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1、(10)申请公布号 CN 102952762 A (43)申请公布日 2013.03.06 CN 102952762 A *CN102952762A* (21)申请号 201110248701.3 (22)申请日 2011.08.26 C12N 1/20(2006.01) A01N 63/00(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 青岛群恒生物科技有限公司 地址 266071 山东省青岛市文登路 9 号等侧 一层 156 室 (72)发明人 不公告发明人 (54) 发明名称 防治植物真菌病害的多粘类芽袍杆菌及其生 产方法 。
2、(57) 摘要 本发明涉及株防治植物真菌病害的多粘类芽 抱杆菌及其生产方法， 属于生物农药技术领域。 本 发明采用的菌株是多粘类芽抱杆菌 EBL 一 06 菌 株， 分离自小麦叶面， 保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号 ： CGMCC No.2377。该菌株可以防治植物多种真菌病害， 提 高作物产量 C 本发明利用味精废水来发酵多粘类 芽抱杆菌， 制备生防菌剂， 该下艺生产的多粘类芽 抱杆菌生防剂能有效防治多种植物真菌病害， 并 且生产成本低廉， 操作简单， 还可以有效利用味精 废水， 减少环境污染。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (1。
3、9)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1.一株具有防治植物病害作用的多粘类芽抱杆菌 （Paenibaclllus polymyxa ) ， 其特 征在于 ： 该多粘类芽抱杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏 编号 ： CGMCC No . 2377 。 2. 权利要求 1 所述的多粘类芽抱杆菌， 其特征在于 ： 该菌株在 POA 培养基上生长良 好， 单个菌落呈半玻璃珠状， 边缘整齐， 表面粘稠， 与培养基结合紧密， 菌落中心乳黄色， 菌 体杆状， 革兰氏染色显阳性， 芽抱端生， 包囊膨人 ； 该菌株。
4、的165 rDNA 基因的部分序列己递 交到 GenBank 数据库， 登录号为 EF545556 。 3. 用权利要求上所述多粘类芽抱杆菌来制备抗植物病害生防剂的生产方法， 其特征在 于 ： 在主要成分为味精废水的培养基中接种权利要求 1 所述的多粘类芽抱杆菌。 4. 权利要求 3 所述的生产方法， 其特征在于 ： 将味精废水用水稀释 5 一 15 倍， 调节 pH 为5 一7 ， 高压灭菌， 接种权利要求1 所述的多粘类芽抱杆菌， 于25 一35 ， 通无菌 空气培养 24 一 72 小时。 权 利 要 求 书 CN 102952762 A 2 1/3 页 3 防治植物真菌病害的多粘类芽袍。
5、杆菌及其生产方法 0001 本发明属于生物农药技术领域。 背景技术 0002 根据味精生产过程中废水所含污染物情况可分成三类 ： 一是高浓度高酸度有机废 水即离交尾液 ； 二是其它中高浓度有机废水 ； 三是不需处理直接外排的冷却降温水。离交 尾液是通过离子交换法提取谷氨酸后剩余的 “废液” ， 它既含有丰富的有机质， 还含有 N 、 P 、 K 等少量无机敖及其它微量元素， 这些物质都可为微生物生长提供营养。 其它中高浓度有 机废水包括 ： 淀粉废水、 制糖废水、 发酵洗灌废水、 精制废水等。淀粉废水和制糖废水除了 含有一定的有机污染物质外， 还有一些悬浮物质 ； 发酵洗灌废水与离交尾液所含成。
6、分基本 相同， 只是含量较低 ； 精制废水有时呈酸性， 有时呈碱性， 有机物污染物质含量较高， 这些有 机废水也是微生物资源开发比较理想的营养来源之一。但是， 这些废水如果得不到合理利 用， 不仅会对环境造成严重污染， 而且使资源白白浪费掉。 文献报导味精废水造成较大环 境污染， 如中国环境生态网上指出 2005 年全国味精生产厂家 230 余家， 年排放废水 17 万 吨， 绝大多数未经治理直接排放迪处兰迎巡 eedu . org . cn / Article / es / envir / ptheory / water / 200511 / 6456 . html ） 。 中国专利 （公开。
