具有经修饰的ERNS蛋白的牛病毒性腹泻病毒.pdf

本发明涉及可用作免疫原性组合物和疫苗的嵌合瘟病毒，其中所述嵌合瘟病毒包含不表达其同源Erns蛋白的牛病毒性腹泻病毒，并且其中所述嵌合瘟病毒表达源自另一种瘟病毒的异源Erns蛋白，或所述异源Erns蛋白的天然的、合成的或遗传变体。本发明还描述了用于治疗或预防牛病毒性腹泻病毒感染的传播的方法和试剂盒，以及用于区分经接种的和野生型感染的动物的方法和试剂盒。

权利要求书嵌合瘟病毒，其中所述嵌合瘟病毒包含不表达其同源Eens蛋白的牛病毒性腹泻病毒，并且其中所述嵌合瘟病毒表达源自另一种瘟病毒的异源Erns蛋白，或所述异源Erns蛋白的天然、合成的或遗传变体。
权利要求1的嵌合瘟病毒，其中所述嵌合瘟病毒的异源Erns蛋白或所述异源Erns蛋白的天然、合成的或遗传变体源自选自驯鹿瘟病毒、长颈鹿瘟病毒和叉角羚瘟病毒的瘟病毒。
权利要求1的嵌合瘟病毒，其中所述嵌合瘟病毒的异源Erns蛋白具有至少一种不存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中的Erns表位。
权利要求1的嵌合瘟病毒，其中所述嵌合瘟病毒的异源Erns蛋白缺失至少一种存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中的Erns表位。
权利要求1的嵌合瘟病毒的培养物。
包含权利要求1的嵌合瘟病毒的细胞系或宿主细胞。
编码权利要求1的嵌合瘟病毒的多核苷酸分子。
包含权利要求1的嵌合瘟病毒和兽医学上可接受的载体的免疫原性组合物。
权利要求8的免疫原性组合物，其中所述兽医学上可接受的载体是佐剂。
权利要求8的免疫原性组合物，其中所述嵌合瘟病毒是活的减毒的。
权利要求8的免疫原性组合物，其中所述嵌合瘟病毒是灭活的。
权利要求8的免疫原性组合物，其进一步包含用于治疗或预防牛中的一种或多种另外的致病微生物的传播的一种或多种另外的抗原。
包含权利要求7的多核苷酸分子和兽医学上可接受的载体的免疫原性组合物。
包含权利要求1的嵌合瘟病毒和兽医学上可接受的载体的疫苗。
权利要求14的疫苗，其中所述兽医学上可接受的载体是佐剂。
权利要求14的疫苗，其中所述嵌合瘟病毒是活的减毒的。
权利要求14的疫苗，其中所述嵌合瘟病毒是灭活的。
包含权利要求7的多核苷酸分子和兽医学上可接受的载体的疫苗。
权利要求14的疫苗，其进一步包含用于治疗或预防牛中的一种或多种另外的致病微生物的传播的一种或多种另外的抗原。
试剂盒，其在至少一个容器中包含权利要求14的疫苗。
治疗或预防牛病毒性腹泻病毒感染的传播的方法，其中向动物施用权利要求14的疫苗。
接种动物的方法，其中向所述动物施用DIVA瘟病毒疫苗，其中所述DIVA瘟病毒疫苗包含权利要求1的嵌合瘟病毒，并且其中所述嵌合瘟病毒具有至少一种不存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中的Erns表位。
接种动物的方法，其中向所述动物施用DIVA瘟病毒疫苗，其中所述DIVA疫苗包含权利要求1的嵌合瘟病毒，并且其中所述嵌合瘟病毒缺失至少一种存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中的Erns表位。
区分接种了权利要求14的疫苗的动物与感染了野生型牛病毒性腹泻病毒的动物的方法，其中接种了所述疫苗的动物产生抗体，所述抗体抗至少一种存在于所述疫苗的嵌合瘟病毒中但不存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中的Erns表位，所述方法包括以下步骤：
a)从动物获取血清样品；
b)就所述抗体的存在或不存在测定所述样品；
c)将具有所述抗体的动物鉴定为已经过所述疫苗接种；和
d)将不含所述抗体的动物鉴定为已被野生型BVDV感染。
区分感染了野生型牛病毒性腹泻病毒的动物和接种了权利要求14的疫苗的动物的方法，其中感染了野生型牛病毒性腹泻病毒的动物产生抗体，所述抗体抗至少一种存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中但不存在于所述疫苗的嵌合瘟病毒中的Erns表位，所述方法包括以下步骤：
a)从动物获取血清样品；
b)就所述抗体的存在或不存在测定所述样品；
c)将具有所述抗体的动物鉴定为已被野生型BVDV感染；和
d)将不含所述抗体的动物鉴定为已经过所述疫苗接种。
用于区分接种了包含权利要求1的嵌合瘟病毒的疫苗的动物与感染了野生型牛病毒性腹泻病毒的动物的诊断试剂盒，所述试剂盒包含能够检测针对至少一种存在于所述疫苗的嵌合瘟病毒中但不存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中的Erns表位的抗体的试剂。
用于区分感染了野生型牛病毒性腹泻病毒的动物和接种了包含权利要求1的嵌合瘟病毒的疫苗的动物的诊断试剂盒，所述试剂盒包含能够检测针对至少一种存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中但不存在于所述疫苗的嵌合瘟病毒中的Erns表位的抗体的试剂。
识别Erns表位的抗体，所述表位存在于权利要求1的嵌合瘟病毒中但不存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中。
识别表位的抗体，所述表位存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中但不存在于权利要求1的嵌合瘟病毒中。

说明书具有经修饰的ERNS蛋白的牛病毒性腹泻病毒
本申请是申请日为2009年11月23日、申请号为200980148483.7的同名申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及新的嵌合瘟病毒及其在免疫原性组合物和疫苗中的用途。本发明还涉及用于治疗或预防牛病毒性腹泻病毒感染的传播的方法和试剂盒。本发明还涉及嵌合瘟病毒在用于区分经接种的动物和经野生型病毒感染的动物的方法和试剂盒中的用途。
背景技术
已经从饲养的和野生的数种动物物种中分离了瘟病毒，包括牛病毒性腹泻病毒(BVD病毒或BVDV)。鉴定的BVDV的宿主包括水牛、羚羊、驯鹿和多种鹿的物种，并且在长颈鹿和叉角羚中已经鉴定了独特的瘟病毒的种。BVDV是黄病毒科的小RNA病毒。其与其它的瘟病毒(其是绵羊中的边界病和猪中的猪瘟(classical swine fever)的诱因剂)密切相关。最近，鉴定出一种被称作Bungowannah瘟病毒的不同的瘟病毒，其是澳大利亚猪崽胎儿感染的致病剂。
由BVDV引起的疾病、尤其是牛中的疾病十分广泛，可以带来经济上的破坏。牛中的BVDV感染可以引起育种上的问题，并且可以导致流产或早产。BVDV能够穿过孕牛的胎盘，并且可以持续感染(PI)小牛，使之对该病毒免疫耐受并且此后终其一生持续病毒血症。被感染的牛还可可表现出“粘膜病”，该病的特征在于体温升高、腹泻、咳嗽和消化系统粘膜的溃疡。这些持续感染的动物在牧群中提供了导致进一步爆发粘膜病的病毒的传播源，并且极易感染引起肠病或肺炎的微生物。
BVDV被分成两种生物型。＂cp＂生物型的BVDV在培养的细胞中诱导引起细胞病变的效应，而非细胞病变性或＂ncp＂生物型的病毒则不诱导此效应。此外，识别了两种主要的基因型(1型和2型)，已经证明二者都引起多种临床上的症状。
BVDV病毒粒子的直径为40‑60nm。BVDV的核衣壳由单个RNA分子和衣壳蛋白C组成。核衣壳由脂膜包围，脂膜上锚定有两种糖蛋白E1和E2。第3种糖蛋白Erns与被膜松散地结合。BVDV基因组的长度是大约12.5kb，其包含位于5'和3'非翻译区(NTR)之间的单个开放阅读框。从该开放阅读框翻译出大约438kD的多聚蛋白，并且该多聚蛋白由细胞和病毒蛋白酶加工成至少11个病毒结构性和非结构性(NS)蛋白(Tautz,et al.,J.Virol.71:5415‑5422(1997);Xu,et al.,J.Virol.71:5312‑5322(1997);Elbers,et al.,J.Virol.70:4131‑4135(1996);和Wiskerchen,et al.,Virology 184:341‑350(1991))。BVDV的基因组顺序是p20/Npro、p14/C、gp48/Erns、gp25/E1、gp53/E2、p54/NS2、p80/NS3、p10/NS4A、p32/NS4B、p58/NS5A和p75/NS5B。三种被膜蛋白gp48/Erns、gp25/E1和gp53/E2是高度糖基化的。Erns(以前被称作E0或gp48)形成通过二硫键共价连接的同二聚体。疏水性膜锚定区的缺失说明Erns与被膜松散地结合。Erns在感染的牛中诱导高抗体滴度，但是抗血清具有有限的病毒中和活性。
目前可获得的BVDV疫苗有：包含化学灭活的野生型病毒的疫苗。这些疫苗通常需要多剂给药，并且产生短期的免疫应答；另外，它们不提供针对病毒的胎儿传播的保护。在绵羊中，已经报道了基于纯化的E2蛋白的亚单位疫苗。虽然该疫苗似乎保护胎儿免受感染，但是保护仅限于病毒的同源株，并且抗体滴度与保护之间没有关联。
已经使用通过在牛或猪细胞中重复传代或者通过化学诱导赋予病毒温度敏感性表型的突变而减毒的病毒生产出了改良式活(ML)BVDV疫苗。已经证明单剂MLV BVDV疫苗足以提供抗感染的保护，并且接种的牛中的免疫力的持续时间可以延伸数年。此外，已经报道了使用MLV疫苗的交叉保护(Martin等人，见“Proceedings of the Conference of Research Workers in Animal Diseases”,75:183(1994))。然而，现有的MLV疫苗不能区分经接种的和天然感染的动物。
