一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白及其制法和用途.pdf

本发明属生物技术领域，具体公开了一种肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白融合蛋白及其制法和用途。该融合蛋白是由膜联蛋白、连接肽、肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白组成的，通过克隆构建该融合蛋白的编码基因。该肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白融合蛋白具有显著增强的诱导细胞凋亡的效果，能够使得诱导对细胞凋亡不敏感的肿瘤细胞凋亡，能够降低获得治疗效果所需要的蛋白给药剂量。

1.  一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白，其特征在于：它包括膜联蛋白的氨基酸序列、肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白的氨基酸序列、以及位于膜联蛋白氨基酸序列和肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白氨基酸序列之间的连接肽序列3部分，其中所述的膜联蛋白是指具有磷脂结合活性的膜联蛋白家族成员或具有磷脂结合活性的膜联蛋白家族成员衍生物，所述的肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白是指肿瘤坏死因子家族中具有诱导细胞凋亡活性的成员蛋白质或具有诱导细胞凋亡活性的肿瘤坏死因子家族成员衍生物。

2.  一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白，其特征在于：它包括膜联蛋白V的氨基酸序列或具有磷脂结合活性的膜联蛋白V衍生物序列、肿瘤坏死因子相关凋亡配体的氨基酸序列或具有诱导细胞凋亡活性的肿瘤坏死因子相关凋亡配体衍生物序列、以及位于膜联蛋白V的氨基酸序列和肿瘤坏死因子相关凋亡配体氨基酸序列之间的连接肽序列3部分。

3.  根据权利要求1或2所述的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白，其特征在于：所述连接肽序列由1-30个氨基酸残基构成。

4.  根据权利要求1或2所述的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-6中所示。

5.  一种分离的DNA分子，其特征在于：它编码权利要求1所述的融合蛋白。

6.  根据权利要求5所述的DNA分子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：7-12中所示。

7.  一种载体，其特征在于：它含有权利要求5或6所述的DNA分子。

8.  一种宿主细胞，其特征在于：它含有权利要求7所述的载体。

9.  根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于：它包括重组大肠埃希菌BL21。

10.  一种制备权利要求1-4任一项所述的融合蛋白的方法，其特征在于，它包括如下步骤：在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和分离所述的融合蛋白。

11.  根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：所述宿主细胞在低温下进行培养和诱导表达，所述低温指10-35℃。

12.  根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：所述分离融合蛋白采用离子交换层析和金属亲和层析。

13.  根据权利要求1或2所述的一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白在制备诱导细胞凋亡的治疗药物中的应用。

14.  根据权利要求1或2所述的一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白在制备肿瘤治疗药物中的应用。

15.  根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述应用包括将所述融合蛋白单独用于制备肿瘤治疗药物，或与现有的肿瘤治疗药物联合用药，或与现有的肿瘤治疗药物组成组合物，或与现有化疗、放疗、中药治疗、生物治疗等方法在肿瘤治疗中联合应用。

16.  一种药物组合物，其特征在于：包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的权利要求1或2所述的融合蛋白。