7、号 ： CN 1916155A ） 中公开了 一种利用味精废水制备发酵培养基及生产生物农药灰色链霉菌的方法， 目前， 众多味精废 水处理技术大致分为两步， 一是提取废水中的谷氨酸菌体单细胞蛋自， 通过此步分离菌体， 约可除去 30 左右的 COD ， 常用物化方法进行处理 （如絮凝、 离心等方法） ； 二是提取菌体 后废液的处理， 使其达到排放标准或处理后用于工厂回用， 这也是众多味精废水处理技术 所面临的关键问题， 常采用生物处理方法 （如厌氧发酵、 生物膜法， SBR 法等） 。 0004 多 粘类芽饱杆菌 （Paenibacillus pol 卿 yxa ） 在自然界中分布广泛， 是一种。
8、重要的生防菌， 对多种植物真菌、 细菌病害均有较好的防治作用。王智文等报道了一株多粘类芽抱杆菌 cp 一 5316 菌株对动植物真菌、 细菌病原物具有广谱抗性， 利用大孔吸附树脂对多粘类抱杆菌 Cp 一 5316 产生的抗真菌活性物质的吸附、 解吸性能， 筛选出其最佳解吸剂， 该活性物质对 热、 紫外线稳定， 对胰蛋白酶、 蛋白酶 K 有一定的耐受性， 对氯仿部分敏感， 对酸稳定， 对碱 敏感 （王智文， 袁士涛， 何亮等， 多粘类芽抱杆菌 cp 一 5316 抗真菌活性物质的提取及其部 分性质研究， 农业环境科学学报， 2007 , 26 ( 4 ) : 1464 一1468 ） 。 中国专。
9、利 （授权公告 号 ： cN 1 1 69942c ） 中报导培养的 Paenibacillus pol 卿及其发酵上清液可以用来防止 植物细菌性青枯病， 而且还可用来防治植物苗期立枯病， 碎倒病， 以及黄瓜枯萎病， 番茄枯 萎病， 茄子枯萎病， 大豆根腐病， 并且对植物具有十分明显的促进生长作用。 中国专利 （授权 公告号 ： cN 1 186441c ） 中公开了 Paenibacillus p 川 ymyxa 可以作为微生物肥料菌剂 中的一种成分分解秸秆， 有效解决农业生产中一方面农业垃圾过多， 污染水体和环境， 处理 困难， 另一方面化肥， 农药使用过多， 土壤恶化 cN 1 0 1 。
10、5 1 9639B 说明书2 / / 3 页的矛盾。 中国专利 （授权公告号 ： CN 1325635C ） 中公开了 Paenibacillus pol 卿 yxa Jaas cd 刚以在较低的浓度卜进入植物体内， 井能 在植物体内定植， 繁殖和传导 ； 对植物同时具有促进生长， 提高产量， 防病抗病的作用， 特别 说 明 书 CN 102952762 A 3 2/3 页 4 是对土传维管束病害具有良好的防治效果。 0 005 多粘类芽抱杆菌生防剂的生产方法 有多种， 如 ； 中国专利 （公开号 ： CN 1844360A ） 中公开了一种多粘类芽抱杆菌的生产方法， 其培养基为豆渣。中国专利。
11、 （授权公告号 ： CN 1 186441C ） 中使用厄肉培养基作为多粘类 芽抱杆菌发酵培养基。 以味精废水为培养基生产多粘类芽抱杆菌生防剂的方法未见文献报 道。 发明内容 0003 本发明的日的是提供一种能够在植物叶际与根际定植， 并且对多种病原菌具有 拮抗作用的生防菌 多粘类芽抱杆菌 EBL 一 06 菌株， 同时提供一种利用味精废水生产 该生防菌剂的方法。 本发明所提供的生防菌株是由我们实验室从小麦的叶面上分离筛 选出来的。将其编号为 EBL 一 06 ， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心， 保藏日期为二零零八年二月二十六日， 分类命名为多粘类芽抱杆菌 （Paenib。
