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1、(10)申请公布号 CN 102949728 A (43)申请公布日 2013.03.06 CN 102949728 A *CN102949728A* (21)申请号 201210534212.9 (22)申请日 2012.12.12 A61K 47/04(2006.01) A61K 47/26(2006.01) A61K 47/42(2006.01) A61K 9/14(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 重庆大学 地址 400044 重庆市沙坪坝区沙正街 174 号 (72)发明人 蔡开勇 罗忠 胡燕 张蓓露 (74)专利代理机构 重庆大学专利中心 5。
2、0201 代理人 胡正顺 (54) 发明名称 一种兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米 药物载体及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开一种兼具还原响应性和靶向性的 介孔硅纳米药物载体及其制备方法。首先通过溶 解凝胶法制备出介孔硅纳米颗粒， 并将其开发成 为药物分子的纳米储存器 ； 而后， 利用简单的化 学修饰方法在介孔硅纳米储存器的表面引入二硫 键， 并将其作为连接纽带 ； 其次， 创新地采用生物 相容性的天然细胞外基质胶原分子固定至介孔 硅纳米储存器表面， 并将其开发成为介孔硅纳米 储存器的纳米封装器 ； 最后， 将乳糖酸分子修饰 至介孔硅 / 胶原纳米复合系统表面， 并将其作为 肝癌细胞膜。
3、表面受体 （ASGP-R） 的特异性受体， 从 而构建出一种兼具细胞特异性靶向性和还原性物 质 / 酶响应性的介孔硅 / 胶原乳糖酸多功能复 合型纳米药物载体系统。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 9 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 9 页 附图 3 页 1/2 页 2 1. 一种兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体的方法， 其特征在于， 包括以 下步骤 ： a制备介孔硅纳米颗粒 ； b采用 3- 氨基丙基硅烷偶联剂修饰步骤 a 所得的介孔硅纳米颗粒， 获得氨基化介孔 硅纳米颗粒 ； c配置丁二。
4、酸酐和丙酮的混合液， 所述丁二酸酐和丙酮的混合液中丁二酸酐的浓度 为 1 2 mol/L ； 将步骤 b 中获得的氨基化的介孔硅纳米复合材料按重量体积比 0.0075 0.015g/mL 加入到丙酮中， 室温下搅拌 3 6 h 后， 逐滴加入过量的所述丁二酸酐和丙酮的 混合液， 搅拌 18 36 h， 洗涤、 离心分离、 烘干后获得白色粉末状的羧基化的介孔硅纳米材 料 ； d采用胱胺分子功能化步骤 c 所得的羧基化介孔硅纳米颗粒， 制备出二硫键修饰的介 孔硅纳米颗粒 ； e将药物负载到步骤 d 所获得的二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒内， 再采用胶原分子 封堵所述二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒， 制备出。
5、介孔硅 / 胶原分子还原响应性纳米复合系 统 ； f采用乳糖酸分子功能化步骤 e 所得的介孔硅 / 胶原分子纳米复合系统， 制备出兼 具细胞特异性靶向性和还原响应性的介孔硅/胶原-乳糖酸多功能复合型纳米药物载体系 统。 2. 根据权利要求 1 所述的兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体的方法， 其特征在于 ： 步骤 a 中， 所述制备介孔硅纳米颗粒是将十六烷基三甲基溴化铵与氢氧化钠 均匀分散至二蒸水中获得混合溶液， 对混合溶液搅拌并加热至 70 90后， 采用匀速加样 器将正硅酸四乙酯逐滴加入至所述混合溶液中， 并剧烈搅拌 2 h， 获得白色悬浊液 ； 将所述 白色悬浊液均匀分散于甲醇和。
6、盐酸的混合液之中， 剧烈搅拌后， 于水浴锅中回流 48h， 获得 介孔二氧化硅纳米颗粒 ； 本步骤中， 所述十六烷基三甲基溴化铵、 氢氧化钠与正硅酸四乙酯 的重量比为 1 0.1 0.3 3 6。 3. 根据权利要求 1 所述的兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体的方法， 其 特征在于 ： 步骤 b 中， 所述制备氨基化介孔硅纳米颗粒是将步骤 a 中所获得的介孔二氧化 硅纳米颗粒按重量体积比 0.01 0.3g/mL 均匀分散在甲苯中， 搅拌 24h 后， 加入 3- 氨丙基 三甲氧基硅烷， 于5565的水浴锅中回流36 h， 离心即得到氨基化的介孔硅纳米复合材 料 ； 本步骤中， 所述。
