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1、(10)申请公布号 CN 102949715 A (43)申请公布日 2013.03.06 CN 102949715 A *CN102949715A* (21)申请号 201110249517.0 (22)申请日 2011.08.26 A61K 39/12(2006.01) C12N 7/00(2006.01) A61P 31/14(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 唐山怡安生物工程有限公司 地址 063020 河北省唐山市高薪技术开发区 火炬路 120 号 (72)发明人 岳雷 郭鑫 陈静 李淑芬 韩中山 张振山 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代。
2、理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 张庆敏 (54) 发明名称 利用生物反应器制备猪乙型脑炎灭活疫苗的 方法 (57) 摘要 本发明提供了一种利用生物反应器制备猪乙 型脑炎灭活疫苗的方法, 其是利用生物反应器和 Cytodex-1 微载体系统, 用抗原性好的 P3 株乙脑 病毒, 对乙脑病毒P3株适应的高密度Vero细胞进 行病毒感染, 根据乙脑病毒P3株在Vero细胞上的 增殖情况, 待细胞病变达一定程度后收获病毒液, 使传统病毒滴度从 105-6PFU/ml 提高到 107-8PFU/ ml 以上, 病毒含量提高 10 倍以上。将收获的病毒 液灭活后, 加入佐剂定量分装即可获得高质量。
3、的 疫苗成品。 制得的疫苗安全、 有效, 生产工艺稳定, 质量可控。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种利用生物反应器制备猪乙型脑炎灭活疫苗的方法, 其特征在于, 其是利用生物 反应器和Cytodex-1微载体系统, 用乙脑病毒P3株对连续灌流式培养的密度为17106/ ml 的乙脑病毒 P3 株适应的 Vero 细胞进行病毒感染, 培养条件为 342, pH 值 7 8, 待 细胞病变达到 75以上时, 收获含有乙脑病。
4、毒的培养液, 然后对收获的病毒培养液进行病 毒灭活。 2.根据权利要求1所述的方法, 其特征在于, 乙脑病毒P3株对Vero细胞进行病毒感染 的接种比例为 0.005 0.5M.O.I。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法, 其特征在于, 病毒灭活使用的是 - 丙内酯, 使用 量为 - 丙内酯病毒液 (v v) 0.1-2 4000。 4.根据权利要求3所述的方法, 其特征在于, -丙内酯病毒液(vv)14000。 5.根据权利要求1或2所述的方法, 其特征在于, 其还包括向病毒灭活液中加入氢氧化 铝胶和硫柳汞。 6.根据权利要求1或2所述的方法, 其特征在于, 氢氧化铝胶和硫柳汞的终。
5、浓度分别为 0.6-1.2mg/ml 和 0.1mg/ml。 权 利 要 求 书 CN 102949715 A 2 1/4 页 3 利用生物反应器制备猪乙型脑炎灭活疫苗的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种疫苗的制备方法, 具体地说, 涉及一种利用生物反应器制备猪乙 型脑炎灭活疫苗的方法。 背景技术 0002 猪乙型脑炎又称日本乙型脑炎, 是一种由日本乙型脑炎病毒引起的蚊媒性人畜共 患病毒性传染病。主要通过吸血昆虫 ( 主要为蚊子 ) 叮咬, 以猪 - 蚊 - 猪循环扩大病毒的 传播, 使其成为乙型脑炎病毒的主要增殖宿主和传染源。各种年龄、 品种、 性别的猪均易感 染此病, 患病种猪可垂直。