因此，显然需要用于控制BVDV传播的新的疫苗。此类疫苗在将来的国家性或区域性BVDV清除工程中将是无价的，并且还可以与其它的牛疫苗组合，其代表了工业上的实质性进步。用于控制和监视BVDV传播的更加有效的疫苗是“标记的”疫苗。此类疫苗可以包含不存在于野生型病毒中的另外的抗原决定簇，或者缺少存在于野生型病毒中的抗原决定簇。就前者而言，经接种的动物产生针对“标志物”免疫原性决定簇的免疫应答，而未经接种的动物则不产生。通过使用针对该标志物决定簇的免疫学检验，可以通过是否存在针对该标志物决定簇的抗体来区分经接种的动物和未经接种的天然感染的动物。在后一个策略的情况下，由于决定簇不存在于标记的疫苗中，所以，感染野生型病毒的动物产生针对标志物决定簇的免疫应答，而未感染的经疫苗接种的动物则不产生。通过使用针对标志物决定簇的免疫学检验，可以将感染的动物与经接种的未感染的动物区分开。在两种情况下，通过剔除被感染的动物，牧群可以随着时间变成无BVDV的牧群。除了去除BVDV疾病的威胁这个益处之外，牧群无BVDV的证明具有直接的自由贸易的经济效益。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提供了嵌合瘟病毒，其中所述嵌合瘟病毒包含不表达其同源Erns蛋白的牛病毒性腹泻病毒，并且其中所述嵌合瘟病毒表达源自另一种瘟病毒的异源Erns蛋白，或所述异源Erns蛋白的天然、合成的或遗传变体。
在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的嵌合瘟病毒，其中所述嵌合瘟病毒的异源Erns蛋白或所述异源Erns蛋白的天然、合成的或遗传变体源自选自驯鹿瘟病毒、长颈鹿瘟病毒和叉角羚瘟病毒的瘟病毒。
在不同的实施方案中，本发明提供了如上所述的嵌合瘟病毒，其中所述嵌合瘟病毒的异源Erns蛋白具有至少一种不存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中的Erns表位。
在单独的实施方案中，本发明提供了如上所述的嵌合瘟病毒，其中所述嵌合瘟病毒的异源Erns蛋白缺失至少一种存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中的Erns表位。
在一个实施方案中，本发明提供了如上所述的嵌合瘟病毒的培养物。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含如上所述的嵌合瘟病毒的细胞系或宿主细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了编码如上所述的嵌合瘟病毒的多核苷酸分子。
在不同的实施方案中，本发明提供了包含如上所述的嵌合瘟病毒和兽医学上可接受的载体的免疫原性组合物。
在单独的实施方案中，本发明提供了如上所述的免疫原性组合物，其中所述兽医学上可接受的载体是佐剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的免疫原性组合物，其中所述嵌合瘟病毒是活的减毒的。
在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的免疫原性组合物，其中所述嵌合瘟病毒是灭活的。
在不同的实施方案中，本发明提供了如上所述的免疫原性组合物，其进一步包含用于治疗或预防动物中的一种或多种另外的致病微生物传播的一种或多种另外的抗原。
在单独的实施方案中，本发明提供了包含编码如上所述的嵌合瘟病毒的多核苷酸分子和兽医学上可接受的载体的免疫原性组合物。
在一个实施方案中，本发明提供了包含如上所述的嵌合瘟病毒和兽医学上可接受的载体的疫苗。
在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的疫苗，其中所述兽医学上可接受的载体是佐剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的疫苗，其中所述嵌合瘟病毒是活的减毒的。
在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的疫苗，其中所述嵌合瘟病毒是灭活的。
在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的疫苗，其进一步包含用于治疗或预防动物中的一种或多种另外的致病微生物的传播的一种或多种另外的抗原。
在单独的实施方案中，本发明提供了包含编码如上所述的嵌合瘟病毒的多核苷酸分子和兽医学上可接受的载体的疫苗。
在一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含，在至少一个容器中，含有如上所述的嵌合瘟病毒的疫苗。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防牛病毒性腹泻病毒感染的传播的方法，其中向动物施用包含如上所述的嵌合瘟病毒的疫苗。
在不同的实施方案中，本发明提供了接种动物的方法，其中向所述动物施用DIVA瘟病毒疫苗，其中所述DIVA瘟病毒疫苗包含如上所述的嵌合瘟病毒，并且其中所述嵌合瘟病毒具有至少一种不存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中的Erns表位。
在单独的实施方案中，本发明提供了接种动物的方法，其中向所述动物施用DIVA瘟病毒疫苗，其中所述DIVA疫苗包含如上所述的嵌合瘟病毒，并且其中所述嵌合瘟病毒缺失至少一种存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中的Erns表位。
在另一个实施方案中，本发明提供了区分接种了包含如上所述的嵌合瘟病毒的疫苗的动物与感染了野生型牛病毒性腹泻病毒的动物的方法，其中接种所述疫苗的动物产生抗体，所述抗体抗至少一种存在于所述疫苗的嵌合瘟病毒中但不存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中的Erns表位，所述方法包括以下步骤：
a)从动物获取血清样品；
b)就所述抗体的存在或不存在测定所述样品；
c)将具有所述抗体的动物鉴定为已经过所述疫苗接种；和
d)将不含所述抗体的动物鉴定为已被野生型BVDV感染。
在另一个实施方案中，本发明提供了区分感染了野生型牛病毒性腹泻病毒的动物和接种了包含如上所述的嵌合瘟病毒的疫苗的动物的方法，其中感染了野生型牛病毒性腹泻病毒的动物产生抗体，所述抗体抗至少一种存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中但不存在于所述疫苗的嵌合瘟病毒中的Erns表位，所述方法包括以下步骤：
a)从动物获取血清样品；
b)就所述抗体的存在或不存在测定所述样品；
c)将具有所述抗体的动物鉴定为已被野生型BVDV感染；和
d)将不含所述抗体的动物鉴定为已经过所述疫苗接种。
在一个实施方案中，本发明提供了用于区分接种了包含如上所述的嵌合瘟病毒的疫苗的动物与感染了野生型牛病毒性腹泻病毒的动物的诊断试剂盒，所述试剂盒包含能够检测针对至少一种存在于所述疫苗的嵌合瘟病毒中但不存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中的Erns表位的抗体的试剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于区分感染了野生型牛病毒性腹泻病毒的动物和接种了包含如上所述的嵌合瘟病毒的疫苗的动物的诊断试剂盒，所述试剂盒包含能够检测针对至少一种存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中但不存在于所述疫苗的嵌合瘟病毒中的Erns表位的抗体的试剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了识别存在于如上所述的嵌合瘟病毒中但不存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中的Erns表位的抗体。
在不同的实施方案中，本发明提供了识别存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中但不存在于如上所述的嵌合瘟病毒中的表位的抗体。
在另一个实施方案中，如本文描述的嵌合瘟病毒用于制备用于预防或治疗BVDV引起的感染的药物。
发明详述
以下定义适用于本发明的实施方案的描述中所用的术语。以下定义取代通过引用方式并入本文的每篇单独的参考文献中包含的任何矛盾的定义。
除非本文另有指明，否则本发明中使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有需要，否则单数的术语应该包括复数，并且复数的术语应该包括单数。
本文使用的术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来经过修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、羧基谷氨酸和O‑磷酸丝氨酸。20种常规氨基酸的立体异构体(例如D‑氨基酸)、非天然氨基酸例如α和α‑双取代的氨基酸、N‑烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也可以是本发明的多肽的合适的成分。非常规氨基酸的实例包括：4‑羟基脯氨酸、γ‑羧基谷氨酸、ε‑N,N,N‑三甲基赖氨酸、ε‑N‑乙酰赖氨酸、O‑磷酸丝氨酸、N‑乙酰丝氨酸、N‑甲酰甲硫氨酸、3‑甲基组氨酸、5‑羟基赖氨酸、σ‑N‑甲基精氨酸和其它类似的氨基酸和亚氨基酸。
氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即，具有与氢、羧基、氨基和R基团结合的碳原子。示例性的氨基酸类似物包括例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保留与天然存在的氨基酸基本上相同的化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构、但是以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用的化合物。
本文中可以通过公知的三字符或IUPAC‑IUB生物化学命名委员会推荐的单字符来指称氨基酸。
本文使用的术语“动物”意在包括易于感染BVDV的任意动物，包括但不限于下列物种：牛、绵羊、山羊和猪，包括饲养的和野生的。
本文使用的术语“抗体”是指能够通过识别表位的方式结合抗原的免疫球蛋白分子。抗体可以是多克隆混合物或单克隆的。抗体可以是来自天然来源的或来自重组来源的完整免疫球蛋白，或者可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体可以以多种形式存在，包括例如，Fv、Fab'、F(ab')2以及单链形式。
本文使用的术语“抗原”是指包含一个或多个表位(线性的、构象型的或二者)的分子，当暴露于受试者后，其将诱导特异于该抗原的免疫应答。术语“抗原”可以指减毒的、灭活的或改良的活的细菌、病毒、真菌、寄生虫或其它微生物。本文使用的术语“抗原”还可以指亚单位抗原，其与抗原在天然状态下结合的完整生物体分开且分离。术语“抗原”还可以指抗体，例如抗独特型抗体或其片段，以及可以模拟抗原或抗原决定簇(表位)的合成的肽模拟位。术语“抗原”还可以指在体内表达抗原或抗原决定簇的寡核苷酸或多核苷酸，例如用于DNA免疫应用。
本文使用的术语“BVDV”、“BVDV分离株”或“BVDV株”是指牛病毒性腹泻病毒，包括但不限于I型和II型，其由病毒基因组、相关蛋白和其它化学成分(例如脂质)组成。本领域技术人员已知多种I型和II型牛病毒性腹泻病毒，并且它们可以从例如美国典型培养物保藏中心获得。牛病毒性腹泻病毒具有RNA形式的基因组。RNA可以被逆转录成DNA以用于克隆。因此，本文中提及核酸和牛病毒性腹泻病毒序列时，其包括病毒RNA序列和源自病毒RNA序列的DNA序列。
本文使用的术语“细胞系”或“宿主细胞”意思是其中可以复制和/或维持病毒的原核或真核细胞。
本文使用的术语“嵌合的”或“嵌合体”意思是包含源自一种以上的祖先的遗传或物理成分的微生物，例如病毒。
本文使用的术语“培养物”意思是在不存在其它物种或类型的情况下生长的细胞或微生物的群体。
本文使用的术语“DIVA”意思是能够区分感染的与接种的动物的疫苗。
“表位”是与T细胞受体或特异性抗体结合的抗原的特定位点，通常包含大约3个氨基酸残基至大约20个氨基酸残基。
本文使用的术语“异源的”意思是源自不同的物种或株。
本文使用的术语“同源的”意思是源自相同的物种或株。
本文使用的术语“免疫原性组合物”意思是，当单独或与药学上可接受的载体一起向动物施用时，产生免疫应答(即具有免疫原性活性)的组合物。所述免疫应答可以是主要由细胞毒性T细胞介导的细胞免疫应答，或主要由辅助T细胞介导的体液免疫应答，其继而激活B细胞，引起抗体的产生。
本文使用的术语“病原体”或“致病微生物”意思是能够在其宿主动物中诱导或引起疾病、生病或异常状态的微生物，例如病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫。
本文使用的术语“瘟病毒”意思是来自黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestiviru)的RNA病毒。瘟病毒包括但不限于BVDV(1型和2型)、猪瘟病毒(CSFV)和边界病病毒(BDV)，以及从例如以下物种中分离的瘟病毒：野猪、水牛、大羚羊(eland)、野牛、羊驼、pudu、邦戈羚羊(bongo)、各种鹿、长颈鹿、驯鹿、岩羚羊和叉角羚(Vilcek和Nettleton;Vet Microbiol.116:1‑12(2006))。
本文使用的术语“多核苷酸分子”意思是由共价键合成链的核苷酸单体组成的有机聚合物分子。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是具有独特的生物学功能的多核苷酸的实例。
本文使用的术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”或“预防(prevention)”等意思是抑制微生物的复制、抑制微生物的传播或抑制微生物在其宿主中进行自我建立。本文使用的这些术语等还可以意指抑制或阻断一种或多种感染迹象或症状。
本文使用的术语“治疗有效量”意思是足以在施用了其的受试者中引发免疫应答的微生物或亚单位抗原或多肽或多核苷酸分子或其组合的量。免疫应答可以包括但不限于细胞和/或体液免疫的诱导。
本文使用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”等意思是减少或消除微生物的感染。本文使用的这些术语等还可以意指减少微生物的复制，减少微生物的传播，或降低微生物在其宿主中自我建立的能力。本文使用的这些术语等还可以意指减少、缓解或消除一种或多种微生物感染迹象或症状，或加速从微生物感染的复原。
本文使用的术语“疫苗”和“疫苗组合物”意思是预防或减少感染，或预防或减少感染的一种或多种迹象或症状的组合物。疫苗组合物抗病原体的保护性效应通常是通过诱导受试者中的免疫应答(其可以是细胞介导的或体液免疫应答或二者的组合)来实现的。一般而言，感染发生率的消除或降低、迹象或症状的缓解或微生物从感染的受试者的加速清除是疫苗组合物的保护性效应的指征。本发明的疫苗组合物提供了抗BVDV引起的感染的保护性效应。
本文使用的术语“变体”是指给定的蛋白和/或基因序列的衍生物，其中衍生的序列与给定的序列是基本上相同的，但是具有突变的差异。所述差异可以是天然发生的，或通过合成或遗传产生的。
本文使用的术语“兽医学上可接受的载体”是指这样的物质，其在合理的医学判断的范围内，适合用于与动物的组织接触而无过度毒性、刺激性、变应性应答等，具有合理的收益/风险比，对于其预期的用途是有效的。
提供了以下描述以辅助本领域技术人员实施本发明。即使如此，该描述不应被解释为过度限制本发明，因为本领域普通技术人员可以不脱离本发明的精神或范围而对本文讨论的实施方案作出修改和改变。
病毒、免疫原性组合物和疫苗
本发明提供了包含一种或多种嵌合瘟病毒的免疫原性组合物和疫苗，其中所述嵌合瘟病毒包含不表达其同源Erns蛋白的牛病毒性腹泻病毒，并且其中所述嵌合瘟病毒表达源自另一种瘟病毒的异源Erns蛋白，或所述异源Erns蛋白的天然、合成的或遗传变体。所述嵌合瘟病毒可以选自但不限于BVDV/驯鹿瘟病毒、BVDV/长颈鹿瘟病毒和BVDV/叉角羚瘟病毒的瘟病毒嵌合体。
在一个实施方案中，BVDV/长颈鹿嵌合瘟病毒是保藏于美国典型培养物保藏中心(10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110‑2209,USA)的UC 25547株，其保藏号为PTA‑9938。在一个实施方案中，BVDV/叉角羚嵌合瘟病毒是保藏于的UC 25548株，其保藏号为PTA‑9939。在一个实施方案中，BVDV/驯鹿嵌合瘟病毒是保藏于的UC 25549株，其保藏号为PTA‑9940。
本发明的嵌合瘟病毒可以在细胞、细胞系和宿主细胞中繁殖。所述细胞、细胞系和宿主细胞可以是例如但不限于哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞，包括昆虫和植物细胞。可用于繁殖本发明的嵌合瘟病毒的细胞、细胞系和宿主细胞是本领域普通技术人员容易获知和获得的。
本发明的嵌合瘟病毒可以在用于免疫原性组合物或疫苗中之前进行减毒或灭活。减毒和灭活的方法是本领域技术人员熟知的。用于减毒的方法包括但不限于，在合适的细胞系中在细胞培养物中连续传代、紫外线辐射和化学诱变。用于灭活的方法包括但不限于，用福尔马林、β丙内酯(BPL)或二乙烯亚胺(BEI)处理，或本领域技术人员已知的其它方法。
使用福尔马林的灭活可以这样进行：将病毒悬浮液与37%的甲醛混合以达到0.05%的最终甲醛浓度。通过恒定搅拌将病毒‑甲醛混合物在室温混合大约24小时。然后，通过在合适的细胞系上测定生长来检测灭活的病毒混合物中的残余活病毒。
使用BEI的灭活可以这样进行：将本发明的病毒悬浮液与0.1M BEI(在0.175N NaOH中的2‑溴‑乙胺)混合以达到1mM的最终BEI浓度。通过恒定搅拌将病毒‑BEI混合物在室温混合大约48小时，然后加入1.0M硫代硫酸钠至0.1mM的终浓度。再混合2个小时。通过在合适的细胞系上测定生长来检测灭活的病毒混合物中的残余活病毒。
本发明的免疫原性组合物和疫苗可以包括一种或多种兽医学上可接受的载体。本文使用的“兽医学上可接受的载体”包括任意和所有溶剂、分散介质、包被物、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等等。稀释剂可以包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗剂可以包括，尤其是本领域技术人员已知的氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖等。稳定剂包括，尤其是本领域技术人员已知的白蛋白等。防腐剂包括，尤其是本领域技术人员已知的硫柳汞等。
