人红细胞球N型细胞特异单克隆抗体的制备方法及N型变异红细胞分析方法 前言
本发明涉及生物医学领域，发明了人红细胞球N型细胞特异单克隆抗体的制备方法及N型变异红细胞分析方法。人红细胞球N型细胞特异单克隆抗体的制备方法是N型变异红细胞分析方法的前提。
研究背景，本发明解决的关键问题
国内，所有MN血型的抗体，无论是单克隆抗体还是多克隆抗体血清，全部是为了临床血型分型鉴定应用的目的，均不能用于变异红细胞分析。在国外，绝大多数MN血型的抗体除了部分为血型鉴定和亚型研究、和GPA蛋白生物学性质研究之外，个别单克隆抗体例如1A6，NN3，BRIC156已经运用于MN型变异红细胞分析的方法。可是，尽管M型抗体中有些能满足变异红细胞分析，而最大困难是N型细胞特异单克隆抗体的制备，至今国际上只有唯一一个抗体即英国1972年生产的BRIC156满足此要求。
人红细胞球N型细胞特异单克隆抗体的制备是关键技术。抗人GPA的特异单克隆抗体生产非常困难。原因如下：
第一、为独特的应用方式所要求。本项目的目的最终要应用到固定细胞的标记，GPA变异红细胞分析要求单抗具有如下特点：不能凝集红细胞，需要固定红细胞；能特异结合固定红细胞且有足够的结合强度；对固定细胞M，N型蛋白应准确识别其分辨能力与细胞ELISA应有一致性。
第二、MN血型抗原结构差异小。GPAM和GPAN型蛋白在肽链一级结构上仅存2个氨基酸的微小差异，第一和第五位置氨基酸S、G决定M型，L、E决定N型。第二三四位有O-糖基连接。GPAM和GPAN型蛋白序列如下：
S/L-S-T-T-G/E-V-A-M-H-T-S-T-S-S-S-V-T-K-S-Y-I-S-S-Q-T-N-D-T-H-K-R-D-T-Y-A-A-T-P-R-A-H-E-V-S-E-I-S-V-R-T-V-Y-P-P-E-E-E-T-G-E-R-V-Q-L-A-H-H-F-S-E-P-E-I-T-L-L-I-F-G-V-M-A-G-V-I-G-T-I-L-L-I-S-Y-G-I-R-R-L-I-K-K-S-P-S-D-V-K-P-L-P-S-P-D-T-D-V-P-L-S-S-V-E-I-E-N-P-E-T-S-D-Q
第三、含糖结构干扰。尽管第二三四位有O-糖基连接，但是最近有研究表明M和N型GPA蛋白序列第二三四位O-糖基存在差异。
第四、所有红细胞含有第二抗原GPB蛋白，GPB蛋白1-26位序列和GPAN型一致，具有假“N血型”对特异抗体制备产生干扰。GPB蛋白序列如下：
L-S-T-T-E-V-A-M-H-T-S-T-S-S-S-V-T-K-S-Y-I-S-S-Q-T-N-G-E-M/T-G-Q-L-V-H-R-F-T-V-P-A-P-V-V-I-I-L-I-I-L-(S)-V-M-A-G-I-I-G-T-I-L-L-I-S-Y-S-I-R-R-L-I-K
第五、MN血型抗原理论上的差异造成N型抗原容易变性。首先，有文献报道M，N血型抗原GPAM和GPAN对固定剂反应不同，即GPAN型对甲醛固定丧失对抗体结合特异性。
第六、我们的实验(未发表)显示：GPAN蛋白抗原在实验制备纯化过程种容易变性。在4℃变性沉淀，而且不能复性溶解。
本发明申请保护的技术方案
申请保护的方案一——抗体制备方法：
组合免疫方案(未发表)：用纯化GPAN蛋白(图1)100微克与完全佐剂初次免疫，用纯化GPAN蛋白100微克与不完全佐剂第二次免疫，用二甲亚胺固定的N型红细胞6×108第三次免疫，以及用二甲亚胺固定的N型红细胞6×108尾静脉加强免疫Balb/C小鼠，取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/O融合。目地是首先，用纯蛋自免疫可产生的对蛋白的各种位点的抗性，再用二甲亚胺固定的N型红细胞免疫：一、避免抗原构象错误；二、加强固定GPAN型蛋白抗原抗性。
组合筛选方案：正常细胞、和胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶处理的人红细胞凝集筛选，间接免疫荧光，酶联免疫分析及纯化GPAM和GPAN型蛋白Western blot鉴定。
本方法生产的6A8单克隆抗体(图2，图3，图4)，抗原决定簇为GPAN型蛋白氨基端1-5位氨基酸和2，3，4位O糖基*组合结构域(序列为L-S*-T*-T*-E-------)，它和自然红细胞结合MN，NN型细胞特异强度高，对MM型细胞有微弱的本底结合。其优势是特异结合二甲亚胺固定的MN，NN型红细胞(图5)。满足了下列保护方案的应用要求。