7、甲苯与 3- 氨丙基三甲氧基硅烷的体积比为 ： 70 100 0.75 1.5。 4. 根据权利要求 1 所述的兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体的方法， 其 特征在于 ： 所述步骤c是将0.15g0.3g的氨基化的介孔硅纳米材料均匀分散在丙酮溶液 中， 并于室温下搅拌 3 6 h ； 然后， 逐滴加入过量的 1 2 mol/L 的丁二酸酐和丙酮混合 液， 并在室温下继续搅拌 18 36 h 后离心获得白色粉末 ； 最后， 用双蒸水和无水乙醇分别 洗涤离心得到白色粉末， 除去残留溶剂， 并置于真空烘箱中干燥， 即得到羧基化的介孔硅纳 米材料。 5. 根据权利要求 1 所述的兼具还原响应。
8、性和靶向性的介孔硅纳米药物载体的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 c 是将 0.2 g 氨基化的介孔硅纳米材料均匀分散在 20 mL 的丙酮溶 液中， 并于室温下搅拌 4 h ； 然后， 逐滴加入 10 mL 丁二酸酐浓度为 1.5 mol/L 的丁二酸酐 权 利 要 求 书 CN 102949728 A 2 2/2 页 3 和丙酮混合液， 并在室温下继续搅拌 24 h 后离心获得白色粉末 ； 最后， 用双蒸水和无水乙 醇分别洗涤离心得到白色粉末， 除去残留溶剂， 并置于真空烘箱中干燥， 即得到羧基化的介 孔硅纳米材料。 6. 根据权利要求 1 所述的兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体。
9、的方法， 其 特征在于 ： 步骤 d 中， 首先将步骤 c 所得的羧基化的介孔硅纳米材料、 1- 乙基 -3-3- 二甲 基氨基丙基 碳化二亚胺盐酸化物和 N- 羟基琥珀酰亚胺共同溶解在 pH=5 6 的 PBS 缓冲 液中， 搅拌 3 h， 以活化所述羧基化的介孔硅纳米材料的羧基 ； 再将过量的胱胺盐酸盐加入 到活化后的所述羧基化的介孔硅纳米材料溶液中， 室温下搅拌3648h后离心 ； 最后， 用双 蒸水和无水乙醇洗涤所述离心操作所获得的产物， 在高度真空中干燥后即得到所述二硫键 功能化介孔硅纳米材料。 7. 根据权利要求 1 所述的兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体的方法， 其特征。
10、在于 ： 步骤 e 中， 药物负载到二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒内后， 将胶原、 1- 乙 基 -3-3- 二甲基氨基丙基 碳化二亚胺盐酸化物、 N- 羟基琥珀酰亚胺和负载了药物的 二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒在溶液中混合， 室温搅拌 24 h， 离心得到的产物即为还原响 应性介孔硅 / 胶原复合系统 ； 本步骤中， 所述二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒、 胶原、 1- 乙 基 -3-3- 二甲基氨基丙基 碳化二亚胺盐酸化物和 N- 羟基琥珀酰亚胺的重量比为 ： 60 90 15 25 8 12 3 6 。 8. 根据权利要求 1 所述的兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体的方法， 其 特征在于 。
11、： 步骤f中， 是先将5070 mg的乳糖酸、 2535 mg 的1-乙基-3-3-二甲基氨 基丙基碳化二亚胺盐酸化物和1020 mg的N-羟基琥珀酰亚胺共同溶解于35 mL的 pH=5.5 6.5 的 PBS 溶液中获得混合物， 室温搅拌 4 6 h， 以活化所述乳糖酸的羧基 ； 之 后， 将本步骤中所述混合物加至步骤 e 所获得的介孔硅 / 胶原复合系统溶液中， 搅拌 18 24 h 后， 离心并使用 pH=7.0 7.4 的 PBS 缓冲溶液充分洗涤， 即得到乳糖酸功能化的还原 响应性细胞靶向介孔硅 / 胶原复合系统。 9.采用18任一权利要求所获得的兼具还原响应性和靶向性的多功能复合型。
