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1、(10)申请公布号 CN 102755315 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102755315 A *CN102755315A* (21)申请号 201210276903.3 (22)申请日 2012.08.06 A61K 31/365(2006.01) A61P 37/02(2006.01) A61P 1/00(2006.01) A61P 19/02(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P 21/04(2006.01) (71)申请人 南京大学 地址 210093 江苏省南京市汉口路 22 号 (72)发明。
2、人 徐强 吴雪丰 孙洋 陈功 (54) 发明名称 梣酮在制备治疗免疫性疾病药物中的应用 (57) 摘要 本发明属于药学领域， 特别涉及梣酮在制备 治疗免疫性疾病药物中的应用。本发明首次提出 梣酮在制备治疗免疫性疾病药物中的应用， 特别 对于免疫性肠炎治疗， 可以做新用途申报化药 1 类新药， 拓展了该化合物的新用途。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 3 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 梣酮在制备治疗免疫性疾病药物中的应用。 2。
3、. 梣酮在制备治疗免疫性疾病药物中的应用， 其特征在于所述的免疫性疾病为免疫性 肠炎。 3. 根据权利要求 1 所述的梣梣酮在制备治疗免疫性疾病药物中的应用， 其特征在于所 述的免疫性疾病为迟发型超敏反应、 类风湿关节炎、 多发性硬化症、 胰岛素依赖性 / 胰岛素 抵抗的糖尿病、 自身免疫性心肌炎、 桥本氏病、 Grave s 病或重症肌无力。 权 利 要 求 书 CN 102755315 A 2 1/6 页 3 梣酮在制备治疗免疫性疾病药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于药学领域， 特别涉及梣酮在制备治疗免疫性疾病药物中的应用。 背景技术 0002 自身免疫性的肠炎是临床上的多发病和。
4、难治性疾病， 包括克罗恩氏病和溃疡性结 肠炎。 免疫性肠炎经常从青少年时就发病， 据报道发病率高达每年410/100000人。 终身 难愈， 后期会发展成各种胃肠道疾病包括肠癌， 伴随着较高的死亡率。 目前临床上主要通过 抗生素抑制肠道菌群， 从而对疾病进程进行控制， 但在治疗过程缺乏直接有效的治愈手段， 而且所用的药物具有强烈的副作用。 0003 梣酮(fraxinellone)是由Dictamnus dasycarpus的根部树皮中提取而出的内酯 类化合物。 对该化合物在药理学方面的活性研究及报道非常少。 SunY等人曾报道该化合物 在对肝损伤模型具有良好的保护作用 (Sun， et al。
5、.Biochem Pharmcol2009， 77 ： 1717. 冉启 琼等 . 药学学报 2007， 42 ： 675.)。另一方面， 极大剂量的梣酮展现出一定的杀虫作用 (Liu， et al. 中国昆虫科学 ： 英文版， 2009， 2 ： 147-155.) 本发明研究了梣酮对免疫性疾病的药理 作用。ZL2005100408789 公开了梣酮作为肝病治疗药物的应用。上述文献只是报道了有关 肝病或杀虫作用， 并没有报道有关治疗免疫性方面的疾病， 特别是有关肠炎的报道。 0004 梣酮 (fraxinellone) 的结构式如下 ： 0005 发明内容 0006 发明目的 0007 首次。
