 搅 拌 3 小 时 后 将 反 应 物 减 压 浓 缩。 柱 层 析 (SiO2， 20 至 30% 丙 酮 的 氯 仿 溶 液 ) 纯 化 提 供 作 为 异 构 体 混 合 物 的 核 苷 142aa(16mg,55%)。 19 FNMR(CDCl3):δ-228.6(t) 和 -230.91(dt)。LCMS ： 保 留 时 间 3.56 分 钟 ； M+Na 计 算 值 613.21， 实测值 613.1。
     E) 亚磷酰胺 (143a)
     亚磷酰胺 143a 可参照实施例 1 的描述通过亚磷酰化 (phosphitilation) 反应由 核苷 142aa 制备得到。
     实施例 22
     核苷亚磷酰胺的合成
     核苷亚磷酰胺可参照此处和本领域 ( 例如但不限于美国专利 6,426,220 和公开的 PCT 申请 WO 02/36743) 所述的方法进行制备。
     实施例 23
     寡核苷酸和寡核苷的合成
     如本发明所述的寡聚化合物可通过公知的固相合成技术进行常规制备。 进行该种 合成的设备已由多家销售商出售， 例如， Applied Biosystems(Foster City,CA)。 本领域已 知的任何其它该类合成方法均可额外或替代性采用。 使用类似技术制备寡核苷酸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物已众所周知。
     寡核苷酸 ： 未取代和取代的磷酸二酯 (P=O) 寡核苷酸可在自动化 DNA 合成仪 (Applied Biosystems 394 型 ) 上采用被碘氧化的标准亚磷酰胺化学法合成得到。
     除以下区别外， 硫代磷酸酯 (P=S) 的合成类似于磷酸二酯寡核苷酸 ： 采用 10%w/v 的 3,H-1,2- 苯并二硫醇 -3- 酮 1,1- 二氧化物的乙腈溶液氧化亚磷酸联接以产生硫杂化。 该硫杂化反应步骤的时间提高至 180 秒且在此之前进行常规的带帽步骤。从 CPG 柱裂解并 在 55℃下于浓氨水中去封闭 (12-16 小时 ) 后， 以大于 3 倍体积的乙醇从 1M NH4OAc 溶液中 沉淀回收寡核苷酸。亚磷酸酯寡核苷酸可参照美国专利 5,508,270 的描述进行制备。
     烷基磷酸酯寡核苷酸可参照美国专利 4,469,863 的描述进行制备。
     3’ - 脱氧 -3’ - 亚甲基磷酸酯寡聚核苷酸可参照美国专利 5,610,289 或 5,625,050 的描述进行制备。
     亚磷酰胺寡核苷酸可参照美国专利 5,256,775 或 5,366,878 的描述进行制备。
     烷 基 硫 代 磷 酸 酯 寡 核 苷 酸 可 参 照 公 布 的 PCT 申 请 PCT/US94/00902 和 PCT/ US93/06976( 分别公布为 WO 94/17093 和 WO 94/02499) 的描述进行制备。
     3’ - 脱氧 -3’ - 氨基磷酰胺酯寡核苷酸可参照美国专利 5,476,925 的描述进行制 备。
     磷酸三酯寡核苷酸可参照美国专利 5,023,243 的描述进行制备。
     硼烷磷酸酯寡核苷酸可参照美国专利 5,130,302 和 5,177,198 的描述进行制备。
     寡核苷酸 ： 亚甲基甲亚胺基连接的寡核苷 ( 也被称为 MMI 连接的寡核苷 )、 亚甲基 二甲基肼连接的寡核苷 ( 也被称为 MDH 连接的寡核苷 )、 和亚甲基羰基氨基连接的寡核苷 ( 也被称为酰胺 -3 连接的寡核苷 )、 和亚甲基氨基羰基连接的寡核苷 ( 也被称为酰胺 -4 连 接的寡核苷 )， 以及具有例如交替的 MMI 和 P ＝ O 或 P ＝ S 联接的混合骨架寡聚化合物可 参照美国专利 5,378,825 ； 5,386,023 ； 5,489,677 ； 5,602,240 和 5,610,289 的描述进行制 备。
     甲缩醛和硫甲缩醛连接的寡核苷可参照美国专利 5,264,562 和 5,264,564 的描述 进行制备。
     环氧乙烷连接的寡核苷可参照美国专利 5,223,618 的描述进行制备。
     实施例 24
     寡核苷酸分离
     从可控孔玻璃固相载体上裂解并在 55 ℃的浓氨水中去封闭 12-16 小时后， 以大 于 3 倍体积的乙醇从 1M NH4OAc 溶液中沉淀回收寡核苷酸或寡核苷。合成的寡核苷酸可 通过电喷雾质谱 ( 分子量测定 ) 和毛细管凝胶电泳进行分析。在合成中获得的硫代磷酸 酯和磷酸二酯联接的相对数量可通过正确分子量相对 -16amu 产品 (+/-32+/-48) 的比例 进行确定。在某些研究中寡核苷酸通过 HPLC 进行纯化， 例如描述于 Chiang 等人 ,J.Biol. Chem.1991,266,18162-18171。 HPLC- 纯化材料所得的结果通常类似于从非 -HPLC 纯化材料 获得的结果。