6、传播传给仔猪。该病夏秋季节流行, 南方 6 7 月, 东北 8 9 月 达到高峰。在我国规模型养猪场中广泛存在, 呈地方性流行, 北京、 云南、 湖南、 湖北、 福建、 广东、 广西、 山西、 山东、 吉林、 甘肃、 河北等省份均报道从猪体内或蚊体内分离到乙型脑炎 病毒。 0003 猪乙型脑炎无特效治疗药, 最主要的防治措施为免疫接种。目前乙脑疫苗主要有 三种 : 日本的鼠脑纯化疫苗、 中国的 SA14-14-2 株减毒活疫苗及灭活疫苗。乙脑组织灭活 苗虽然安全可靠, 但生产成本高, 存在大量无关抗原成分, 副作用明显。弱毒疫苗虽然保护 性好, 但可能出现潜在的毒力返强、 带毒、 排毒、 垂直。
7、传播等不安全因素, 而利用原代地鼠肾 细胞生产乙型脑炎灭活疫苗的工艺, 很难提高抗原含量和控制疫苗质量, 因此, 寻找一种安 全、 有效的乙脑灭活疫苗的生产方法成为亟待解决的问题。 发明内容 0004 本发明旨在克服已有的猪乙脑灭活疫苗制备方法中存在的不足, 提供一种新型 的、 安全、 有效的猪乙脑灭活疫苗的制备方法。 0005 为了实现本发明目的, 本发明的一种利用生物反应器制备猪乙型脑炎灭活疫苗的 方法, 其是利用生物反应器和 Cytodex-1 微载体系统, 用乙脑病毒 P3 株对密度可达 1 7106/ml的乙脑病毒P3株适应的Vero细胞进行病毒感染, 培养条件为342, pH值7 。
8、8, 待细胞病变达到 75以上时, 收获含有乙脑病毒的培养液, 然后对收获的病毒培养液进 行灭活。 0006 其中, 乙脑病毒P3株对Vero细胞进行病毒感染的接种比例为0.0050.5M.O.I。 0007 优选地, 使用 - 丙内酯灭活病毒, 使用量为 - 丙内酯病毒液 (v v) 0.1-2 4000, 更优选地, - 丙内酯病毒液 (v v) 1 4000。 0008 前述的方法, 其还包括最后向病毒灭活液中加入氢氧化铝胶和硫柳汞的步骤。优 选地, 氢氧化铝胶和硫柳汞的终浓度分别为 0.6-1.2mg/ml 和 0.1mg/ml。 0009 借由上述技术方案, 本发明至少具有下列优点及。
9、有益效果 : 0010 本发明利用生物反应器和 Cytodex-1 微载体系统, 用抗原性好的 P3 株乙脑病毒, 对乙脑病毒 P3 株适应的高密度 Vero 细胞进行病毒感染, 根据乙脑病毒 P3 株在 Vero 细胞 上的增殖情况, 待细胞病变达一定程度后收获病毒液, 使传统病毒含量从 105-6PFU/ml 提高 说 明 书 CN 102949715 A 3 2/4 页 4 到 107-8PFU/ml 以上, 病毒含量提高 10 倍以上。将收获的病毒液灭活后, 加入佐剂定量分装 即可获得高质量的疫苗成品。制得的疫苗安全、 有效, 生产工艺稳定, 质量可控。另外, 与传 统生产工艺相比, 。
10、本发明改进了培养系统的氧传递方式, 减少了剪切力, 降低有害代谢废物 浓度。 由于可模拟空间中的微重力环境, 使培养物的重力向量在旋转过程中产生随机化, 导 致一定程度的重力降低, 使细胞处于一种模拟自由落体状态, 以此模拟微重力环境。 由于没 有搅拌剪切力影响, 细胞可以在相对温和的环境中进行三维生长, 同时在动物细胞培养过 程中, 葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢密切相关。通过控制葡萄糖和谷氨酰胺浓度可控制乳酸 和氨等有害代谢物的产生浓度, 可有效控制细胞生长状况。大规模连续灌流培养高密度宿 主细胞, 细胞密度可达 7106/ml, 这种成本低、 易于操作的细胞能量代谢转移研究方法, 为 实现高密。