6、提出梣酮治疗免疫性方面疾病， 特别是免疫性肠炎， 增加了该化合物的适应 症， 为老药新用提供依据。 0008 技术方案 0009 梣酮在制备治疗免疫性疾病药物中的应用。 0010 作为一种优化方式所述的免疫性疾病为免疫性肠炎。 0011 作为一种优化方式所述的免疫性疾病为迟发型超敏反应、 类风湿关节炎、 多发性 硬化症、 胰岛素依赖性 / 胰岛素抵抗的糖尿病、 自身免疫性心肌炎、 桥本氏病、 Grave s 病、 重症肌无力。 0012 有益效果 说 明 书 CN 102755315 A 3 2/6 页 4 0013 本发明首次提出梣酮在制备治疗免疫性疾病药物中的应用， 特别对于免疫性肠炎 治。
7、疗， 可以做新用途申报化药 1 类新药， 拓展了该化合物的新用途。具体为 ： 0014 梣酮口服能够有效的， 剂量依赖性的改善 DSS 诱导的小鼠肠炎症状。梣酮可以改 善小鼠的体重下降和肠炎活动指数(图1， A和B)， 抑制肠炎小鼠肠长度下降， 肠重量/长度 比下降的性状 ( 图 1， C 和 D)。对肠炎小鼠的组织切片也可以证实这点， 通过对组织切片的 观察可以发现， 炎症小鼠肠组织中炎症细胞增加， 杯状细胞减少， 黏膜增厚， 黏膜下层浸润， 肠组织结构损坏的情况， 通过口服梣酮都有了明显的剂量依赖性的好转 ( 图 2)。通过对炎 症小鼠血清中炎症相关细胞因子的考察以及炎症小鼠肠组织中炎症有。
8、关细胞因子的 mRNA 水平的考察发现， 在口服了梣酮的小鼠中， 血清中 IL-1 的表达量有明显的下降 ； 而在小 鼠肠组织中， IL-1， TNF-， iNOS， COX-2， IL-6 等细胞因子的 mRNA 水平也有显著下降 ( 图 3)。 0015 在肠炎的发生发展过程中有许多炎症细胞因子的参与。本研究通过体外培养 THP-1 细胞观察梣酮对免疫细胞和免疫性细胞因子的影响。刺激 THP-1 细胞使其向巨噬细 胞分化， 再用 DSS 加以刺激， 可以考察梣酮在其中起到的作用。实验表明， 梣酮可以剂量依 赖性的下调 THP-1 细胞中 NO 的释放量， 从 RNA 水平下调 iNOS 以。
9、及 COX-2 的表达量 ( 图 4)。 这也显示了梣酮可能通过影响巨噬细胞及相关炎症因子改善 DSS 诱导的肠炎。 0016 以上结果提示， 梣酮 (fraxinellone) 可以应用于包括克罗恩氏病和溃疡性结肠 炎在内的肠道疾病以及其它多种细胞因子相关的自身免疫性疾病， 如迟发型超敏反应、 类 风湿关节炎、 多发性硬化症、 胰岛素依赖性 / 胰岛素抵抗的糖尿病、 自身免疫性心肌炎、 桥 本氏病、 Grave s 病、 重症肌无力等。 附图说明 0017 图 1. 梣酮对小鼠 DSS 诱导肠炎的改善作用。(A) 梣酮 (15， 30mg/kg) 灌胃给药， 各组小鼠的体重变化。结果以 me。
10、ans.d. 表示。*P 0.05， *P 0.01， vs 正常小鼠 ； #P 0.05， #P 0.01， vs 模型小鼠 (Students t test)。(B) 梣酮 (15， 30mg/kg) 灌胃给药， 对模型小鼠疾病活动度 (DAI) 的影响。*P 0.05， vs 模型小鼠 (Students t test)。(C) 梣酮 (15， 30mg/kg) 灌胃给药对模型小鼠结肠组织的保护效应。(D) 梣酮 (15， 30mg/kg) 灌 胃给药， 对模型小鼠肠组织长度的影响。 (E)梣酮(15， 30mg/kg)灌胃给药， 对模型小鼠肠组 织重量的影响。*P 0.05， vs 正。
11、常小鼠 ； #P 0.05， vs 模型小鼠 (Students ttest)。 0018 图2.梣酮对小鼠炎症结肠病理组织学检查指标的改善作用。 (A)正常肠组织 ； (B) DSS 模型组肠组织 ； (C). 梣酮 (15mg/kg) 灌胃给药组肠组织 ； (D) 梣酮 (30mg/kg) 灌胃给药 组肠组织。组织切片作 HE 染色。放大倍数 100。 0019 图 3. 梣酮对肠炎小鼠肠道组织和血清中的炎症因子表达、 产生的抑制作用。用 ELISA 的方法检测血清中 IL-1 的水平 (A)， 用 RT-PCR 的方法检测肠组织中 IL-1， TNF-， iNOS， COX-2， IL-。