佐剂包括但不限于，尤其是如本领域技术人员已知的，RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、明矾、氢氧化铝凝胶、水包油乳液、油包水乳液例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta Ga.)、SAF‑M(Chiron,Emeryville Calif.)、佐剂、皂甙、Quil A、QS‑21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge Mass.)、GPI‑0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)或其它的皂甙级份，单磷酰脂质A、阿夫立定脂质‑胺佐剂、来自大肠杆菌的热不稳定性肠毒素(重组的或其它的)、霍乱毒素或胞壁酰二肽等。用于本发明的情形中的佐剂和添加剂的量和浓度可以由技术人员容易地确定。在一个实施方案中，本发明涉及包含大约50μg至大约2000μg佐剂的免疫原性组合物和疫苗。在另一个实施方案中，包括的佐剂的量是大约100μg至大约1500μg，或大约250μg至大约1000μg，或大约350μg至大约750μg。在另一个实施方案中，包括的佐剂的量是大约500μg/2ml剂量的免疫原性组合物或疫苗。
免疫原性组合物和疫苗还可以包含抗生素。此类抗生素包括但不限于下列类别的抗生素：氨基葡萄糖苷、碳青霉烯类、头孢菌素、糖肽类、大环内酯类、青霉素、多肽、喹诺酮类、磺胺类和四环素。在一个实施方案中，本发明涉及包含大约1μg/ml至大约60μg/ml抗生素的免疫原性组合物和疫苗。在另一个实施方案中，免疫原性组合物和疫苗包含大约5μg/ml至大约55μg/ml抗生素，或大约10μg/ml至大约50μg/ml抗生素，或大约15μg/ml至大约45μg/ml抗生素，或大约20μg/ml至大约40μg/ml抗生素，或大约25μg/ml至大约35μg/ml抗生素。在另一个实施方案中，免疫原性组合物和疫苗包含少于大约30μg/ml的抗生素。
本发明的免疫原性组合物和疫苗还可以包含一种或多种其它的免疫刺激剂，例如，白介素、干扰素或其它细胞因子，其适宜的量可以由技术人员确定。
本发明的免疫原性组合物和疫苗可以包含编码嵌合瘟病毒的一种或多种多核苷酸分子。免疫原性组合物或疫苗中可以使用编码嵌合瘟病毒的全部基因组或一个或多个开放阅读框的DNA或RNA分子。可以在不存在其它试剂的情况下施用所述DNA或RNA分子，或者，可以与促进细胞摄取的试剂(例如脂质体或阳离子脂质)一起施用DNA或RNA分子。免疫原性组合物或疫苗中的总的多核苷酸一般是大约0.1μg/ml至大约5.0mg/ml。在另一个实施方案中，免疫原性组合物或疫苗中的总的多核苷酸是大约1μg/ml至大约4.0mg/ml，或大约10μg/ml至大约3.0mg/ml，或大约100μg/ml至大约2.0mg/ml。使用核酸(DNA或mRNA)的疫苗和接种程序在本领域已有广泛描述，例如美国专利5,703,055、美国专利5,580,859、美国专利5,589,466，这些文献全部通过引用方式并入本文。
本发明的免疫原性组合物和疫苗还可以包含另外的BVDV抗原，例如在美国专利6,060,457、美国专利6,015,795、美国专利6,001,613和美国专利5,593,873中描述的那些，这些文献全部通过引用方式并入本文。
除了一种或多种嵌合瘟病毒以外，免疫原性组合物和疫苗还可以包含其它抗原。抗原可以是微生物的灭活的完整或部分制备物的形式，或者可以是通过基因工程技术或化学合成获得的抗原性分子的形式。适合用于本发明的其它抗原包括但不限于，源自下列致病细菌的抗原，例如睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、支气管败血性博代氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonie)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、曼氏溶血杆菌(Mannhemia haemolytica)、牛支原体(Mycoplasma bovis)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)、梭菌属(Clostridial spp.)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusopathiae)、衣原体属(Chlamydia spp.)、布鲁氏菌属(Brucella spp.)、弧菌属(Vibrio spp.)、伤寒肠道沙门氏菌(Salmonella enterica serovars)和细螺旋体属(Leptospira spp)。抗原还可以源自致病真菌例如念珠菌属(Candida)，原生动物例如小球隐孢子虫(Cryptosporidium paryum)、犬新孢子虫(Neospora canium)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、艾美耳球虫属(Eimeria spp.)、巴贝西虫属(Babesia spp.)、贾第鞭毛虫属(Giardia spp.)，或寄生虫例如奥斯特线虫属(Ostertagia)、古柏线虫属(Cooperia)、血矛线虫属(Haemonchus)和片形吸虫属(Fasciola)。另外的抗原包括致病性病毒，例如，牛冠状病毒、牛疱疹病毒‑1,3,6、牛副流感病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛白血性增生病毒、牛瘟病毒、口蹄疫病毒、狂犬病病毒和流感病毒。
给药的形式、剂量、途径
可以向动物施用本发明的免疫原性组合物和疫苗以诱导有效的针对BVDV的免疫应答。因此，本发明提供了通过向动物施用治疗有效量的本文描述的本发明的免疫原性组合物或疫苗来刺激针对BVDV的有效的免疫应答的方法。
取决于给药途径，本发明的免疫原性组合物和疫苗可以制成多种形式。例如，免疫原性组合物和疫苗可以制成适合于注射用途的无菌水溶液或分散液的形式，或者使用冷冻‑干燥技术制成冻干形式。冻干的免疫原性组合物和疫苗通常维持在大约4℃，可以在稳定化溶液例如盐水或和HEPES(含有或不含佐剂)中重构。免疫原性组合物和疫苗还可以制成悬浮液或乳液的形式。
本发明的免疫原性组合物和疫苗包含治疗有效量的一种或多种如上所述的嵌合瘟病毒。纯化的病毒可直接用于免疫原性组合物或疫苗，或者可以进一步进行减毒或灭活。免疫原性组合物或疫苗通常包含大约1×102至大约1×1012个病毒颗粒，或大约1×103至大约1×1011个病毒颗粒，或大约1×104至大约1×1010个病毒颗粒，或大约1×105至大约1×109个病毒颗粒，或大约1×106至大约1×108个病毒颗粒。免疫原性组合物或疫苗中的有效提供保护性效应的病毒的精确量可由技术人员测定。
免疫原性组合物和疫苗一般包含体积是大约0.5ml至大约5ml的兽医学上可接受的载体。在另一个实施方案中，载体的体积是大约1ml至大约4ml，或大约2ml至大约3ml。在另一个实施方案中，载体的体积是大约1ml或大约2ml，或大约5ml。适合用于免疫原性组合物和疫苗的兽医学上可接受的载体可以是任意的上文描述的那些。
本领域技术人员可以容易地确定病毒是否需要在施用之前进行减毒或灭活。在本发明的另一个实施方案中，可以将嵌合瘟病毒直接施用至动物，不进行另外的减毒。病毒的治疗上有效的量可以根据所用的特定病毒、动物的状况和/或感染的程度而变化，并且可以由技术人员确定。
根据本发明的方法，可以向动物施用单一剂量，或者可替代地，可以按照大约2至大约10周的间隔进行2次或更多次接种。可能需要加强免疫方案，并且可以调整剂量方案以提供最佳免疫。本领域技术人员可以容易地确定最佳的给药方案。
免疫原性组合物和疫苗可以直接施用进入血流、进入肌肉或者进入内部器官。用于肠胃外给药的合适方式包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内和皮下。用于肠胃外给药的合适装置包括针(包括微针)注射器、无针注射器和输注技术。
肠胃外制剂通常是水溶液，其可以含有赋形剂，例如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选达到以下pH：大约3至大约9，或大约4至大约8，或大约5至大约7.5，或大约6至大约7.5，或大约7至大约7.5)，但是，对于一些应用，可以更适宜地将其配制成无菌的非水性溶液，或配制为干燥形式，以与合适的介质例如无菌的无热原的水一起使用。
可以使用本领域技术人员熟知的标准药物技术容易地进行无菌条件下的肠胃外制剂的制备(例如通过冻干法进行)。
可以通过使用技术人员已知的合适的配制技术来增加用于制备肠胃外溶液的化合物的溶解性，例如掺入增强溶解性的试剂，例如缓冲剂、盐、表面活性剂、脂质体、环式糊精等。
用于肠胃外给药的制剂可以配制为即释和/或改释。改释制剂包括延释、缓释、脉冲释、控释、靶向释放和程序化释放。因此，本发明的化合物可以配制为固体、半固体或触变式液体，以作为植入库来施用，其提供活性化合物的改释。此类制剂的实例包括药物包被的支架和聚(d1乳酸‑乙醇酸)共聚物(PGLA)微球体。
还可以将本发明的免疫原性组合物和疫苗局部施用至皮肤或粘膜，即，经皮或透皮施用。用于此目的的典型制剂包括凝胶、水凝胶、洗液、溶液、霜、膏、扑粉剂、敷料、泡沫、膜、皮肤贴、糯米纸剂、植入物、海绵、纤维、绷带和微乳剂。还可以使用脂质体。典型的载体包括醇、水、矿物油、液体凡士林、白凡士林、甘油、聚乙二醇和丙二醇。可以掺入渗透增强剂。参见，例如Finnin和Morgan,J.Pharm Sci，88(10):955‑958(1999)。
其它的局部施用方式包括：通过电穿孔法、电离子透入法、音频透入法、超声透入法以及微针或无针(例如PowderjectTM、BiojectTM等)注射进行的递送。
用于局部给药的制剂可以配制为即释和/或改释。改释制剂包括延释、缓释、脉冲释、控释、靶向释放和程序化释放。
