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1、(10)申请公布号 CN 102892443 A (43)申请公布日 2013.01.23 CN 102892443 A *CN102892443A* (21)申请号 201180017765.0 (22)申请日 2011.03.30 10158592.5 2010.03.31 EP 61/319,274 2010.03.31 US A61L 31/10(2006.01) A61L 31/16(2006.01) (71)申请人 巴斯夫欧洲公司 地址 德国路德维希港 (72)发明人 T萨布科夫斯基 U维克特 (74)专利代理机构 北京市中咨律师事务所 11247 代理人 黄革生 林柏楠 (54)。
2、 发明名称 涂覆的支架和用蛋白涂覆的方法 (57) 摘要 一种涂覆可植入构件例如支架的方法， 通过 使用包含至少一种疏水蛋白衍生物 (H)、 水和其 它组分的组合物致使得到可长时间使用的植入 物。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.09.29 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2011/054887 2011.03.30 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/121009 EN 2011.10.06 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页。
3、 说明书 9 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种涂覆可植入构件 (I) 的方法， 其包括用组合物处理所述可植入构件 (I) 的表面 的步骤， 所述组合物包含至少一种疏水蛋白衍生物 (H)。 2. 权利要求 1 所述的涂覆可植入构件 (I) 的方法， 特征在于所述可植入构件 (I) 是支 架， 并且用包含至少一种疏水蛋白衍生物 (H) 和至少一种其它组分 (F) 的组合物处理所述 表面。 3. 权利要求 1 和 2 中任意一项所述的涂覆可植入构件 (I) 的方法， 其中所述组合物包 含至少一种疏水蛋白衍生物 (H) 和水， 并且可能包含其它组分 (F)， 其中基于全部组合物， 疏水蛋白。
4、衍生物 (H) 的量为 0.0001-20 重量。 4. 权利要求 1 至 3 中任意一项所述的涂覆可植入构件 (I) 的方法， 其中所述可植入 构件 (I) 是支架， 所述支架被包含至少一种疏水蛋白衍生物 (H)、 水并且可能包含其它组分 (F) 的组合物处理， 其中基于全部组合物， 疏水蛋白衍生物 (H) 的量为 0.001-10 重量。 5. 权利要求 1 至 4 中任意一项所述的涂覆可植入构件 (I) 的方法， 其中将组合物应用 至可植入构件 (I) 的表面， 所述组合物包含疏水蛋白衍生物 (H)、 水和至少一种其它药学活 性化合物 (D)。 6. 权利要求 1 至 5 中任意一项所述。
5、的涂覆可植入构件 (I) 的方法， 其中将组合物应用 至可植入构件 (I) 的表面， 所述组合物包含疏水蛋白衍生物 (H)、 水和作为其它药学活性化 合物 (D) 的选自肝素、 抗生素和细胞抑制化合物的化合物。 7. 权利要求 1 至 6 中任意一项所述的涂覆可植入构件 (I) 的方法， 其中使用的疏水蛋 白衍生物 (H) 是融合疏水蛋白或其衍生物。 8. 权利要求 1 至 7 中任意一项所述的涂覆可植入构件 (I) 的方法， 其中将包含至少一 种疏水蛋白衍生物 (H) 的组合物于 4至 95的温度下、 在 0.01 小时至 48 小时的时间内 应用至可植入构件 (I) 的表面。 9. 一种涂。
