微生物转化法生产香兰素 一、技术领域
本发明涉及以谷糠、麦麸等农副产品以及当归、川芎等中药原料或其提取物残渣为原料，或由此原料中富集、分离、提取得到的阿魏酸、姜黄素、以及天然(异)丁子香酚、4-甲基愈创木酚为底物，利用微生物转化法生产天然香兰素的工艺技术。
二、技术背景
香兰素，学名4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，别名香草醛、香兰醛。英文名vanillin，4-Hydroxy-3-Methoxybenzaldehyde，分子式：C8H8O3，分子量：152.15。外观为白色至黄色针状结晶或晶性粉末，有香荚兰豆特有的香气，微甜，沸点284-285℃，相对密度1.056。微溶于水(1g/100ml，14℃)，易溶于乙醇、冰醋酸等。易受光的影响，在空气中逐渐氧化，遇见碱性物质变色。ADI：0-10mg/kg，LD50：1580mg/kg.
香兰素为广谱性高档香料，是世界上产量最大、用途最多的香料之一，广泛用于冰淇淋、饮料、巧克力、糖果、布丁、焙烤食品以及酒类、香烟、高档化妆品中，除作为增香剂外，香兰素还作为食品中的抗氧化剂；同时，香兰素、乙基香兰素、阿魏酸等芳香化合物还是医药原料及医药合成中重要的中间体，其需求量每年以10％的速度增加，目前年需求量在1.5万吨以上。
香兰素是天然芳香植物—香荚兰中的主要成份，其在干香荚兰豆中的含量约为15-20g/kg，从天然植物中提取的成本较高。香荚兰在种植过程中需要对花朵进行人工授粉，劳动强度大，难以大规模栽种；而且，香荚兰植物的主要种植国家和地区的种植面积和产量有限(1999年全球产量仅2200-2400吨：其中，马达加斯加950-1400吨/年、印度尼西亚150-300吨/年、塔希提岛150-200吨/年、墨西哥20-40吨/年、中国10-20吨/年；我国的海南省已经开始种植香荚兰，但还没有香兰素工业产品供应)，因此，单靠增加香荚兰豆的产量，从植物中提取香兰素已不能满足日益增长的市场需要，并且，每年从香荚兰豆中提取的天然香兰素只有约20吨。
目前，绝大部分的香兰素是采用化学法进行合成，虽然该方法已经成熟，且成本低廉，但不论是采用有毒原料----愈创木酚、还是采用丁香酚、木质素合成生产香兰素，不仅会造成环境污染，而且所合成香兰素的安全性也受到质疑，加之目前欧共体和美国等发达国家已开始限制合成香兰素的添加使用量，消费者日益注重食品及其组分的安全性和天然性，因此，国内外对天然香兰素的需求趋势在不断上升，采用生物技术生产天然香兰素也受到了广泛的关注。
目前，我国香兰素的生产全部采用化学合成的方法，虽然能创造一定的经济效益，但由于技术水平低，废弃物处理不当等原因，对环境造成很大破坏，寻求天然香兰素的生产方法是必然地趋势。目前，比较有前景的实验室研究有河南医科大学和华中理工大学利用香荚兰植物细胞悬浮培养物生产香兰素，但要实现商业化生产还需要很长时间，国内目前还没有以微生物转化法生产香兰素的相关研究报道。
国外对微生物转化法生产香兰素的研究也只有十几年的历史，而且也还没有商业化生产的报道。
由于天然香兰素巨大的市场需求(1.5万吨/年)以及微生物转化法生产香兰素的诱人前景，对该领域的深入研究将会带来巨大的经济与社会效益。目前该领域技术的发展趋势也表明：前体物的选择更多地集中在那些易得、价格低廉的农副产品；当然，此工作的前提是香兰素生物转化技术的发展和基因工程菌株的构建，特别是以淀粉或葡萄糖直接合成香兰素工程菌株的构建技术。
生产香兰素或香子兰香精系列产品，除考虑技术的可行性外，还要综合考虑其经济性、安全性等。据估算，采用植物细胞培养技术生产香兰素，成本高达15000美元/公斤，而采用传统方法从香荚兰豆中提取的成本为4000美元/公斤，利用微生物转化法成本约为1000美元/公斤。利用提取法生产的天然香兰素每年只有约20吨，远不能满足人们对天然香兰素和天然香兰素香精产品的巨大需求，如果微生物转化法生产香兰素的成本能进一步降低的话，相信全球每年1.5万吨、且还有以10％增长率的香兰素市场需求量，即使有超过10％的产品被微生物转化法生产的香兰素所取代，每年也会有1500吨的巨大市场需求。
香兰素微生物转化的前体物阿魏酸一般在谷糠和麦麸、甜菜等农副产品下脚料中含量较高，据估计，我国每年有1000万吨的米糠，1000万吨的麦麸等。目前，这些资源开发的比例极小。该发明技术的推广使用，不仅把农副产品转化成高附加值产品，而且可以解决环保和农业资源与农村人力资源问题，具有很高的经济与社会效益。
三、发明内容
1、发明内容概论
本发明涉及以谷糠、麦麸等农副产品以及当归、川芎等中药原料或其提取物残渣为原料，或由此原料进行富集、分离、提取得到的阿魏酸、姜黄素、以及天然(异)丁子香酚、4-甲基愈创木酚为底物，利用微生物转化法生产天然香兰素的工艺技术。
2、本发明的技术实施方案及工艺