申请保护的方案二——N型变异红细胞分析方案(图6)：
方案一生产的6A8单克隆抗体(其性能描述文章已发表)为建立本方法前提，因此建立在本发明生产的6A8单克隆抗体基础上的两种N型变异红细胞分析GPA突变分析方法(1Wb，2Wa。图6)，为我实验室首创，建立在6A8单克隆抗体基础上，随之申请保护。
结合其它2株特异抗体(已经发表)3G4(抗M)和3C5(抗MN)分别标记荧光和生物素，将3C5-FITC和生物素化6A8结合，建立了GPA分析法1Wb；采用生物素化6A8结合FITC-3G4建立2Wa分析法。
在流式细胞仪上以结合抗体性质和荧光强度分选出MM，MN，NN型红细胞，1Wb法可将MN血型红细胞分为正常和变异2群(1Wa：MN和MO，MM或1Wb：MN和NO，NN)，2Wa法可将MN型红细胞分选为MN，MO，MM，NO，NN等5群，并分别计算变异细胞频率(图6)。使用Coulter EPICS单光束流式细胞仪，激发光源为氩离子激光器，激发波长488nm，荧光信号采集使用前向角(FS)和侧向角(SS)散射双参数，以520nm滤片检测绿色荧光(FITC)，以580nm滤片过滤检测PE红色荧光，测量数据通过计算机System II 2.0版本软件处理数据。检测速率为每秒2,000个细胞。表1组合的N型变异红细胞方法。
表1 GPA N型变异红细胞分析法的构成及特点
抗体结合 荧光 检测 检出变异 计算细胞变
检测方法 抗体 荧光素 细胞处理方法
特异性位点 信号 位点 细胞群 异频率
1Wb 3C5 FITC 二甲亚胺固定 M，N 绿 N MM，MO Vf(MM+MO)
6A8 PE N 红
2Wa 3G4 FITC 二甲亚胺固定 M 绿 M和N MM，MO， Vf(MM)，Vf(MO)，
6A8 PE N 红 NN，NO Vf(NN)，Vf(NO)
国外建立的方法需用专用试剂，我们通过实践，自行摸索试剂配置方法，细胞染色试剂在红细胞标记和流式分析中应用效果好，未产生非特异、或假阳性。
创立的分析法，在放射病人剂量诊断和肿瘤发生风险预测以及肿瘤诊断应用。
显示性能良好和独特的应用优势：采取血样便利；需血样少(10ul)，对血样要求不需要无菌操作和培养；快速和对大样本诊断。
本发明相关辅助技术
·红细胞固定化技术(参考国外方法建立，已经发表，不申请保护)：变异红细胞分析方法采用人红细胞球，即固定化红细胞，目的是为了防止单克隆抗体引起红细胞的凝集。人红细胞球的制备方法有二：
(1).红细胞二甲亚胺固定：用Ficoll分离全血得到红细胞，用PBS洗涤以去除粒细胞和血清。取0.1ml积压红细胞，加入0.3％DMS溶液中(用含0.15mol/LNaCl的0.1mol/LNa2CO3缓冲液pH 10.3配制)，37℃孵育20分钟，用PBS洗涤红细胞，将红细胞悬浮在PBS中备用。
(2).红细胞甲醛固定：取0.1ml肝素钠抗凝全血，加入含SDS75μg/ml的PBS中，1分钟后用PBS将SDS浓度调至10μg/ml，并加入37％甲醛使其终浓度为3％，1.5小时后将甲醛浓度调至10％，室温过夜固定。用洗涤缓冲液(1mg/ml BSA，0.01％NP-40和1.5mmol/L NaN3)洗涤红细胞，将细胞悬浮于洗涤缓冲液中备用。
·分析样品制备技术(参考国外方法自行修改建立，已经发表，不申请保护)
细胞样品(见上述固定化技术)固定红细胞与标记抗体反应：用PBS将固定细胞制成106/ml悬液，每管加入biotin标记抗体2μg，轻轻振荡反应30min，再加入sv-PE1μl反应30min；或者每管1ml红细胞加入FITC标记2μg，轻轻振荡反应30min。反应样品用PBS洗涤后在荧光显微镜下观察。
每个检测样品取106红细胞，于1ml染色缓冲液中，先加入FITC标记抗体2μg，室温反应30min后，加入biotin标记抗体2μg，室温反应30min，加入sv-PE 3μl室温反应30min，用染色缓冲液离心洗涤，将细胞重悬于1ml染色缓冲液中，上流式细胞仪测定。使用Coulter EPICS单光束流式细胞仪，激发光源为氩离子激光器，激发波长488nm，荧光信号采集使用前向角(FS)和侧向角(SS)散射双参数，以520nm滤片检测绿色荧光(FITC)，以580nm滤片过滤检测PE红色荧光，测量数据通过计算机EPICSXL/XL-MCL system II2.0版本软件处理，检测速率为每秒2000个细胞。设荧光标记兔抗鼠IgG二抗为阴性对照，以MM，MN，NN三型红细胞混合样品为阳性对照，设定标准窗口。