6、覆的可植入构件 (I)， 其具有至少部分被疏水蛋白衍生物 (H) 处理的表面。 10. 一种涂覆的可植入构件 (I)， 其通过权利要求 1 至 8 中任意一项所述的方法用疏水 蛋白衍生物 (H) 至少部分表面涂覆。 11. 权利要求 10 所述的涂覆的可植入构件 (I)， 其中可植入构件 (I) 是支架， 尤其是胆 管支架。 12.用于涂覆可植入构件(I)的组合物， 其中所述组合物包含0.0001至20重量的疏 水蛋白 (H) 和 99.999 至 80 重量的其它组分 (F)。 13. 用于涂覆权利要求 11 所述的可植入构件 (I) 的组合物， 其中所述组合物包含至少 0.001 至 10。
7、 重量的至少一种疏水蛋白衍生物 (H)、 至少 50 重量的水和可能有的其它组 分 (F)。 14. 疏水蛋白衍生物 (H) 用于涂覆可植入构件 (I) 的用途。 15. 疏水蛋白衍生物 (H) 用于涂覆支架的用途。 权 利 要 求 书 CN 102892443 A 2 1/9 页 3 涂覆的支架和用蛋白涂覆的方法 0001 本 发 明 涉 及 涂 覆 的 (coated) 医 疗 装 置 例 如 可 植 入 构 件 (implantable structures) 例如支架， 以及用蛋白涂覆可植入构件、 例如支架和其它医疗装置的新方 法。本发明还涉及用含有特定蛋白疏水蛋白 ( 单独的 ) 或。
8、与其它组分例如肝素组合的疏 水蛋白的组合物涂覆医疗装置例如支架、 吻合装置 (anastomotic device) 和血管周包物 (perivascular wrap) 的方法。 0002 许多可植入构件例如支架是已知的， 尤其是胆管支架。塑料和金属的支架被用于 各种目的， 但是仍无法得到具有低生产成本、 持久功能以及使用和更换易于操作的高质量 支架。 0003 本发明涉及医疗装置例如可植入构件 (I)， 其涂覆有疏水蛋白， 并且在一个具体 的实施方案中， 其可用于例如药物或药物组合的局部递送， 例如用于预防和治疗血管疾 病。本发明还涉及医疗装置， 包括涂覆有疏水蛋白的支架、 吻合装置、 血。
9、管周包物、 缝合线 (sutures) 和钉 (staples)。这些医疗装置可以用于治疗和预防疾病， 并且最小化或基本消 除生物体对医疗装置引入到生物体内的反应。此外， 所述涂覆的装置可以用于促进愈合和 内皮化。 0004 本发明还涉及医疗装置尤其是可植入构件例如支架的涂料(coatings)。 本发明还 包括用于控制可植入医疗装置的药物、 活性剂和 / 或化合物的流出速度的涂料。本发明还 涉及用于药物的局部递送的药物递送系统， 例如用于治疗血管疾病。本发明还涉及涂覆的 医疗装置例如可植入构件， 其具有固定在其上的疏水蛋白和药物， 用于治疗疾病。 0005 疏水蛋白及其衍生物是具有大约 10。
10、0-150 个氨基酸的小蛋白， 其存在于丝状 真菌如裂褶菌 (Schizophyllum commune) 中。它们通常在分子中具有 8 个半胱氨酸单 元 (Cys)。疏水蛋白是真菌来源的最具表面活性的蛋白。疏水蛋白含有不同的氨基酸序 列， 其通过形成四个二硫键在它们的基本序列中共享八个 Cys 残基的特征模式。已知通 过 Cys 残基形成的二硫键解释为防止在溶液中自发自组装的在亲水 - 疏水界面处的控 制装置。已经发现这些蛋白对于地面生长 ( 例如， 气生菌丝、 孢子和子实体例如蘑菇 ) 和 真菌附着在固体支持物上是重要的。疏水蛋白相当稳定， 能够忍受接近于水的沸点的温 度。疏水蛋白能够从天。
11、然源中分离得到， 但是它们还能够通过重组法获得， 例如公开于 WO2006/082251 或 WO2006/131564 中的那些。现有技术已经提出几种疏水蛋白在不同应用 中的用途。WO1996/41882 公开了疏水蛋白作为乳化剂和稠化剂用于亲水化疏水表面的用 途。还已公开使用疏水蛋白作为反乳化剂， 参见 WO2006/103251 中 ； 作为蒸发阻滞剂， 参见 WO2006/128877 ； 或作为污损抑制剂， 参见 WO2006/103215。WO2006/082253 和 EP-A1252516 中描述了疏水蛋白衍生物从水溶液沉积到不同表面的方法， 所述表面例如塑料聚合物表 面、 玻。