还可以通过鼻内或通过吸入来施用免疫原性组合物和疫苗，其通常是来自干粉吸入器的干粉形式(单独的或作为混合物，例如，与乳糖干燥混合，或作为混合成分颗粒，例如与磷脂例如磷脂酰胆碱混合)，或作为来自加压容器、泵、喷雾器、雾化器(优选使用电流体动力学来提供精细薄雾的雾化器)或喷洒器的气雾剂喷雾，可以使用或不使用合适的助推剂，例如1,1,1,2‑四氟乙烷或1,1,1,2,3,3,3‑七氟丙烷。对于鼻内施用，粉末可以包含生物粘附性试剂，例如壳聚糖或环式糊精。
加压容器、泵、喷雾器、雾化器或喷洒器含有本发明的化合物的溶液或悬浮液，其包含例如乙醇、含水乙醇或用于分散、溶解或延缓活性物释放的合适的替代性试剂、助推剂作为溶剂和任选的表面活性剂，例如山梨糖醇酐三油酸酯、油酸或寡聚乳酸。
在用于干粉或悬浮液制剂之前，一般将药物产品微粉化至适于通过吸入方式递送的大小(通常小于大约5微米)。这可以通过任意合适的粉碎方法来实现，例如，螺旋喷射研磨、流床喷射研磨、超临界流体加工以形成纳米颗粒、高压匀化或喷雾干燥。
用于吸入器或吹入器的胶囊(例如从明胶或羟丙甲基纤维素制备)、罩板包装和药筒可以配制为包含本发明的化合物、合适的粉末基质例如乳糖或淀粉和性能修饰剂例如1‑亮氨酸、甘露醇或硬脂酸镁的粉末混合物。乳糖可以是无水或一水合物的形式。其它合适的赋形剂包括葡聚糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨醇、木糖醇、果糖、蔗糖和海藻糖。
用于雾化器(其使用电流体动力学来产生精细的薄雾)的合适的溶液制剂可以包含大约1μg至大约20mg本发明的化合物/启动，启动体积可以是大约1μl至大约100μl。在另一个实施方案中，每次启动的化合物的量可以是大约100μg至大约15mg，或大约500μg至大约10mg，或大约1mg至大约10mg，或大约2.5μg至大约5mg。在另一个实施方案中，启动体积可以是大约5μl至大约75μl，或大约10μl至大约50μl，或大约15μl至大约25μl。典型的制剂可以包含本发明的化合物、丙二醇、无菌水、乙醇和氯化钠。可用于替代丙二醇的备选溶剂包括甘油和聚乙二醇。
用于吸入/鼻内给药的制剂可以配制为即释和/或改释，使用例如PGLA。改释制剂包括延释、缓释、脉冲释、控释、靶向释放和程序化释放。
在干粉吸入器和气雾剂的情况下，一般通过递送计量数量的阀门来确定剂量单元。根据本发明的单元通常安排为施用计量剂量或“puff”，其包含大约10ng至大约100μg的本发明的化合物。在另一个实施方案中，以计量剂量施用的化合物的量是大约50ng至大约75μg，或大约100ng至大约50μg，或大约500ng至大约25μg，或大约750ng至大约10μg，或大约1μg至大约5μg。每日的总剂量通常是大约1μg至大约100mg，这可以通过单剂施用，或者，更通常地作为一天内的分开的剂量施用。在另一个实施方案中，每日的总剂量可以是大约50μg至大约75mg，或大约100μg至大约50mg，或大约500μg至大约25mg，或大约750μg至大约10mg，或大约1mg至大约5mg。
本发明的免疫原性组合物和疫苗还可以口服或经口给药，即通过口或经由口进入受试者体内，包括吞咽或通过口粘膜运输(例如舌下或口腔吸收)或二者皆有。可以向意欲口服或经口给药的本发明的制剂中加入合适的香味剂例如薄荷醇和左薄荷脑，或甜味剂例如糖精或糖精钠。
本发明的免疫原性组合物和疫苗可以经直肠或阴道施用，例如以栓剂、阴道药栓或灌肠剂的形式。可可油是传统的栓剂基质，但是可以视需要使用各种替代物。用于直肠/阴道给药的制剂可以配制为即释和/或改释。改释制剂包括延释、缓释、脉冲释、控释、靶向释放和程序化释放。
本发明的免疫原性组合物和疫苗还可以直接向眼或耳施用，通常是等渗的pH经调节的无菌盐水中的微粉化悬浮液或溶液的滴液的形式。适合于眼和耳给药的其它制剂包括膏、生物可降解的(例如可吸收的凝胶海绵、胶原)和非生物可降解的(例如硅酮)植入物、糯米纸剂、镜片和颗粒或囊泡系统，例如非离子型表面活性剂脂质体(niosomes)或脂质体。可以掺入聚合物，例如交联的聚丙烯酸、聚乙烯醇、透明质酸、纤维质聚合物例如羟丙甲基纤维素、羟乙基纤维素或甲基纤维素或异聚糖聚合物，例如gelan gum；并一起掺入防腐剂，例如苯扎氯胺。还可以通过电离子透入法递送此类制剂。
用于眼/耳给药的制剂可以配制为即释和/或改释。改释制剂包括延释、缓释、脉冲释、控释、靶向释放和程序化释放。
本发明的免疫原性组合物和疫苗可用于制备用于治疗或预防动物中的牛病毒性腹泻病毒感染的传播的药物。
本发明的免疫原性组合物和疫苗可用于制备用于向动物施用的药物，其中所述药物是包含嵌合瘟病毒的DIVA瘟病毒疫苗，所述嵌合瘟病毒包含不表达其同源Erns蛋白的牛病毒性腹泻病毒，并且其中所述嵌合瘟病毒表达源自另一种瘟病毒的异源Erns蛋白，或所述异源Erns蛋白的天然、合成的或遗传变体。在一个实施方案中，所述嵌合瘟病毒具有至少一种不存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中的Erns表位。在另一个实施方案中，所述嵌合瘟病毒缺失至少一种存在于野生型牛病毒性腹泻病毒中的Erns表位。
检测、诊断方法
本发明提供了确定存在于动物受试者中的瘟病毒的来源的方法。
使用DIVA疫苗进行的接种提供了用于确定存在于动物受试者中的瘟病毒的来源的方法，其中所述DIVA疫苗能够区分感染的与接种的动物。这种区分可以通过多种诊断方法中的任一种来实现，包括但不限于，ELISA、Western印迹和PCR。本领域普通技术人员容易获知并知晓这些和其它方法。
本发明的嵌合瘟病毒可区别于野生型BVDV株，所述区别在于它们的基因组组成和表达的蛋白。此类区别允许区分接种的和感染的动物。例如，可以确定在某些实验室检验中测试为BVDV阳性的动物是携带野生型BVDV株还是携带通过以前的接种而获得的本发明的嵌合瘟病毒。
可以使用多种测定法来进行所述确定。例如，可以从测试为BVDV阳性的动物分离病毒，并可以使用基于核酸的测定法来确定嵌合瘟病毒基因组的存在(其指示以前的接种)。基于核酸的测定法包括Southern或Northern印迹分析、PCR和测序。可替代地，可以使用基于蛋白的测定法。在基于蛋白的测定法中，可以从测试为BVDV阳性的动物分离怀疑被感染的细胞或组织。可以从此类细胞或组织中制备细胞提取物，并可以进行例如Western印迹，其中使用针对能够区分性地鉴别存在之前接种的嵌合瘟病毒还是野生型BVDV的病毒蛋白的合适的抗体。
可以通过使用多种技术来评估在动物中诱导的免疫应答的程度和性质。例如，可以从接种的动物中收集血清，并测定是否存在特异于嵌合病毒的抗体，例如，在常规的的病毒中和测定中进行测定。可以通过测定例如T细胞增殖测定来进行淋巴组织中响应性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的检测，以指征细胞免疫应答的诱导。相关的技术在本领域中有详尽的描述，例如Coligan et al.Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons Inc.(1994)。
试剂盒
由于可能需要联合另外的化合物来施用免疫原性组合物或疫苗，例如为了治疗特定疾病或病况的目的，所以，本发明的范围包括：免疫原性组合物或疫苗可以方便地包括于或组合于试剂盒的形式中，所述试剂盒适合于组合物的施用或联合施用。
因此，本发明的试剂盒可以包含一种或多种分开的药物组合物，其中至少一种是根据本发明的免疫原性组合物或疫苗，以及用于分开盛放所述组合物的器具，例如，容器、分割瓶或分割的铝箔袋。此类试剂盒的实例是注射器和针等等。本发明的试剂盒特别适合于施用不同的剂型(例如，口服或肠胃外)，适合于以不同的给药间隔施用分开的组合物，或适合于滴定针对彼此的分开的组合物。为了辅助施用本发明的组合物，试剂盒通常包含施用说明书。
本发明的另一种试剂盒可以包含用于检测和区分BVDV感染的动物和嵌合瘟病毒接种的动物的一种或多种试剂。试剂盒可以包含用于分析样品中是否含有不存在于免疫原性组合物或疫苗的嵌合瘟病毒中的完整BVDV或BVDV多肽、表位或多核苷酸序列的试剂。可替代地，本发明的试剂盒可以包含用于分析样品中是否含有不存在于野生型BVDV中的嵌合瘟病毒或多肽、表位或多核苷酸序列的试剂。可以使用抗体、PCR、杂交和本领域技术人员已知的其它检测方法来测定病毒、多肽或多核苷酸序列的存在。
本发明的另一种试剂盒可以提供用于检测针对特定表位的抗体的试剂。表位存在于本发明的嵌合瘟病毒中而不存在于野生型BVDV中；或者，存在于野生型BVDV中而不存在于本发明的嵌合瘟病毒中。此类试剂可用于分析样品中是否存在抗体，并且是本领域普通技术人员容易知晓和获得的。可以使用本领域技术人员已知的标准检测方法来测定抗体的存在。
在一些实施方案中，试剂盒可以包含一组印刷的说明书或标签，以指明该试剂盒可用于检测和区分BVDV感染的动物与嵌合瘟病毒接种的动物。
抗体
抗体可以是单克隆的，多克隆的或重组的。可以方便地制备针对免疫原或其部分的抗体。例如，可以分离基于免疫原的氨基酸序列的合成的肽，或通过克隆技术重组制备的肽，或天然基因产物和/或其部分，并用作免疫原。可以通过本领域技术人员熟知的标准抗体产生技术，使用免疫原来产生抗体，所述技术的一般性描述参见例如Harlow和Lane,“Antibodies:A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,(1988)和Borrebaeck,“Antibody Engineering‑A Practical Guide”,W.H.Freeman和Co.(1992)。还可以通过本领域技术人员已知的方法从抗体中制备抗体片段，包括Fab、F(ab')2和Fv。