一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白及其制法和用途
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白及其制法和用途。
背景技术
癌症是世界上导致死亡的第二大因素。目前治疗癌症的方法除手术外，主要是化疗和放疗，但这两种方法缺乏特异性，具有明显的细胞毒性。理想的抗肿瘤药物是能选择性地杀死肿瘤细胞而不伤害正常细胞。许多化疗药物是通过诱导凋亡来杀死肿瘤细胞的，肿瘤细胞也会通过产生抑制凋亡的机制而导致化疗的失败。因此，凋亡通路成为研制抗肿瘤药物的最具吸引力的靶点。
自从Aggarwal等人1984年分离并鉴定出首个肿瘤坏死因子（TNF）至今，这个蛋白家族已有19名成员。肿瘤坏死因子家族成员通过与其受体家族--肿瘤坏死因子受体家族相互作用，发挥重要生理作用。肿瘤坏死因子及其受体家族系统在自身免疫性疾病、细菌和病毒感染、肿瘤、糖尿病、骨质疏松等多种疾病的发生与发展中起关键作用。因此，大部分肿瘤坏死因子及其受体家族成员被作为多种疾病的药物靶点进行广泛开发。美国食品药品管理局（FDA）已批准5种TNF阻断剂药物上市销售，主要用于关节炎、牛皮癣、克罗恩病等炎症和自身免疫疾病治疗，其中有三种药物的销售额已跻身于美国“重磅炸弹”（年销售额过10亿美元）行列，成为最成功的生物技术类药物之一。2010年11月FDA批准肿瘤坏死因子家族成员之一-RANKL的人源化抗体（Xgeva）用于防治肿瘤转移相关的骨破坏病症；近期，FDA又批准另外一种肿瘤坏死因子家族成员BAFF的中和抗体（Benlysta）用于系统性红斑狼疮（SLE）治疗。另外，还有多种肿瘤坏死因子及其受体家族成员相关药物正处于不同的临床试验阶段。肿瘤坏死因子及其受体家族成为药物开发中的明星家族，相信不久的将来会有更大的发展。肿瘤坏死因子及其受体家族成员中，大部分肿瘤坏死因子家族成员均可以表达为Ⅱ型跨膜蛋白，包括氨基端的胞内区、跨膜区、羧基端的胞外区三部分。肿瘤坏死因子家族成员的胞外区结构比较类似，都是由多条反向平行的β折叠片层组成典型的β蛋卷结构，在与受体结合的几个区域，氨基酸序列比较保守。大部分跨膜型TNF家族成员胞外区 可以被特定的酶水解产生可溶性蛋白；可溶性与膜结合型TNF家族成员与受体结合能力相似，但是可以激活不同的信号途径，介导不同的生理与病理作用。
到目前为止，大约有19种肿瘤坏死因子超家族的成员被克隆出来，有部分已经作为药物使用如TNFα，TNFβ，大部分还处于临床阶段，如FasL、TRAIL、TWEAK、RANKL等。其中，大部分肿瘤坏死因子家族成员（例如，FasL、TNF、TRAIL等）都是通过诱导细胞凋亡发挥其生物学及其治疗功能。以下仅以肿瘤坏死因子相关凋亡配体为例，说明肿瘤坏死因子家族成员诱导细胞凋亡的作用、应用及其面临的问题。
肿瘤坏死因子相关凋亡配体（TRAIL）是肿瘤坏死因子（TNF）超家族的又一成员，自从1995年被发现以来，因为其能诱导一系列的肿瘤细胞凋亡而不影响正常细胞而成为具有重要应用前景的抗肿瘤生物药物（Walczak.H等，1999，Nat.Med5:157-163）。TRAIL是分子量为30KD的Ⅱ型跨膜蛋白，能被半胱氨酸蛋白酶加工成分子量为20KD的可溶性蛋白（S.M.Mariani等，1998，Eur.J.Immonol28:973-982）。TRAIL的N端区域是不保守的，但C端与该家族的其它成员有高度的保守性。TRAIL是该家族唯一含有半胱氨酸Cys230的蛋白，该Cys230使三个TRAIL分子能相互作用。与该Cys结合的锌离子对维持三聚体结构、可溶性以及正常的生物学功能具有重要的作用（Mongkolsapaya J等，Nat Struct Biol6:1048-1053）。本发明中所称的TRAIL是指可溶性的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，通常是指、但不局限于肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体114-281氨基酸序列，其中包括了由肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体衍生物（截短的、加长的、突变的突变体蛋白质）。TNF超家族的成员FasL以及TNFα的表达是严格控制的、并且只短暂表达于一些活化的细胞中；但TRAIL在多种正常组织包括淋巴细胞，脾，胸腺，前列腺，卵巢以及肠等组织中组成型表达（在脑和肝脏中不表达）（Wiley,S.R.等，1995，Immunity3:673-682）。在体内，系统给药时，FasL以及TNFα除了能诱导肿瘤细胞凋亡外还能引起炎症反应以及肝毒性，但TRAIL不会（Ashkenazi,A.等，1998，Science281：1305-1308）。因此，TRAIL是一种有前景的抗肿瘤药物。
凋亡主要由两条通路引起，即胞外信号通路和胞内信号通路，但这两条通路最终激活相同的凋亡效应半胱氨酸蛋白酶（Caspase）和凋亡效应分子。胞内凋亡信号通路是由严重的DNA损伤、缺氧以及其它压力引起的（如化疗和放疗）。胞内信号通路很大程度上是由Bcl-2蛋白家族的凋亡与抗凋亡成员相互作用来介导和调控的（Wei,M.C.等，2001，Science 292:727–730）。胞外凋亡信号通路是由TNF超家族配体结合到相应的受体上引起的。TRAIL主要是通过胞外通路来诱导凋亡的（Scaffidi C.等，1998，EMBO J.17：1675–1687）。与TNF超家族其它成员不同，TRAIL能与一系列受体结合，与不同受体结合的亲和力不同，引起的结果也不同。TRAIL-R1（DR4）和TRAIL-R2（DR5）是凋亡受体，能将TRAIL诱导的凋亡信号传到细胞内（LeBlanc,H.N.等，2004，Cell Death Differ10：66–75）。TRAIL-R3（DcR1）和TRAIL-R4（DcR2）是假受体，可拮抗TRAIL的凋亡信号。TRAIL-R3没有胞内区域而TRAIL-R4的死亡结构域是剪切了的，因此它们都不能传导凋亡信号。此外，TRAIL还能与OPG结合，但亲和力较低。
如同其它TNF超家族配体成员一样，肿瘤坏死因子相关凋亡配体诱导凋亡的第一步是三聚体的TRAIL与TRAIL-R1和TRAIL-R2的结合。TRAIL与其受体的相互作用促使受体成簇并招募接头蛋白FADD，FADD通过死亡效应区域进一步招募Casapase8前体，进而形成死亡信号诱导复合物（DISC）（Kischkel FC等，2000，Immunity12:611–20）。Casapase8前体招募到DISC后，通过构象变化以及自我剪切而激活，激活后的Caspase8进一步剪切和活化效应Caspase3,6,7从而执行细胞凋亡。根据是否需要胞内信号通路来执行凋亡可将细胞分为两种类型即Ⅰ型和Ⅱ型。在Ⅰ型细胞中，DISC完全活化Caspase8并通过直接活化Caspase3,6,7而诱导凋亡（Gonzalvez F.等，2010，Oncogene29:4752–4765）。在Ⅱ型细胞中，DISC活化的Caspase8不足以诱导凋亡因而需要胞内信号通路来放大凋亡信号。胞内信号通路是在Caspase8介导的Bid剪切成活性形式tBid后而激活的。tBid迅速移位到线粒体内并激活Bax和Bak,从而引起线粒体膜电位的改变。从而，凋亡因子如细胞色素C和Smac/DIABLO释放到细胞质中。细胞色素C与接头蛋白Apaf-1结合并将Caspase-9招募到凋亡复合物中。活化的Caspase-9进一步激活Caspase-3，从而引起完全的凋亡。
虽然很多报道证实肿瘤坏死因子相关凋亡配体能诱导多种肿瘤细胞凋亡，是一种有前景的抗肿瘤药物，但是许多原发的肿瘤对TRAIL诱导的凋亡具有抵抗作用（Dyer,M.J.等，2007，J.Clin.Oncol.25:4505-4506）。这种抵抗机制发生在TRAIL诱导的凋亡通路中从受体到效应分子的多个水平。在受体水平，DR4或DR5重要区域如死亡受体区域和与TRAIL结合区域的突变会抑制TRAIL诱导的凋亡（MCDONALD ER3RD等，2001，J Biol Chem276:14939–14945）。DcR1与DR4和DR5竞争结合TRAIL而抑制DISC的形成，而DcR2与 DR5一起被招募到DISC中并抑制起始caspase的激活（Merino D.等，2006，Mol Cell Biol26:7046–7055）。在TRAIL DISC水平，cFLIP与Caspase8竞争结合FADD从而抑制caspase的活化（Kataoka T.等，2005，Crit.Rev.Immunol.25:31–58）。XIAP的高表达可直接抑制Caspase3,7,9（Deveraux,Q.L等，1997，Nature388：300–304）。Bcl-2家族的抗凋亡蛋白如Bcl-2,Bcl-X L以及Mcl-1可抑制线粒体膜电势的改变而抑制凋亡（Tait S.W.等，2010，Nat.Rev.Mol.Cell Biol11:621-632）。此外，其他生存信号通路包括AKT和NF-κB通路的激活也会导致对TRAIL诱导凋亡的抑制（LoPiccolo J等，2008，Drug Resist Updat11:32–50）。肿瘤细胞对TRAIL的抵抗性限制了TRAIL的使用，因此了解肿瘤细胞对TRAIL抵抗的胞内分子机制有助于基于TRAIL的抗肿瘤方法的发展。
目前，化疗和放疗与TRAIL联合使用是较常用的增加肿瘤细胞对TRAIL敏感性的方法，但放疗和化疗对正常细胞也有一定的影响。此外，TRAIL不稳定容易变性，并且半衰期短，这些对其应用都有影响。因此，如何利用生物学的方法增加以肿瘤细胞为代表的疾病细胞或病理组织肿瘤细胞对TRAIL的敏感性？这对于TRAIL的应用具有重要的意义。对于以细胞凋亡活性为主要生物学功能的肿瘤坏死因子家族配体成员而言，诱导细胞凋亡是它们的主要生物学功能及药学价值，在治疗过程中被治疗的靶细胞对于细胞凋亡的抵抗对于肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白的应用具有重要的意义。
膜联蛋白（Annexins）是一大类钙依赖的磷脂结合蛋白超家族，在结构上均具有保守C-端中心结构域，及其Ｎ-端结构域。被定义为膜联蛋白的标准是，能够在钙离子存在条件下可逆地结合于细胞表面带负电的磷脂；并且必须包含具有约70个氨基酸的重复序列，这种重复序列被称作膜联蛋白折叠。膜联蛋白基因超家族具有独特的、保守的四个同源重复序列，该结构具有钙和磷脂结合能力。从序列比对和进化上看，膜联蛋白1、2、3、9、10、3’6高度同源和相似，膜联蛋白4、5（V）、8、5’6高度同源和相似。但是膜联蛋白I（膜联蛋白1）的空间结构域膜联蛋白V（Annexin5）几乎完全重叠，显示出膜联蛋白在结构及功能（与细胞表面带负电的磷脂结合）上的高度相似性。膜联蛋白V（Annexin V）是膜联蛋白（Annexin）家族的成员之一，在钙离子存在的条件下可与磷脂酰丝氨酸（PS）结合。其表达较广泛，特别是在骨骼，心脏，平滑肌，内皮细胞，软骨细胞以及神经元。膜联蛋白V参与了多种胞内胞外过程，包括凝血，信号转导，抗炎症反应，膜运输以及离子通道活性（Rahman,M.M. 等，1997，Anat.Embryol195:31-39）。此外，最近的研究还发现，膜联蛋白V可封闭肿瘤细胞自分泌的含有EGFR的微囊泡从而抑制肿瘤血管的新生（Khalid Al-Nedawi等，2009，Proc Natl Acad Sci106:3794–3799）。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种以肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白为基础的、克服靶细胞或者治疗患者对于肿瘤坏死因子家族成员诱导的细胞凋亡抵抗的蛋白，它是膜联蛋白（Annexin）或具有磷脂结合活性的膜联蛋白衍生物与肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白或具有诱导细胞凋亡活性的肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白衍生物构成的融合蛋白。
本发明的另一个目的是提供一种以肿瘤坏死因子相关凋亡配体（TRAIL）为基础的、克服以靶细胞（例如，一些肿瘤细胞）或者患者（例如，肿瘤患者）对TRAIL抵抗的蛋白，它是膜联蛋白V（Annexin V）或具有磷脂结合活性的膜联蛋白V衍生物与肿瘤坏死因子相关凋亡配体（TRAIL）或具有诱导细胞凋亡活性的肿瘤坏死因子相关凋亡配体衍生物构成的融合蛋白。
本发明的另一目的是提供编码所述融合蛋白的DNA、含有该DNA序列的载体和含该载体的宿主细胞。
本发明的另一目的是提供一种成本低廉，效果显著地生产所述融合蛋白的方法。
本发明的再一目的是提供所述的融合蛋白在制备包括抗肿瘤药物在内的诱导细胞凋亡药物中的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白，其特征在于它具有膜联蛋白的氨基酸序列或具有磷脂结合活性的膜联蛋白衍生物序列、肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白的氨基酸序列或具有诱导细胞凋亡活性的肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白衍生物序列、以及位于膜联蛋白氨基酸序列和肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白氨基酸序列之间的连接肽序列，是通过基因工程方法构建由膜联蛋白或具有磷脂结合活性的膜联蛋白衍生物、连接肽、肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白或具有诱导细胞凋亡活性的肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白衍生物三个部分组成的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体融合蛋白质，即利用常规基 因工程方法通过人工合成或者克隆构建融合蛋白的编码基因、可溶性地重组表达和简便地分离纯化。
所述的膜联蛋白是指具有磷脂结合活性的膜联蛋白家族成员或具有磷脂结合活性的膜联蛋白衍生物，所述的肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白是指肿瘤坏死因子家族中具有诱导细胞凋亡活性的成员蛋白质或具有诱导细胞凋亡活性的肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白衍生物。所述的连接肽序列是一段具有柔性结构的、不含支链氨基酸的短肽，其中，短肽长度为、但不局限于，1-30个氨基酸残基，主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等不含支链的氨基酸组成。所述的衍生物是指具有磷脂结合活性的，截短的、加长的、突变的膜联蛋白突变体，或具有诱导细胞凋亡活性的，截短的、加长的、突变的肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白突变体。