12、璃、 金属表面、 自然表面例如皮革、 棉和纸。 0006 本发明涉及用疏水蛋白涂覆医疗装置。 本发明一个具体方面涉及涂覆可植入构件 (I)的新方法， 其包括使用含有至少一种疏水蛋白衍生物(H)的组合物处理可植入构件(I) 的表面的步骤。 0007 本发明还涉及涂覆可植入构件(I)的方法， 特征在于可植入构件(I)是支架， 并且 说 明 书 CN 102892443 A 3 2/9 页 4 使用包含至少一种疏水蛋白衍生物 (H) 和至少一种其它组分 (F) 的组合物处理所述表面。 0008 本发明还涉及涂覆可植入构件 (I) 的方法， 其中所述组合物包含至少一种疏水蛋 白衍生物(H)和水、 以及。
13、可能有的其它组分(F)， 其中基于全部组合物， 疏水蛋白衍生物(H) 的量为 0.0001-20 重量， 通常为 0.001-10 重量。在可植入构件 (I) 的表面上， 疏水蛋 白衍生物的量通常为 0.1-10mg/m2。 0009 其它组分可以是例如聚合物添加剂、 溶剂、 缓冲剂、 药学活性物质和 / 或辅助剂。 术语辅助剂包括药学可接受、 无生理活性的成分， 例如粘合剂、 填充剂和形成涂层的化合 物。任选的辅助赋形剂的其它实例是抗粘附剂、 防腐剂、 助流剂、 润滑剂和吸附剂。合适的 物质是本领域已知的。 0010 通常， 所述组合物是水基 (water-based) 组合物。本发明还涉及。
14、涂覆可植入构件 (I) 的方法， 其中所述可植入构件 (I) 是用包含至少一种疏水蛋白衍生物 (H)、 水和可能有 的其它组分 (F) 的组合物处理的支架， 其中， 基于全部组合物， 疏水蛋白衍生物 (H) 的量为 0.001-10 重量。 0011 本发明还涉及涂覆可植入构件 (I) 的方法， 其中将组合物应用至所述可植入构件 (I) 的表面， 所述组合物包含疏水蛋白衍生物 (H)、 水和至少一种其它药学活性化合物 (D)。 所述方法可以包括其它步骤例如清洁和加水 (watering) 步骤。本发明还涉及涂覆可植入 构件(I)的方法， 其中将组合物应用至所述可植入构件(I)的表面， 所述组合。
15、物包含疏水蛋 白衍生物 (H)、 水和作为其它药学活性化合物 (D) 的一种或多种化合物， 所述化合物选自肝 素、 抗生素(例如氨苄西林或舒巴坦或左氧氟沙星)和细胞抑制化合物(例如alkylantia、 抗代谢物、 有丝分裂抑制剂或激素)。 疏水蛋白和肝素以及其衍生物(例如依诺肝素)的组 合是特别关注的。其它实例是包含疏水蛋白和香豆素衍生物例如华法林、 苯丙香豆素或双 香豆乙酯 (Ethylbiscoumacetat) 的组合物。所述其它药学活性化合物 (D) 也可以被化学 连接到疏水蛋白。 0012 本发明还涉及涂覆可植入构件 (I) 的方法， 其中使用的疏水蛋白衍生物 (H) 是融 合疏水。
16、蛋白或其衍生物。本发明还涉及涂覆可植入构件 (I) 的方法， 其中将包含至少一种 疏水蛋白衍生物 (H) 的组合物于 4至 95的温度下、 特别是 20至 90、 在 0.01 小时至 48 小时、 优选 0.1 至 20 小时、 通常 1 至 10 小时的时间内应用至可植入构件 (I) 的表面。 0013 本发明另一方面是涂覆的可植入构件 (I)， 其具有至少部分用疏水蛋白衍生物 (H) 处理的表面。 0014 本发明还涉及一种涂覆的可植入构件 (I)， 其通过上述方法被疏水蛋白衍生物 (H) 至少部分表面涂覆。 0015 本发明还涉及一种涂覆的可植入构件 (I)， 其中可植入构件 (I) 。