     实施例 25
     寡核苷酸合成 -96 孔板形式
     寡核苷酸可在能够以 96- 孔形式同时装配 96 个序列的自动化合成器中通过固相P(III) 亚磷酰胺化学法合成得到。 磷酸二酯核苷酸间联接可通过碘水溶液氧化得到。 硫代 磷酸酯核苷酸间联接可通过使用无水乙腈中的 3,H-1,2 苯并二硫醇 -3- 酮 1,1- 二氧化物 (Beaucage 试剂 ) 硫化得到。标准的碱基被保护的 β- 氰乙基 - 二异丙基亚磷酰胺可从销 售商 ( 例如 PE-Applied Biosystems,Foster City,CA 或 Pharmacia,Piscataway,NJ) 处购 得。非标准核苷可参照标准和专利方法进行合成。它们可作为碱基保护的 β- 氰乙基 - 二 异丙基亚磷酰胺。
     寡核苷酸从载体上裂解并在升高的温度 (55-60℃ ) 下在浓 NH4OH 中去保护 12-16 小时， 在真空下干燥所释放的产品。 将干燥的产品重悬于无菌水中以提供主平板， 从该平板 上使用机械移液管稀释得到所有的分析和测试平板样本。
     实施例 26
     采用 96- 孔板形式进行寡核苷酸分析
     各微孔中的寡核苷酸浓度可通过稀释样本和 UV 吸收广谱测定。单个产品的全长 完整性可以 96- 孔形式 (Beckman P/ACETM MDQ) 或针对单独制备的样本在商用毛细管电泳 设备 ( 例如 ,Beckman P/ACETM 5000,ABI 270) 上通过毛细管电泳 (CE) 进行评估。碱基和 骨架组成可采用电喷雾质谱对寡聚化合物进行质谱分析确定。 所有的测试平板均从主平板 采用单和多道机械移液器稀释得到。 如果平板上至少 85% 的寡聚化合物具有至少 85% 全长， 则可认为该平板可接受。
     实施例 27
     细胞培养和寡核苷酸处理
     寡聚化合物对靶标核酸表达的作用可在各种细胞类型中进行测试， 只要该靶标核 酸以可测水平在该细胞类型中存在。这可通过使用， 例如 PCR 或 Northern 印迹分析等方法 常规测定。来自多种组织和物种的细胞系可从美国菌种保藏中心 (ATCC,Manassas,VA) 获 得。
     下列提供的细胞类型仅供阐述目的， 也可常规采用其它细胞类型， 只要靶标在选 定的细胞类型中表达。这可通过本领域常规的方法， 例如， Northern 印迹分析、 核糖核酸酶 保护测定或 RT-PCR 等进行简便的测定。
     b.END 细 胞 ： 小 鼠 脑 内 皮 细 胞 系 b.END 由 Max Plank 研 究 所 (Bad Nauheim， Germany) 的 Werner Risau 博 士 提 供。b.END 细 胞 常 规 培 养 于 添 加 了 10% 胎 牛 血 清 (Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA) 的 高 糖 DMEM 中 (Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)。 在 汇 合 度 达 到 约 90% 时， 通过胰蛋白酶化和稀 释 进 行 常 规 的 细 胞 传 代。 将 细 胞 以 大 约 3000 细 胞 / 微 孔 的 密 度 接 种 至 96- 孔 板 (Falcon-Primaria#353872， BD Biosciences， Bedford， MA)， 从而用于包括但不限于寡聚化 合物转染实验。
     涉及以寡聚化合物处理细胞的实验 ：
     当细胞达到适当的汇合度时， 采用所述的转染方法以寡聚化合物对其进行处理。 TM
     LIPOFECTIN
     当 细 胞 达 到 65-75% 汇 合 度 时， 以 寡 核 苷 酸 对 其 进 行 处 理。 将 寡 核 苷 酸 与 TM LIPOFECTIN (Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA) 在 Opti-MEMTM-1 低血清培养 基 (Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA) 中混合， 以实现寡核苷酸的理想浓度，且 LIPOFECTINTM 的浓度为每 100nM 寡核苷酸 2.5 或 3μg/mL。将该转染混合物在室温下 孵育约 0.5 小时。细胞生长于 96- 孔板时， 以 100μL OPTI-MEMTM-1 洗涤微孔一次， 然后以 130μL 转染混合物处理。类似地， 用适当体积的培养基和寡核苷酸处理生长于 24- 孔板或 其它标准组织培养板中的细胞。重复两次或三次处理细胞并取得数值。在 37℃下处理约 4-7 小时后， 以新鲜培养基替换含转染混合物的培养基。 寡核苷酸处理后 16-24 小时采集细 胞。