12、介孔硅 纳米药物载体。 权 利 要 求 书 CN 102949728 A 3 1/9 页 4 一种兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体及其 制备方法 技术领域 0001 本发明属于医用材料领域， 涉及一种多功能医药纳米载体的构建方法。 背景技术 0002 经过半个多世纪的探索与发展， 智能药物控制释放系统在医学领域充分展示了其 潜在的应用价值。控释给药也逐渐成为生物医学研究领域的一个重要分支， 其横跨了工程 技术、 组织工程、 生物材料与临床医学等多类交叉学科。Robert Langer 等开创的微机电给 药系统， 利用外界远程信号实现系统的体内控制释放。 然而， 系统释放出来的药物分子。
13、不能 特异性的识别靶细胞， 药物分子大部分分布于正常组织并被正常细胞所摄取 ； 而病变组织 中的药物分布较少， 造成药物递送效力较低， 增加了药物在体内的毒副作用。因此， 研究人 员都在寻找特定的生物材料作为药物载体， 设计更加新型的药物控制释放系统， 提高功能 药物被病变细胞摄入的效率。 0003 纳米技术的迅速发展为制备并设计新型的智能药物释放系统提供了可能性。 纳米 粒子和纳米胶囊是指粒径分布在 10-100 纳米之间的固态胶体粒子， 可通过细胞吞噬作用 进入细胞体内。 因此， 研究人员通过整合药物化学和纳米技术， 设计新型的纳米控制释放系 统， 努力提高活性药物分子被细胞摄入的效率。药。
14、物分子可以通过物理作用 （扩散作用、 吸 附作用） 或化学作用 （亲疏水性作用、 化学交联作用） 粘附在纳米颗粒的表面， 形成药物分子 /纳米颗粒的复合系统。 这类纳米药物控释系统可实现药物的缓释， 并提高药物的细胞摄入 率。纳米药物控制释放系统的研究是传统药物制剂的进一步深化和发展， 属于当今最前沿 的研究领域之一。其具有较好的医学应用前景， 尤其在抗肿瘤领域已获得了较好的临床效 果， 该学科已促进了药学、 医学、 材料、 化学、 生物、 等领域多学科的交叉与融合。 0004 为了促使纳米控制释放系统具有更好的疗效， 并减少毒副作用 ； 相关材料科学家、 生物学家及临床医生都在共同努力设计一。
15、种新型的智能控释系统， 使其不仅能特异性识别 靶位组织， 还能针对病变细胞实行特定信号的定向 “爆破” 。 具体来说， 就是其能在特定的时 刻， 以合适的速率， 将所需剂量的药物导入人体所需要的部位， 即药物定点、 定时、 定量地释 放， 充分的利用了药物的疗效， 避免药物积累中毒， 减轻药物的毒副作用， 达到治愈的目的。 0005 介孔硅纳米材料是一种孔径在 2-50nm 范围内的材料， 其比表面积大 （通常为 900 g/cm-3） 、 表面特性活泼 （丰富的 -OH） ， 是一种很好的生物相容性药物载体。但是， 采用介孔 硅纳米材料制备兼具还原响应性和靶向性的药物载体时， 需要通过多个工。
16、艺步骤来进行表 面修饰。目前， 在制备介孔硅纳米材料药物载体的领域中， 由于工艺的原因， 往往还原响应 性和靶向性难以兼顾， 而且转化率较低， 药物的性能不尽人意。 发明内容 0006 有鉴于此， 本发明旨在构建一种兼具细胞特异性靶向性和还原性物质 / 酶响应性 的介孔硅 / 胶原乳糖酸多功能复合型控释系统。该方法具有操作简单、 成本低廉、 通用性 说 明 书 CN 102949728 A 4 2/9 页 5 强， 不需要特殊设备。利用该方法制备的多功能性介孔硅 / 胶原分子纳米复合材料具有较 好的细胞相性 ； 其能被肝癌细胞所特异性识别， 并能在细胞内还原响应性酶 （谷胱甘肽） 的 作用下实。
17、现定向 “爆破” ， 在抗癌治疗领域具有广阔的临床应用价值。 0007 为实现本发明目的而采用的技术方案是这样的， 一种兼具还原响应性和靶向性 的介孔硅纳米药物载体的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： a制备介孔硅纳米颗粒 ； b采用 3- 氨基丙基硅烷偶联剂修饰步骤 a 所得的介孔硅纳米颗粒， 获得氨基化介孔 硅纳米颗粒 ； c配置丁二酸酐和丙酮的混合液， 所述丁二酸酐和丙酮的混合液中丁二酸酐的浓度 为 1 2 mol/L ； 将步骤 b 中获得的氨基化的介孔硅纳米复合材料按重量体积比 0.0075 0.015g/mL 加入到丙酮中， 室温下搅拌 3 6 h 后， 逐滴加入过量的所述丁二。