17、是支架， 特别是胆 管支架。 0016 本发明另一个目的是提供一种用于涂覆可植入构件 (I) 的组合物， 其中所述组合 物包含基于全部组合物的 0.0001 至 20 重量的疏水蛋白 (H) 和 99.999 至 80 重量的其 它组分 (F)。就其它组分而言， 通常使用溶剂水。 0017 本发明还涉及一种用于涂覆可植入构件 (I) 的组合物， 其中所述组合物包含至少 0.001 至 10 重量的至少一种疏水蛋白衍生物 (H)、 至少 50 重量的水和可能有的其它组 分 (F)。另一方面是疏水蛋白衍生物 (H) 用于涂覆可植入构件 (I)、 特别是支架的用途。 说 明 书 CN 1028924。
18、43 A 4 3/9 页 5 0018 多种类型的医疗装置例如可植入构件 (I) 通常在使用前被涂覆。作为可植入构件 的一个实例， 胆管支架用于治疗发生于胆管中的阻塞。 胆汁是一种帮助消化脂肪的物质， 其 由肝脏产生， 通过胆管分泌并且储存于胆囊中。在进食含有脂肪的饮食后， 其被释放入小 肠。存有多种能够引起胆管狭窄的情况 ( 恶性的或良性的 )。胰腺癌是一种常见的恶性原 因， 胆囊、 胆管、 肝脏和大肠的癌症是其它的实例。胆管狭窄的非癌症原因包括胆囊切除手 术中胆管的损伤、 胰腺炎 ( 胰腺感染 )、 原发性硬化性胆管炎 ( 胆管感染 )、 胆结石、 放射疗 法和腹部钝伤。 0019 胆管支。
19、架通常为细的、 类管状结构， 其可以是被表面涂覆的而且其用于支撑胆管 的狭窄部分并且预防狭窄的再形成。支架可以由例如塑料或金属制造。两种最常见的用于 放置胆管支架的方法为内窥镜逆行胰胆管造影(ERCP)和经皮经肝胆管造影(PTC)。 使用涂 覆的装置对于两种方法都是有利的。ERCP 是一种用于诊断胰脏、 肝脏、 胆囊和胆管疾病的 成像技术， 且同样具有用作治疗装置的优点。内窥镜是一种细的、 发光的、 连接到显示屏的 中空管， 并且其能被插入患者口腔内， 进入食道， 通过胃， 进入小肠的上部， 直至到达胆管排 空的地方。此时， 将称作套管的小管通过内窥镜插入， 并且向胆管内注射对照染料。然后当 。
20、染料通过胆管移动时施行一系列的 X 射线。如果 X 射线表明胆管狭窄存在， 可以将涂覆的 支架放置入胆管内以减轻阻塞。 为了做到这一点， 将特定的仪器插入内窥镜中， 并且进行括 约肌切开术以提供进入胆管的通路。在某些情况下， 胆管狭窄部位首先使用称作导管的细 的柔性管进行扩张， 随后使用充气的气球型装置进行扩张。 然后将涂覆的支架插入胆管内。 另一施用涂覆支架的方法 ( 经皮经肝胆管造影或 PTC) 与 ERCP 类似的是所述测试用于诊断 和治疗影响胆汁从肝脏流向胃肠道的阻塞。 使用细针头将对照染料通过皮肤注射入肝脏或 胆囊内。当染料移动通过胆管时， 获取 X 射线图像。如果胆管狭窄得到证实，。
21、 然后则可以放 置涂覆的支架。将中空针头引入胆管内， 并且将细的导丝插入针头内。 0020 将所述丝导向阻塞区域， 然后所述涂覆的支架越过丝前进并放置于阻塞的胆管 内。 0021 支架也可以用于其它医疗领域。 0022 许多个体患有由遍布在心脏和其它主要器官的血管的进行性阻滞引起的循环系 统疾病。非常严重的血管阻塞通常引起高血压、 缺血性损伤、 中风或心肌梗死。动脉粥样硬 化病变是缺血性心脏病的主要原因。 经皮腔内冠状动脉成形术是一种目的是增加通过动脉 的血流量的医疗操作。经皮腔内冠状动脉成形术是冠状血管狭窄的主要疗法。经皮腔内 冠状动脉成形术的一个局限之处在于血管的突然闭合， 其可能在该操作。
22、和再狭窄后立刻发 生， 再狭窄在该操作后逐渐发生。 0023 众多物质被用于在支架上测试其在再狭窄中的抗增殖作用， 并且在实验动物模型 中表现出一些活性。一些物质已经在动物模型中表现出成功降低内膜增生程度， 其包括肝 素和肝素片段、 紫杉醇、 血管紧张素转换酶抑制剂、 血管肽素 (angiopeptin)、 环孢霉素 A、 特比萘芬、 干扰素、 雷帕霉素、 甾类、 反义寡核苷酸和基因载体。 涂覆的支架还可以用于减 少再狭窄。 0024 这些涂覆的支架通常是可气球膨胀的有槽金属管 ( 例如不锈钢 )， 当在血管成形 术管状动脉的内腔中膨胀时， 其通过刚性支架为动脉壁提供结构支撑。这种支撑有助于维。