     本领域已知的其它适用转染试剂包括， 但不限于， CYTOFECTINTM、 LIPOFECTAMINETM、 OLIGOFECTAMINETM 和 FUGENETM。 本领域已知的其它适用的转染方法包括， 但不限于电穿孔。
     实施例 28
     寡核苷酸抑制靶标表达的分析
     靶标表达的反义调节可通过本领域已知的多种方法进行测定。例如， 靶标 mRNA 水 平可通过， 例如， Northern 印迹分析、 竞争性聚合酶链式反应 (PCR) 或实时 PCR 进行定量。 目前希望采用实时定量 PCR。 可对总细胞 RNA 或 poly(A)+mRNA 进行 RNA 分析。 本发明的一种 RNA 分析方法采用总细胞 RNA， 如本文其它实施例中所描述。RNA 分离的方法已为本领域公 知。 Northern 印迹分析也是本领域的常规方法。 实时定量 (PCR) 通过使用来自 PE-Applied TM Biosystems,Foster City,CA 的 ABI PRISM 7600、 7700 或 7900 序列检测系统并参照生产 商说明得以便利地实现。
     靶标蛋白水平可通过本领域公知的多种方法进行定量， 例如免疫沉淀、 Western 印迹分析 ( 免疫印迹 )、 酶联免疫吸附测定 (ELISA) 或荧光激活细胞分类 (FACS)。针对靶 标的抗体可从多种来源例如抗体的 MSRS 目录 (Aerie Corporation,Birmingham,MI) 鉴定 并获得， 或者可通过本领域公知的常规单克隆或多克隆抗体生成方法制备得到。制备多 克隆抗血清的方法可参见， 例如， Ausubel,F.M. 等人 ,Current Protocols in Molecular Biology, 第 2 卷 , 第 11.12.1-11.12.9 页 ,John Wiley&Sons,Inc.,1997。单克隆抗体的 制备可参见， 例如， Ausubel,F.M. 等人 ,Current Protocols in Molecular Biology, 第 2 卷 , 第 11.4.1-11.11.5 页 ,John Wiley&Sons,Inc.,1997。
     免疫沉淀法是本领域的标准方法， 并可参见例如， Ausubel,F.M. 等人 ,Current Protocols in Molecular Biology, 第 2 卷 , 第 10.16.1-10.16.11 页 ,John Wiley&Sons,Inc.,1998。Western 印迹 ( 免疫印迹 ) 分析是本领域的标准方法， 并可参 见 例 如， Ausubel,F.M. 等 人 ,Current Protocols in Molecular Biology, 第 2 卷 , 第 10.16.1-10.80.21 页 ,John Wiley&Sons,Inc.,1997。 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 (ELISA) 是 本 领域的标准方法， 并可参见例如， Ausubel,F.M. 等人 ,Current Protocols in Molecular Biology, 第 2 卷 , 第 11.4.1-11.2.22 页 ,John Wiley&Sons,Inc.,1991。
     实施例 29
     对靶标抑制剂用途的表型测定和体内研究的设计
     表型测定
     一旦靶标抑制剂通过此处披露的方法进行鉴定， 可在一个或多个表型测定中进一 步考察该寡聚化合物， 其中每个测定具有预示对特定疾病状态或症状进行治疗的效力的可 测端点。
     表型测定、 其中适用的试剂盒和试剂已为本领域技术人员公知， 并在此处用于考察靶标在健康和疾病中的作用和 / 或关联。代表性的表型测定 ( 可从多个销售商中购得 ) 包括测定细胞活性、 细胞毒性、 扩增或细胞存活的测定 (Molecular Probes,Eugene,OR ； PerkinElmer,Boston,MA)， 基于蛋白的测定包括酶法测定 (Panvera,LLC,Madison,WI;BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ;Oncogene Research Products,San Diego,CA)， 细 胞调节、 信号转导、 炎症、 氧化过程以及凋亡 (Assay Designs Inc.,Ann Arbor,MI)、 甘 油 三 酯 积 累 (Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、 血 管 生 成 测 定、 管 道 形 成 测 定、 细胞因子 和 激 素 测 定 以 及 代 谢 测 定 (Chemicon International Inc.,Temecula,CA;Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。