12、acillus polymyxa ） 。 保藏编号为 ： CGMCC No . 2377 。 该菌株具有下列性质 ： l 菌落形态特征 该 菌株在 PDA 培养基上生长良好， 单个菌落呈半玻璃珠状， 边缘整齐， 表面粘稠， 与培养基结 合紧密， 菌落中心乳黄色。 2 菌体形态特征菌体杆状， 革兰氏染色显阳性， 芽抱端生， 包囊 膨大。 3 碳源利用能力可以利用碳源 ： Q 一环式糊精 ； 肝糖 ； D 一葡糖胺酸 ； 衣康酸 ； D 一半 乳糖酸 Y 一内醋 ； D 一半乳糖醛酸 ； 2 一环式糊精 ； 肝糖 ； D 一葡糖胺酸 ； 衣康酸 ； D 一半 乳糖酸 Y 一内醋 ； D 一半乳糖醛。
13、酸 ； 2 一轻基苯甲酸 ； 4 一轻基苯甲酸 ； L 一精氨酸 ； L 一 天门冬酞胺 ； L 一丝氨酸 ； 甘氨酞一 L 一谷氨酸 ； D 一木糖 ； D 一甘露醇 ； 苯乙胺。不可利 用碳源 ： 丙酮酸甲酷 ； D 一纤维二糖 ； p 一甲基一 D 一葡萄糖昔 ； i 一赤醉糖醇 ； N 一乙酞 一 D 葡萄糖氨 ； D , L 一 u 一磷酸甘油 ； u 一丁酮酸 ； Y 一经丁酸 ； L 一苯丙氨酸 ； L 一苏 氨酸 ； 腐胺。 对真菌拮抗能力菌株在 PDA 固体培养基上表现出对灰葡萄抱霉、 黄瓜黑星 病的病原菌原菌、 木霉菌等的高效拮抗效果。 5 0 021 2 、 液体种子制备。
14、 ： 向高压灭 菌的土显液体培养基中， 接种多粘类芽抱杆菌， 十 25 一 35oC , ZOOr / min 培养， 得到液 体种子。 002 幻 4 、 液态发酵 ： 向经过预处理的废水中接种 5 % （体积） 的液体种子， 于 25 一 35 ， 通无菌空气培养 24 一 72 小时。 0 。2315 、 后处理 ： 培养好的发酵液经 细菌计数后， 调节至 1 08 一 1 口。cell / ml ， 包装使用。 0004 具体实施方式 0 。 24 由本发明技术方案生产的多粘类芽抱杆菌生防剂能够 高效防治多种真菌类植物病害， 而且无公害， 生产成本低， 并且有效地利用了味精废水。以 下。
15、通过具体实施例详细说明本发明的实施， 目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实 质， 但不作为对本发明实施范围的限定。 0 。 25 实施例1 ： 多粘类芽抱杆菌生物农药制 备 0026 种子培养基制备 ： 称取 2009 土豆， 切碎， 于儿自来水中煮沸 30 分钟， 过滤除 去残渣， 加入209 葡萄糖， 定容至IL ， 即得土豆培养基。 分装入5 个lL 的三角瓶中， 121oC 火菌 20min 。 0 。27 发酵培养基制备 ： 经过絮凝除去细菌蛋白的味精废水比加入 gL 自来水稀释， 并用氢氧化钠调节 pH 至 6 . 0 。 0 。25 液体种子制备 ： 向土豆液体培 养基中接种。
16、多粘类芽抱杆菌， 于 30 ， 摇瓶 ZO0r / min ， 恒温摇床振荡培养 24 小时， 得 到液体种子。 0 。29 发酵产品 ： 将上述发酵培养基装罐到 10L 的发酵罐中， 121 火菌巧 min ， 按照 5 的接种量接种液体种子， 在 30 恒温， 通无菌空气的条件下， 发酵 2 至 3 天， 取样计数后， 无菌条件下分装。 0 。30 实施例 2 ： 对多种病原真菌的拮抗 说 明 书 CN 102952762 A 4 3/3 页 5 作用 0 031 菌株在 PDA 固体培养基平板中心处接种直径为 1 cm 的病原真菌， 在距离 病原真菌菌落边缘 Zcm 处接种 （点接） 活。
17、化好的多粘类芽抱杆菌， 第 6 天观察抑菌圈大小， 发现对病原真菌灰葡萄抱霉 （Bot 翔 tis cinerea ） 、 黄瓜黑星病的病原菌 （Cladosporium sp . ） 和木霉 ( T richoderma sP . ） 等都具有显著的拮抗作用。 0 。32 实施例 3 ： 对黄瓜黑星病防治效果 0 。33 温室盆钵中的黄瓜苗长至四片真叶时， 用 107 / m1 多粘类芽抱杆菌菌液喷雾处理叶片一次， 间隔 l 天后接种黑星病原菌， 再间隔 l 天后喷施 l 了 ml 多粘类芽抱杆菌菌液一次， 以清水代替多粘类芽抱杆菌菌液喷雾的黄瓜苗为对 照， 连续调查黄瓜苗的病情， 发现多粘类芽抱杆菌处理对黄瓜黑星病有明显的防治效果。 说 明 书 CN 102952762 A 5 。