23、 持血管内腔的通畅。在经皮腔内冠状动脉成形术后， 这些涂覆的支架能够表现出成功的血 说 明 书 CN 102892443 A 5 4/9 页 6 管造影增加。此外， 具有疏水蛋白和最终其它化合物例如肝素及其衍生物的支架的涂覆表 现出具有降低支架植入后亚急性血栓形成的附加效果。具有疏水蛋白和肝素 ( 以及最终的 其它化合物 ) 的支架涂料可能具有临床用处。 0025 还已经发现， 疏水蛋白涂覆的支架的应用是局部药物递送的一种方法。其中特定 药物(或药物组合)固定至局部递送装置例如支架的这种方式起到发挥这类治疗的效力的 作用。 0026 本发明的一个典型方式是将药物分子通过化学方法固定在涂覆于装置。
24、表面的疏 水蛋白上。用于将药物 ( 或药物组合 ) 固定至支架的方法和材料应当不干扰药物的起效。 此外， 使用的方法和材料应当是生物相容的， 而且应当将药物或药物组合保持在局部装置 至递送并持续很长的时间。 需要用于预防和治疗疾病例如血管损伤的能够用作局部递送装 置的特定蛋白涂覆的支架。 0027 许多支架涂覆的方法和组合物已经被公开。 涂料本身可能能够降低支架对受损部 分 ( 例如内腔壁 ) 的刺激， 从而减少血栓或再狭窄的趋势。或者， 涂料可以递送药物。药物 递送的机理是例如所述活性剂通过本体聚合物 (bulk polymer) 或在聚合物结构上产生的 孔或通过生物可降解涂料的侵蚀进行扩散。
25、。 也可以通过使用疏水蛋白将药物化合物涂覆到 支架表面。 0028 已经报道生物可吸收的和生物稳定的组合物都可作为支架的涂覆材料。 聚合物涂 料可以封装药物。其它将所述活性剂固定至表面的方法是已知的， 例如肝素涂覆的支架。 以多种方法将这些涂料应用至支架， 所述方法包括浸渍、 喷雾或旋转涂覆方法。一类已经 报道的用作支架涂料的生物稳定的聚合物材料是多氟 (polyfluoro) 均聚物。聚四氟乙烯 (PTFE) 均聚物用作植入物已经很多年了。这些均聚物在合理温度下不溶于任何溶剂， 因此 很难在保持装置的重要特征 ( 例如支架中的槽 ) 的情况下将其涂覆到小的医疗装置上。已 经建议具有聚偏二氟乙。
26、烯均聚物制备的涂料并含有用于释放的药物物质 / 治疗剂或药物 的支架。 但是， 很难在不使其承受相对高温的情况下将它们作为高质量的膜应用至表面上。 0029 现在已经发现开发含有疏水蛋白或其衍生物的可植入构件的涂料是有利的。 0030 这些涂料能够通过使用含有疏水蛋白的组合物应用至医疗装置的表面。 这些涂料 可应用于可植入医疗装置， 可能包括 ( 但不是必须 ) 使用药物活性剂或药物。这些涂覆的 装置具有对于使用有效的物理和机械性能。 涂覆的医疗装置与药物联合使用可能是有利于 的， 所述药物治疗疾病和最小化或基本消除活生物体对医疗装置植入的反应。在某些情况 下， 发展与促进伤口愈合以及医疗装置。
27、的内皮化的药物例如肝素联用的疏水蛋白涂覆的医 疗装置是有利的。 0031 本发明文本中， 术语 “疏水蛋白” 或 “疏水蛋白衍生物” 可以理解为特别是意指具 有结构通式 (I) 的多肽， 0032 Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm(I) 0033 其中 X 可以是 20 种天然存在的氨基酸 (Phe、 Leu、 Ser、 Tyr、 Cys、 Trp、 Pro、 His、 Gln、 Arg、 Ile、 Met、 Thr、 Asn、 Lys、 Val、 Ala、 Asp、 Glu、 Gly。