18、酸酐和丙酮的 混合液， 搅拌 18 36 h， 洗涤、 离心分离、 烘干后获得白色粉末状的羧基化的介孔硅纳米材 料 ； d采用胱胺分子功能化步骤 c 所得的羧基化介孔硅纳米颗粒， 制备出二硫键修饰的介 孔硅纳米颗粒 ； e将药物负载到步骤 d 所获得的二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒内， 再采用胶原分子 封堵所述二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒， 制备出介孔硅 / 胶原分子还原响应性纳米复合系 统 ； f采用乳糖酸分子功能化步骤 e 所得的介孔硅 / 胶原分子纳米复合系统， 制备出兼 具细胞特异性靶向性和还原响应性的介孔硅/胶原-乳糖酸多功能复合型纳米药物载体系 统。 0008 制备介孔硅纳米颗粒在本领域。
19、中具有多种方法， 但是， 所采用的工艺方法对介孔 的孔径、 表面活性等有重要影响。本发明公开一种制备介孔硅纳米颗粒的详细工艺， 即所 述步骤 a 中， 所述制备介孔硅纳米颗粒是将十六烷基三甲基溴化铵与氢氧化钠均匀分散至 二蒸水中获得混合溶液， 对混合溶液搅拌并加热至 70 90后， 采用匀速加样器将正硅酸 四乙酯逐滴加入至所述混合溶液中， 并剧烈搅拌 2 h， 获得白色悬浊液。将所述白色悬浊液 均匀分散于甲醇和盐酸的混合液之中， 剧烈搅拌后， 于水浴锅中回流 48h， 获得介孔二氧化 硅纳米颗粒。 本步骤中， 所述十六烷基三甲基溴化铵、 氢氧化钠与正硅酸四乙酯的重量比为 1 0.1 0.3 3。
20、 6。 0009 作为优选步骤b中选用3-氨丙基三甲氧基硅烷来实现介孔硅纳米颗粒的氨基化， 即所述制备氨基化介孔硅纳米颗粒是将步骤 a 中所获得的介孔二氧化硅纳米颗粒按重量 体积比 0.01 0.3g/mL 均匀分散在甲苯中， 搅拌 24h 后， 加入 3- 氨丙基三甲氧基硅烷， 于 55 65的水浴锅中回流 36 h， 离心即得到氨基化的介孔硅纳米复合材料。本步骤中， 所 述甲苯与 3- 氨丙基三甲氧基硅烷的体积比为 ： 70 100 0.75 1.5。 0010 本发明中， 将介孔硅纳米材料羧基化是进一步获得二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒 的必经环节。然而， 将介孔硅纳米材料羧基化较为困难， 。
21、且转化率较低。本发明公开了一种 转化率高达 95的将介孔硅纳米材料羧基化的方法。即所述步骤 c 是将 0.15g 0.3g 的 氨基化的介孔硅纳米材料均匀分散在丙酮溶液中， 并于室温下搅拌 3 6 h。然后， 逐滴加 入过量的 1 2 mol/L 的丁二酸酐和丙酮混合液， 并在室温下继续搅拌 18 36 h 后离心 说 明 书 CN 102949728 A 5 3/9 页 6 获得白色粉末。最后， 用双蒸水和无水乙醇分别洗涤离心得到白色粉末， 除去残留溶剂， 并 置于真空烘箱中干燥， 即得到羧基化的介孔硅纳米材料。 0011 作为优选， 所述步骤 c 是将 0.2 g 氨基化的介孔硅纳米材料均。
22、匀分散在 20 mL 的 丙酮溶液中， 并于室温下搅拌 4 h。然后， 逐滴加入 10 mL 丁二酸酐浓度为 1.5 mol/L 的丁 二酸酐和丙酮混合液， 并在室温下继续搅拌 24 h 后离心获得白色粉末。最后， 用双蒸水和 无水乙醇分别洗涤离心得到白色粉末， 除去残留溶剂， 并置于真空烘箱中干燥， 即得到羧基 化的介孔硅纳米材料。 0012 采用丁二酸酐处理后所获得的羧基化的介孔硅纳米材料中， 羧基的活性较低。因 此， 为了提高转化率， 步骤 d 中， 需要先将步骤 c 所得的羧基化的介孔硅纳米材料、 1- 乙 基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺共同溶解在pH。
23、=5 6 的 PBS 缓冲液中， 搅拌 3 h， 以活化所述羧基化的介孔硅纳米材料的羧基。再将过量的胱 胺盐酸盐加入到活化后的所述羧基化的介孔硅纳米材料溶液中， 室温下搅拌3648h后离 心。 最后， 用双蒸水和无水乙醇洗涤所述离心操作所获得的产物， 在高度真空中干燥后即得 到所述二硫键功能化介孔硅纳米材料。 0013 制备出二硫键功能化介孔硅纳米材料即完成了载体的制备， 在进行封堵前， 需要 将药物负载到载体上。 本发明的载体可以负载多种类型的药物。 问了验证效果， 本发明以异 硫氰酸荧光素 （FITC） 作为标记 “药物” ， 先将 0.514 mM 的 FITC 溶解于 30 mL 的 。
