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1、(10)申请公布号 CN 102952757 A (43)申请公布日 2013.03.06 CN 102952757 A *CN102952757A* (21)申请号 201210415385.9 (22)申请日 2012.10.26 CCTCC No: M 2012364 2012.09.19 C12N 1/14(2006.01) A61K 36/06(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 31/10(2006.01) A01N 63/04(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 云南大学 。
2、地址 650091 云南省昆明市翠湖北路 2 号云 南大学 (72)发明人 吴少华 苗翠苹 陈有为 (54) 发明名称 一株滇牡丹内生拟茎点霉菌 (57) 摘要 本发明涉及微生物技术领域， 特别是涉及 一种具有广谱抗菌活性的微生物菌株。本发明 所述的滇牡丹内生拟茎点霉菌命名为拟茎点霉 菌 YE3250（Phomopsissp.YE3250） ，现 保 藏 在 国家知识产权局指定的保藏单位， 保藏编号为 CCTCCNO ： M2012364。本发明首次从滇牡丹植物 （Paeoniadelavayi） 中分离获得拟茎点霉类型的 内生真菌， 并发现拟茎点霉菌 YE3250 对 2 种革兰 氏阳性细菌。
3、、 1 种革兰氏阴性细菌、 2 种人体致病 真菌和4种植物病原真菌， 共9种病原微生物具有 较明显的抑制生长作用。本发明目的是利用植物 内生真菌资源， 通过发酵以求获得医用或农用的 新型天然抗菌药物活性成分。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 一 种 滇 牡 丹 内 生 拟 茎 点 霉 菌， 其 特 征 在 于 ： 命 名 为 拟 茎 点 霉 菌 YE3250 （Phom。
4、opsissp. YE3250） ， 现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位， 保藏编号为 CCTCC No ： M 2012364。 2. 根据权利要求 1 所述的滇牡丹内生拟茎点霉菌， 其特征在于 ： 其 ITS rDNA 基因组由 558 个碱基组成， 序列如下 ： 1 AGAAATGGCT GGACGCGCTT CGGCGCACCC AGAAACCCTT TGTGAACTTA 51 TACCTTTTAG TTGCCTCGGC GTCAGGCCGG CCCCCTAGGG GCCCCTCGGA 101 GACGAGGAGC AGGCCCGCCG ACGGTACACC AAACTCTTGT T。
5、TTTACACTG 151 AAACTCTGAG AAACAAACAT AAATGAATCA AAACTTTCAA CAACGGATCT 201 CTTGGTTCTG GCATCGATGA AGAACGCAGC GAAATGCGAT AAGTAATGTG 251 AATTGCAGAA TTCAGTGAAT CATCGAATCT TTGAACGCAC ATTGCGCCCT 301 CTGGTATTCC GGAGGGCATG CCTGTTCGAG CGTCATTTCA ACCCTCAAGC 351 CTGGCTTGGT GATGGGGCAC TGCTTCCGAG AGGGGGCAGG CCCTGA。
6、AATC 401 TAGTGGCGAG CTCGCCAGGA CCCCGAGCGC AGTAGTTAAA CCCTCGCTCT 451 GGAAGGCCCT GGCGGTGCCC TGCCGTTAAA CCCCCAACTT CTGAAAATTT 501 GACCTCGGAT CAGGTAGGAA TACCCGCTGA ACTTAAGCAT ATCAATAAGG 551 CGGAGGA。 3. 根据权利要求 1 所述的滇牡丹内生拟茎点霉菌的用途， 其特征在于 ： 用于制备抗菌 药物。 权 利 要 求 书 CN 102952757 A 2 1/3 页 3 一株滇牡丹内生拟茎点霉菌 技术领域 000。
7、1 本发明涉及微生物技术领域， 特别是涉及一种具有广谱抗菌活性的微生物菌株。 背景技术 0002 滇牡丹 (Paeonia delavayi Franch.) 属芍药科芍药属牡丹组植物， 为中国西南 地区特有种， 其性寒、 味酸辛， 根皮用于清热凉血 , 治吐血、 尿血、 血痢、 痛经等， 也被用作丹 皮药用， 可抑制中枢神经系统， 有扩张冠状血管， 降压、 抑菌、 抗炎、 抗凝血等功能。 我们从生 长在云南省嵩明县的滇牡丹植物中分离获得了内生真菌， 并进行了形态鉴定和抗菌活性的 筛选 （苗翠苹等，中国药学杂志， 2011，46， 738） 。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种分离。