12、6 的表达 (B)。*P 0.01， vs 正常小鼠 ； #P 0.01， vs 模型小 鼠 (Students t test)。 0020 图 4. 梣酮对 THP-1 细胞的 iNOS-NO 含量的影响。用 PMA 诱导培养的 THP-1 细胞 向巨噬细胞分化， 再分别用 7.5M， 15M， 30M 梣酮预处理， 用 10g/mlDSS 刺激 24h， 测 量其上清中的 NO 含量 (A) ； 并提取细胞 RNA， 用 RT-PCR 的方法测量其中 iNOS 和 COX-2 的 说 明 书 CN 102755315 A 4 3/6 页 5 mRNA 水平 (B)。*P 0.01， vs 。
13、正常小鼠 ； #P 0.01， vs 模型小鼠 (Students t test)。 具体实施方式 0021 实施例 1 梣酮的药理试验 0022 1) 小鼠肠炎的诱导 0023 C57BL/6 雌性小鼠 24 只按体重随机分组， 分为梣酮 ( 梣酮购自上海科研用品丽臣 专卖， 纯度为 99.3 ) 高 (30mg/kg)、 低 (15mg/kg) 剂量组 ； 空白组、 模型组共 4 组， 各组 6 只。各药组灌胃给药， 从造模前 3 天前起提前给药， 每天 1 次， 连续 14 天。空白组及模型组 灌胃给 PBS， 除了空白组， 均在小鼠每日饮用水中加入 3.5 DSS( 葡聚糖硫酸钠盐， 。
14、购自 MP 公司)。 造模过程中每天测量小鼠体重并观察小鼠粪便， 造模成功后， 禁食18-24h后眼眶取 血， 冰上静置 30min 再室温静置 30min 后， 3000rpm 离心 15min， 收集血清， 取小鼠结肠备做 后续研究。 0024 2) 小鼠炎症症状的观察和结肠组织病理变化的评分 0025 分别对结肠和 H&E 染色的石蜡切片做宏观学和微观学评分， 疾病活动度用大便情 况作为疾病活动度 (DAI) 评价， 具体评分标准见表 1。 0026 表 1DAI 评分细则 0027 0028 组织学评分根据炎症细胞数量， 杯状细胞数量， 黏膜层厚度， 下层黏膜细胞浸润情 况评定， 具体。
15、见表 2。 0029 表 2 组织学评分 说 明 书 CN 102755315 A 5 4/6 页 6 0030 0031 3) 组织总 RNA 的提取 0032 从小鼠结肠样本中剪取约 0.5cm 左右长度， 用匀浆器初步匀浆， 用 Trizol 试剂匀 浆提取组织总 RNA。具体操作如下 ： 在 RNase-free 的离心管中， 加入 1mlTrizol， 混匀。再 加入 0.2ml 氯仿， 混匀， 室温放置 2-15min。4 摄氏度、 12000g 离心 15min， 将上清移至另一 个RNase-free的离心管中， 加入等体积的异丙醇， 上下颠倒混匀， 于室温放置5-10min，。
16、 4摄 氏度， 12000g 离心 15min， 弃上清。加入 1ml 75的乙醇， 4 摄氏度， 7500g 离心 10min， 弃 上清后于室温干燥 5-15min。溶于 50l 0.1 RNase-free ddH2O， 混匀后 58 摄氏度水浴 15min， 用蛋白核酸检测仪 (Eppendorf， Germany) 测定 A260/A280 比值在 1.8-2.0 之间， 说 明 RNA 样品纯度理想。保存于 -80 度， 待用。 0033 4)RT-PCR 检测 mRNA 表达水平 0034 采用逆转录试剂盒(购自invitrogen公司)合成cDNA， 20l反应体系如下 ： 1。
17、g total RNA， 11.75l nuclease-free water， 4l 5RT buffer， 2l dNTP， 1l Oligo dT， 0.25l RNase inhibitor 和 0.5l Rever Tra Ace ； 反应程序如下 ： 30 度， 10min ； 42 度， 20min ； 99 度， 5min ； 4 度， 5min 获得了 cDNA， -20 度保存待用。 0035 利用上述 cDNA 模板 PCR 扩增 IL-1， TNF-， iNOS， COX-2， IL-6 以及 IL-10。取 上述 cDNA 1l 加入 13.8l ddH2O， 再加入。