上述由膜联蛋白或具有磷脂结合活性的膜联蛋白衍生物与肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白或具有诱导细胞凋亡活性的肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白衍生物所构成的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白可以是将膜联蛋白或具有磷脂结合活性的膜联蛋白衍生物置于肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白或具有诱导细胞凋亡活性的肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白衍生物的N端，中间添加一段含有但不局限于1-30个氨基酸残基组成的连接肽；也可以将膜联蛋白或具有磷脂结合活性的膜联蛋白衍生物置于肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白或具有诱导细胞凋亡活性的肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白衍生物的C端，中间添加一段含有但不局限于1-30个氨基酸残基组成的连接肽。
优选的所述融合蛋白包括如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，还提供了一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白，其特征在于它具有膜联蛋白V的氨基酸序列或具有磷脂结合活性的膜联蛋白V衍生物的氨基酸序列、肿瘤坏死因子相关凋亡配体的氨基酸序列或具有诱导细胞凋亡活性的肿瘤坏死因子相关凋亡配体衍生物的氨基酸序列、以及位于膜联蛋白V的氨基酸序列或具有磷脂结合活性的膜联蛋白V衍生物的氨基酸序列和肿瘤坏死因子相关凋亡配体氨基酸序列或具有诱导细胞凋亡活性的肿瘤坏死因子相关凋亡配体衍生物的氨基酸序列之间的连接肽序列，是通过基因工程方法构建由膜联蛋白V或具有磷脂结合活性的膜联蛋白V衍生物、连接肽、肿瘤坏死因子相关凋亡配体或具有诱导细胞凋亡活性的肿瘤坏死因子相关凋亡配体衍生物三个部分组成的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体融合蛋白质，即利用常规基因工程方法通过人工合成或者克隆构建融 合蛋白的编码基因、可溶性地重组表达和简便地分离纯化。
所述的连接肽序列是一段具有柔性结构的、不含支链氨基酸的短肽，其中，短肽长度为、但不局限于，1-30个氨基酸残基，主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等不含支链的氨基酸组成。
优选的所述融合蛋白包括如SEQ ID NO：1-5中所示的氨基酸序列。
上述由膜联蛋白V与肿瘤坏死因子相关凋亡配体所构成的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白可以是将膜联蛋白V或具有磷脂结合活性的膜联蛋白V衍生物置于肿瘤坏死因子相关凋亡配体或具有诱导细胞凋亡活性的肿瘤坏死因子相关凋亡配体衍生物的N端，中间添加一段含有但不局限于1-30个氨基酸残基组成的连接肽；也可以将膜联蛋白V或具有磷脂结合活性的膜联蛋白V衍生物置于肿瘤坏死因子相关凋亡配体或具有诱导细胞凋亡活性的肿瘤坏死因子相关凋亡配体衍生物的C端，中间添加一段含有但不局限于1-30个氨基酸残基组成的连接肽。
在本发明的第三方面，提供了一种分离的DNA分子，它编码本发明上述的融合蛋白，较佳的，所述的DNA分子编码包括SEQ ID NO：1-6中所示的氨基酸序列的融合蛋白。更加的，所述的DNA分子包括SEQ ID NO：7-12中所示的核苷酸序列。
在本发明的第四方面，提供含有上述DNA分子的载体；还提供了含有上述载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以选用基因工程中常用的工程菌，优选的为大肠埃希菌BL21。
在本发明的第五方面，提供了一种产生本发明融合蛋白的方法，它包括如下步骤：
在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和分离所述的融合蛋白。
具体的，本发明提供了一种在大肠杆菌中可溶性表达、能够方便地进行大规模分离纯化的、高纯度的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白的方法。目前肿瘤坏死因子相关凋亡配体在大肠杆菌中表达多为无生物活性的包涵体产物，而本发明中的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白的分子结构和分子量比野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体更为复杂，因此在大肠杆菌中表达时，其包涵体形成将更为严重、纯化将更为复杂。本发明采用了低温下培养和诱导表达肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白的表达方法，使得表达产物有效避免了包涵体的形成；本发明同时利用了肿瘤坏死因子相关凋亡配体具有鏊合金属离子的生物功能，利用离子交换层析和金属亲和层析相结合使得肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白得到了有效的纯 化、获得了高纯度的蛋白质产物，而且纯化产物具有高比例的聚体形式，因此具有非常好的生物活性。其中低温指10℃-35℃。当然，利用高等生物的细胞（酵母、真菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等）能够比大肠杆菌更好地产生可溶性的融合蛋白质产物。
膜联蛋白V与肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合后，能够显著提高肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白多聚体的比例，由于肿瘤坏死因子相关凋亡配体的活性依赖于多聚体（尤其是三聚体）的形成，因此肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白诱导细胞凋亡的活性得以显著提高。
同时公开编码肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白的cDNA，它可以通过肿瘤坏死因子相关凋亡配体的cDNA与膜联蛋白V cDNA序列、以及连接肽的DNA序列制备。上述组成的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白的cDNA可用于基因治疗。
本发明的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白可以通过采用聚乙二醇、脂肪酸化、重组加上抗体Fc片段或白蛋白等方法修饰，从而延长肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白的半衰期，达到更好的药代动力学效果。
在本发明的第六方面，提供了如上所述的融合蛋白在制备肿瘤治疗药物中的应用。所述应用包括所述融合蛋白单独用于制备肿瘤治疗药物，或与现有的肿瘤治疗药物组成组合物，或与现有化疗、放疗、中药治疗、生物治疗等方法在肿瘤治疗中联合运用。
在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的权利要求1所述的融合蛋白。
在本发明的第八方面，由于肿瘤坏死因子及其受体家族在进化、蛋白质结构及其作用方式、生物学功能等方面的高度同源和相似，因此，本发明公开的技术方案不仅仅局限于肿瘤坏死因子相关凋亡配体或具有诱导细胞凋亡活性的肿瘤坏死因子相关凋亡配体衍生物，也适用于肿瘤坏死因子家族其它成员或具有诱导细胞凋亡活性的肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白衍生物。
在本发明的第九方面，由于膜联蛋白家族在进化、蛋白质结构及其作用方式、生物学功能等方面的高度同源和相似，因此，本发明公开的技术方案不仅仅局限于膜联蛋白V或具有磷脂结合活性的膜联蛋白V衍生物，也适用于膜联蛋白家族其它成员或具有磷脂结合活性的膜联蛋白衍生物。
同已有的肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其变体相比，本发明具有如下的有益效果：
（1）更好的形成聚体的能力：与野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体单独或者与膜联蛋白V混合存在时相比较，肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白具有更高的多聚体存在形式，例如，肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8的三聚体形式比野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体高11倍。由于肿瘤坏死因子相关凋亡配体诱导凋亡的第一步是三聚体的TRAIL与其受体结合，因此，三聚体形式则必然使得肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白具有更高的诱导细胞凋亡的生物活性。
（2）更为高效的诱导肿瘤细胞凋亡的效果：肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白呈现出比肿瘤坏死因子相关凋亡配体更高的诱导肿瘤细胞凋亡的效果。肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白能显著诱导TRAIL敏感的、中度敏感的甚至TRAIL不敏感的肿瘤细胞凋亡，而且对于Colo-205和MDA-MB-231肿瘤细胞，进行测定EC50实验时，肿瘤坏死因子相关凋亡配体仅仅需要作用细胞4小时，而不是像常规测定其他肿瘤细胞时需要作用24小时，由此可见肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白具有强烈增强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力。
除诱导肿瘤细胞凋亡之外，肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白还具有长期的作用效应，它能显著抑制肿瘤细胞的克隆形成，因此具有抑制肿瘤生长的能力。
（3）可靠的选择性作用：虽然肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的能力显著增强，但肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白对肿瘤细胞的特异性并没有改变，正常细胞系（如LO2和293T）并不响应肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白诱导的细胞凋亡，即是说与TRAIL相比较，肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白不会带来额外的毒副作用。肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的方式与TRAIL完全相同，均依赖于Caspase-8。TRAIL，膜联蛋白V与肿瘤坏死因子相关凋亡配体混合物（Annexin V+TRAIL）以及肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白与肿瘤细胞A549细胞表面的受体DR4/DR5的结合能力没有差异。下游的信号分子（如DR4，DR5，DcR2以及与线粒体通路相关的蛋白如Bcl-XL，Bax，Bim，Noxa，Puma）的表达在经不同药物处理后也无差异。但是Caspase-8，Caspase-3，PARP只有在经肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白处理后才被明显激活。而且，Caspase-8抑制剂Z-IETD-FMK可明显减少肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白诱导的细胞凋亡，而Caspase-9抑制剂Z-LEHK-FMK对肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白诱导的凋亡无明显影 响。这充分说明，肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白与TRAIL具有完全一样的作用机制，其安全性与TRAIL相同。
（4）更为高效的抗肿瘤效果：由于本专利发明的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白具有显著增加的诱导TRAIL敏感的、中度敏感的甚至TRAIL不敏感的肿瘤细胞的细胞凋亡的能力，与野生型TRAIL、靶向于肿瘤细胞表面的整合素αVβ3、αVβ5的TRAIL变体RGD-L-TRAIL（中国发明专利申请号：200710133862.1）、靶向于肿瘤细胞表面的CD13的TRAIL变体NGR-L-TRAIL（中国发明专利申请号：200710133862.1）相比，无论在单独使用、还是与现有的化疗、放疗、中药治疗、生物治疗等方法联合使用时都表现出具有更好的抗肿瘤效果。
（5）更低的使用剂量：由于肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白比相同剂量的肿瘤坏死因子相关凋亡配体具有更好的抗肿瘤效果，因此在使用时，能够在保证相同抗肿瘤疗效的情况下，大大降低肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白的用量。肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白给药剂量的降低将能够克服肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿瘤治疗中潜在的副作用，同时可以降低肿瘤患者的治疗费用，达到高效、低毒副作用、低成本肿瘤治疗的效果。