     在一个非限制性实例中， 经测定适用于特定表型测定的细胞 ( 即， 选择用于乳腺 癌研究的 MCF-7 细胞 ； 用于肥胖研究的脂肪细胞 ) 用体外研究鉴定的靶标抑制剂和对照化 合物在最佳浓度下处理 （通过上述方法测定的） 。在处理末期， 用一种或多种对测定特异的 方法来分析经处理和未经处理的细胞来确定表型结果和终点。
     表型终点包括细胞形态随时间或处理剂量的变化以及细胞成分如蛋白、 脂质、 核 酸、 激素、 糖或金属等的水平变化。 对细胞状态 ( 包括 pH、 细胞周期阶段、 细胞对生物指示剂 的摄取或排除 ) 的检测通常是感兴趣的。
     对处理后的细胞中一种或多种基因表达的检测同样可用作靶标抑制剂的效力或 功效的指示。同时检测经处理和未经处理的细胞中的纯度印记基因或怀疑与特定疾病状 态、 症状或表型有关的那些基因。
     体内研究
     本文所述的体内研究中的个体对象为温血脊椎动物， 包括人。
     实施例 30
     RNA 分离
     Poly(A)+mRNA 分离
     Poly(A)+mRNA 的 分 离 可 参 照 Miura 等 人 的 方 法 (Clin. Chem.,1996,42,1758-1764)。其它的 poly(A)+mRNA 分离方法为本领域的常规方法。简 言之， 对于生长于 96- 孔板的细胞， 从细胞去除生长培养基并以 200μL 冷 PBS 洗涤每 个 微 孔。 向 每 个 微 孔 添 加 60μL 裂 解 缓 冲 液 (10mM Tris-HCl,pH 7.6,1mMEDTA,0.5M NaCl,0.5%NP-40,20mM 氧钒 - 核糖核苷复合物 )， 轻柔摇动平板并在室温下孵育五分钟。将 55μL 裂解产物转移至涂覆了寡聚 d(T) 包被的 96- 孔板 (AGCT Inc.,Irvine CA)。将平 板在室温下孵育 60 分钟， 以 200μL 洗涤缓冲液 (10mM Tris-HCl pH 7.6,1mM EDTA,0.3M NaCl) 洗涤 3 次。末次洗涤后， 以纸巾吸去多余的洗涤缓冲液， 然后空气干燥 5 分钟。将预 热至 70℃的 60μL 洗脱缓冲液 (5mM Tris-HCl pH 7.6) 添加至各微孔， 将平板在 90℃热板 上孵育 5 分钟， 然后将洗脱物转移至新鲜的 96- 孔板。
     生长于 100mm 或其它标准平板的细胞也可采用适当体积的所有溶液进行类似处 理。
     总 RNA 分离
     总 RNA 可采用由 Qiagen Inc.(Valencia,CA) 购得的 RNEASY 96TM 试剂盒和缓冲 液并参照生产商的推荐方法进行分离。简言之， 对于生长于 96- 孔板的细胞， 从细胞去除生 长培养基并分别以 200μL 冷 PBS 洗涤每个微孔。向每个微孔添加 150μL 缓冲 RLT 并将平板剧烈摇动 20 秒。将 150μL 的 70% 乙醇添加至各微孔， 然后通过上下吹吸三次混合内含 物。随后将样本转移至装配了废物采集盘并连接至真空源的 QIA V ACTM 集流腔所连接的 RNEASY 96TM 孔板上。抽真空 1 分钟。将 500μL 缓冲 RW1 添加至 RNEASY 96TM 板的各微孔 中并孵育 15 分钟， 再次抽真空 1 分钟。再次将 500μL 缓冲 RW1 添加至 RNEASY 96TM 板的各 微孔中并再次抽真空 2 分钟。然后将 1mL 的缓冲 RPE 添加至 RNEASY 96TM 板的各微孔中并 抽真空 90 秒钟。重复用缓冲 RPE 洗涤， 再次吸真空 3 分钟。然后从 QIA V ACTM 集流腔取 走平板并用纸巾吸干。重新将平板连接至装配了含 1.2mL 采集管的采集管架的 QIA V ACTM 集流腔。然后通过向各微孔中移入 140μL 无 RNA 酶的水， 孵育 1 分钟， 抽真空 3 分钟洗脱 RNA。
     重 复 移 液 和 洗 脱 步 骤 可 通 过 QIAGEN Bio-Robot 9604(Qiagen,Inc.,Valencia CA) 自动完成。简言之， 裂解培养平板上的细胞之后， 将平板转移至进行移液、 DNA 酶处理和 洗脱步骤的机械平台上。
     实施例 31
     靶标 mRNA 水平的实时定量 PCR 分析