24、pH 6.0 的 PBS 缓冲溶液中， 再加入步骤 d 所获得的二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒， 使得 FITC 负载 到所述二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒内。 之后将胶原、 1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳 化二亚胺盐酸化物、 N- 羟基琥珀酰亚胺和负载了 FITC 的二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒在 溶液中混合， 室温搅拌24 h， 离心得到的产物即为还原响应性介孔硅/胶原复合系统。 本步 骤中， 所述二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒、 胶原、 1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳化二亚 胺盐酸化物和 N- 羟基琥珀酰亚胺的重量比为 ： 60 90 15 25 8 12 3 6 。 0014 步骤 f 中，。
25、 是先将 50 70 mg 的乳糖酸、 25 35 mg 的 1- 乙基 -3-3- 二甲基氨 基丙基碳化二亚胺盐酸化物和1020 mg的N-羟基琥珀酰亚胺共同溶解于35 mL的 pH=5.5 6.5 的 PBS 溶液中获得混合物， 室温搅拌 4 6 h， 以活化所述乳糖酸的羧基。之 后， 将本步骤中所述混合物加至步骤 e 所获得的介孔硅 / 胶原复合系统溶液中， 搅拌 18 24 h 后， 离心并使用 pH=7.0 7.4 的 PBS 缓冲溶液充分洗涤， 即得到乳糖酸功能化的还原 响应性细胞靶向介孔硅 / 胶原复合系统。 0015 本发明还包括采用上述方法获得的兼具还原响应性和靶向性的多功能。
26、复合型介 孔硅纳米药物载体。 0016 本发明的有益效果在于 ： 该方法具有操作简单、 成本低廉、 通用性强， 不需要特殊 设备。利用该方法制备的多功能性介孔硅 / 胶原分子纳米复合材料具有较好的细胞相容 性。其能被肝癌细胞所特异性识别， 并能在细胞内还原响应性酶 （谷胱甘肽） 的作用下实现 定向 “爆破” ， 在抗癌治疗领域具有广阔的临床应用价值。 附图说明 0017 图1为介孔硅纳米颗粒和介孔硅/胶原乳糖酸纳米复合颗粒的特征图 ： A和B分 别为介孔硅纳米颗粒和介孔硅 / 胶原乳糖酸纳米复合颗粒的透射电镜形貌图 ； C 和 D 分 说 明 书 CN 102949728 A 6 4/9 页 。
27、7 别是修饰后介孔硅纳米颗粒的吸附等压线相对压力变化和孔径变化的特征图 ； 图 2 为介孔硅 / 胶原乳糖酸纳米复合系统的还原响应性释放特性图 ： A 是系统的还 原响应性释放特性图 （DTT 刺激） ； B 是还原响应性脉冲式释放特性 （DTT 刺激） ； C 是系统的 长时间还原响应性释放特性 ； 图 3 为共聚焦监控对照组 （无纳米颗粒， a1-a3） 、 介孔硅纳米颗粒 (b1-b3) 和介孔硅 / 胶原乳糖酸纳米复合颗粒 (c1-c3) 被细胞吞噬后的胞内分布状况 ； 图 4 为细胞流式仪监控肝癌细胞与纳米颗粒间的相互作用特性 ： A 为肝癌细胞吞噬 FITC 荧光分子、 MSNsF。
28、ITC 纳米颗粒和 LA-Col-linker-MSNsFITC 纳米复合颗粒后的荧光 定量分析 ； B 为肝癌细胞 （HepG2） 和内皮细胞 （EC） 吞噬 LA-Col-linker-MSNsFITC 纳米复 合颗粒后的荧光定量分析。 具体实施方式 0018 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明， 但不应该理解为本发明上述主题 范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下， 根据本领域普通技术知 识和惯用手段， 作出各种替换和变更， 均应包括在本发明范围内。 0019 本发明采用溶胶凝胶和模板法制备单分散的具有规则孔道结构的介孔硅纳米材 料 ； 而后利用化学修饰方法， 在。
29、介孔硅纳米材料表面构建出具有多生物功能的介孔硅 / 胶 原 - 乳糖酸复合纳米颗粒。在制备过程中， 诸多因素可以影响介孔硅纳米材料颗粒的合成， 例如反应溶液 （水） 的体积、 水解主体 （正硅酸四乙酯） 和表面活性剂 （十六烷基三甲基溴化 铵） 的浓度以及反应温度和 pH 条件等， 不同的制备方法可得到具有不同形貌特征的介孔硅 纳米材料。 本发明对反应体系和反应条件进行了考察， 包括不同比例的反应物 （正硅酸四乙 酯和正硅酸四乙酯在水溶液中的浓度） 和反应条件等。结果显示， 当十六烷基溴化铵 / 正硅 酸四乙酯 / 水之间的质量比小于 1 ： 10 ： 480 或小于 5 ： 10 ： 480。