8、自中国云南省嵩明县滇牡丹 (Paeonia delavayi Franch.) 植物活体中具有广谱抗菌活性的微生物菌株 ： 滇牡丹内生拟茎点霉菌。 0004 本发明所述的滇牡丹内生拟茎点霉菌系从中国云南省嵩明县滇牡丹植物活体中 分离获得。 现在国家知识产权局认可的保藏单位保藏， 保藏单位名称 ： 中国典型培养物保藏 中心， 简称 ： CCTCC， 保藏单位地址 ： 中国， 武汉大学， 邮政编码 ： 430072。保藏日期为 2012 年 9 月 19 日， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2012364。 0005 本发明所述的滇牡丹内生拟茎点霉菌命名为拟茎点霉菌 YE3250（Phom。
9、opsis sp. YE3250） ， 现保藏在国家知识产权局认可的保藏单位， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2012364。 0006 菌株 YE3250 的固体培养特征 ： 1、 PDA培养基上菌落生长迅速， 28培养7天， 菌落直径达7.5 cm， 菌丝灰白色， 生长松 散， 呈辐射状， 边缘整齐。培养 15 天后， 在培养基表面出现载孢体， 载孢体基内生长， 成熟后 位于培养基表面。 0007 2、 查氏培养基上菌落生长较慢， 28培养 10 天， 菌落直径达 8.1 cm， 中间向上鼓 起， 白色绒状， 菌落灰白色， 边缘整齐。培养 15 天无载孢体产生。 0008 3、 麦。
10、芽汁培养基上菌落生长最慢， 28培养 12 天， 菌落直径达 7.9 cm， 菌丝较 薄， 生长较为松散， 四周菌丝匍匐状， 表面灰白色， 边缘整齐。培养 15 天无载孢体产生。 0009 菌株 YE3250 的显微形态特征 ：（见图 1、 图 2、 图 3） 菌丝生长旺盛， 交织生长， 透明有隔， 有核。取子座剖开后压片观察， 有 、 两种分生 孢子， 分生孢子梗无色， 单枝至合轴分枝， 分生孢子无色， 油球一般为2个， 分生孢子无 色， 一端为钩型， 单胞。 0010 菌株 YE3250 的分子生物学特征 ： 采用分子生物学 PCR 技术， DNA 序列测定分析， 菌株 YE3250 的 。
11、ITS rDNA 基因组由 558 个碱基 （bp） 组成。以 ITS rDNA 序列为基础构建系统发育树， 该菌为拟茎点霉属 （见图 4） 。 0011 菌株 YE3250 的液体发酵培养 ： 1、 PDB 培养基摇瓶培养 7 天， 培养温度 282。 说 明 书 CN 102952757 A 3 2/3 页 4 0012 2、 发酵培养特征 ： 培养第 1 天， 有零星的白色菌丝点出现 ； 培养第 3 天， 发酵液中 白色菌丝增多， 有少量菌丝帖壁 ； 培养第 5 天， 发酵液菌丝体密集， 菌丝体呈灰白色 ； 培养第 7 天， 发酵液菌丝体密集成块状， 呈灰白色， 发酵液粘稠。 0013 。
12、菌株 YE3250 的发酵工艺 ： 活化菌种 （PDA 培养基， 282， 培养 7 天） 制备种子液 （PDB培养基， 282， 摇床200 r/min， 培养3-4天） 液体发酵 （按 5% 接种量， PDB 培养基， 282， 摇床 200 r/min， 培养 7 天） 。 0014 上述发酵工艺中 PDB 培养基 （马铃薯葡萄糖液体培养基） 的制备 ： 取新鲜马铃薯 200 克， 去皮切成小块， 加水 1 升煮沸 30 分钟， 过滤， 滤液加水补足至 1 升， 加入葡萄糖 20 克， pH 自然。 0015 上述培养基中加入 15 克琼脂， 即为 PDA 培养基。 0016 发酵完毕，。
13、 加入等体积 95% 乙醇浸提 48 小时， 过滤， 将滤液浓缩至干， 加入无菌水 制得抗菌发酵液制品。 0017 本发明所述的菌株 YE3250 的抗菌活性试验 ： 1、 病原指示菌共 14 株 ： 革兰氏阳性细菌包括 ： 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、 藤 黄 八 叠 球 菌 （Sarcina lutea） 、 枯 草 芽 孢 杆 菌 （Bacillus subtilis） ； 革 兰氏阴性细菌包括 ： 大肠杆菌 (Escherichia coli)、 铜绿色假单孢菌 (Pseudomonas aeruginosa) ； 人体致病真菌包括 ： 白色念珠菌 。
14、(Candida albicans)、 星形石膏样毛癣菌 (Trichophyton gypseum)、 紧密单孢枝霉 (Hormodendrum compactum) ； 植物病原真菌包 括 ： 稻瘟霉 （Pyricularia oryzae） 、 灰葡萄孢 （Botrytis cinerea） 、 禾谷镰刀菌 （Fusarium graminearum） 、 燕 麦 镰 孢 （Fusarium avenaceum） 、 玉 蜀 黍 长 蠕 孢 (Helminthosporium maydis)、 黑曲霉 (Aspergillus niger)。 0018 2病原指示菌培养基 ： 细菌类指示。
15、菌采用牛肉膏蛋白胨培养基 ； 人体致病真菌类 指示菌采用沙氏培养基 ； 植物病原真菌类指示菌采用 PDA 培养基。 0019 3内生真菌的培养 ： 将滇牡丹内生拟茎点霉菌株 YE3250 接入含 7 mL PDB 液体培养基的三角瓶中， 置于 282， 摇床 200r/min 培养 7 天， 加入等体积 95% 乙醇浸提 48 小时， 过滤， 将滤液浓缩至 干， 加入无菌水制成浓度为 1mg/ml 的发酵液样品备用。 0020 4抗菌活性的测定 ： 采用滤纸片扩散法 (Barry A L et al, J. Clin. Microbiol.,1979, 10, 885) 测定 对14种病原微生。