（6）可溶性的表达和简易的分离纯化：尽管目前肿瘤坏死因子相关凋亡配体在大肠杆菌中表达时易形成无生物活性的包涵体产物，而本专利发明的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白的分子结构和分子量比野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体更为复杂，因此依照常规条件在大肠杆菌中表达融合蛋白时，其包涵体形成将更为严重、纯化难度更大。本发明采用了低温下培养和诱导表达肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白的表达方法，使得表达产物有效避免了包涵体的形成；本发明同时利用了肿瘤坏死因子相关凋亡配体具有鏊合金属离子的生物功能，将金属亲和层析和离子交换层析方法相结合使得肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白得到了有效的纯化、获得了高纯度的蛋白质产物。本发明通过可溶性表达和简易分离纯化方法的优化最终导致纯化产物具有高比例的聚体形式，从而保证了获得的产物具有非常好的生物活性。生产高比例聚体形式的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白，这是本发明与同类研究的显著区别。本发明提供了一种有效表达和高效获得高的聚体含量的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白的表达方法和纯化工艺。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1.SDS-PAGE分析肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8纯化结果及聚体形成情况。
图1.1.Zn²⁺离子金属亲和层析与DEAE离子交换层析纯化获得的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8：1.蛋白质分子量标准，2.纯化后的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8；
图1.2.非还原SDS-PAGE分析TRAIL以及Annexin V+TRAIL中TRAIL单体、二聚体以及三聚体形成情况：1.蛋白质分子量标准，2.Annexin V，3.TRAIL，4.Annexin V+TRAIL；21.TRAIL三聚体，22.TRAIL二聚体，23.TRAIL单体；
图1.3.非还原SDA-PAGE分析肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8单体、二聚体以及三聚体形成情况：31.TP8三聚体，32.TP8二聚体，33.TP8单体。
图2.不同细胞系对肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8敏感性分析。
图2.1.不同浓度的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8对正常的人源细胞293T的影响分析；
图2.2.不同浓度的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8对正常的人源细胞LO2的影响分析。
图3.等摩尔数的不同药物处理A549相同时间后A549细胞形态、细胞凋亡分析以及克隆形成分析。
等摩尔数的Annexin V、TRAIL、Annexin V+TRAIL以及肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8处理A549相同时间后，以PBS作为阴性对照：
图3.1.在显微镜下观察细胞形态的变化:1.PBS；2.Annexin V；3.TRAIL；4.Annexin V+TRAIL；5.TP8；
图3.2.透射电镜观察经不同蛋白处理后细胞形态变化：1.PBS；2.Annexin V；3.TRAIL；4.Annexin V+TRAIL；5.TP8；
图3.3.流式细胞仪分析不同药物处理后A549凋亡情况：1.PBS；2.Annexin V；3.TRAIL； 4.Annexin V+TRAIL；5.TP8；
图3.4.不同药物处理对A549克隆形成的影响：1.PBS；2.Annexin V；3.TRAIL；4.Annexin V+TRAIL；5.TP8。
图4.肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8诱导人非小细胞肺癌细胞A549细胞凋亡的剂量及作用时间的关系分析。
图4.1.流式细胞分析术分析A549凋亡与TP8剂量的关系：1.PBS；2.10ng/ml TP8；3.50ng/ml TP8；4.100ng/ml TP8；5.200ng/ml TP8；6.400ng/ml TP8；7.600ng/ml TP8；8.800ng/ml TP8；
图4.2.TP8处理时间与A549细胞凋亡的关系。
图5.肿瘤坏死因子相关凋亡配体TRAIL、肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体RGD-TRAIL、肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8以及TP8变体诱导人非小细胞肺癌细胞A549凋亡的效果比较。
图5.1.肿瘤坏死因子相关凋亡配体TRAIL、肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体RGD-TRAIL、肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8诱导人非小细胞肺癌细胞A549凋亡的效果比较。
图5.2.肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8与肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8变体TP8-C230G诱导人非小细胞肺癌细胞A549凋亡的效果比较：1.未给药对照组；2-6.100、200、400、600、800ng/ml肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8（黑色柱状）及肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8变体TP8-C230G（白色柱状）。
图6.TP8诱导A549凋亡机制分析
图6.1.Western blotting分析凋亡通路中重要蛋白的变化情况：1.PBS组；2.Annexin V组；3.TRAIL组；4.Annexin V+TRAIL组；5.TP8组；
图6.2.RT-PCR分析细胞凋亡信号通路中重要蛋白质的变化情况：1.PBS组；2.Annexin V组；3.TRAIL组；4.Annexin V+TRAIL组；5.TP8组；
图6.3.流式细胞仪分析Annexin V、TRAIL、Annexin V+TRAIL以及TP8与A549细胞结合情况。蛋白经荧光染料标记后与A549一起孵育，再经流式检测；
图6.4.流式细胞仪分析不同药物处理后A549细胞表面的TRAIL受体DR4和DR5表达 情况：1.DR5；2.DR4。
图7.Caspase8和Caspase3活性分析：
图7.1.Caspase8活性分析：1.PBS组；2.Annexin V组；3.TRAIL组；4.Annexin V+TRAIL组；5.TP8组；**p<0.01，TP8组与其它组比较；
图7.2.Caspase3活性分析：1.PBS组；2.Annexin V组；3.TRAIL组；4.Annexin V+TRAIL组；5.TP8组；**p<0.01，TP8组与其它组比较；
图7.3.Caspase8和Caspase3抑制剂对TP8诱导的人非小细胞肺癌细胞A549细胞凋亡的影响分析；**p<0.01，TP8与Caspase-8抑制剂同时处理组与TP8处理组比较。
图8.肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8对不同肿瘤的抑瘤效果分析。
图8.1.不同蛋白对A549肿瘤抑制作用比较：1.PBS；2.Annexin V；3.TRAIL；4.Annexin V+TRAIL；5.TP86.25mg/kg；6.TP812.5mg/kg；7.TP825mg/kg；**P＜0.01；
图8.2.不同蛋白对A549肿瘤倍增时间（即肿瘤体积增加一倍所需天数）和肿瘤生长延迟时间（即肿瘤体积长到1000mm³时相对于PBS组所需天数）的比较：
图8.2.1.肿瘤倍增时间：1.PBS；2.Annexin V；3.TRAIL；4.Annexin V+TRAIL；5.TP86.25mg/kg；6.TP812.5mg/kg；7.TP825mg/kg；**P＜0.01，TP812.5mg/kg组与PBS组比较；++<0.01，TP825mg/kg组与TP86.25mg/kg组比较；
图8.2.2.肿瘤生长延迟时间：1.PBS；2.Annexin V；3.TRAIL；4.Annexin V+TRAIL；5.TP86.25mg/kg；6.TP812.5mg/kg；7.TP825mg/kg；**P＜0.01，TP812.5mg/kg组与PBS组比较；++<0.01，TP825mg/kg组与TP86.25mg/kg组比较；
图8.3.不同蛋白对Bel7402肿瘤抑制作用比较：1.PBS；2.Annexin V；3.TRAIL；4.Annexin V+TRAIL；5.TP86.25mg/kg；6.TP812.5mg/kg；7.TP825mg/kg；**P＜0.01；
图8.4.不同蛋白对Bel7402肿瘤倍增时间和肿瘤生长延迟时间的比较：
图8.4.1.肿瘤倍增时间：1.PBS；2.Annexin V；3.TRAIL；4.Annexin V+TRAIL；5.TP86.25mg/kg；6.TP812.5mg/kg；7.TP825mg/kg；**P＜0.01，TP812.5mg/kg组与PBS组比较；++<0.01，TP825mg/kg组与TP86.25mg/kg组比较；
图8.4.2.肿瘤生长延迟时间：1.PBS；2.Annexin V；3.TRAIL；4.Annexin V+TRAIL；5.TP86.25mg/kg；6.TP812.5mg/kg；7.TP825mg/kg；**P＜0.01，TP812.5mg/kg组与PBS组比 较；++<0.01，TP825mg/kg组与TP86.25mg/kg组比较；
图8.5.不同蛋白对Colo205肿瘤抑制作用比较：1.PBS；2.Annexin V；3.TRAIL；4.Annexin V+TRAIL；5.TP86.25mg/kg；6.TP812.5mg/kg；7.TP825mg/kg；*p<0.05;**p<0.01；
图8.6.不同蛋白对Colo-205肿瘤倍增时间和肿瘤生长延迟时间的比较：
图8.6.1.肿瘤倍增时间：1.PBS；2.Annexin V；3.TRAIL；4.Annexin V+TRAIL；5.TP86.25mg/kg；6.TP812.5mg/kg；7.TP825mg/kg；**P＜0.01，TP812.5mg/kg组与PBS组比较；++<0.01，TP825mg/kg组与TP86.25mg/kg组比较；
图8.6.2.肿瘤生长延迟时间：1.PBS；2.Annexin V；3.TRAIL；4.Annexin V+TRAIL；5.TP86.25mg/kg；6.TP812.5mg/kg；7.TP825mg/kg；**P＜0.01，TP812.5mg/kg组与PBS组比较；++<0.01，TP825mg/kg组与TP86.25mg/kg组比较。
图9.肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8治疗A549肿瘤的病理分析。
TUNEL法分析不同蛋白诱导的肿瘤凋亡情况：1.PBS；2.Annexin V；3.TRAIL；4.Annexin V+TRAIL；5.TP8。
图10.肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8与联合抑制人非小细胞肺癌细胞A549肿瘤效果评价。
1.PBS；2.顺铂；3.TP8；4.TP8+顺铂；**p<0.01。
具体实施方式
实施例1
肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白的设计、表达、制备与鉴定
利用计算机辅助结构模拟和分子设计，在SGI计算机工作站上，利用MSI公司的分子设计软件（InsightII、Discover等模块），在肿瘤坏死因子相关凋亡配体和膜联蛋白V晶体结构的基础上，对肿瘤坏死因子相关凋亡配体和膜联蛋白V融合蛋白，进行分子模建和分子设计，确定连接肽的氨基酸长度。
在肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白的计算机辅助分子设计中，发明人利用对肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白进行了结构模拟和分子设计，在肿瘤坏死因子相关凋亡配体和膜联蛋白V晶体结构的基础上，对肿瘤坏死因子相关凋亡配体与膜联蛋白V之间的连接肽氨 基酸序列和长度进行分子模建和分子设计，确定连接肽的氨基酸长度。结果发现：由于肿瘤坏死因子相关凋亡配体和膜联蛋白V的N端及C端都暴露在分子的外表面，因此无论将2个分子的哪一个分子放在N端都能够保持各自的空间结构，不影响2个分子与各自靶点或者受体的结合。在计算机分子设计时，发明人发现：在添加1-30个氨基酸短肽长度内，只要短肽由不含支链的、柔性较大的氨基酸残基、例如：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等组成，都不会对肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白中的肿瘤坏死因子相关凋亡配体和膜联蛋白V结构产生影响，也不会影响2者的功能；而且在分子动力学所计算的不含支链、柔性较大的30个氨基酸短肽长度范围内，短肽长度越长，对肿瘤坏死因子相关凋亡配体和膜联蛋白V的结构产生的扰动越小；因此，30个氨基酸以上的连接肽也不会影响肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白的功能。此外，即使在2个分子之间不添加连接肽将两个蛋白质进行融合，两个蛋白质也可以较好地保持各自的空间结构，2个分子与各自靶点或者受体的结合也可以基本不受影响，但是融合蛋白的活性还是会受到一定程度的影响。