11、度、 高产率的细胞培养优化工艺提供了广阔的应用前景。 附图说明 0011 图 1 为本发明方法制得的猪乙型脑炎灭活疫苗的动物学免疫实验结果。 具体实施方式 0012 以下实施例用于说明本发明, 但不用来限制本发明的范围。 0013 以下实施例中使用的非洲绿猴肾细胞 (Vero 细胞 ) 购自 ATCC, Cytodex-1 微载体 系统购自 Amersham 公司, 乙脑病毒 P3 株购自中国药品生物制品检定所。 0014 实施例 1 乙脑病毒 P3 株适应的 Vero 细胞传代扩增培养 0015 将乙脑病毒 M53 代 P3 株乙型脑炎病毒种子用标准 MEM 培养基稀释后, 脑内接种乳 鼠,。
12、 采集死亡小鼠脑组织, 研磨制成脑组织悬液, 离心, 取上清制成乙型脑炎鼠脑病毒。 0016 将制备成的乙型脑炎病毒鼠脑悬液用细胞维持液进行适当稀释后, 接种长成单 层的 Vero 细胞, 在 34.02.0进行病毒培养, 培养至细胞病变达 75左右时收获病毒 上清液, 按照上述方法, 将 P3 株乙型脑炎病毒在 Vero 细胞中连续传代, 测定病毒含量在 107.0PFU/ml 以上。表明乙脑病毒 P3 株对 Vero 细胞敏感, 可以用于疫苗的生产。 0017 实施例 2 利用生物反应器和 Cytodex-1 微载体系统进行 Vero 细胞培养 0018 生物反应器工作体积 10L 500。
13、L, Cytodex-1 微载体系统使用 10g/L, 细胞密度由 5105递增到 5 7106。 0019 实施例 3 接种乙脑病毒 P3 株对 Vero 细胞进行病毒感染 0020 当细胞长成单层时, 按照接种 0.005 0.5M.O.I 进行 P3 株乙脑病毒感染, 根据测 定培养基 ( 含有 5-10牛血清的标准 MEM 培养基 ) 中葡萄糖浓度、 乳酸盐浓度、 谷氨酰胺、 耗氧速率以及 pH 值指标来控制 ; 病毒培养温度控制在 34.02.0, pH 值为 7 8, 20 60 转 / 分, 溶氧 10 100。 0021 实施例 4 病毒液的超滤浓缩、 灭活及疫苗成品的制备 0。
14、022 接种病毒后, 待细胞病变达到 75以上时收获含有乙脑病毒的培养液, 按 0.1-2ml/4000ml 病毒液的量加入 - 丙内酯进行灭活。然后, 向病毒灭活液中加入终浓度 为0.6-1.2mg/ml氢氧化铝胶和0.1mg/ml硫柳汞, 充分摇匀, 经灌装后即为猪乙型脑炎灭活 疫苗成品。 0023 实施例 5 猪乙型脑炎灭活疫苗的制备 说 明 书 CN 102949715 A 4 3/4 页 5 0024 1 病毒与细胞 : 0025 用于制备猪乙型脑炎灭活疫苗的病毒株为具有良好抗原性的乙脑病毒 P3 株, 以 对该病毒株具有良好敏感性的细胞系 Vero 细胞, 作为制苗用细胞系, 以感。
15、染并大量繁殖乙 脑病毒。 0026 2 毒种制备 : 0027 将制备疫苗用的细胞系 Vero 细胞接种到含 5-10新生牛血清的标准 MEM 培养基 中, Cytodex 1 微载体浓度为 10g/L, 在温度 : 37.02.0, pH 值 7-8, 搅拌速度 20-60 转 / 分条件下培养。待微载体上的 Vero 细胞长成单层, 弃去生长液, 按 0.1的比例接种基础 毒种, 在 34.02.0条件下进行培养, 待细胞病变达到 75以上收获上清液。按照上述方 法, 病毒在细胞上连续传代, 测定病毒含量在 107.0PFU/ml 以上, 表明病毒适应 Vero 细胞, 即 完成乙脑病毒适。