18、 2l10Buffer、 1.6l mg2+、 0.4ldNTP、 1l 引物和 0.2l Taq DNA 聚合酶， 用 PCR 仪 (ABI) 进行扩增。PCR 引物如下 ： 0036 GAPDH ： 5 -AACGACCCCTTCATTGAC-3 ， 0037 5 -TCCACGACATACTCAGCAC-3 ； 0038 IL-6 ： 5 -ATGAACTCCTTCTCCACAAGC-3 ， 0039 3 -CTACATTTGCCGAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-5 ； 0040 IL-1 ： 5 -CTGAAAGCTCTCCACCTC-3 ， 0041 5 -CTTTGAA。
19、CAGAATGTGCC ； 0042 TNF- ： 5 -CCATCGGACGGGCTGTACCTC-3 ， 0043 5 -CTCGGCGCTGAGTCGGTCTC-3 ； 0044 IL-10 ： 5 -TGC CAA GCC TTG TCA GAAATG ATC AAG-3， 0045 5 -GTA TCC AGA GGG TCT TCA GCT TCT CTC-3 ； 0046 iNOS ： 5 -GTG GTG ACAAGC ACA TT TGG-3， 0047 5 -GGC AGC CTC T TG TCT TTGAC-3 ； 说 明 书 CN 102755315 A 6 5/6 。
20、页 7 0048 COX-2， 5 -TCA AGT CCC TGA GCA TCT AC-3， 0049 5 -CATTCCTACCACCAGCAACC-3。 0050 PCR 产物在含 1mg/ml EB 的 1.5琼脂糖凝胶上电泳， 凝胶置于 UVP 电泳成像系统 中扫描、 成像和拍照。 0051 5) 血清中炎症因子的测定 (CBA 法 ) 0052 BDTM Cytometric Bead Array(CBA)， Mouse IL1-ELISA Kit( 购自北京达科为 公司 ) 可以测定血清中的 IL-1 的含量。具体测定方法见试剂盒说明。 0053 6) 细胞培养 0054 TH。
21、P-1 细胞 ( 人急性单核细胞性白血病细胞 )( 购自中国科学院上海细胞生物研 究所 )。于 DMEM 培养基， 10 FBS， 37， 5 CO2 条件下培养， 用于检测其中 NO 的释放， 于 RPMI-1640 培养基， 10 FBS， 37， 5 CO2 条件下培养， 用于检测其中细胞因子的表达。 0055 7)Griess 法检测 NO 释放。 0056 THP-1 细胞在 DMEM 培养基中培养给予 160nmol/l 佛波酯 (phorbol myristate acetate， PMA) 孵育 6h 使其向巨噬细胞分化， 用不同浓度的梣酮预处理 3 小时后加 10g/ ml 。
22、DSS 刺激。用 Griess 法测细胞上清中 NO 的表达量。 0057 8) 细胞中 RNA 的提取 0058 取对数生长期的细胞 5106， 加入 1ml tripure 匀浆， 4以 12000g 离心 10 分钟， 转移上清至新 eppendorf 管中， 室温静置 5 分钟， 再加入氯仿 200l， 剧烈颠倒混匀 15 秒， 室温静置 2-15 分钟， 12000g 离心 15 分钟后， 将上清移至新 eppendorf 管中， 加入等体积异 丙醇混匀， 上下颠倒几次， 室温静置 5-10 分钟后 12000g 离心 10 分钟， 弃上清， 以 70乙醇 洗涤沉淀， 7500g 离。
23、心 5 分钟， 弃上清， 待乙醇蒸发后加入 30l DEPC-treated water 溶解 RNA。 0059 9) 统计 0060 数据以 meanSD 表示。对于多组之间的比较， 先用单因素方差 (ANOVA) 进行统计 分析， 如果有显著性差异 (P 0.05)， 再以 Student s two-tailed t-test 来检验各组间 的差异。 0061 3. 梣酮的药理试验结果及分析 0062 1) 梣酮对 DSS 诱导肠炎的影响 0063 如图 1A 所示， DSS 模型组小鼠从第 8 天开始出现体重明显下降的现象， 从第 14 天 开始出现小鼠的大量死亡， 每天给 15mg。