     靶标 mRNA 水平可采用 ABI PRISMTM 7600、 7700 或 7900 序列检测系统 (PE-Applied Biosystems,Foster City,CA) 并参照生产商的说明通过实时定量 PCR 实现定量。这是 一个闭管、 非凝胶式荧光检测系统， 其允许对聚合酶链式反应 (PCR) 产物进行实时高通量 定量。与扩增产物在 PCR 完成后定量的标准 PCR 不同， 在实时定量 PCR 中的产物在其积 累时定量。这一点可通过在 PCR 反应中包含在正向和反向 PCR 引物之间特异性退火并包 含两个荧光染料的寡核苷酸探针来实现。报告染料 ( 例如， FAM 或 JOE， 来自 PE-Applied Biosystems,Foster City,CA,Operon Technologies Inc.,Alameda,CA 或 Integrated DNA Technologies Inc.,Coralville,IA) 被连接至探针的 5’ 端而淬火染料 ( 例如， TAMRA， 来 自 PE-Applied Biosystems,Foster City,CA,Operon Technologies Inc.,Alameda,CA 或 Integrated DNA Technologies Inc.,Coralville,IA) 被连接至探针的 3’ 端。当探针和染 料完整时， 报告染料的发射被邻近的 3’ 端淬火染料淬灭。在扩增过程中， 探针与靶标序列 的退火生成能被 Taq 聚合酶的 5’ - 核酸外切酶活性裂解的底物。在 PCR 扩增周期的延伸阶 段， Taq 聚合酶对探针的裂解从探针的剩余部分 ( 并从而由淬火部分 ) 释放了报告染料， 从 而生成了序列特异性荧光信号。在每一个周期中， 附加的报告染料分子从其相应的探针中 TM 裂解， 并可通过整合在 ABI PRISM 序列检测系统中的激光镜头定期监测荧光强度。 在每一 个测定中， 一系列包含来自未处理对照样本的 mRNA 系列稀释物的平行反应生成标准曲线， 它可用于对测试样本进行反义寡核苷酸处理后的抑制百分比进行定量。
     在定量 PCR 分析之前， 对被测靶标基因特异性的引物 - 探针组与 GAPDH 扩增反应 的 “多重性 (multiplexed)” 能力进行评估。在多重化中， 靶标基因和内标基因 GAPDH 在 单个样本中同时扩增。在该分析中， 从未处理细胞中分离 的 mRNA 被系列稀释。各稀释物 可在仅特异性靶向 GAPDH、 仅特异性靶向靶标基因 (“单重” ) 或对两者都特异 ( 多重 ) 的 引物 - 探针组的存在下扩增。PCR 扩增之后， 可同时从单重和多重样本生成作为稀释函数 的 GAPDH 和靶标 mRNA 信号的标准曲线。如果从多重样本中生成的 GAPDH 和靶标信号的斜 率和相关联系数均小于从单重样本所得相应数值的 10% 之内， 则该对靶标具有特异性的引 物 - 探针组可认为具有多重性。其它 PCR 方法已为本领域所知。RT 和 PCR 试剂可从 Invitrogen Life Technologies(Carlsbad,CA) 获得。 RT， 实时 PCR 可通过向含有 30μL 总 RNA 溶液 (20-200ng) 的 96- 孔板添加 20μLPCR 混合物 (2.5× 无 MgCl2PCR 缓冲液， 6.6mM MgCl2， dATP、 dCTP、 dCTP 和 dGTP 各 375μM， 正向引物和反向引 物各 375nM， 125nM 探针， 4 单位 RNA 酶抑制剂， 1.25 单位 PLATINUM Taq， 5 单位 MuLV 逆转 录酶以及 2.5×ROX 染料 ) 得以实现。RT 反应可通过在 48℃下孵育 30 分钟得以实现。在 95℃下孵育 10 分钟以激活 PLATINUM Taq 后， 进行 40 个循环的两步 PCR 法 ： 95℃下进行 15 秒 ( 变性 ) 后在 60℃下进行 1.5 分钟 ( 退火 / 延伸 )。
     通过 RT， 实时 PCR 得到的基因目标量通过 GAPDH( 一种表达恒定的基因 ) 的表达水 平或通过以 RIBOGREENTM(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR) 定量总 RNA 来归一化。GAPDH 表达可通过与靶标同时多重或单独运行实时 RT-PCR 来定量。总 RNA 可采用 RiboGreenTM RNA 定量试剂 (Molecular Probes,Inc.Eugene,OR) 进行定量。通过 RIBOGREENTM 进行 RNA 定量的方法可参见 Jones,L.J., 等人 ,(Analytical Biochemistry,1998,265,368-374)。
     在该测定中， 170μL 的 RIBOGREENTM 工作试剂 (RIBOGREENTM 试剂以 1:350 稀释于 10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 7.5) 以移液管移入含有 30μL 纯 化细胞 RNA 的 96- 孔板。 在 CytoFluor 4000(PE Applied Biosystems) 中读板， 激发波长为 485nm， 发射波长为 530nm。