在制备抗体时，可以通过本领域已知的标准免疫学方法来实现想要的抗体的筛选。未详细描述的技术一般是遵循Stites,et al.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(第8版),Appleton和Lange,Norwalk,CT(1994)以及Mishell和Shiigi(eds),"Selected Methods in Cellular Immunology",W.H. Freeman和Co.,New York(1980)。一般而言，ELISA和Western印迹是优选的免疫测定类型。这两种测定是本领域技术人员熟知的。多克隆和单克隆抗体都可用于这些测定。抗体可以结合于固体支持物基底上或缀合于可检测部分，或者既是结合的又是缀合的，如本领域中所熟知的。(关于荧光或酶部分的缀合的一般性讨论，见Johnstone和Thorpe,"Immunochemistry in Practice",Blackwell Scientific Publications,Oxford(1982))。抗体与固体支持物基底的结合也是本领域熟知的(关于一般性讨论，见Harlow和Lane(1988)和Borrebaeck(1992))。用于本发明的可检测部分可以包括但不限于，荧光的、金属的、酶的和放射性的标志物，例如生物素、金、铁蛋白、碱性磷酸酶、b‑半乳糖苷酶、过氧化物酶、脲酶、荧光素、若丹明、氚、14C和碘。
通过以下实施例进一步诠释本发明，但本发明不限于此。
实施例1：嵌合瘟病毒的构建和血清学表征
大肠杆菌K12 GM2163[F‑ara‑14,leuB6,thi‑1,fhuA31,lacY1,tsx‑78,galK2,galT22,supE44,hisG4,rpsL136,(Strr),xyl‑5,mtl‑1,dam13::Tn9(Camr),dcm‑6,mcrB1,hsdR2(rk‑mk‑),mcrA]含有包含牛病毒性腹泻病毒株NADL(BVDV‑NADL)的全长基因组cDNA的质粒，其获自University of Nebraska的R.Donis博士。
RD细胞(用SV40转化的牛睾丸细胞；获自R.Donis博士)维持于OptiMEM中，该培养基中补充了3%马血清、1%非必需氨基酸(NEAA)(在改良的Eagle培养基(MEM)中)、2mM GlutaMax和10μg/ml庆大霉素。BK‑6细胞获自Pfizer Global Manufacturing(PGM)。细胞在Dulbecco改良的Eagles培养基(DMEM)中生长，该培养基中补充了5%马血清或供体牛血清(PGM)、2mM Glutamax和1%抗生素和抗真菌剂。除了指明的之外，所有的培养基成分购自Invitrogen(Carlsbad,CA)。所有的细胞维持于37℃，5%CO2的环境中。
特异于BVDV Erns的单克隆抗体(MAb)15C5购自IDEXX(Westbrook,ME)。针对BVDV NS 3的MAb 20.10.6由E.Dubovi博士(Cornell University)惠赠。具有针对边界病病毒(BDV)Erns蛋白的特异性的MAb WS 363、WS 373和WS 371获自Veterinary Laboratories Agency(Surrey,UK)。牛血清样品#77、#816、#1281和#1434由Pfizer内部提供。
使用重叠PCR方法，通过将BVDV‑NADL株的Erns基因替换为长颈鹿的Erns基因(G‑Erns)、驯鹿的Erns基因(R‑Erns)或叉角羚的Erns基因(P‑Erns)来产生嵌合瘟病毒。使用PfuUltraTM II融合HS DNA聚合酶(Stratagene;La Jolla,CA)或Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen)。用于重叠PCR和用于产生全长病毒DNA的寡核苷酸引物(以及相应的SEQ ID NO)列于表1。
表1.用于PCR扩增的寡核苷酸引物

从dam‑大肠杆菌K12 GM2163中提取包含BVDV‑NADL的全长cDNA的质粒。在体外使用dam甲基转移酶和S‑腺苷甲硫氨酸(New England Biolabs;Ipswich,MA)将该质粒甲基化。合成G‑Erns、R‑Erns和P‑Erns基因(GenBank登录号分别是NC_003678、NC_003677和AY781152)并克隆进入克隆载体。
为了构建嵌合BVDV‑NADL/G‑ErnsDNA，使用引物Oligo B‑5和Oligo 127通过PCR从甲基化的质粒扩增编码5'UTR至C基因的3'末端的BVDV‑NADL的片段。使用引物Oligo 128和Oligo 129通过PCR 从含有G‑Erns基因的质粒DNA中扩增G‑Erns基因。使用引物Oligo 130和Oligo 84通过PCR从甲基化的质粒中扩增编码E1至3'UTR的BVDV片段。使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen;Valencia,CA)凝胶纯化PCR产物。以Dpn I和Exonuclease 1(New England Biolabs)处理纯化的PCR产物。使用Oligo B‑5和Oligo 84通过PCR组装经处理的PCR产物以产生全长的嵌合BVDV‑NADL/G‑Erns基因组。
为了构建嵌合BVDV‑NADL/R‑ErnsDNA，使用引物Oligo B‑5和Oligo131通过PCR从甲基化的质粒扩增编码5'UTR至C基因的3'末端的BVDV‑NADL的片段。使用引物Oligo 132和Oligo 133通过PCR 从含有R‑Erns基因的质粒中扩增R‑Erns基因。使用引物Oligo 134和Oligo 84通过PCR从甲基化的质粒中扩增编码E1至3'UTR的BVDV片段。使用QIAquick Gel Extraction Kit凝胶纯化PCR产物。以Dpn I和Exonuclease 1处理纯化的PCR产物。使用Oligo B‑5和Oligo 84通过PCR组装经处理的PCR产物以产生全长的嵌合BVDV‑NADL/R‑Erns基因组。
为了构建嵌合BVDV‑NADL/P‑ErnsDNA，使用引物Oligo B‑5和Oligo 135通过PCR从甲基化的质粒扩增编码5'UTR至C基因的3'末端的BVDV‑NADL的片段。使用引物Oligo 136和Oligo 137通过PCR 从含有P‑Erns基因的质粒DNA中扩增P‑Erns基因。使用引物Oligo 138和Oligo 84通过PCR从甲基化的质粒中扩增编码E1至3'UTR的BVDV片段。使用QIAquick Gel Extraction Kit凝胶纯化PCR产物。以Dpn I和Exonuclease 1处理纯化的PCR产物。使用Oligo B‑5和Oligo 84通过PCR组装经处理的PCR产物以产生全长的嵌合BVDV‑NADL/P‑Erns基因组。
为了进行嵌合Erns区域的序列确认，使用Oligo B‑5和Oligo 175通过PCR扩增每个组装的全长嵌合基因组的对应于5'UTR至E1区域的片段，对PCR产物进行测序和分析。
使用mMessage mMachine T7 Ultra试剂盒(Ambion;Austin,TX)从包含BVDV‑NADL的全长cDNA或嵌合BVDV‑NADL/ErnsDNA的质粒中产生全长病毒基因组RNA转录物。在RNA凝胶和Nanodrop分光光度计(Nanodrop;Wilmington,DE)上测定每个RNA转录物的质量和数量。根据生产商的说明书，使用Lipofectin试剂(Invitrogen)以病毒RNA转染6孔板的孔中的RD细胞的过夜培养物。转染后，将细胞在37℃温育3天。收集上清液并储存于‑80℃。
根据生产商的说明书，使用MagMaxTM AI/ND Viral RNA Isolation  Kit(Ambion)从收集的上清液中提取病毒RNA。根据生产商的说明书，使用引物Oligo 177和Oligo 175(表1)和ThermoScriptTM RT‑PCR System(Invitrogen)逆转录RNA并扩增每个嵌合体的编码Npro至E1的 区域。然后将RT‑PCR产物测序。
将来自病毒RNA转染或病毒感染的细胞单层固定于80%的丙酮中。使用BVDV‑或BDV‑特异性单克隆抗体(Mab)以及抗小鼠‑IgG过氧化物酶ABC Elite试剂盒(Vector Laboratories;Burlingame,CA)。使用VIP过氧化物酶底物(Vector Laboratories)显色。
通过有限稀释法测定嵌合病毒的滴度。将病毒样品10倍连续稀释并转移至96孔板(100μl/孔)，每个稀释度一式4‑6份。然后，向每个孔中加入100μl BK‑6细胞的悬浮液，将平板在37℃温育4‑5天。通过细胞病变效应(CPE)和MAb染色两种方法测定病毒感染。使用法计算病毒滴度。
为了获得每个嵌合体的生物克隆，首先将病毒样品稀释100倍，然后进行10倍连续稀释。将100μl稀释的病毒转移至96孔板的每个孔中，每个稀释度一式四份。然后，向每个孔中加入100μl BK‑6细胞，将平板在37℃温育4天。收集上清液并转移至新的平板并储存于‑80℃。将细胞固定并染色。从包含单个病毒灶的孔中收集上清液，并扩增为病毒贮液。
在含有BK‑6细胞的T‑25培养瓶中进行生长动力学研究。当细胞达到大约90%的汇合度时，以0.02的MOI用各嵌合体感染细胞。吸附1个小时后，除掉接种体。以PBS洗涤细胞3次，然后加入3ml新鲜的生长培养基。然后在0‑144小时的不同时间点收集样品用于滴度测定。