(附图说明)：
图1.GPA的纯化示意图；
图2.抗体6A8纯化制备示意图；
图3.纯化6A8示意图
图4.纯化6A8和红细胞膜蛋白组分、和纯化GPAN特异结合印迹。
图5.纯化6A8和自然MN，NN红细胞，和固定MN，NN红细胞特异结合示意图。
图6.纯化6A8和其他抗体组合构建GPA分析方法1Wb，2Wa示意图。
图7.正常人和MDS、白血病病人的MM，MO变异红细胞分选图。
MDS和白血病病人以及治疗的白血病病人(编号：L1-L6)红细胞的MM，MO变异频率明显高于正常人。
本发明实施应用的实例(结合附图说明)
实施例一：两例钴源事故受照者以及离体照射外周血的GPA突变频率分析
正常人血液样本由解放军307医院血站提供，33例正常MN型男性，年龄20～35。“6.25”事故两个MN型病例由第二军医大学提供，病例“给”男性62岁，病例“武”男性29岁，采其外周血，肝素钠抗凝，分离红细胞加甘油液氮储存。用1Wb分析法对2例放射病病例的分析：
表2.1 Wb分析法对2例放射病病例的分析
样品号 3C5标记弱的细 6A8标记弱的细胞群 6A8标记标记强度3％细胞 6A8标记标记强度1％细胞
胞群数量(％) Vf(MM+MO)(％) 群Vf(MM+MO)(×10-6) 群Vf(MM+MO)(×10-6)
3 10.6 3.5 3521 3
4 11.6 19.1 1196 21
5 13.3 24.9 258 31
6 14.5 19.6 2393 11
“给” 21.8 1.4 7371 61
“武” 19.5 1.2 6457 66
结论：
1.抗MN结合抗N抗体建立了1Wb方法，参考文献报道方法，界定6A8标记的细胞群标记强度以1％为限，定为变异细胞。
2.放射病病人“给”和“武”的Vf(MM+MO)值均有明显升高。且与所受照剂量成相关性。用GPA分析法2Wa检测2例放射病病人
表3.GPA分析法2Wa对2例放射病人的检测
样品号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 给 武
原编号 10 15 3 1 13 11 9 12 16 17 14 G S
Vf(MM+MO) 7 2 3 16 46 25 24 5 2 14 13 73 16
Vf(NN+NO) 8 11 3 2 1 1 6 1 7 10 2 17 22
以物理剂量估计：“武”为2.5Gy，“给”为2.4Gy*(*郭勇1994)，其突变与所受剂量也显示正相关。
但是二者的变异频率相差较大，应考虑其他环境及个人因素。
重复对2例MN血型放射病病人“武”“给”进行了检测，结果表明：其GPA MM+MO变异频率和NN+NO变异频率都高于正常人，
表4.2Wa分析法重复对2例放射病病例的分析
样品号 1 2 3 4 给 武
原编号 5 4 12 13 G S
Vf(MM+MO) 10 20 1 4 80 120
Vf(NN+NO) 6 9 2 7 13 35
与前述结果相似，比较受照的物理剂量：“武”为2.5Gy，“给”为2.4Gy*，其GPA突变与所受剂量显示正相关。
进一步证明两者估算受照剂量高者，突变频率高。
实施例二：MDS和白血病病人外周血的GPA突变频率分析
目的：探讨临床化疗和放疗对人体GPA损伤致突变的影响。
方法：正常人和样本由解放军307医院血站提供，33例正常MN型男性，年龄20～35。白血病血液样本由解放军307医院血液科提供。用GPA突变分析1Wb和2Wa方法。
结果：来自正常人和分别受化疗和放疗处理的20例MDS和白血病人的NN和NO变异频率，正常人群(18例)和未接受治疗的(2例)为0～19×10-6，16例接受治疗的病人极显著高出。
见图7.正常人和MDS、白血病病人的MM，MO变异红细胞状况。MDS和白血病病人以及治疗的白血病病人MM，MO变异频率显著高于正常人。
结论：实验表明，MDS和白血病病人GPAN抗原有较大差异，因而使MM，MO的变异频率参差不齐。
提示MDS和白血病病人以及治疗的白血病病人MM，MO变异频率显著高于正常人。可能用于预测突变水平与癌患风险。