     实施例 32
     靶标特异性引物和探针
     可采用公开的序列信息设计探针和引物， 与靶标序列杂交。
     例如， 对于人 PTEN， 可使用公开的序列信息 (GENBANKTM 录入号 U92436.1,SEQ ID NO:1) 设计下列引物 - 探针组 ：
     正向引物 ： AATGGCTAAGTGAAGATGACAATCAT(SEQ ID NO:2)
     反向引物 ： TGCACATATCATTACACCAGTTCGT(SEQ ID NO:3)
     以及 PCR 探针 ：
     FAM-TTGCAGCAATTCACTGTAAAGCTGGAAAGG-TAMRA(SEQ ID NO:4)， 其中 FAM 为荧光染 料， TAMRA 为淬火染料。
     实施例 33
     靶标蛋白水平的 Western 印迹分析
     Western 印迹分析 ( 免疫印迹分析 ) 可采用标准方法进行。在寡核苷酸处理后 16-20 小时采集细胞， 以 PBS 洗涤一次， 悬浮于 Laemmli 缓冲液 (100μl/ 微孔 )， 煮沸 5 分 钟并上样至 16%SDS-PAGE 凝胶。在 150V 下跑胶 1.5 小时， 并转移到膜上进行 western 印 迹。采用适当的针对靶标的一抗， 以及针对该一抗的放射标记或荧光标记的二抗。采用 TM PHOSPHORIMAGER (Molecular Dynamics,Sunnyvale CA) 显示条带。
     实施例 34
     靶向 PTEN 的 6-(R 或 S)-CH3 和 6-(R 或 S)-CH2-O-CH3BNA 2-10-2 带间隙寡聚体 ： 体外研究
     如本发明所述， 合成寡聚化合物并在一定剂量范围内检测其减少 PTEN 表达的 能 力。 采 用 此 处 所 述 的 方 法 以 0.3125、 0.0625、 1.25、 2.5、 5、 10 或 20nM 浓 度 的 6-(R 或 S)-CH3-BNA( 分 别 为 392748 和 392749) 以 及 6-(R 或 S)-CH2-O-CH3( 分 别 为 396004 和 396005) 修饰的寡聚体处理 b.END 细胞。 如此处其它实施例所述， PTEN 的表达水平可通过实时 PCR 测定并对 RIBOGREENTM 归一化。 所得的剂量 - 响应曲线可如下所示用于测定 EC50。 可 在 pH 7 的含 0.1mM EDTA 的 100mM 磷酸盐缓冲液中于 260nm 下使用 4μM6-(R 或 S)-CH3-BNA 或 6-(R 或 S)-CH2-O-CH3 修饰的寡聚体和 4μM 互补 RNA 评估 Tm。
     所有的核苷间联接为硫代磷酸酯， 粗体的核苷为 6-(R 或 S)-CH3BNA 核苷， 加下划 线和粗体的核苷为 6-(R 或 S)-CH2-O-CH3BNA 核苷， 而下标 R 和 S 表示了在 6 位碳原子处的 构型。应当指出 6- 修饰的 BNA 寡聚化合物显示了更大的效力， 尽管它的 Tm 略微下降。
     实施例 35
     靶向 PTEN 的 6-(S)-CH3-BNA 和 6-(R)-CH3-BNA 2-10-2 带间隙的寡聚体 ： 体内研究
     在 3 周 中 每 周 两 次 向 六 周 大 的 Balb/c 小 鼠 (Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME) 注射剂量为 0.5 或 2μmol/kg 的靶向 PTEN 的 6-CH3-BNA 修饰寡聚体 (6-(S) 或 6-(R))。在最后一次施用后 48 小时处死小鼠。将肝组织匀浆化并按照此处所述通过实时 PCR 对 mRNA 水平定量， 从而与未处理对照水平进行比较 (%UTC)。
     所有的核苷间联接为硫代磷酸酯， 粗体核苷为 6-CH3-BNA 核苷而下标 R 和 S 表示 了在 6 位碳原子处的构型。
     实施例 36
     靶向 PTEN 的 6-(S)-CH3-BNA 和 6-(R)-CH3-BNA 2-10-2 带间隙的寡聚体 ： 体内研究
     向六周大的 Balb/c 小鼠 (Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME) 注射一次剂量为 1、 2、 4 或 8μmol/kg 的靶向 PTEN 的 6-CH3-BNA 修饰的寡聚体 (6-(S) 或 6-(R))。在施用后 72 小时处死小鼠。 将肝组织匀浆化并按照此处所述通过实时 PCR 对 mRNA 水平定量， 从而与 未处理对照水平进行比较 (%UTC)。
     所有的核苷间联接为硫代磷酸酯， 粗体的核苷为 6-CH3-BNA 核苷而下标 S 和 R 表 示了 6 位碳原子处的构型。实施例 37