为了进行病毒中和测试，将3种BVDV‑NADL/Erns嵌合体、亲代BVDV‑NADL和BVDV‑CM5960(I型BVDV)的冷冻贮液在DMEM中稀释至大约4,000 TCID50/ml。以DMEM 2倍连续稀释来自经Bovi‑Shield Gold(Pfizer;New York,NY)免疫的牛的血清，该血清具有针对I型和II型BVDV的预先确定的滴度。将50μl病毒(200 TCID50)与等体积的稀释的牛血清在96孔组织培养板中混合(每个稀释度一式四份)，并在37℃温育60分钟。然后，向每个孔中加入100μl BK‑6细胞，将平板在37℃温育3‑6天。作为对照，每个板中还包括BVDV抗体阴性的血清。在第3天和第6天使用CPE和免疫组化(IHC)两种方法测定血清的终点中和滴度。
结果.构建了嵌合BVDV‑NADL/Erns DNA，其中NADL Erns基因/蛋白被替换为长颈鹿的Erns(G‑Erns)、驯鹿的Erns(R‑Erns)或叉角羚的Erns(P‑Erns)。对包含各嵌合Erns区域的质粒DNA进行测序以确认序列真实性。以下嵌合瘟病毒于2009年4月2日保藏于美国典型培养物保藏中心10801 University Blvd.,Manassas,VA,20110,USA，并由于2009年4月23日确认存活：BVDV‑NADL/G‑Erns(PTA‑9938)、BVDV‑NADL/P‑Erns(PTA‑9939)和BVDV‑NADL/R‑Erns(PTA‑9940)。
用体外转录的病毒RNA转染后，从RD细胞回收BVDV‑NADL/Erns嵌合病毒。在用BVDV‑NADL/G‑Erns或BVDV‑NADL/R‑ErnsRNA转录物转染48‑72小时后观察到RD细胞中严重的细胞病变效应(CPE)。然而，用BVDV‑NADL/P‑Erns病毒转染的细胞的CPE不明显。从每个孔中收集培养物上清液，将剩余的细胞固定并用BVDV NS3‑特异性MAb抗体20.10.6染色。将感染了3种嵌合瘟病毒中的一种的细胞与MAb一起温育。从收集的上清液中提取病毒RNA，并测序以确认所有3种嵌合体的Erns基因。
测试了3种BVDV‑NADL/Erns嵌合体对于特异于BVDV或BDV的数种ErnsMAb中的每一种的反应性。结果显示于表2。BVDV‑NADL/R‑Erns嵌合体对所有3种BDV Erns Mab均有反应，而BVDV‑NADL/G‑Erns、BVDV‑NADL/P‑Erns和BVDV‑NADL亲代病毒都不被BDV Erns Mab识别。BVDV‑NADL/G‑Erns、BVDV‑NADL/R‑Erns和NADL亲代病毒与广谱的‑BVDV ErnsMAb 15C5有反应。特异于BDV或BVDV的Erns的Mab与BVDV‑NADL/P‑Erns嵌合体无反应。
表2.BVDV‑NADL/Erns嵌合体与Mab的反应性

为了确定病毒中的嵌合Erns蛋白对于来自BVDV接种的牛的抗体识别病毒中和表位是否有影响，使用3种BVDV‑NADL/Erns嵌合体、BVDV‑NADL和BVDV‑CM5960(I型BVDV)进行了病毒中和测定。使用了来自4头牛的血清，其中和抗体滴度在0至大于40,000之间(之前针对BVDV‑CM5960测定的)。结果(表3)表明，针对所有3种嵌合体的滴度与针对亲代BVDV‑NADL和BVDV‑CM5960的滴度基本上相当。针对BVDV‑NADL/P‑Erns的中和滴度稍低于针对其它两种嵌合体、BVDV‑NADL和BVDV‑CM5960的滴度。
表3.牛抗血清针对BVDV‑NADL/Erns嵌合体的中和滴度

通过有限稀释法将3种BVDV‑NADL/Erns嵌合体生物克隆两次。获得了BVDV‑NADL/G‑Erns的3个克隆，BVDV‑NADL/R‑Erns的4个克隆和BVDV‑NADL/P‑Erns的3个克隆。将这些克隆各自扩增1‑3次。滴定结果表明：扩增的BVDV‑NADL/G‑Erns克隆1、BVDV‑NADL/R‑Erns克隆3和5和BVDV‑NADL/P‑Erns克隆2产生了最高的滴度。
以BVDV‑NADL/G‑Erns克隆1、BVDV‑NADL/R‑Erns克隆3、BVDV‑NADL/P‑Erns克隆2和未克隆的BVDV‑NADL/P‑Erns进行了生长动力学研究。将从这些克隆产生的生长曲线与亲代BVDV‑NADL进行比较。BVDV‑NADL/G‑Erns和BVDV‑NADL/R‑Erns嵌合体具有类似于亲代BVDV‑NADL的生长动力学，而BVDV‑NADL/P‑Erns相对于亲代病毒和其它两种嵌合体生长较慢，并且在每个时间点都具有较低的滴度。
产生了3种BVDV‑NADL/Erns嵌合病毒，其中NADL Erns基因/蛋白被替换为长颈鹿、驯鹿或叉角羚瘟病毒的Erns。所有3种嵌合体在RD和BK‑6细胞中都是存活的并且是感染性的。体外数据证明嵌合Erns蛋白不影响来自BVDV接种的牛的抗血清对嵌合体的中和。这说明嵌合病毒上的中和表位，无论它们位于何处，都不受Erns替换的影响。
嵌合病毒具有不同的生长动力学以及针对BVDV或BDV Erns单克隆抗体的不同反应性。BVDV‑NADL/G‑Erns和BVDV‑NADL/R‑Erns具有类似于亲代病毒的生长动力学，而BVDV‑NADL/P‑Erns比亲代病毒生长慢，并具有较低的滴度。BVDV‑NADL/G‑Erns和BVDV‑NADL/R‑Erns都与BVDV Erns单克隆抗体15C5反应，而BVDV‑NADL/P‑Erns不与其反应。序列比较结果显示：G‑Erns和R‑Erns与BVDV NADL的序列相似性(分别是75.8%和76.2%)高于P‑Erns与BVDV NADL的序列相似性(59%)。这些数据联同Mab反应性结果一起说明，G‑Erns和R‑Erns在抗原性上与亲代Erns的相似性可能高于P‑Erns与亲代Erns的相似性。
实施例2.嵌合瘟病毒疫苗候选物的构建和血清学表征及功效测试
1型BVDV株CM5960和2型BVDV株CM53637获自Pfizer Global Manufacturing。根据生产商的说明书，使用MagMaxTM AI/ND Viral RNA Isolation Kit(Ambion)提取病毒RNA。根据生产商的说明书，使用ThermoScriptTM RT‑PCR System(Invitrogen)逆转录RNA以产生cDNA。使用重叠PCR方法，通过将CM5960和CM53637的Erns基因替换为叉角羚瘟病毒的Erns基因(P‑Erns)，从而产生嵌合瘟病毒。用于PCR的寡核苷酸引物列于表1。
为了构建嵌合CM5960/P‑ErnsDNA，使用引物Oligo B‑5和Oligo 135通过PCR从CM5960 cDNA扩增5'UTR与C基因的3'末端之间的CM5960 cDNA的片段。使用引物Oligo 136和Oligo 137通过PCR从含有P‑Erns基因的质粒DNA中扩增P‑Erns基因。使用引物Oligo 138和Oligo 237通过PCR从CM5960 cDNA中扩增E1起始端至E2的3'末端之间的第三片段。
使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)凝胶纯化上述片段，并使用Oligo B‑5和Oligo 237通过PCR进行组装以产生一个片段。使用引物Oligo P7和Oligo P8通过PCR从CM5960 cDNA中扩增E1区与NS5B区之间的片段。使用引物Oligo P3和Oligo 84通过PCR从CM5960 cDNA中扩增NS5A区域与3'UTR末端之间的另一片段。然后将这3个片段进行凝胶纯化，并使用Oligo B‑5和Oligo 84通过PCR进行组装以产生全长的嵌合CM5960L/P‑Erns基因组。
为了构建嵌合CM53637/P‑ErnsDNA，使用引物Oligo 296‑1和Oligo 297通过PCR从CM53637 cDNA中扩增5'UTR至C基因的3'末端之间的CM53637 cDNA片段。使用引物Oligo 298和Oligo 303通过PCR从CM53637cDNA中扩增E1的起始端至E2的3'末端之间的第二片段。将这两个片段进行凝胶纯化，并使用Oligo 296‑1和Oligo 303通过PCR与编码P‑Erns基因的片段(见上文)一起进行组装，以产生一个片段。
然后使用引物Oligo 298和Oligo 299通过PCR从CM53637 cDNA中扩增E1区域与NS3区域之间的片段。使用引物Oligo 300和Oligo 92‑1通过PCR从CM53637 cDNA中扩增NS 3区域至3'UTR末端之间的另一片段。将这两个片段和上述一个片段进行凝胶纯化，并使用Oligo 296‑1和Oligo 92‑1通过PCR进行组装以产生全长的嵌合CM53637/P‑Erns基因组。
使用mMessage mMachine T7 Ultra试剂盒(Ambion)，从嵌合CM5960/P‑Erns和嵌合CM53637/P‑Erns DNA产生全长的病毒基因组RNA转录物。在RNA凝胶上测定每个RNA转录物的质量和数量。根据生产商的说明书，使用Lipofectin试剂(Invitrogen)以病毒RNA转染6孔板的孔中的RD细胞的过夜培养物。转染后，将细胞在37℃温育3天。将细胞加上清液在RD和/或BK‑6细胞中传代1至数次。然后将上清液在BK‑6细胞中连续传代。收集上清液并储存于‑80℃。
为了确认回收的重组病毒的本体，根据生产商的说明书，使用MagMaxTM AI/ND Viral RNA Isolation Kit(Ambion)从收集的上清液中提取病毒RNA。根据生产商的说明书，使用ThermoScriptTM RT‑PCR System (Invitrogen)逆转录RNA；使用引物Oligo B‑5和Oligo 237(用于CM5960/P‑Erns嵌合体)或Oligo 296‑1和Oligo 321(用于CM53637/P‑Erns嵌合体)(表1)通过PCR扩增每个嵌合体的5'UTR至E2或p7之间的区域。然后将RT‑PCR产物测序。