16、应 Vero 细胞的传代, 可用于建立病毒基础毒种和生产毒种。 0028 3 连续的细胞培养 : 0029 Vero 细胞接种到装有浓度为 10g/L 的 Cytodex 1 微载体的 10L 生物反应器中, 采 用含有10牛血清的标准MEM培养基培养, 温度 : 37.02.0, pH值7-8, 溶氧40-70, 搅 拌速度 20-60 转 / 分。连接程序控制软件, 通过计算机在线监控。根据细胞生长情况使用 含 10牛血清的标准 MEM 培养基进行灌流培养。 0030 4 收获感染病毒 0031 待微载体上的 Vero 细胞长成单层, 弃去生长液, 接种 0.5M.O.I( 感染复数 ) 。
17、的 生产用毒种, 采用含有 2-5牛血清的标准 MEM 培养基, 于 34.02.0, pH 为 7-8, 溶氧 50-70, 搅拌速度 20-60 转 / 分培养, 连接程序控制软件, 通过计算机在线监控。待细胞病 变达到 75以上收获病毒液。收获液病毒含量可达 107PFU/ml 以上。 0032 5 病毒灭活 : 0033 每批收获病毒液按 1ml/4000ml 病毒液的量加入 - 丙内酯, 在 4下灭活病毒 48 小时, 将灭活后的病毒置于 37水解, 彻底降解 - 丙内酯。 0034 6 成品配置分装 : 0035 浓缩灭活后的乙脑病毒液, 加入终浓度为 0.6-1.2mg/ml 氢。
18、氧化铝胶和 0.1mg/ml 硫柳汞, 制备成液体疫苗成品。 0036 实施例 6 本发明猪乙型脑炎灭活疫苗的安全性评价 0037 1. 疫苗接种小鼠的安全性实验 0038 用体重 12 14g 清洁级小鼠 10 只, 每只小鼠肌肉注射疫苗 0.5ml( 含 0.5 头份 ), 观察 14 日, 接种后 3 日内非特异性死亡应不超过 2 只, 且应全部健活 ; 否则, 应使用同等数 量小鼠重检 1 次。 0039 结果表明, 上述 6 批疫苗接种小鼠后, 小鼠未发生死亡, 说明疫苗安全性良好。 0040 2. 疫苗超剂量接种试验猪的安全性试验 0041 用猪乙型脑炎灭活疫苗 (P3 株 ), 。
19、对仔猪分别经肌肉注射 2 倍 ( 即 2ml, 含 2 头份 疫苗 ) 和 5 倍 ( 即 5ml, 含 5 头份疫苗 ) 使用剂量, 观察 14 日并记录。结果表明, 肌肉注射 2 倍和 5 倍剂量猪乙型脑炎灭活疫苗 (P3 株 ), 采食、 体温等无异常反应, 与空白对照组猪采 食与健康状况无明显差异。说明此疫苗超剂量注射试验猪安全。 0042 实施例 7 本发明猪乙型脑炎灭活疫苗的动物学免疫实验 说 明 书 CN 102949715 A 5 4/4 页 6 0043 3 批疫苗猪乙型脑炎灭活疫苗按照免疫程序免疫仔猪, 1ml/ 头份 (1ml/ 只 ) 后, 14 日开始产生抗体, 28。
20、 日抗体达到高峰, 随后下降, 接种后 6 个月仍保持在保护性抗体水平以 上。( 图 1) 0044 猪乙型脑炎灭活疫苗使用 - 丙内酯灭活, 可降低灭活剂残留。使用铝胶作为佐 剂, 可降低副反应发生率, 同时便于免疫时注射操作。 该疫苗安全、 有效, 是目前猪用疫苗中 的高端疫苗, 能够有效预防猪乙型脑炎病毒的感染。 0045 虽然, 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述, 但在 本发明基础上, 可以对之作一些修改或改进, 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此, 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进, 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 102949715 A 6 1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 102949715 A 7 。