     靶向 PTEN 的 6-(S)-CH3-O-CH2-BNA 和 6-(R)-CH3-O-CH2-BNA 2-10-2 带间隙寡聚 体： 体内研究
     向六周大的 Balb/c 小鼠 (Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME) 注射一次剂量为 1、 2、 4 或 8μmol/kg( 以下仅显示了 8μmol/kg 的数据 ) 的靶向 PTEN 的 6-CH3-BNA 修饰的 寡聚体 (6-(S) 或 6-(R))。在施用后 72 小时处死小鼠。将肝组织匀浆化并按照此处所述通 过实时 PCR 对 mRNA 水平定量， 从而与未处理对照水平进行比较 (%UTC)。
     所有的核苷间联接均为硫代磷酸酯， 粗体和带下划线的核苷为 6-CH3-O-CH2-BNA 核苷而下标 S 和 R 表示了 6 位碳原子处的构型。
     实施例 38
     以 SVPD 处理的 6-(R 或 S)-CH3-BNA 修饰的寡聚体的核酸酶稳定性
     6-(R 或 S)-CH3-BNA( 分别为 392748 和 392749) 修饰的寡聚体的核酸酶稳定性可采 用蛇毒磷酸二酯酶 (SVPD) 进行测定。该研究分别包括了可进行比较的 6- 未取代的间隙体 (gapmer)(4’ -CH2-O-2’ 桥连的 BNA， 392745， 下标 1) 和 2’ -O-MOE 间隙体 (2’ -O-(CH2)2-OCH3， 392753, 下标 e)。各寡聚体制备为含有以下成分的 500μL 混合物 ： 5μL l00μM 寡聚体， 50μL 含于 SVPD 缓冲液 (50mM Tris-HCl， pH 7.5， 8mM MgCl2) 的 0.5 单位 /mL 磷酸二酯酶， 其最终浓度为 0.05 单位 /mL， 445μL SVP 缓冲液。 将样本在 37℃下于水浴中孵育。 在第 0、 1、 2 和 4 天取等份 (100μL) 并在第 1 和 2 天添加新鲜的酶。在等份取出后立即添加 EDTA
     以终止酶活性。在 IP HPLC/MS 上分析样本。
     所 有 的 核 苷 间 联 接 为 硫 代 磷 酸 酯， 粗 体 核 苷 为 修 饰 的 核 苷， 下标 R 和 S 表示 了 6-CH3-BNA 核苷在 6 位碳原子的构型， 下标 e 表示了 2’ -O-MOE 核苷而下标 1 表示了 4’ -CH2-O-2’ 修饰的核苷。含有 6- 甲基取代的 BNA 的化合物 (392748 和 392749) 比含有 未取代 BNA 的化合物 (392745) 具有明显的提高。
     实施例 39
     以 SVPD 处理的 6-(R 或 S)-CH3-BNA、 4’ -CH2-O-2’ BNA 和 2’ -O-MOE 修饰的寡聚体 的核酸酶稳定性
     6-CH3-BNA 修饰的寡聚体的核酸酶稳定性可采用蛇毒磷酸二酯酶 (SVPD) 进行测 定。各寡聚体制备为含有以下成分的 90μL 混合物 ： 5μL 寡聚体 (2μL5μM 寡聚体和 3μL 32 5’ P- 标记的寡聚体 )、 75μL H2O 以及 10μL 10× 缓冲液 (500mM Tris-HCl， 700mM NaCl 以及 140mM MgCl2， pH 8.6)。 在 0 分钟， 从上述制备的寡聚体样本取出 9μL 并添加至 10μL 终止缓冲液 (6.67M 尿素， 16.67% 甲酰胺和 83.3mM EDTA) 然后添加 1μL H2O 并在 100℃下 加热 2.5 至 3 分钟。通过添加 9μL SVPD(0.5 单位 /mL) 开始测定动力学。最终的酶浓度 为 0.05 单位 /mL。将每等份的 10μL 寡聚体动力学溶液添加至 10μL 终止缓冲液并按如 上所述热灭活。取 1、 3、 9、 27、 80、 240 和 1290 为动力学时间点。通过 12% 丙烯酰胺 PAGE 在 45 瓦特 / 凝胶下跑 2 小时分析样本。
     所有的核苷间联接均为硫代磷酸酯， 粗体核苷为修饰的核苷， 下标 R 和 S 表示了 6-CH3-BNA 核苷在 6 位碳原子的构型， 下标 e 表示 2’ -O-MOE 核苷而下标 1 表示 4’ -CH2-O-2’ 修饰核苷。
     实施例 40
     在 三 周、 多 剂 量 体 内 研 究 中 靶 向 PTEN 的 6-(S)-CH3-BNA、 4’ -CH2-O-2-BNA 和 2’ -O-MOE 修饰的寡聚体