将来自病毒RNA转染或病毒感染的细胞单层固定于80%的丙酮中。使用BVDV特异性Mab以及抗小鼠‑IgG过氧化物酶ABC Elite试剂盒(Vector Laboratories)进行免疫组化。使用VIP过氧化物酶底物(Vector Laboratories)显色。
结果.构建并回收了嵌合CM5960/P‑Erns和CM53637/P‑Erns病毒。通过测序确认了5'UTR至E2区域(包括嵌合叉角羚‑Erns区域)。两种嵌合体在RD和BK‑6细胞中都是存活的并且是感染性的。在免疫组化染色中，两种嵌合体对于BVDV Erns特异性MAb 15C5都没有反应性，但是对于BVDV NS3特异性MAb 20.10.6都具有反应性。
嵌合瘟病毒(BVDV‑CM5960(I型BVDV)/P‑Erns)的序列在序列表中显示为SEQ ID NO:31。嵌合瘟病毒(BVDV‑CM53637(II型BVDV)/P‑Erns)的序列在序列表中显示为SEQ ID NO:32。
通过有限稀释法生物克隆了CM5960/P‑Erns嵌合体(其方法见上文的实施例1)。
实施例3.嵌合瘟病毒疫苗候选物在牛呼吸道疾病模型中的功效测试
获得BVDV阴性的健康的牛，随机分成研究组，并保持在主诊兽医的监护下。将测试疫苗与无菌佐剂混合，通过肌内(IM)或皮下(SC)注射或通过鼻内(IN)接种方式施用。按照1剂或2剂来施用疫苗。按照21‑28天的间隔施用2剂疫苗。然后，在最后一次接种后21‑28天，以1型或2型BVDV株攻击动物。以4ml的分割剂量(2ml/鼻孔)通过鼻内施用攻击接种物。在整个研究过程中也维持对照组，其由未接种的、未经攻击的动物和/或未接种的、经攻击的动物组成。
每日监测临床参数，包括直肠温度、抑郁、厌食和腹泻。使用血清的连续稀释物以及1型或2型BVDV株，在牛细胞培养物中通过“病毒恒定，血清减少”的测定法测定血清的中和滴度。在牛细胞培养物中获得来自外周血的BVDV的攻击后分离株。通过间接的免疫荧光来测定BVDV阳性细胞培养物。为了证明攻击后的保护作用，显示了接种组相对于对照组的感染率的下降。
实施例4.嵌合瘟病毒疫苗在孕牛‑小牛模型中的功效测试
获得BVDV‑阴性的母牛和繁殖期的小母牛，并随机分成接种测试组或安慰剂(对照)组。母牛通过肌内(IM)或皮下(SC)注射接种两次：按照21‑28天的间隔，接种疫苗或安慰剂。在第二次接种后，所有的母牛接受IM注射前列腺素以使发情期同步。通过人工授精使发情的母牛与经鉴定为BVDV阴性的精液配种。妊娠大约60天时，通过直肠触诊确定母牛的妊娠状态。
大约6周后，从每个测试组随机选择确认怀孕的母牛。通过鼻内接种1型或2型BVDV攻击这些母牛中的每一头。在攻击当天和攻击后的多个间隔收集血液样品，以分离BVDV。
攻击后28天，进行左侧腰窝开腹，从每头母牛提取羊水。在临手术之前，从每头母牛收集血液样品以进行血清中和测定。剖腹产之后，从每个胎儿收集血液样品。然后将胎儿实施安乐死，在无菌条件下收集组织以分离BVDV。在发生自发流产的情况下，在检测到流产时和2周后从母兽提取血液样品。将配对的血液样品和流产的胎儿进行血清学测试和病毒分离。通过胎儿无感染或胎儿感染的降低以及迟的流产证明了疫苗的有效性。
实施例5.用于区分接种的和天然感染的牛的诊断测定
接种了本发明的疫苗的牛可以与天然感染了野生型BVDV的牛进行比较。根据提供的操作指示，以活的或灭活的嵌合瘟病毒疫苗接种各个年龄的牛。在接种后2‑3周或更迟的时间收集血清样品。为了区分接受嵌合瘟病毒疫苗的牛和感染了BVDV的田间(野生型)株的牛，通过区分性诊断测定法检测血清样品。嵌合瘟病毒引起特异性抗体的产生，所述抗体结合嵌合瘟病毒的Erns蛋白，但不结合野生型BVDV中存在的Erns蛋白。在野生型BVDV的情况下，情况相反：产生了特异性抗体，其识别存在于野生型BVDV中的Erns蛋白，但不识别存在于嵌合瘟病毒中的Erns蛋白。用于测定抗体结合特异性和亲和力的方法是本领域熟知的，并且包括但不限于下列免疫测定形式，例如竞争性ELISA、直接肽ELISA、Western印迹、间接免疫荧光测定等。
对于竞争性ELISA，使用完整的或部分的野生型或嵌合瘟病毒病毒抗原(包括Erns蛋白(天然的、合成的或重组来源的))作为抗原来源。在碱性条件下以抗原包被ELISA平板后,加入牛血清样品和稀释物，以及特异于野生型BVDV的Erns蛋白或嵌合瘟病毒的Erns蛋白的Mab的最适稀释物，并温育30‑90分钟。Mab与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶缀合，以允许通过比色法检测结合情况。洗涤平板后，加入酶特异性发色底物，并在最后的温育步骤后，在适合于所用底物的波长下测定每个孔的光密度。标记的mAb的结合的抑制程度取决于牛血清中特异性识别包被平板的蛋白的抗体的水平。
在测试抗原是存在于嵌合瘟病毒上的嵌合Erns蛋白(例如叉角羚Erns)的情况下，嵌合瘟病毒Erns‑特异性mAb的结合的缺失表示在牛血清中存在识别嵌合瘟病毒特异性表位的抗体，其指示接种。相反，来自于未经免疫的但天然感染的牛的血清将不含与包被平板的嵌合瘟病毒Erns蛋白结合的抗体。因此，嵌合瘟病毒Erns‑特异性mAb将与包被的蛋白结合，引起后来的颜色的产生。
在测试抗原是存在于野生型BVDV上的Erns蛋白的情况下，野生型BVDV Erns‑特异性mAb的结合的缺失表示在牛血清中存在识别野生型BVDV特异性表位的抗体，其指示存在天然(野生型)感染。相反，来自于经嵌合瘟病毒疫苗免疫的牛的血清将不含与包被平板的野生型BVDV Erns蛋白结合的抗体。因此，野生型BVDV Erns‑特异性mAb将与包被的蛋白结合，引起后来的颜色的产生。
为了进行此类测定，进行了如下的方法。
首先，构建表达BVDV‑NADL Erns的重组杆状病毒。使用引物Oligo 250(SEQ ID NO:29;5'‑CACCATGAAAATAGTGCCCAAAGAATC‑3')和Oligo 252(SEQ ID NO:30;5'‑TTAAGCGTATGCTCCAAACCACGTC‑3')，通过PCR从包含全长BVDV‑NADL cDNA的质粒扩增BVDV的C蛋白的一部分+全长Erns基因。根据生产商的说明书，将PCR产物克隆进入pENTRTM/D‑TOPO(Invitrogen)并转化进入OneCompetent大肠杆菌(Invitrogen)。提取重组质粒并通过测序确认插入物。该质粒被称作pENTR‑Erns。根据生产商的说明书，使用pENTR‑Erns和BaculoDirectTM Baculovirus Expression System(Invitrogen)来构建表达BVDV‑NADL Erns的重组杆状病毒。产生表达BVDV‑NADL Erns的重组杆状病毒、进行斑纯化、扩增并储存于4℃和‑80℃。通过免疫荧光染色以及Western印迹(使用针对BVDV Erns的特异性MAb 15C5，按照常规的Western印迹方法进行)确认重组杆状病毒中BVDV‑NADL Erns的表达。
为了产生ELISA抗原，以0.5ml重组杆状病毒贮液感染100ml悬浮培养物中的SF21细胞。在27℃温育4天后收集细胞。在低速(大约800g)离心细胞10分钟以收集细胞，并以PBS洗涤1次。以150mM NaCl,50mM Tris HCl pH 8.0和1%IGEPAL CA‑630裂解细胞。首先将混合物在冰上温育10分钟，然后置于‑80℃1小时。解冻后，通过在1000g离心15分钟使混合物澄清。通过在4℃以8000g离心20分钟使上清液进一步澄清。最后的上清液被称作Baculo‑Erns裂解物，将其等份分装并储存于‑80℃。
在进行测定时，在4℃以100μl/孔的MAb WB210(Veterinary Laboratory Agency;特异于1型BVDV Erns)包被ELISA平板过夜，该抗体在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH 9.0)中以1:1000稀释。第二天，洗涤平板3次并以封闭缓冲液(含有1%酪蛋白钠盐和0.05%Tween 20的PBS)在37℃封闭1小时。然后以封闭缓冲液将平板洗涤3次，向每个孔中加入100μl Baculo‑Erns裂解物(1:3200稀释于PBS中)，将平板在37℃温育1小时。以封闭缓冲液洗涤3次后，向孔中加入100μl未稀释的牛血清样品；有1列的孔不加(作为非竞争性15C5‑HRP对照)；在37℃温育1小时。以封闭缓冲液洗涤3次后，向每个孔中加入100μl MAb15C5‑HRP缀合物(特异于BVDV Erns，1:20,000稀释于封闭缓冲液中)并在37℃温育1小时。以封闭缓冲液洗涤3次后，向每个孔中加入100μlABTS底物(过氧化物酶底物溶液A+B;KPL,USA)并在室温温育20‑60分钟，以进行显色。在405nm的波长处测定光密度(OD)。根据以下公式计算每个血清样品的OD降低百分比：
[1‑(样品OD÷15C5‑HRP对照的平均OD)]x 100%
结果：
所有的经病毒中和(VN)测试检测为阳性的血清样品都具有82%以上的O.D.降低，除了样品ID#13851以外(表4)。所有的经病毒中和测试检测为阴性的血清样品都具有17%以下的O.D.降低，除了样品ID#5150以外(表4)。不一致之处可以通过进行测定的方法的差异来解释，因为它们测定的是不同的抗体，并且特异性抗体在动物之间的比例是不同的。
表4.MAb15C5竞争性ELISA中的BVDV阳性和阴性血清样品


第1‑16行：阳性牛血清样品
第17‑27行：阴性牛血清样品
‑ELISA中使用的所有的血清样品未经稀释
虽然通过参考本发明的一些形式对本发明进行了相当详尽的描述，但是其它形式也是可行的。因此，随附的权利要求的范围不应被限于本文所包含的形式的描述。