30、 的时候， 制备的纳米颗粒不具 有规则的介孔硅结构 ； 当反应体系的温度低于 60或 pH 小于 9.5 的时候， 纳米颗粒的制备 过程比较缓慢 ； 而当将十六烷基溴化铵/正硅酸四乙酯/水之间的质量比控制在1 ： 5: 480 的时， 反应温度置于 80， pH 条件置于 11 的条件时候， 可以制备出具有规则孔道结构的介 孔硅纳米材料 ； 因此， 本发明的反应主体优选十六烷基三级基溴化铵 / 正硅酸四乙酯 / 水 的质量比为 1 ： 5: 480， 反应温度置于 80， pH 条件置于 11。 0020 实施例 1 本实施例主要包括以下步骤 ： a利用溶胶凝胶和模板法制备出单分散的介孔硅纳米。
31、颗粒 ； b采用 3- 氨基丙基硅烷偶联剂修饰步骤 a 所得的介孔硅纳米颗粒， 制备氨基化的介 孔硅纳米颗粒 ； c采用琥珀酸酐与步骤 b 所得的氨基化介孔硅纳米颗粒反应， 制备出羧基化的介孔硅 纳米颗粒 ； d采用胱胺分子 （富含二硫键） 功能化步骤 c 所得的羧基化介孔硅纳米颗粒， 制备出二 硫键修饰的介孔硅纳米颗粒 ； e采用胶原分子封堵步骤 d 所得的二硫键功能化介孔硅纳米颗粒， 制备出介孔硅 / 胶 原分子还原响应性纳米复合系统 ； 说 明 书 CN 102949728 A 7 5/9 页 8 f采用乳糖酸分子功能化 e 所得的介孔硅 / 胶原分子纳米复合系统， 制备出兼具细胞 特异。
32、性靶向性和还原响应性的介孔硅 / 胶原 - 乳糖酸多功能复合型纳米药物载体系统。 0021 优选的， 所述步骤 a 是将 200800 mL 的水溶液作为反应溶剂， 0.52g 的双亲性表 面活性剂 ( 十六烷基三甲基溴化铵， CTAB) 作为模板剂， 碱性条件 （pH=1113） 和反应温度作 为反应控制条件 （75 85） ， 通过正硅酸四乙酯的水解而合成。而后， 将上述制备的带有 表面活性剂介孔硅纳米材料(CTABMSNs)均匀分散于100150 mL的甲醇/盐酸 （V ： V=9 ： 1） 混合液中。剧烈搅拌后， 将上述溶液置于 6580的水浴锅中回流 3648h， 即可有效地抽取 表。
33、面活性剂 （CTAB） ， 得到规则孔道结构的介孔二氧化硅纳米颗粒 （MSNs） 。 0022 更优选的是， 所述步骤 a 是将 1g 十六烷基三甲基溴化铵与 0.28 g 氢氧化钠均匀 分散至480 mL二蒸水中， 剧烈搅拌并加热至80。 用匀速加样器逐滴加入5 g正硅酸四乙 酯至上述溶液中， 并剧烈搅拌2 h， 直至混合液成为白色悬浊液。 而后， 制备的带有表面活性 剂的介孔硅纳米材料 (CTABMSNs) 均匀分散于 150 mL 的甲醇 / 盐酸 （135 mL ： 15 mL） 混合 液中。剧烈搅拌后， 将上述溶液置于 80的水浴锅中回流 48h， 即可有效地抽取表面活性剂 （CTA。
34、B） ， 得到规则孔道结构的介孔二氧化硅纳米颗粒 （MSNs） 。 0023 优选的， 所述步骤 b 是利用 3- 氨基丙基硅烷偶联剂功能化步骤 a 得的介孔硅纳米 颗粒 ； 简单来说 ： 就是将 1.02.0g 的带有表面活性剂的介孔硅纳米材料 (CTABMSNs) 均匀 分散在 70 mL100 mL 的甲苯混合液中。剧烈搅拌 24 h 后， 加入 0.751.5 mL 的的 3- 氨 丙基三甲氧基硅烷， 并置于 55-65的水浴锅中回流 3648 h， 离心即得到氨基化的介孔硅 纳米复合材料 (CTABMSNs-APTS)。 0024 更为优选的， 所述步骤 b 是利用 3- 氨基丙基硅。
35、烷偶联剂功能化步骤 a 得的介孔 硅纳米颗粒 ； 简单来说 ： 将 1.5g 的带有表面活性剂的介孔硅纳米材料 (CTABMSNs) 均匀 分散在 85 mL 的甲苯混合液中。剧烈搅拌 24 h 后， 加入 1 mL 的的 3- 氨丙基三甲氧基硅 烷， 并置于 60的水浴锅中回流 36 h， 离心即得到氨基化的介孔硅纳米复合材料 (CTAB MSNs-APTS)。 0025 优选的， 所述步骤 c 是将 0.15g0.3g 的氨基化的介孔硅纳米材料 （APTS-MSN） 均 匀分散在丙酮溶液中， 并于室温下搅拌 36 h。然后， 逐滴加入过量的 12 mol/L 的琥珀酸 酐 / 丙酮混合液，。
36、 并在室温下继续搅拌 1836 h。最后， 分别用双蒸水和无水乙醇充分洗涤 离心得到白色粉末， 除去残留溶剂， 并置于真空烘箱中干燥， 即得到羧基化的介孔硅纳米材 料 （COOH-MSNs） 。 0026 更为优选的， 所述步骤 c 是将 0.2 g 氨基化的介孔硅纳米材料 （APTS-MSNs） 均匀 分散在 20 mL 的丙酮溶液中， 并于室温下搅拌 4 h。然后， 逐滴加入 10 mL 1.5 mol/L 琥珀 酸酐/丙酮混合液， 并在室温下继续搅拌24 h。 最后， 分别用双蒸水和无水乙醇充分洗涤离 心得到白色粉末， 除去残留溶剂， 并置于真空烘箱中干燥， 即得到羧基化的介孔硅纳米材料。