在分子设计的基础上，我们尝试表达了连接肽为甘氨酸（SEQ ID NO：2）、丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（SEQ ID NO：3）的短肽的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白，含有以上三个重复的甘氨酸-（丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸）-（丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸）-（丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸）的25个氨基酸残基的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白（SEQ ID NO：4），以及含有甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸的短肽的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白（SEQ ID NO：1），而且在每种连接肽情况下，都尝试将肿瘤坏死因子相关凋亡配体和膜联蛋白V分别置于N端（例如肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白PT8，SEQ ID NO：5），都获得了相似的结果和活性，从而证明了计算机分子设计的正确性。当然不同融合蛋白质的表达量会有一些差别，相形之下，添加了14个氨基酸连接肽的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白（Annexin V-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-TRAIL，代号TP8，即第8种融合蛋白）（SEQ ID NO：1）的表达水平最高，并且其表达产物可溶性表达水平最好，因此便于大规模制备和分离纯化，其它融合蛋白质不是表达水平略低、就是表达产物的可溶性较 差，不利于大规模分离纯化用于动物实验。因此，本专利着重呈现第8种融合蛋白（即TP8）的实验数据。
本专利还构建了由肿瘤坏死因子家族另一细胞凋亡蛋白肿瘤坏死因子（TNF）构成的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白（Annexin V-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-TNF）（SEQ ID NO：6），也获得了与TRAIL融合蛋白相似的结果。
肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8表达载体的构建：从NCBI数据库中获取人源的Annexin V和人源TRAIL可溶部分的mRNA序列，设计相应的PCR引物，并化学合成相应的引物，其中，Annexin V上游引物：5’-GTTCCATGGGCGCACAGGTTCT CAGAGGCA-3’，下游引物：5’-ACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCGTCATCTTCTCCACAGAGCA-3’；TRAIL上游引物为：5’-GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGT GTG AGAGAA-3’，下游引物为：5’-TCCGCTCGAGTTAGCCAACTAAAAA GGCCC CG-3’。
以Annexin V表达质粒和TRAIL表达质粒为模板，用PCR的方法分别扩增得到AnnexinV和TRAIL序列。PCR反应的条件为：Annexin V基因：94℃热变性1分钟，60℃退火1分钟，72C延伸1.5分钟，共进行25个循环。TRAIL基因：94℃热变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共进行25个循环。以PCR扩增的AnnexinV和TRAIL为模板，以Annexin V上游引物和TRAIL下游引物为上下游引物，再次PCR扩增，得到TP8序列。PCR反应条件为：94℃热变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共进行26个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收后进行Nco I/XhoI双酶切，表达载体pET28a也经Nco I/XhoI双酶切，使用T4DNA连接酶将两条双酶切回收片段进行连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10菌株感受态细胞，用限制性内切酶酶切及PCR法筛选阳性克隆，得到质粒pET28a-TP8，经过DNA序列测序分析验证序列的正确性。
肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8的表达纯化:表达质粒pET28a-TP8转化到埃希氏大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中，并在宿主菌中进行诱导表达。将平板中的新鲜转化的菌接种到LB（卡那霉素）培养基中，在摇床上37℃培养过夜，然后转入到新鲜的LB（卡那霉素）培养基中37℃培养2.5小时左右，OD600nm为0.6～0.8左右时将培养温度降至28℃继续培 养0.5小时后，加入终浓度为1mM的IPTG诱导TP8表达4小时。诱导表达的菌体经50mM Tris,pH8.0重悬后，加入终浓度为1mg/ml的溶菌酶，20mM Cacl2，65%的蔗糖，室温下搅拌1小时。用50mM Tris,pH8.0,20mM Cacl2将菌液稀释20倍并于室温下搅拌1小时，离心去上清，沉淀用50mM Tris,pH8.0,20mM EDTA解离后，超声使核酸断裂。离心回收可溶性蛋白，并用硫酸铵沉淀收集由10%-50%的硫酸铵沉淀下来的蛋白，经磷酸盐缓冲液（50mM磷酸氢二钠，10mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，pH7.6）溶解后用Zn-NTA亲和柱进行纯化。平衡缓冲液为50mM磷酸氢二钠，10mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，pH7.6，洗脱缓冲液为50mM磷酸氢二钠，10mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，60mM咪唑，pH7.6，收集洗脱峰。收集到的蛋白溶液对50mM Tris,pH8.0透析除去盐离子后，用DEAE-Sepharose阴离子交换树脂进一步纯化。平衡缓冲液为50mM Tris，pH8.0,10mM氯化钠，洗涤缓冲液为50mM Tris,pH8.0，70mM氯化钠，洗脱缓冲液为50mM Tris，pH8.0,220mM氯化钠，收集洗脱峰。蛋白溶液对PBS透析，除去Tris，过滤除菌，分装，保存于-80℃。
纯化好的TP8蛋白分布用12%的还原性SDS-PAGE和8%的还原性SDS-PAGE电泳，并用考马斯亮蓝染色检测。还原性SDS-PAGE用于分析蛋白的纯度，非还原性SDS-PAGE用于分析二聚体以及三聚体形成情况。
在以往的报道中，野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体在大肠杆菌中表达时，常常会以无生物活性的包涵体产物形式存在；本专利发明的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白在TRAIL的基础上又增加了318个氨基酸，该融合蛋白在大肠杆菌中表达时应当比野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体更加容易形成无生物活性的包涵体产物、纯化将更为困难。本发明通过优化表达条件和分离纯化过程、成功地实现了肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白以可溶性形式表达，而且经过硫酸铵沉淀、镍金属亲和层析和离子树脂层析，纯化获得了具有生物活性的、高纯度的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白，纯度高达98%以上（图1.1）。而且在本专利的表达条件和纯化工艺下，肿瘤坏死因子相关凋亡配体TRAIL及TP8具有很高的聚体比例（图1.3），这一点在肿瘤坏死因子相关凋亡配体表达和纯化的同类工作中是难得一见的。肿瘤坏死因子超家族蛋白都有形成单体、二聚体和三聚体的特性，并且它们的生物学活性依赖于二聚体和三聚体形式，肿瘤坏死因子相关凋亡配体也不例外。为了检测与Annexin V融合后是否对肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白形成聚体的能力产生影响，非 变性非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示：野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体单独或者与膜联蛋白V混合存在时，有70.14%为单体形式，27.25%为二聚体形式，2.62%为三聚体形式。而肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8的单体形式仅在31.69%，38.70%为二聚体形式，三聚体形式则高达29.61%，三聚体形式比野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体高11倍。Annexin V增强了融合蛋白TP8的二聚体和三聚体形成能力，这与TP8较TRAIL有更强的诱导凋亡的能力相关。重组肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白具有形成聚体的能力。以上结果证明：本专利表达、纯化的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白确实具有正确的空间结构、比以往报道的大肠杆菌表达的TRAIL具有更好的生物活性。
实施例2
人源的不同肿瘤细胞系对肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8的敏感性检测
将不同的人源肿瘤细胞株：结肠癌Colo-205、乳腺癌MDA-MB-231、宫颈癌Hela、小细胞肺癌H446、肝癌PLC、非小细胞肺癌H1229、肝癌Bel7402、非小细胞肺癌A549、乳腺癌MCF-7、淋巴瘤U937、肝癌HepG2、结肠癌HT29、乳腺癌高转移细胞MDA-MB-435、舌鳞癌TCA8113、结肠癌HCT116、胰腺癌SW1990、K562细胞，慢性髓原白血病K562等在含10％新生牛血清的DMEM（含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）中，并放置37℃，5％CO2的培养箱中生长。K562和Colo205在含10％新生牛血清的RPMI1640（含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）中，并放置37℃，5％CO2的培养箱中生长。所有细胞均购自ATCC。取处于对数生长期的细胞，胰酶消化后，接种于12孔板中，加入1.5ml培养液，将培养板移入培养箱中进行培养。待细胞密度长到70%时加药，浓度为10ng/ml，30ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，400ng/ml，600ng/ml，800ng/ml，每个浓度三个孔重复，药物处理18小时后，经胰酶消化后从孔中吸出，PBS洗两遍，4℃800rpm离心5分钟，去上清，用200μl结合缓冲液重悬细胞，加入终浓度为2μg/ml的EGFP-Annexin V室温孵育20分钟后，加入300μl结合缓冲液并转入流式管中，每管加入1μg碘化吡啶（PI），在30分钟内用流式细胞仪分析。由于研究的人肿瘤细胞株数量众多，下面仅以非小细胞肺癌A549为例，简要描述研究肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8体外、体内的抗肿瘤活性及其作用机制的方法：
细胞形态分析：取处于对数生长期的细胞，胰酶消化后，接种于12孔板中，加入1.5ml培养液，将培养板移入培养箱中进行培养。待细胞密度长到70%时用不同的药物处理，药物及其浓度如下：Annexin V（360ng/ml）,TRAIL（180ng/ml）,Annexin V（360ng/ml）+TRAIL（180ng/ml）以及TP8（600ng/ml），以PBS作为对照，处理6小时后，用PBS洗两遍，在显微镜下观察。
不同药物对诱导A549凋亡的分析：取处于对数生长期的细胞，胰酶消化后，接种于12孔板中，加入1.5ml培养液，将培养板移入培养箱中进行培养。待细胞密度长到70%时用不同的药物处理，药物及其浓度如下：Annexin V（360ng/ml）,TRAIL（180ng/ml）,Annexin V（360ng/ml）+TRAIL（180ng/ml）以及TP8（600ng/ml），以PBS作为对照，处理6小时后，经胰酶消化后从孔中吸出，PBS洗两遍，4℃800rpm离心5分钟，去上清，用200μl结合缓冲液重悬细胞，加入终浓度为2μg/ml的EGFP-Annexin V室温孵育20分钟后，加入300μl结合缓冲液并转入流式管中，每管加入1μg碘化吡啶（PI），在30分钟内用流式细胞仪分析。
药物作用剂量对诱导A549凋亡的分析：取处于对数生长期的细胞，胰酶消化后，接种于12孔板中，加入1.5ml培养液，将培养板移入培养箱中进行培养。待细胞密度长到70%时用不同浓度的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8处理即10ng/ml，30ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，400ng/ml，600ng/ml，800ng/ml，处理6小时后，经胰酶消化后从孔中吸出，PBS洗两遍，4℃800rpm离心5分钟，去上清，用200μl结合缓冲液重悬细胞，加入终浓度为2μg/ml的EGFP-Annexin V室温孵育20分钟后，加入300μl结合缓冲液并转入流式管中，每管加入1μg碘化吡啶（PI），在30分钟内用流式细胞仪分析。