     在 三 周 中 每 周 两 次 向 六 周 大 的 Balb/c 小 鼠 (Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME) 注射剂量为 3.2、 1.0、 0.32 和 0.1μmol/kg( 以下仅显示了 3.2 和 1μmol/g 的 数据 ) 的靶向 PTEN 的 6-(S)-CH3-BNA(2-10-2,14- 聚体 )、 4’ -CH2-O-2’ -BNA(2-10-2,14- 聚 体 ) 和 2’ -O-MOE(5-10-5,20- 聚体 ) 修饰的寡聚体。在最后一次施用后 48 小时处死小鼠。 将肝组织匀浆化并按照此处所述通过实时 PCR 对 mRNA 水平定量， 从而与未处理对照水平进 行比较 (%UTC)。处死后测定血浆化学和肝重。
     所 有 的 核 苷 间 联 接 为 硫 代 磷 酸 酯， 粗 体 核 苷 为 修 饰 的 位 置， 下标 s 表示 Me 6-(S)-CH3-BNA， 下标 1 表示 4’ -CH2-O-2’ BNA， 下标 e 表示 2’ -O-MOE 而 C 表示 5’ - 甲基 胞嘧啶核苷。
     在 研 究 的 最 高 点，含 4’ -CH2-O-2’ BNA(392063， 3.2μmol/Kg 剂 量 组 ) 的 寡 聚 体 的 高 剂 量 组 动 物 显 示 肝 重 明 显 升 高 的 ( 相 对 盐 水 为 153%)。 与 之 相 对， 含 6-(S)-CH3BNA(392749， 3.2μmol/Kg 剂 量 组 ) 寡 聚 体 的 肝 重 为 盐 水 组 的 117%。 含 2’ O-MOE(116847， 1.0μmol/Kg 剂量组 ) 寡聚体的肝重为盐水组的 116%。该实施例证明了 6-(S)-CH3-BNA 修饰在允许设计的反义寡聚体保持 4’ -CH2-O-2’ BNA 所赋予的效力的同时， 其 ALT 水平相对 4’ -CH2-O-2’ BNA 修饰的化合物有显著提升。
     实施例 41
     靶向 PTEN 的 6-(R 或 S)-CH3 和 6-(R 或 S)-CH2-OCH3、 4’ -CH2-O-2’ BNA 2-10-2 带 间隙的寡聚体 ： 体内研究
     向六周大的 Balb/c 小鼠 (Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME) 注射一次剂量为 2.5、 5、 10 和 20μmol/kg( 以下仅显示了 5 和 10μmol/kg 的数据 ) 的靶向 PTEN 的修饰的 6-(R 或 S)-CH3( 分别为 396568 和 396024)、 6-(R 或 S)-CH2-OCH3( 分别为 396007 和 396008)、 4’ -CH2-O-2’ BNA 2-10-2 带间隙的寡聚体 (6-(S) 或 6-(R))。在施用后 66 小时处死小鼠。 将肝组织匀浆化。
     所有的核苷间联接均为硫代磷酸酯， 粗体的核苷为修饰的核苷， 下标 R 和 S 表示所 示的 6-CH3-BNA( 仅粗体 ) 和 6-CH2-O-CH3-BNA( 粗体并带下划线 ) 核苷在 6 位碳原子的构 型， 下标 1 表示 4’ -CH2-O-2’ 核苷而 MeC 表示 5’ - 甲基胞嘧啶核苷。
     上述寡核苷中， 一个寡核苷 (Isis No.392063) 在 6 位碳原子处不含手性核苷， 其 中其它四个 (Isis No.396024、 396568、 396008 和 396007) 在 6 位碳原子处含手性的核苷。 特别地， 这四个寡核苷在 1、 2、 13 和 14 位具有一个该种核苷。在肝中， 在 6 位碳原子处不含 手性核苷的寡核苷比包括在 6 位碳原子处含手性核苷的四个寡核苷具有相对更高的毒性。
     实施例 42
     靶向 PTEN 的 2-14-2 带间隙的寡聚体 ： 体内研究
     在向六周大的 Balb/c 小鼠 (Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME) 注射一次剂量 为 2 或 10μmol/kg 的靶向 PTEN 的 6-CH3-BNA 修饰的寡聚体。在施用后 72 小时处死小鼠。 将肝组织匀浆化并按照此处所述通过实时 PCR 对 mRNA 水平定量， 从而与未处理对照水平进 行比较 (%UTC)。
     所有的核苷间联接均为硫代磷酸酯， 粗体的核苷为修饰的核苷， 下标 R 和 S 表示所 示的 6-CH3-BNA 和 6-CH2-O-CH3-BNA 核苷在 6 位碳原子的构型， 下标 e 表示 2’ -O-MOE 核苷 Me 而 C 表示 5’ - 甲基胞嘧啶核苷。
     此处所引用的所有出版物、 专利和专利申请均纳入本文作为参考。尽管在前述的
     说明书中本发明通过某些优选实施方案进行了描述， 且为了阐述的 目的列举了众多具体 内容， 本领域技术人员显然理解本发明可采用其它的实施方案， 且此处所述的某些具体内 容可在不悖离本发明基本原则的情况下进行相当的改变。70