37、 （COOH-MSNs） 。 0027 优 选 的， 所 述 步 骤 d 是 将 0.1g0.15g 羧 基 化 介 孔 纳 米 材 料 （COOH-MSNs） ， 0.0150.02mol 的 1- 乙基 -3-3- 二甲基氨基丙基 碳化二亚胺盐酸化物 （EDC） 和 N- 羟基 琥珀酰亚胺 (NHS) 共同溶解在 2030 mL 的 PBS 缓冲液中 （pH=56） ， 并搅拌 3 h， 活化介孔 硅纳米材料的羧基。其次， 将过量的 1.02.0 g 胱胺盐酸盐加入上述溶液， 并在室温下搅拌 3648h。 最后， 用双蒸水和无水乙醇洗涤上述溶液的离心产物， 并在高度真空(1000 Pa) 。
38、说 明 书 CN 102949728 A 8 6/9 页 9 中干燥， 除去介孔内残留的溶剂， 即得到二硫键功能化介孔硅纳米材料。 0028 更为优选的， 所述步骤 d 是将 0.1g 羧基化介孔纳米材料 （COOH-MSNs） ， 0.015 mol 的 1- 乙基 -3-3- 二甲基氨基丙基 碳化二亚胺盐酸化物 （EDC）和 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS)共同溶解在20 mL的PBS缓冲液中 （pH=5） ， 并搅拌3 h， 活化介孔硅纳米材料的羧基。 其次， 将 1 g 胱胺盐酸盐加入上述溶液， 并在室温下搅拌 36 h。最后， 用双蒸水和无水乙醇 洗涤上述溶液的离心产物， 并在高度真。
39、空(1000 Pa)中干燥， 除去介孔内残留的溶剂， 即 得到二硫键功能化介孔硅纳米材料。 0029 优选的， 所述步骤 e 是将 0.50.6 mM 的 FITC 溶解于 2540mL PBS (pH=5.56.5) 缓冲溶液中。 加入7090 mg二硫键功能化的介孔硅纳米材料， 搅拌1824h。 最后， 将1825 mg胶原， 8-12 mg EDC和46 mg NHS共同加入到上述混合缓冲液中， 室温搅拌1824 h。 离 心得到的产物即为还原响应性介孔硅 / 胶原复合系统， 记为 Col-linker-MSNs。 0030 更为优选的， 所述步骤 e 是将 0.514 mM 的 FIT。
40、C 溶解于 30 mL PBS (pH 6.0) 缓冲 溶液中。而后， 加入 80 mg 二硫键功能化的介孔硅纳米材料， 搅拌 24h。最后， 将 20 mg 胶 原， 10 mg EDC 和 5 mg NHS 共同加入到上述混合缓冲液中， 室温搅拌 24 h。离心得到的产 物即为还原响应性介孔硅 / 胶原复合系统， 记为 Col-linker-MSNs。 0031 优选的， 所述步骤f是将5070 mg乳糖酸、 25-35 mg EDC以及10-20 mg NHS共同 溶解于 35 mL PBS 溶液中 （pH=5.56.5） ， 室温搅拌 46 h， 活化乳糖酸的羧基。而后， 将上 述混合。
41、液加至介孔硅 / 胶原复合系统溶液中。搅拌 1824 h 后， 离心并使用 PBS 缓冲溶液 （pH=7.07.4） 洗涤多次， 即得到乳糖酸功能化的还原响应性细胞靶向介孔硅 / 胶原复合系 统。标记为 LA-Col-linker-MSNs。 0032 更为优选的， 所述步骤 f 是将 60 mg 乳糖酸、 30mg EDC 以及 15mg NHS 共同溶解 于 4 mL PBS 溶液中 （pH=6.0） ， 室温搅拌 4 h， 活化乳糖酸的羧基。而后， 将 4 mL 上述混 合液加至介孔硅 / 胶原复合系统溶液中。搅拌 24 h 后， 离心， PBS 缓冲溶液 （pH 7.0） 洗 涤 10。
42、 次， 即得到乳糖酸功能化的还原响应性细胞靶向介孔硅 / 胶原复合系统。标记为 LA-Col-linker-MSNs。 0033 实施例 2 本实施例制备兼具还原响应性和靶向性的介孔硅/胶原-乳糖酸多功能纳米复合颗粒 的制备。 0034 包括以下步骤 ： a介孔硅纳米颗粒的合成 ： 首先， 将 1g 十六烷基三甲基溴化铵与 0.28 g 氢氧化钠均匀分散至 480 mL 二蒸水中， 剧烈搅拌并加热至 80。用匀速加样器逐 滴加入 5 g 正硅酸四乙酯至上述溶液中， 并剧烈搅拌 2 h， 直至混合液成为白色悬浊液。而 后， 制备的带有表面活性剂的介孔硅纳米材料 (CTABMSNs) 均匀分散于 。