药物处理时间对诱导A549凋亡的分析：取处于对数生长期的细胞，胰酶消化后，接种于12孔板中，加入1.5ml培养液，将培养板移入培养箱中进行培养。待细胞密度长到70%时用600ng/mlTP8分别处理1小时，2小时，4小时，6小时，8小时，10小时后经胰酶消化后从孔中吸出，PBS洗两遍，4℃800rpm离心5分钟，去上清，用200μl结合缓冲液重悬细胞，加入终浓度为2μg/ml的EGFP-Annexin V室温孵育20分钟后，加入300μl结合缓冲液并转入流式管中，每管加入1μg碘化吡啶（PI），在30分钟内用流式细胞仪分析。
TRAIL、RGD-TRAIL以及TP8诱导A549凋亡的效果比较：取处于对数生长期的细胞，胰酶消化后，接种于12孔板中，加入1.5ml培养液，将培养板移入培养箱中进行培养。待细 胞密度长到70%时用等摩尔数的TRAIL，RGD-TRAIL以及TP8处理，处理6小时后，经胰酶消化后从孔中吸出，PBS洗两遍，4℃800rpm离心5分钟，去上清，用200μl结合缓冲液重悬细胞，加入终浓度为2μg/ml的EGFP-Annexin V室温孵育20分钟后，加入300μl结合缓冲液并转入流式管中，每管加入1μg碘化吡啶（PI），在30分钟内用流式细胞仪分析。
本发明在体外比较了一系列肿瘤细胞对TRAIL和TP8敏感性的差异。TP8较TRAIL有更强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力，其能诱导TRAIL敏感的、中度敏感的甚至TRAIL不敏感的肿瘤细胞凋亡。肿瘤坏死因子相关凋亡配体对于结肠癌细胞Colo-205的EC50（半有效剂量）是1.67nM，肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8的EC50则为0.61nM，活性提高2.74倍；肿瘤坏死因子相关凋亡配体对于乳腺癌细胞MDA-MB-231的EC50是2.96nM，肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8的EC50则为0.57nM，活性提高5.19倍；肿瘤坏死因子相关凋亡配体对于宫颈癌细胞Hela的EC50是33.75nM，肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8的EC50则为0.84nM，活性提高40.18倍；肿瘤坏死因子相关凋亡配体对于小细胞肺癌细胞H446的EC50是48.63nM，肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8的EC50则为0.85nM，活性提高57.21倍；肿瘤坏死因子相关凋亡配体对于肝癌细胞PLC的EC50是78.97nM，肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8的EC50则为0.46nM，活性提高171.67倍；肿瘤坏死因子相关凋亡配体对于非小细胞肺癌细胞H1229的EC50是67.71nM，肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8的EC50则为1.01nM，活性提高67.04倍；肿瘤坏死因子相关凋亡配体对于肝癌细胞Bel7402的EC50是389.5nM，肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8的EC50则为1.58nM，活性提高246.52倍；肿瘤坏死因子相关凋亡配体对于非小细胞肺癌细胞A549的EC50大于1000.0nM（即本发明所设实验条件下无法检出），肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8的EC50则为5.82nM，活性至少提高171.82倍以上；肿瘤坏死因子相关凋亡配体对于乳腺癌细胞MCF-7的EC50大于1000.0nM（即本发明所设实验条件下无法检出），肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8的EC50则为0.57nM，活性至少提高1754.39倍以上；肿瘤坏死因子相关凋亡配体的EC50对于淋巴瘤细胞U937的EC50大于1000.0nM（即本发明所设实验条件下无法检出），肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8的EC50则为2.96nM，活性至少提高337.84倍以上；肿瘤坏死因子相关凋亡配体对于肝癌HepG2细胞的EC50大于1000.0nM（即本发明所设实验条件下无法检出），肿瘤坏死因子 相关凋亡配体融合蛋白TP8的EC50则为3.82nM，活性至少提高261.87倍以上。
由上述结果可见，肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白能诱导TRAIL敏感的、中度敏感的甚至TRAIL不敏感的肿瘤细胞凋亡，而且对于Colo-205和MDA-MB-231肿瘤细胞，进行测定EC50实验时，肿瘤坏死因子相关凋亡配体仅仅需要作用细胞4小时，而不是像常规测定其他肿瘤细胞时需要作用24小时，由此可见肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白具有强烈增强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力。而且，无论是对TRAIL高度敏感细胞，TRAIL中度敏感细胞，还是TRAIL抵抗细胞，肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白的EC50都不超过6nM，这充分说明肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白强大的诱导细胞凋亡活性。
虽然诱导凋亡的能力增强了，但TP8对肿瘤的特异性没有改变，因为正常细胞系LO2和293T不受TP8的影响，即是说TP8不会带来额外的毒副作用（图2.1，2.2）。为了确定TP8诱导了肿瘤细胞凋亡，经等摩尔数的Annexin V，TRAIL，Annexin V+TRAIL以及TP8处理的A549细胞分别流式细胞仪检测凋亡情况以及用显微镜和透射电镜观察细胞形态变化。流式结果表明，仅TP8诱导了明显的凋亡（图3.3）。与流式结果一致，A549细胞只在TP8处理后才有明显的凋亡形态（图3.1，3.2）。TP8诱导的A549凋亡具有时间和剂量依赖性（图4.1，4.2）。除诱导肿瘤细胞凋亡之外，肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白还具有长期的作用效应，它能显著抑制肿瘤细胞A549的克隆形成（图3.4），因此具有抑制肿瘤生长的能力。
RGD-TRAIL是本课题组研发的一个肿瘤靶向性的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体蛋白，其诱导肿瘤细胞凋亡的活性显著好于野生型TRAIL（中国发明专利号：ZL200710133862.1）。等摩尔数的TRAIL、RGD-TRAIL、TP8在诱导A549凋亡时，RGD-TRAIL较TRAIL效果好，但是TP8的效果最好、为RGD-TRAIL的2倍以上。RGD-TRAIL和TP8诱导的凋亡随着浓度的升高而增加，TRAIL随着浓度的升高在诱导凋亡的效果上没有明显变化（图5.1.）。
由Annexin V-TNF构成的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白（SEQ ID NO：6）也在标准的TNF测活细胞L929上表现出类似的增强的诱导细胞凋亡活性。
实施例3
肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白的作用机制分析
Western Blot从蛋白水平检测与凋亡通路相关的重要蛋白表达情况：将A549细胞置于 6孔细胞培养板生长至80%密度，根据要求加等摩尔数的药物进行处理，继续培养6小时后，收取细胞，用预冷的PBS将细胞沉淀洗涤一次后，加入适量细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂，Roche公司）悬浮混匀，冰上放置30分钟后，4℃，12000rpm离心15分钟，吸取上清，利用考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白浓度，调整蛋白浓度，加入4×loading buffer并在沸水浴中煮样5分钟，样品置于－20℃保存备用。
按照分子克隆中的配方配制12％SDS-PAGE gel，通过测定的样品蛋白含量计算，使各组样品上样量保持一致,上样量为50μg。浓缩胶采用80伏恒压进行压缩，分离胶采用120伏电压分离，然后使用半干法将SDS-PAGE胶中蛋白转印至PVDF（polyvinylidene fluoride）膜上，10伏恒压电转2-3小时。转印结束后根据预染Marker确定转印效率。然后将转印后的膜放在新鲜配制的5％脱脂奶粉（PBST配制）中进行封闭，室温孵育1小时。封闭结束后，根据抗体说明用含5％脱脂奶粉的PBST溶液稀释一抗（primary antibody）至最佳工作浓度，将膜包被于一抗中置于4℃作用过夜。然后将膜用PBST置于摇床上轻轻摇荡洗涤3次，每次5-10分钟。洗涤完成后包被二抗，将HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗用含5％脱脂奶粉的PBST溶液按1：2000稀释，与膜共同孵育1小时，同样以PBST洗涤3次，每次5-10分钟。最后，按照产品说明配制发光底物溶液（ECL化学发光底物）滴加于PVDF膜上，室温放置1分钟，用滤纸将多余发光液吸干，将膜用保鲜膜包被后放入压片夹移入暗房，取X光片置于膜上曝光1-5分钟后，冲洗胶片，根据曝光条带判断蛋白的表达结果。
RT-PCR从mRNA水平检测与凋亡通路相关的重要蛋白表达情况：
（1）细胞mRNA提取：所有物品均提前用DEPC处理并灭菌（或购买的RNase free产品）。将细胞消化计数后分装于六孔细胞培养板，置细胞培养箱培养，待细胞生长至80%密度后，加药进行处理，继续培养6小时后，PBS洗涤一次。加入1ml Trizol，用移液枪吹打至细胞完全溶解。室温放置5分钟。加入200μl的氯仿/ml Trizol，振荡15秒后室温放置2-3分钟，然后于4℃，12000g离心15分钟。吸取上层（约400μl），转移至另一新eppendorf管中，加入500μl异丙醇，混匀，放置10分钟，4℃，12000g离心10分钟。可见RNA沉淀。弃去上清，加入1ml75％乙醇洗涤沉淀，7500g离心5分钟，在空气中晾干RNA沉淀，加入30μl DEPC处理的DDW溶解，测定RNA浓度及纯度，取一部分立即进行逆转录，剩余RNA冻存于-70℃，备用。
（2）RNA逆转录：采用20μl逆转录体系，将提取的模板RNA约2μg与5×buffer4μl，2μl dNTP(10mM),1μl oligo(dT)18(10μM)，RNase Inhibitor1μl，逆转录酶Rever-Tra Ace-α-1μl，混匀后37℃30分钟，85℃水浴反应5秒。
（3）半定量PCR：取逆转录的cDNA作为模板，以GAPDH为内标，采用其引物进行PCR，调整模板的使用量，然后利用调整后的模板同时扩增目的基因和GAPDH基因，以GAPDH为参照，观察不同加药处理对与凋亡通路相关蛋白基因RNA转录水平的影响。PCR采用20μl PCR反应体系：2μl10×Taq buffer，2μl dNTPs，2μl Mg2+，1μl上游引物，1μl下游引物，1μl cDNA模板，0.5μl rTaq polymerase，用DDW补足到20μl。PCR条件：94℃热变性4min，94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸40s,循环数为20-32个，最后72℃延伸分钟。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外观测仪下观察，拍照记录。
所用特异性引物为：DR4上游引物：5’-CAGAACGTCCTGGAGCCTGTAAC-3’，下游引物：5’-ATGTCCATTGCCTGATTCTTTGTG-3’；DR5上游引物：5’-GGGAAGAAGATTCTCCTGAGATGTG-3’，下游引物：5’-ACATTGTCCTC AGCCCCAGGTCG-3’；DcR2上游引物：5’-CTTCAGGAAACCAGAGCTTCCCT C-3’，下游引物5’-TTCTCCCGTTTGCTTA-TCACACGC-3’；Bcl-xl上游引物：5’-TTGGACAATGGACTGGTTGA-3’，下游引物：5’-GTAGAGTGGATGGTC AGTG-3’；Bax上游引物：5’-AAGAAGCTGAGCGAGTGT-3’，下游引物：5’-GGAGGAAGTCCAATGTC-3’；Bim上游引物:5’-ATGAGAAGATCCTCCCTGC T-3’,下游引物：5’-AATGCATTCTCCACACCAGG-3’；Noxa上游引物：5’-GTGCCCTTGGAAACGGAGA-3’，下游引物为：5’-CCAGCCGCCCAGTCTAATC A-3’；Puma上游引物：5’-CAGACTGTGAATCCTGTGCT-3’，下游引物为：5’-ACAGTATCTTACAGGCTGGG-3’；GAPDH上游引物:5’-ACCACAGTCCAT GCCATCAC-3’，下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’；
不同蛋白与A549结合能力分析：荧光染料FAM标记的蛋白FAM-AnnexinV，FAM-TRAIL，FAM-Annexin V+FAM-TRAIL，FAM-TP8与A549于37℃孵育30分钟，胰酶消化，收集细胞，经PBS洗3遍后，用流式细胞仪分析。以FAM-BSA作为阴性对照。
DR4和DR5表达水平的流式分析：A549细胞经PBS、Annexin V、TRAIL、Annexin  V+TRAIL、TP8处理6小时后，收细胞后，用含有0.2%FBS的PBS洗一遍。细胞与用含有0.2%FBS的PBS稀释后的荧光标记的抗体在4℃避光孵育1小时。用含有0.2%FBS的PBS将与抗体孵育后的细胞洗3遍后，细胞由4%多聚甲醛固定并用流式细胞仪进行检测和分析。以与含有0.2%FBS的PBS孵育的细胞作为阴性对照。
Caspase8和Caspase3活性分析：A549细胞经PBS、Annexin V、TRAIL、Annexin V+TRAIL、TP8处理6小时后，收细胞后Caspase8和Caspase3活性分别用碧云天的Caspase8和Caspase3活性检测试剂盒进行分析。用试剂盒提供的底物和标准品绘制标准曲线。活性检测的具体操作如下：
胰酶消化并收集细胞，600g4℃离心5分钟，并用PBS洗一次。加入裂解液，冰上裂解15分钟。4℃16,000-20,000g离心10-15分钟，上清转入预冷的离心管中，立即测定cspase活性。将蛋白裂解液加入底物中，37℃孵育1小时至2小时，颜色变化较明显时，测定A405，同标准曲线对比即可得出caspase活性。
肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的方式与TRAIL完全相同，均依赖于Caspase-8。TRAIL，Annexin V+TRAIL以及肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白与肿瘤细胞A549细胞表面的受体DR4/DR5的结合能力没有差异（图6.3）。下游的信号分子（如DR4，DR5，DcR2以及与线粒体通路相关的蛋白如Bcl-XL，Bax，Bim，Noxa，Puma）的表达在不同药物处理后也无差异（图6.1，6.2，6.4）。但是Caspase-8，Caspase-3，PARP只有在经肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白处理后才被明显激活（图6.1，7.1，7.2）。而且，Caspase-8抑制剂Z-IETD-FMK可明显减少肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白诱导的细胞凋亡，而Caspase-9抑制剂Z-LEHK-FMK对肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白诱导的凋亡无明显影响（图7.3）。这充分说明，肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白与TRAIL具有完全一样的作用机制，其安全性与TRAIL相同。
此外，我们还构建、表达和制备了肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白的变体，在该变体中肿瘤坏死因子相关凋亡配体的活性中心-TRAIL第230位的半胱氨酸（Cys230）变突变为甘氨酸。如图5.2所示，肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白变体就不再具有诱导细胞凋亡的活性，这充分说明肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白是通过增加肿瘤细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡配体敏感性、即通过肿瘤坏死因子相关凋亡配体诱导细胞凋亡的信号通路发挥抗 肿瘤作用的。肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白并未增加了其它诱导细胞凋亡的作用方式，因此其具有与肿瘤坏死因子相关凋亡配体相同的安全性。
实施例4
肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白在肿瘤动物模型的抗肿瘤疗效实验
小鼠背部皮下肿瘤模型制备：5-6周龄的雌性裸鼠购于北京军事研究所。取指数生长期的A549或Bel7402或Colo205细胞，经胰酶消化后，用PBS于800×g离心洗涤2次。计数后PBS重悬并调整细胞浓度至10⁷细胞/ml然后每只小鼠右侧背部皮下经皮下注射100μL（10⁶细胞），一周左右，肿瘤大小生长至50mm³左右，将小鼠分成8组，每组8只。分别用PBS、Annexin V、TRAIL、Annexin V+TRAIL、TP8以及化疗药物给药，蛋白类药物及PBS经腹腔注射给药，每天注射一次，共治疗14天。化疗药物经尾静脉给药，每四天注射一次，共治疗14天。从开始治疗后每两天测量肿瘤大小，并按下列公式计算肿瘤体积：0.5×L1×(L2)²，其中L1为肿瘤长轴，L2为肿瘤短轴。治疗第15天，处死小鼠。
肿瘤组织切片CD31染色分析：给药结束后，处死老鼠，立即剖取出肿瘤组织用OTC包埋后，用冰冻切片机切片，切片厚度为5μm。切片完成后，风干，在冰丙酮中固定10分钟，室温晾干。用PBST洗片三次，擦干边缘，用油笔沿组织切片外缘画圈，用羊血清封闭液室温封闭30min。用抗体稀释液稀释一抗（CD311:50）。PBST冲洗片子后包被一抗4℃过夜。PBST冲洗3-5次，擦干边缘。包被二抗，37℃，45min。PBST洗三次。擦干边缘。DAPI染细胞核，用荧光显微镜镜检。
肿瘤组织切片TUNEL分析：给药结束后，处死老鼠，立即剖取出肿瘤组织用OTC包埋后，用冰冻切片机切片，切片厚度为5μm。切片完成后，风干，在冰丙酮中固定10分钟，室温晾干。用PBST洗片三次，擦干边缘，用油笔沿组织切片外缘画圈，用蛋白酶K室温孵育5分钟，TBS洗一次。3%H₂O₂室温孵育5分钟后，TBS洗一次。TdT Equilibration Buffer室温孵育15分钟，吸干TdT buffer，滴加TdT labeling reaction mixture，37℃孵育1.5小时，TBS洗三次并吸干，加入stop buffer室温孵育10分钟，吸干stop buffer，加入conjugate buffer,室温孵育30分钟，TBS洗一次并吸干，滴加DAB在组织表面，室温孵育15分钟后，ddH2O洗一次并吸干，在组织表面滴加甲基绿室温孵育3分钟，吸去甲基绿，在组织表面滴加100%乙醇 三次至组织表面无绿色。在组织表面迅速滴加二甲苯，并迅速吸干，重复一次，用甘油封片，在荧光显微镜下观察。
本发明采用了三种肿瘤模型，即对TRAIL不敏感的A549肿瘤模型，对TRAIL中度敏感的Bel7402肿瘤模型以及对TRAIL敏感的Colo-205肿瘤模型评估了肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8的抗肿瘤效果。在A549肿瘤模型中，腹腔注射TRAIL（5mg/kg/天），Annexin V（7.5mg/kg/天），TRAIL（5mg/kg/天）+Annexin V（7.5mg/kg/天），肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8（6.25mg/kg/天、12.5mg/kg/天、25mg/kg/天）。与阴性对照组（磷酸缓冲液组）相比（肿瘤倍增时间为5.3天），Annexin V，TRAIL，Annexin V+TRAIL未能有效抑制肿瘤生长，三组的肿瘤倍增时间分别为：6.1天、6.1天、6.0天；与阴性对照组相比，三组的肿瘤生长延滞时间（体积达到1000mm³时，相对于PBS组所需时间）分别为：0天、0.6天、1.1天。而不同剂量的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8均能明显抑制肿瘤生长，且这种抑制作用随着肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8剂量的增加而增强，三个剂量组的肿瘤倍增时间分别为：6.5天、7.4天、7.9天；与阴性对照组相比，三组的肿瘤生长延滞时间分别为：2.8天、6.9天、12.8天（图8.1、8.2）。
在Bel7402肿瘤模型中，腹腔注射TRAIL（5mg/kg/天），Annexin V（7.5mg/kg/天），TRAIL（5mg/kg/天）+Annexin V（7.5mg/kg/天），肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8（6.25mg/kg/天、12.5mg/kg/天、25mg/kg/天）。肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8（12.5mg/kg组）抑制肿瘤生长的效果较阴性对照组（磷酸缓冲液组），Annexin V组，TRAIL组以及Annexin V+TRAIL组要明显，且这种抑制作用随着肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8剂量的增加而增强。与阴性对照组（磷酸缓冲液组）相比（肿瘤倍增时间为7.3天），Annexin V，TRAIL，Annexin V+TRAIL未能有效抑制肿瘤生长，三组的肿瘤倍增时间分别为：7.8天、8.0天、7.6天；与阴性对照组相比，三组的肿瘤生长延滞时间分别为：4天、5.4天、5.0天。而不同剂量的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8均能明显抑制肿瘤生长，且这种抑制作用随着肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8浓度的增加而增强，三个剂量组的肿瘤倍增时间分别为：9.0天、9.3天、10.1天；与阴性对照组相比，三组的肿瘤生长延滞时间分别为：9.3天、10.0天、18.5天（图8.3、8.4）。
在Colo-205肿瘤模型中，腹腔注射TRAIL（5mg/kg/天），Annexin V（7.5mg/kg/天），TRAIL （5mg/kg/天）+Annexin V（7.5mg/kg/天），肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8（6.25mg/kg/天、12.5mg/kg/天、25mg/kg/天）。肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8（12.5mg/kg组）抑制肿瘤生长的效果较阴性对照组（磷酸缓冲液组）、Annexin V组、TRAIL组以及Annexin V+TRAIL组要明显，且这种抑制作用随着肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8剂量的增加而增强。与阴性对照组（磷酸缓冲液组）相比（肿瘤倍增时间为10.0天），Annexin V，TRAIL，Annexin V+TRAIL未能有效抑制肿瘤生长，三组的肿瘤倍增时间分别为：10.2天、12.5天、10.4天；与阴性对照组相比，三组的肿瘤生长延滞时间分别为：0.9天、4.6天、3.1天。而不同剂量的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8均能明显抑制肿瘤生长，且这种抑制作用随着肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8浓度的增加而增强，三个剂量组的肿瘤倍增时间分别为：14.5天、15.0天、14.0天；与阴性对照组相比，三组的肿瘤生长延滞时间分别为：12.2天、18.3天、22天（图8.5、8.6）。
用TUNEL对肿瘤组织切片中的肿瘤细胞凋亡进行了评估。与体外实验结果一致，仅TP8组能够明显地诱导肿瘤细胞的凋亡（图9）。
实施例5
肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8与顺铂联用抑制肿瘤生长的疗效评价实验
接种在皮下的A549肿瘤大小生长至50-100mm3左右，将小鼠分成8组，每组8只。分别用PBS、TP8（6.25mg/kg/day）以及顺铂(5mg/kg/day)进行治疗。TP8与PBS经腹腔注射给药，每天注射一次，共治疗14天。顺铂经尾静脉给药，每四天注射一次，共治疗14天。从开始治疗后每两天测量肿瘤大小，并按下列公式计算肿瘤体积：0.5×L1×(L2)²，其中L1为肿瘤长轴，L2为肿瘤短轴。
与PBS阴性对照组相比，肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8、顺铂以及TP8-顺铂联用均能抑制A549肿瘤的生长。TP8和顺铂联用时，抑制A549肿瘤生长的效果明显好于TP8、以及顺铂单独使用时的治疗效果。PBS组肿瘤倍增时间为16.1天，顺铂组肿瘤倍增时间为31.35天，TP8组肿瘤倍增时间为30.96天，TP8与顺铂联用组肿瘤倍增时间为40.92天。肿瘤生长延迟时间（即肿瘤体积达到1000mm³时相对PBS组所需时间）顺铂组为15.25天，TP8组为14.87天，TP8与顺铂联用组为24.83天（图10）。
本发明还尝试将肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白与抗肿瘤生物治疗药物，如重组内皮抑素（Endostatin）、血管抑素（Vasostatin）等联合使用，也取得了相似的协同治疗效果。
本发明还尝试将肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白与抗肿瘤中药成分，如雷公藤内酯醇等联合使用，也取得了相似的协同治疗效果。
本发明还尝试将肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白与本实验室前期已经研究多年的抗肿瘤减毒沙门氏菌VNP20009联合使用，也取得了相似的协同治疗效果。
本发明还尝试利用肿瘤靶向性的减毒沙门氏菌VNP20009为基因治疗载体，利用本实验室前述开发的技术（《治疗基因在厌氧组织靶向性递送和选择性稳定表达方法及应用》中国发明专利申请号：201010565011.6）进行肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白的基因治疗。利用减毒沙门氏菌VNP20009将肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白基因的表达质粒在肿瘤动物中进行基因治疗，取得了比单独用减毒沙门氏菌VNP20009治疗更好的治疗效果。
以膜联蛋白和肿瘤坏死因子相关凋亡配体为主要成分而构成的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白具有显著强大的抗多种肿瘤的生物活性、能够克服多种肿瘤细胞对细胞凋亡的不敏感或者抵抗，并且能够与化疗药物、生物药物、基因治疗、微生物药物、中药等治疗方法联合应用，产生更好的治疗效果。
因此，由具有磷脂结合活性的膜联蛋白家族成员蛋白质或具有磷脂结合活性的膜联蛋白家族成员蛋白质衍生物与肿瘤坏死因子家族中具有诱导细胞凋亡活性的成员蛋白质或具有诱导细胞凋亡活性的肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白衍生物构成的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白具有显著增强的诱导细胞凋亡的生物活性、能够克服目前广泛存在的包括肿瘤细胞在内的多种病理细胞对细胞凋亡的不敏感或者抵抗，并且能够与现有的诱导细胞凋亡的药物或者治疗方法（化疗药物、生物药物、基因治疗、微生物药物、中药等）联合应用，产生更好的治疗效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考一样。此外应理解，在阅读了本发明的上诉讲授内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种修改或改动，这些等价形式均应包含在本发明的保护范围之内。

