24、/kg 以及 30mg/kg 的梣酮能不同程度的显著逆转体 重下降， 并提高存活率。 0064 15mg/kg和30mg/kg的梣酮还可以不同程度地降低小鼠的疾病活动度(DAI)， 见图 1B。同时， 梣酮可以剂量依赖性的逆转 DSS 诱导的小鼠炎性肠病造成的结肠长度重量下降 的症状 ( 图 1C， D)。 0065 2) 梣酮抑制肠炎小鼠炎症局部的病理损伤和炎性细胞浸润 0066 肠组织切片分析显示在模型中有典型的结肠炎特点如隐窝畸变， Goblet 细胞丢 失， 单核细胞侵润和严重的粘膜损伤。这些病变可被 15 或 30mg/kg 的梣酮显著改善， 评分 标准见上表 2。 0067 如图 。
25、2 所示， 普通组小鼠肠壁各层结构清晰， 粘膜上皮含大量杯状细胞， 无变性坏 说 明 书 CN 102755315 A 7 6/6 页 8 死， 固有层内血管无扩张充血， 无水肿， 可见少许淋巴细胞、 粘膜肌层无著变 ； 粘膜下层血管 无扩张充血， 无炎细胞浸润， 肌层亦无无水肿及炎细胞浸润 ； 浆膜层无炎细胞浸润。模型组 小鼠结肠粘膜上皮细胞大部分缺失， 上皮损伤脱落形成缺损， 严重处累及至粘膜下层， 粘膜 固有层血管扩张充血， 可见较多淋巴细胞、 单核细胞、 浆细胞和中性粒细胞浸润 ； 粘膜下层 有大量炎细胞浸润 ； 肌层和浆膜层未见明显异常变化。梣酮低剂量组小鼠组织学形态基本 同模型组，。
26、 与模型组相比病变总体程度明显减轻。 主要表现为粘膜上皮坏死脱落缺损， 代之 以大量的炎细胞浸润， 可见连续的粘膜上皮， 呈现多灶性的面积相对较小的缺损， 粘膜固有 层和粘膜下层有大量炎细胞浸润， 肌层和浆膜层未见明显异常。梣酮高剂量组小鼠病变总 体程度较模型组明显减轻。 粘膜损伤面积明显减小， 且未突破粘膜肌层， 浸润的炎细胞数量 有明显减少。 0068 3)梣酮抑制肠炎小鼠血清中IL-1的释放量并且从mRNA水平上抑制小鼠肠组织 中各炎症相关细胞因子的释放量。 0069 我们分离了小鼠血清， 并且提取了小鼠结肠细胞中的 RNA， 用于分析其中炎性细胞 因子的表达量。 结果显示， 梣酮对一些。
27、重要的炎症细胞因子如IL-1， TNF-， iNOS， COX-2， IL-6以及IL-10都有较为明显的抑制效果。 说明梣酮的抗炎效果可能与以上细胞因子所涉 及的信号通路有关。如图 3 所示。 0070 4) 梣酮抑制 THP-1 细胞中 NO 的释放及 DSS 引起的 iNOS 和 COX-2 表达量的增加 0071 THP-1细胞培养后， 用PMA诱导其向巨噬细胞分化。 6小时后可见80的细胞由悬 浮状态变为贴壁状态， 且细胞形态有圆形变为梭形、 椭圆形、 不规则形， 提示单核细胞已分 化为巨噬细胞。再分别用 7.5M， 15M， 30M 梣酮预处理后， 用 10g/ml DSS 刺激 。
28、24h， 测量其上清中的NO含量 ； 并提取细胞RNA， 用RT-PCR的方法测量其中iNOS和COX-2的mRNA 水平。 0072 由图 4 可见， 梣酮可以剂量依赖性的抑制 DSS 刺激的 THP-1 细胞内 NO 释放量的增 加。同时， 细胞中 COX-2 和 iNOS 的 mRNA 水平都有所下降。 说 明 书 CN 102755315 A 8 1/3 页 9 0001 序 列 表 CN 102755315 A 9 2/3 页 10 0002 0003 序 列 表 CN 102755315 A 10 3/3 页 11 序 列 表 CN 102755315 A 11 1/2 页 12 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102755315 A 12 2/2 页 13 图 4 说 明 书 附 图 CN 102755315 A 13 。