16、物的抑制生长活性， 滤纸片直径为10mm。 在无菌条件下分别取供试指示菌 悬液 0.2mL， 加入相应的固体培养基制成含菌平板， 然后取蘸有发酵液样品的无菌滤纸片放 入平板内， 细菌和人体致病真菌置于 371， 植物致病真菌置于 281， 培养 48h 后， 分 别测量抑菌圈直径大小， 结果见图 5。 0021 本发明首次从滇牡丹植物 （Paeonia delavayi） 中分离获得拟茎点霉类型的内生 真菌， 确定为拟茎点霉菌 （Phomopsis sp.） ， 发现该菌对 2 种革兰氏阳性细菌、 1 种革兰氏阴 性细菌、 2 种人体致病真菌和 4 种植物病原真菌， 共 9 种病原微生物具有比。
17、较明显的抑制生 长作用。本发明利用植物内生真菌资源， 通过发酵获得农用或医用新型天然抗菌药物活性 成分。 说 明 书 CN 102952757 A 4 3/3 页 5 附图说明 0022 图 1 为本发明所述的拟茎点霉菌 YE3250 的分生孢子梗显微形态图 （400X） 。 0023 图 2 为本发明所述的拟茎点霉菌 YE3250 的分生孢子显微形态图 （400X） 。 0024 图 3 为本发明所述的拟茎点霉菌 YE3250 的菌丝显微形态图 （400X） 。 0025 图 4 为本发明所述的拟茎点霉菌 YE3250 及其相近种的系统发育树图。 0026 图 5 为本发明所述的拟茎点霉菌 。
18、YE3250 的抑菌活性结果 （抑菌圈直径） 。 具体实施方式 0027 实施例 ： 拟茎点霉菌 YE3250 菌株是通过发酵获得农用或医用新型天然抗菌药物活性成分的微 生物药源。 0028 取 YE3250 菌种， 在无菌条件下用接种针挑取少量菌丝， 接种于装有已灭菌的 PDA 培养基试管中， 置培养箱内于282活化培养7天， 备用。 在无菌条件下， 将活化好的菌种 以相同方法接入已灭菌的 PDB 培养基中， 在 282培养 3-4 天， 即为 YE3250 菌株的种子 液。 0029 将配制好的 PDB 培养基 100ml 装入 500ml 三角瓶内， 121灭菌 30 分钟备用。取 YE。
19、3250菌株的种子液， 在无菌条件下接种于装有100ml PDB培养基的500ml三角瓶内， 接种 量按 5%（v/v） 计， 置于 282摇床 （200 r/min） 培养 7 天， 期间注意检查有无染菌现象。 0030 发酵完毕， 向发酵液中加入等体积95 %乙醇浸提48小时， 过滤， 将滤液浓缩至干， 加入无菌水即制成抗菌发酵液样品。 说 明 书 CN 102952757 A 5 1/1 页 6 本发明所述的拟茎点霉菌 YE3250 的 ITS rDNA 基因组由 558 个碱基 （bp） 组成， 其序列 如下 ： 1 AGAAATGGCT GGACGCGCTT CGGCGCACCC A。
20、GAAACCCTT TGTGAACTTA 51 TACCTTTTAG TTGCCTCGGC GTCAGGCCGG CCCCCTAGGG GCCCCTCGGA 101 GACGAGGAGC AGGCCCGCCG ACGGTACACC AAACTCTTGT TTTTACACTG 151 AAACTCTGAG AAACAAACAT AAATGAATCA AAACTTTCAA CAACGGATCT 201 CTTGGTTCTG GCATCGATGA AGAACGCAGC GAAATGCGAT AAGTAATGTG 251 AATTGCAGAA TTCAGTGAAT CATCGAATCT TTGAACG。
21、CAC ATTGCGCCCT 301 CTGGTATTCC GGAGGGCATG CCTGTTCGAG CGTCATTTCA ACCCTCAAGC 351 CTGGCTTGGT GATGGGGCAC TGCTTCCGAG AGGGGGCAGG CCCTGAAATC 401 TAGTGGCGAG CTCGCCAGGA CCCCGAGCGC AGTAGTTAAA CCCTCGCTCT 451 GGAAGGCCCT GGCGGTGCCC TGCCGTTAAA CCCCCAACTT CTGAAAATTT 501 GACCTCGGAT CAGGTAGGAA TACCCGCTGA ACTTAAGCAT ATCAATAAGG 551 CGGAGGAA 序 列 表 CN 102952757 A 6 1/4 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102952757 A 7 2/4 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 102952757 A 8 3/4 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 102952757 A 9 4/4 页 10 图 5 说 明 书 附 图 CN 102952757 A 10 。