<210>7
<211>1506
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白TP8基因序列
<400>7
GCACAGGTTC TCAGAGGCAC TGTGACTGAC TTCCCTGGAT TTGATGAGCG   50
GGCTGATGCA GAAACTCTTC GGAAGGCTAT GAAAGGCTTG GGCACAGATG   100
AGGAGAGCAT CCTGACTCTG TTGACATCCC GAAGTAATGC TCAGCGCCAG   150
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CCTGAAATCA GAACTAACTG GAAAATTTGA AAAATTAATT GTGGCTCTGA   250
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AGTGTGTCTC ATTTGAGAAA GGTGTTTGAC AAGTACATGA CTATATCAGG   650
ATTTCAAATT GAGGAAACCA TTGACCGCGA GACTTCTGGC AATTTAGAGC   700
AACTACTCCT TGCTGTTGTG AAATCTATTC GAAGTATACC TGCCTACCTT   750
GCAGAGACCC TCTATTATGC TATGAAGGGA GCTGGGACAG ATGATCATAC   800
CCTCATCAGA GTCATGGTTT CCAGGAGTGA GATTGATCTG TTTAACATCA   850
GGAAGGAGTT TAGGAAGAAT TTTGCCACCT CTCTTTATTC CATGATTAAG   900
GGAGATACAT CTGGGGACTA TAAGAAAGCT CTTCTGCTGC TCTGTGGAGA   950
AGATGACGGT GGTGGTGGTT CTGGTGGTGG TGGTTCTGGT GGTGGTGGTG   1000
TGAGAGAAAG AGGTCCTCAG AGAGTAGCAG CTCACATAAC TGGGACCAGA   1050
GGAAGAAGCA ACACATTGTC TTCTCCAAAC TCCAAGAATG AAAAGGCTCT   1100
GGGCCGCAAA ATAAACTCCT GGGAATCATC AAGGAGTGGG CATTCATTCC   1150
TGAGCAACTT GCACTTGAGG AATGGTGAAC TGGTCATCCA TGAAAAAGGG   1200
TTTTACTACA TCTATTCCCA AACATACTTT CGATTTCAGG AGGAAATAAA   1250
AGAAAACACA AAGAACGACA AACAAATGGT CCAATATATT TACAAATACA   1300
CAAGTTATCC TGACCCTATA TTGTTGATGA AAAGTGCTAG AAATAGTTGT   1350
TGGTCTAAAG ATGCAGAATA TGGACTCTAT TCCATCTATC AAGGGGGAAT   1400
ATTTGAGCTT AAGGAAAATG ACAGAATTTT TGTTTCTGTA ACAAATGAGC   1450
ACTTGATAGA CATGGACCAT GAAGCCAGTT TTTTTGGGGC CTTTTTAGTT   1500
GGCTAA                                         1506
<210>8
<211>1467
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白基因序列
<400>8
GCACAGGTTC TCAGAGGCAC TGTGACTGAC TTCCCTGGAT TTGATGAGCG   50
GGCTGATGCA GAAACTCTTC GGAAGGCTAT GAAAGGCTTG GGCACAGATG   100
AGGAGAGCAT CCTGACTCTG TTGACATCCC GAAGTAATGC TCAGCGCCAG   150
GAAATCTCTG CAGCTTTTAA GACTCTGTTT GGCAGGGATC TTCTGGATGA   200
CCTGAAATCA GAACTAACTG GAAAATTTGA AAAATTAATT GTGGCTCTGA   250
TGAAACCCTC TCGGCTTTAT GATGCTTATG AACTGAAACA TGCCTTGAAG   300
GGAGCTGGAA CAAATGAAAA AGTACTGACA GAAATTATTG CTTCAAGGAC   350
ACCTGAAGAA CTGAGAGCCA TCAAACAAGT TTATGAAGAA GAATATGGCT   400
CAAGCCTGGA AGATGACGTG GTGGGGGACA CTTCAGGGTA CTACCAGCGG   450
ATGTTGGTGG TTCTCCTTCA GGCTAACAGA GACCCTGATG CTGGAATTGA   500
TGAAGCTCAA GTTGAACAAG ATGCTCAGGC TTTATTTCAG GCTGGAGAAC   550
TTAAATGGGG GACAGATGAA GAAAAGTTTA TCACCATCTT TGGAACACGA   600
AGTGTGTCTC ATTTGAGAAA GGTGTTTGAC AAGTACATGA CTATATCAGG   650
ATTTCAAATT GAGGAAACCA TTGACCGCGA GACTTCTGGC AATTTAGAGC   700
AACTACTCCT TGCTGTTGTG AAATCTATTC GAAGTATACC TGCCTACCTT   750
GCAGAGACCC TCTATTATGC TATGAAGGGA GCTGGGACAG ATGATCATAC   800
CCTCATCAGA GTCATGGTTT CCAGGAGTGA GATTGATCTG TTTAACATCA   850
GGAAGGAGTT TAGGAAGAAT TTTGCCACCT CTCTTTATTC CATGATTAAG   900
GGAGATACAT CTGGGGACTA TAAGAAAGCT CTTCTGCTGC TCTGTGGAGA   950
AGATGACGGT GTGAGAGAAA GAGGTCCTCA GAGAGTAGCA GCTCACATAA   1000
CTGGGACCAG AGGAAGAAGC AACACATTGT CTTCTCCAAA CTCCAAGAAT   1050
GAAAAGGCTC TGGGCCGCAA AATAAACTCC TGGGAATCAT CAAGGAGTGG   1100
GCATTCATTC CTGAGCAACT TGCACTTGAG GAATGGTGAA CTGGTCATCC   1150
ATGAAAAAGG GTTTTACTAC ATCTATTCCC AAACATACTT TCGATTTCAG   1200
GAGGAAATAA AAGAAAACAC AAAGAACGAC AAACAAATGG TCCAATATAT   1250
TTACAAATAC ACAAGTTATC CTGACCCTAT ATTGTTGATG AAAAGTGCTA   1300
GAAATAGTTG TTGGTCTAAA GATGCAGAAT ATGGACTCTA TTCCATCTAT   1350
CAAGGGGGAA TATTTGAGCT TAAGGAAAAT GACAGAATTT TTGTTTCTGT   1400
AACAAATGAG CACTTGATAG ACATGGACCA TGAAGCCAGT TTTTTTGGGG   1450
CCTTTTTAGT TGGCTAA                                       1467
<210>9
<211>1488
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白基因序列
<400>9
GCACAGGTTC TCAGAGGCAC TGTGACTGAC TTCCCTGGAT TTGATGAGCG   50
GGCTGATGCA GAAACTCTTC GGAAGGCTAT GAAAGGCTTG GGCACAGATG   100
AGGAGAGCAT CCTGACTCTG TTGACATCCC GAAGTAATGC TCAGCGCCAG   150
GAAATCTCTG CAGCTTTTAA GACTCTGTTT GGCAGGGATC TTCTGGATGA   200
CCTGAAATCA GAACTAACTG GAAAATTTGA AAAATTAATT GTGGCTCTGA   250
TGAAACCCTC TCGGCTTTAT GATGCTTATG AACTGAAACA TGCCTTGAAG   300
GGAGCTGGAA CAAATGAAAA AGTACTGACA GAAATTATTG CTTCAAGGAC   350
ACCTGAAGAA CTGAGAGCCA TCAAACAAGT TTATGAAGAA GAATATGGCT   400
CAAGCCTGGA AGATGACGTG GTGGGGGACA CTTCAGGGTA CTACCAGCGG   450
ATGTTGGTGG TTCTCCTTCA GGCTAACAGA GACCCTGATG CTGGAATTGA   500
TGAAGCTCAA GTTGAACAAG ATGCTCAGGC TTTATTTCAG GCTGGAGAAC   550
TTAAATGGGG GACAGATGAA GAAAAGTTTA TCACCATCTT TGGAACACGA   600
AGTGTGTCTC ATTTGAGAAA GGTGTTTGAC AAGTACATGA CTATATCAGG   650
ATTTCAAATT GAGGAAACCA TTGACCGCGA GACTTCTGGC AATTTAGAGC   700
AACTACTCCT TGCTGTTGTG AAATCTATTC GAAGTATACC TGCCTACCTT   750
GCAGAGACCC TCTATTATGC TATGAAGGGA GCTGGGACAG ATGATCATAC   800
CCTCATCAGA GTCATGGTTT CCAGGAGTGA GATTGATCTG TTTAACATCA   850
GGAAGGAGTT TAGGAAGAAT TTTGCCACCT CTCTTTATTC CATGATTAAG   900
GGAGATACAT CTGGGGACTA TAAGAAAGCT CTTCTGCTGC TCTGTGGAGA   950
AGATGACGCA GGTGGTTCTT CTGGTGGTGG TGTGAGAGAA AGAGGTCCTC   1000
AGAGAGTAGC AGCTCACATA ACTGGGACCA GAGGAAGAAG CAACACATTG   1050
TCTTCTCCAA ACTCCAAGAA TGAAAAGGCT CTGGGCCGCA AAATAAACTC   1100
CTGGGAATCA TCAAGGAGTG GGCATTCATT CCTGAGCAAC TTGCACTTGA   1150
GGAATGGTGA ACTGGTCATC CATGAAAAAG GGTTTTACTA CATCTATTCC   1200
CAAACATACT TTCGATTTCA GGAGGAAATA AAAGAAAACA CAAAGAACGA   1250
CAAACAAATG GTCCAATATA TTTACAAATA CACAAGTTAT CCTGACCCTA   1300
TATTGTTGAT GAAAAGTGCT AGAAATAGTT GTTGGTCTAA AGATGCAGAA   1350
TATGGACTCT ATTCCATCTA TCAAGGGGGA ATATTTGAGC TTAAGGAAAA   1400
TGACAGAATT TTTGTTTCTG TAACAAATGA GCACTTGATA GACATGGACC   1450
ATGAAGCCAG TTTTTTTGGG GCCTTTTTAG TTGGCTAA   1488
<210>10
<211>1539
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白基因序列
<400>10
GCACAGGTTC TCAGAGGCAC TGTGACTGAC TTCCCTGGAT TTGATGAGCG   50
GGCTGATGCA GAAACTCTTC GGAAGGCTAT GAAAGGCTTG GGCACAGATG   100
AGGAGAGCAT CCTGACTCTG TTGACATCCC GAAGTAATGC TCAGCGCCAG   150
GAAATCTCTG CAGCTTTTAA GACTCTGTTT GGCAGGGATC TTCTGGATGA   200
CCTGAAATCA GAACTAACTG GAAAATTTGA AAAATTAATT GTGGCTCTGA   250
TGAAACCCTC TCGGCTTTAT GATGCTTATG AACTGAAACA TGCCTTGAAG   300
GGAGCTGGAA CAAATGAAAA AGTACTGACA GAAATTATTG CTTCAAGGAC   350
ACCTGAAGAA CTGAGAGCCA TCAAACAAGT TTATGAAGAA GAATATGGCT   400
CAAGCCTGGA AGATGACGTG GTGGGGGACA CTTCAGGGTA CTACCAGCGG   450
ATGTTGGTGG TTCTCCTTCA GGCTAACAGA GACCCTGATG CTGGAATTGA   500
TGAAGCTCAA GTTGAACAAG ATGCTCAGGC TTTATTTCAG GCTGGAGAAC   550
TTAAATGGGG GACAGATGAA GAAAAGTTTA TCACCATCTT TGGAACACGA   600
AGTGTGTCTC ATTTGAGAAA GGTGTTTGAC AAGTACATGA CTATATCAGG   650
ATTTCAAATT GAGGAAACCA TTGACCGCGA GACTTCTGGC AATTTAGAGC   700
AACTACTCCT TGCTGTTGTG AAATCTATTC GAAGTATACC TGCCTACCTT   750
GCAGAGACCC TCTATTATGC TATGAAGGGA GCTGGGACAG ATGATCATAC   800
CCTCATCAGA GTCATGGTTT CCAGGAGTGA GATTGATCTG TTTAACATCA   850
GGAAGGAGTT TAGGAAGAAT TTTGCCACCT CTCTTTATTC CATGATTAAG   900
GGAGATACAT CTGGGGACTA TAAGAAAGCT CTTCTGCTGC TCTGTGGAGA   950
AGATGACGGT GCAGGTGGTT CTTCTGGTGG TGGTGCAGGT GGTTCTTCTG   1000
GTGGTGGTGC AGGTGGTTCT TCTGGTGGTG GTGTGAGAGA AAGAGGTCCT   1050
CAGAGAGTAG CAGCTCACAT AACTGGGACC AGAGGAAGAA GCAACACATT   1100
GTCTTCTCCA AACTCCAAGA ATGAAAAGGC TCTGGGCCGC AAAATAAACT   1150
CCTGGGAATC ATCAAGGAGT GGGCATTCAT TCCTGAGCAA CTTGCACTTG   1200
AGGAATGGTG AACTGGTCAT CCATGAAAAA GGGTTTTACT ACATCTATTC   1250
CCAAACATAC TTTCGATTTC AGGAGGAAAT AAAAGAAAAC ACAAAGAACG   1300
ACAAACAAAT GGTCCAATAT ATTTACAAAT ACACAAGTTA TCCTGACCCT   1350
ATATTGTTGA TGAAAAGTGC TAGAAATAGT TGTTGGTCTA AAGATGCAGA   1400
ATATGGACTC TATTCCATCT ATCAAGGGGG AATATTTGAG CTTAAGGAAA   1450
ATGACAGAAT TTTTGTTTCT GTAACAAATG AGCACTTGAT AGACATGGAC   1500
CATGAAGCCA GTTTTTTTGG GGCCTTTTTA GTTGGCTAA               1539
<210>11
<211>1506
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白PT8基因序列
<400>11
GTGAGAGAAA GAGGTCCTCA GAGAGTAGCA GCTCACATAA CTGGGACCAG   50
AGGAAGAAGC AACACATTGT CTTCTCCAAA CTCCAAGAAT GAAAAGGCTC   100
TGGGCCGCAA AATAAACTCC TGGGAATCAT CAAGGAGTGG GCATTCATTC   150
CTGAGCAACT TGCACTTGAG GAATGGTGAA CTGGTCATCC ATGAAAAAGG   200
GTTTTACTAC ATCTATTCCC AAACATACTT TCGATTTCAG GAGGAAATAA   250
AAGAAAACAC AAAGAACGAC AAACAAATGG TCCAATATAT TTACAAATAC   300
ACAAGTTATC CTGACCCTAT ATTGTTGATG AAAAGTGCTA GAAATAGTTG   350
TTGGTCTAAA GATGCAGAAT ATGGACTCTA TTCCATCTAT CAAGGGGGAA   400
TATTTGAGCT TAAGGAAAAT GACAGAATTT TTGTTTCTGT AACAAATGAG   450
CACTTGATAG ACATGGACCA TGAAGCCAGT TTTTTTGGGG CCTTTTTAGT   500
TGGCGGTGGT GGTGGTTCTG GTGGTGGTGG TTCTGGTGGT GGTGGTGCAC   550
AGGTTCTCAG AGGCACTGTG ACTGACTTCC CTGGATTTGA TGAGCGGGCT   600
GATGCAGAAA CTCTTCGGAA GGCTATGAAA GGCTTGGGCA CAGATGAGGA   650
GAGCATCCTG ACTCTGTTGA CATCCCGAAG TAATGCTCAG CGCCAGGAAA   700
TCTCTGCAGC TTTTAAGACT CTGTTTGGCA GGGATCTTCT GGATGACCTG   750
AAATCAGAAC TAACTGGAAA ATTTGAAAAA TTAATTGTGG CTCTGATGAA   800
ACCCTCTCGG CTTTATGATG CTTATGAACT GAAACATGCC TTGAAGGGAG   850
CTGGAACAAA TGAAAAAGTA CTGACAGAAA TTATTGCTTC AAGGACACCT   900
GAAGAACTGA GAGCCATCAA ACAAGTTTAT GAAGAAGAAT ATGGCTCAAG   950
CCTGGAAGAT GACGTGGTGG GGGACACTTC AGGGTACTAC CAGCGGATGT   1000
TGGTGGTTCT CCTTCAGGCT AACAGAGACC CTGATGCTGG AATTGATGAA   1050
GCTCAAGTTG AACAAGATGC TCAGGCTTTA TTTCAGGCTG GAGAACTTAA   1100
ATGGGGGACA GATGAAGAAA AGTTTATCAC CATCTTTGGA ACACGAAGTG   1150
TGTCTCATTT GAGAAAGGTG TTTGACAAGT ACATGACTAT ATCAGGATTT   1200
CAAATTGAGG AAACCATTGA CCGCGAGACT TCTGGCAATT TAGAGCAACT   1250
ACTCCTTGCT GTTGTGAAAT CTATTCGAAG TATACCTGCC TACCTTGCAG   1300
AGACCCTCTA TTATGCTATG AAGGGAGCTG GGACAGATGA TCATACCCTC   1350
ATCAGAGTCA TGGTTTCCAG GAGTGAGATT GATCTGTTTA ACATCAGGAA   1400
GGAGTTTAGG AAGAATTTTG CCACCTCTCT TTATTCCATG ATTAAGGGAG   1450
ATACATCTGG GGACTATAAG AAAGCTCTTC TGCTGCTCTG TGGAGAAGAT   1500
GACTAA                                                   1506
<210>12
<211>1473
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>膜联蛋白-肿瘤坏死因子α融合蛋白基因序列
<400>12
GCACAGGTTC TCAGAGGCAC TGTGACTGAC TTCCCTGGAT TTGATGAGCG   50
GGCTGATGCA GAAACTCTTC GGAAGGCTAT GAAAGGCTTG GGCACAGATG   100
AGGAGAGCAT CCTGACTCTG TTGACATCCC GAAGTAATGC TCAGCGCCAG   150
GAAATCTCTG CAGCTTTTAA GACTCTGTTT GGCAGGGATC TTCTGGATGA   200
CCTGAAATCA GAACTAACTG GAAAATTTGA AAAATTAATT GTGGCTCTGA   250
TGAAACCCTC TCGGCTTTAT GATGCTTATG AACTGAAACA TGCCTTGAAG   300
GGAGCTGGAA CAAATGAAAA AGTACTGACA GAAATTATTG CTTCAAGGAC   350
ACCTGAAGAA CTGAGAGCCA TCAAACAAGT TTATGAAGAA GAATATGGCT   400
CAAGCCTGGA AGATGACGTG GTGGGGGACA CTTCAGGGTA CTACCAGCGG   450
ATGTTGGTGG TTCTCCTTCA GGCTAACAGA GACCCTGATG CTGGAATTGA   500
TGAAGCTCAA GTTGAACAAG ATGCTCAGGC TTTATTTCAG GCTGGAGAAC   550
TTAAATGGGG GACAGATGAA GAAAAGTTTA TCACCATCTT TGGAACACGA   600
AGTGTGTCTC ATTTGAGAAA GGTGTTTGAC AAGTACATGA CTATATCAGG   650
ATTTCAAATT GAGGAAACCA TTGACCGCGA GACTTCTGGC AATTTAGAGC   700
AACTACTCCT TGCTGTTGTG AAATCTATTC GAAGTATACC TGCCTACCTT   750
GCAGAGACCC TCTATTATGC TATGAAGGGA GCTGGGACAG ATGATCATAC   800
CCTCATCAGA GTCATGGTTT CCAGGAGTGA GATTGATCTG TTTAACATCA   850
GGAAGGAGTT TAGGAAGAAT TTTGCCACCT CTCTTTATTC CATGATTAAG   900
GGAGATACAT CTGGGGACTA TAAGAAAGCT CTTCTGCTGC TCTGTGGAGA   950
AGATGACGGT GGTGGTGGTT CTGGTGGTGG TGGTTCTGGT GGTGGTGGTG   1000
TCAGATCATC TTCTCGAACC CCGAGTGACA AGCCTGTAGC CCATGTTGTA   1050
GCAAACCCTC AAGCTGAGGG GCAGCTCCAG TGGCTGAACC GCCGGGCCAA   1100
TGCCCTCCTG GCCAATGGCG TGGAGCTGAG AGATAACCAG CTGGTGGTGC   1150
CATCAGAGGG CCTGTACCTC ATCTACTCCC AGGTCCTCTT CAAGGGCCAA   1200
GGCTGCCCCT CCACCCATGT GCTCCTCACC CACACCATCA GCCGCATCGC   1250
CGTCTCCTAC CAGACCAAGG TCAACCTCCT CTCTGCCATC AAGAGCCCCT   1300
GCCAGAGGGA GACCCCAGAG GGGGCTGAGG CCAAGCCCTG GTATGAGCCC   1350
ATCTATCTGG GAGGGGTCTT CCAGCTGGAG AAGGGTGACC GACTCAGCGC   1400
TGAGATCAAT CGGCCCGACT ATCTCGACTT TGCCGAGTCT GGGCAGGTCT   1450
ACTTTGGGAT CATTGCCCTG TGA                                1473