43、150 mL 的甲醇 / 盐 酸 （135 mL ： 15 mL） 混合液中。剧烈搅拌后， 将上述溶液置于 80的水浴锅中回流 48h， 即 可有效地抽取表面活性剂 （CTAB） ， 得到规则孔道结构的介孔二氧化硅纳米颗粒 （MSNs） 。 0035 b氨基功能化介孔硅纳米颗粒的合成 ： 首先， 将 a 步骤所得的 1.5g 纳米颗粒 (CTAB MSNs)均匀分散在85 mL的甲苯混合液中。 剧烈搅拌24 h后， 加入1 mL的的3-氨 丙基三甲氧基硅烷， 并置于 60的水浴锅中回流 36 h， 离心即得到氨基化的介孔硅纳米复 合材料 (MSNs-APTS)。 0036 c ： 羧基功能化介。
44、孔硅纳米颗粒的制备 ： 首先， 将 b 步骤所得的 0.2g 纳米材料 说 明 书 CN 102949728 A 9 7/9 页 10 （APTS-MSNs） 均匀分散在 20 mL 的丙酮溶液中， 并于室温下搅拌 4 h。然后， 逐滴加入 10 mL 1.5 mol/L 琥珀酸酐 / 丙酮混合液， 并在室温下继续搅拌 24 h。最后， 分别用双蒸水和无水 乙醇充分洗涤离心得到白色粉末， 除去残留溶剂， 并置于真空烘箱中干燥， 即得到羧基化的 介孔硅纳米材料 （COOH-MSNs） 。 0037 d二硫键功能化介孔硅纳米颗粒的制备 ： 首先， 将 c 步骤所得的 0.1g 纳米材料 （COOH。
45、-MSN） 、 0.015 mol 的 1- 乙基 -3-3- 二甲基氨基丙基 碳化二亚胺盐酸化物 （EDC） 和 N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)共同溶解在20 mL的PBS缓冲液中 （pH=5） ， 并搅拌3 h， 活化介孔 硅纳米材料的羧基。其次， 将 1 g 胱胺盐酸盐加入上述溶液， 并在室温下搅拌 36 h。最后， 用双蒸水和无水乙醇洗涤上述溶液的离心产物， 并在高度真空 ( 1000 Pa) 中干燥， 除去 介孔内残留的溶剂， 即得到二硫键功能化介孔硅纳米材料。 0038 e 还原响应性介孔硅/胶原纳米复合系统的制备 ： 首先， 将0.514 mM的FITC溶解 于30 mL PBS。
46、 (pH 6.0)缓冲溶液中。 而后， 加入d步骤所得的80 mg的功能性纳米材料， 搅 拌24h。 最后， 将20 mg胶原， 10 mg EDC和5 mg NHS共同加入到上述混合缓冲液中， 室温搅 拌 24 h。离心得到的产物即为还原响应性介孔硅 / 胶原复合系统， 记为 Col-linker-MSNs。 0039 f ： 兼具还原响应性和靶向性的介孔硅 / 胶原 - 乳糖酸多功能纳米复合颗粒的制 备 ： 首先， 将60 mg乳糖酸、 30mg EDC以及15mg NHS共同溶解于4 mL PBS溶液中 （pH=6.0） ， 室温搅拌4 h， 活化乳糖酸的羧基。 而后， 将4 mL上述混。
47、合液加至e所得的纳米颗粒混和液 中。搅拌 24 h 后， 离心， PBS 缓冲溶液 （pH 7.0） 洗涤 10 次， 即得到乳糖酸功能化的还原响 应性细胞靶向介孔硅 / 胶原复合系统。标记为 LA-Col-linker-MSNs。 0040 上述 a 步骤和 f 步骤处理后的介孔硅纳米材料和介孔硅 / 胶原乳糖酸纳米复合 颗粒的透射电镜图分别间图 1. A 和图 1. B ； 可见本发明制备的介孔硅纳米颗粒具有规则 有序的孔道结构， 而经过胶原乳糖酸分子修饰的介孔硅纳米材料的孔道比较模糊 ； 该结 果表明介孔硅胶原分子已经成功修饰至介孔硅纳米材料表面。实例 a-f 各个步骤处理后 纳米材料的。
48、纳米孔道孔径和比表面积的特征分别间图 1. C 和图 1. D ； 从图中可看出， 介孔 硅纳米颗粒的孔径和比表面积分别为 3.8 nm 和 884 m2/g ； 而经过氨基、 二硫键和胶原分 子修时候， 其孔径分别降低至3.3 nm、 2.7 nm 和消失 ； 而比表面积会分别降低至774 m2/g、 474 m2/g、 109 m2/g ； 上述结果进一步证明本发明所述的各个反应过程是成功可控的。 实施例 3 本实施例作为本发明的第一个实验例， 研究介孔硅 / 胶原乳糖酸多功能纳米复合颗 粒的还原响应性行为。 0041 本研究以FITC作为模型药物， 考察了介孔硅/胶原乳糖酸复合系统的还原性响 应性释放特性。 0042 首先， 本发明考察苏硫二糖醇 （DTT） 对纳米复合系统释放行为的影响。具体实验 过程如下 ： 将两组3.3 mg FITC标记的介孔硅/胶原乳糖酸颗粒和3.3 mg胶原吸附的介 孔硅纳米颗粒分别溶解于 3 mL 的 PBS 中， 并分别加载 30 mg、 0 mg 和 30 mg 的 DTT， 制成三 组混合液。而后， 将上述混合液液全部转移到透析袋 （分子量大于 14000） 中， 并置于含有 9 mL PBS 的容器中， 37旋转孵育 24 h。在设定时间点。