谷糠、麦麸等农副产品下脚料经过筛选除去沙石、金属等杂质后进行处理。
微波处理既可以杀灭物料中的有害微生物，延长原料的保质期，又有助于阿魏酸和不溶性纤维素之间化学键的断裂，提高游离阿魏酸的含量，从而提高阿魏酸得率。根据微波处理的物料数量和微波发生器的功率来确定处理时间，一般微波处理的条件是时间5-20min，物料处理温度不超过80℃。经过微波处理的原料如果不立即使用，则可以进行封闭保存，保质期为半年以上。
微波处理后的原料可以进行超细粉碎，物料目数300-500目。
经过以上工艺处理得到的原料进行挤压膨化处理，条件是中心温度：140-230℃，主轴转速：40-100r/min，物料水分：9-15％，进料速度：20-60kg/h。经处理的原料，粗粉碎或切割成小颗粒。
阿魏酸的富集、分离和提取采用下列工艺路线：
物料浸泡→回流→过滤→减压蒸馏浓缩→粗提物。浸提溶剂可以是甲醇、乙醇、甲烷或正己烷等有机溶剂。提取得到的粗提物-阿魏酸含量在10-80％。
微生物转化所需的菌种经活化处理后进行培养，培养条件是：时间5-50h，温度25-35℃，搅拌转速200-400r/min。
当微生物生长进入稳定期后，加入经过提纯的阿魏酸或经过处理的麦麸进行生物转化，其转化条件为：时间30-90h，温度30-45℃，搅拌转速200-700r/min。
不同阿魏酸添加量对香兰素产量的影响：无菌添加阿魏酸，使其初始浓度分别为1g/L、6g/L和8g/L，然后进行转化试验，结果如图1、2和3所示。
由图1、2和3可以看出，香兰素的产量随阿魏酸添加量的增大而增加，但产生香兰素的延迟期随阿魏酸添加量的增大而延长。当阿魏酸添加量为6g/L，并在38h补加6g/L阿魏酸时的香兰素产量最高，达到8.59g/L。而副产物香草酸的产量一直都保持在很低水平。这是由于霉菌在以阿魏酸为底物进行代谢时，香草酸只积累到一定量，然后将香兰素作为主要代谢产物，即在此处形成一个瓶颈，导致香兰素的过量合成。
微生物转化以后，过滤菌体或发酵液中的固体物质，然后分离、精制上述微生物转化液中的香兰素。
香兰素的分离提取工艺路线为：浸提→萃取→回流→减压蒸馏浓缩→粗提物。
浸提溶剂可以是苯、甲醇、乙醇、甲烷、正己烷等有机物；萃取溶剂为碱性水溶液。
香兰素粗提物的精制采用超临界二氧化碳萃取工艺。
超临界二氧化碳萃取工艺的条件是：温度30-50℃；压力：15-40Pa。甲醇、乙醇或甲烷、正己烷等有机溶剂作携带剂。经该工艺处理得到的香兰素制品，纯度高于90％。
由于本发明的最大特点是香兰素粗提物的精制采用超临界二氧化碳萃取工艺。该提取工艺可以省去大量酸碱处理过程，除降低分离成本外，还可以大大降低酸碱溶液对环境的污染。
四、本发明具体实施步骤
1、原料的前处理技术
将经过筛选以及去石、去金属物等处理后，进行微波处理。条件是：时间20分钟，物料温度不超过80℃。上述物料经超微粉碎处理，物料目数350目，然后进行挤压膨化处理，条件是中心温度：180-200℃，主轴转速：75rpm，物料水分：13.5％，进料速度：40kg/h。经此处理工艺的原料，粗粉碎或切割成小颗粒备用。
2、香兰素的微生物转化技术
将预处理的物料，经过浸提、回流、过滤和浓缩处理，得到阿魏酸的粗体物，阿魏酸含量10-80％，备用。
事例1：
经过事例2得到的阿魏酸粗提物，采用超临界二氧化碳萃取工艺进行精制。超临界二氧化碳萃取工艺的条件是温度：35℃；压力：25-30Pa；甲醇作携带剂。经该工艺处理得到的阿魏酸制品，纯度高于90-99％。
事例2：
在斜面培养基中将出发菌株于30℃条件下培养72h，然后接入种子培养基，摇床190-230r/min，37℃振荡培养24-28h后，以1-3％的接种量接入发酵培养基中，当生长到静止期时加入阿魏酸，使其初始浓度分别为8g/L，并在35-45h流加阿魏酸8g/L，发酵转化完成后测定培养基中阿魏酸、香兰素、香草酸的含量，香兰素产量8.6g/L。
事例3：
将发酵液中的菌体离心分离后，得到1.5L发酵液，50-55℃真空浓缩后得到浓缩发酵液0.5L，然后使用有机溶剂乙醇和正己烷(1.1-1.5∶1)混合萃取3次，得到2.4L萃取液，浓缩回收后使用丙酮和正己烷(1∶1-2)混合萃取后浓缩回收，得到香兰素含量为36％的粗体物20g。提取率为60％。
事例4：
将事例5所得到的香兰素粗提物进行超临界二氧化碳萃取，萃取工艺条件是温度：30-50℃；压力：15-40大气压。乙醇作携带剂，得到含量为91％的天然香兰素7.5g。超临界二氧化碳萃取提取率为94.8％。
综合提取率为57％。
本发明所采用的方法，可以最大限度的降低酸碱以及有机溶剂的使用和排放，减少对环境的污染破坏。产品更加安全可靠。
五、附图说明
图1为阿魏酸添加量为1g/L时的产量曲线。图2为阿魏酸添加量为6g/L时对产物的影响。图3为阿魏酸添加量为8g/L时对产物的影响。