28、) 中的任意氨基酸。在通式中， X 基团在各情况中可以是相同或不同的。X 旁边的指数各自是特定部分的序列 X 中的氨基 酸的数目， C 是半胱氨酸、 丙氨酸、 丝氨酸、 甘氨酸、 甲硫氨酸或苏氨酸， 其中至少四个用 C 代 表的残基是半胱氨酸， 而指数 n 和 m 各自独立地是 0 至 500 之间、 优选 15 至 300 之间的自 说 明 书 CN 102892443 A 6 5/9 页 7 然数。通式 (I) 的多肽也可以用以下性能表征 ： 在室温下， 在涂敷玻璃表面后， 在各情况下 与相同大小的水滴和未涂覆的玻璃表面的接触角相比， 它们使得与水滴的接触角增加至少 20、 优选至少 25。
29、且更优选 30。 0034 C1至 C8代表的氨基酸优选是半胱氨酸。但是， 它们也可以被具有相似空间填充的 其它氨基酸所替代， 所述其它氨基酸优选是丙氨酸、 丝氨酸、 苏氨酸、 甲硫氨酸或甘氨酸。 0035 但是， C1至 C8位置中的至少四个、 优选至少五个、 更优选至少六个以及尤其是至少 七个由半胱氨酸组成。在本发明的蛋白质中， 半胱氨酸可以以还原形式存在或相互形成二 硫键。特别优选的是分子内形成 C-C 键， 特别是具有至少一个分子内二硫键、 优选两个、 更 优选三个以及最优选四个分子内二硫键。 在上述使用具有相似空间填充的氨基酸替代半胱 氨酸的情况中， 所述 C 位置有利地由能够相互形。
30、成分子内二硫键的氨基酸成对替代。如果 半胱氨酸、 丝氨酸、 丙氨酸、 甘氨酸、 甲硫氨酸或苏氨酸也用于 X 代表的位置， 则通式中各 C 位置的编号可相应地改变。 0036 优选使用通式 (II) 的疏水蛋白来实施本发明 0037 Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8-Xm(II) 0038 其中 X、 C 以及 X 和 C 旁边的指数均如上所定义， 指数 n 和 m 各自是 0 至 350 之间、 优选15至300之间的数， 而且所述蛋白另外特征在于上面所述的接触角变化， 此外， 至少六 个用 C。
31、 代表的残基是半胱氨酸。更优选地， 所有的 C 残基都是半胱氨酸。 0039 特别优选使用通式 (III) 的疏水蛋白 0040 Xn-C1-X5-9-C2-C3-X11-39-C4X2-23-C5-X5-6-C6-C7-X6-18-C8-Xm(III) 0041 其中 X、 C 以及 X 旁边的指数均如上所定义， 指数 n 和 m 各自是 0 至 200 之间的数， 而且所述蛋白另外特征在于上面所述的接触角变化， 并且至少六个用 C 代表的残基是半胱 氨酸。更优选地， 所有的 C 残基都是半胱氨酸。Xn和 Xm残基可以是也天然连接到疏水蛋白 的肽序列。但是， 一个或这两个残基也可以是非天然连。
32、接到疏水蛋白的肽序列。 0042 这也可以理解为意指那些Xn和/或Xm残基， 其中天然存在于疏水蛋白中的肽序列 被非天然存在于疏水蛋白中的肽序列延长。 0043 如果 Xn和 / 或 Xm是非天然键合至疏水蛋白的肽序列， 这些序列通常为至少 20、 优选至少 35 个氨基酸长度。例如， 它们可以是 20 至 500、 优选 30 至 400、 更优选 35 至 100 个氨基酸的序列。这种不是天然连接到疏水蛋白的残基在下文中还称作融合伴侣 (fusion partner)。这意欲表示蛋白可以由至少一个疏水蛋白部分和融合伴侣部分组成， 其在自然 界中不以这种形式一起存在。 由融合伴侣和疏水蛋白部。
33、分组成的融合疏水蛋白描述在例如 WO2006/0802251、 WO2006/082253 和 WO2006/131564 中。 0044 所述融合伴侣部分可以选自许多蛋白质。可以仅一个单一融合伴侣键合至所述 疏水蛋白部分， 或者也可以多个融合伴侣键合至一个疏水蛋白部分， 例如在疏水蛋白部 分的氨基端 (Xn) 和羧基端 (Xm) 上。但是， 也可以例如两个融合伴侣键合至本发明所述 蛋白的一个位置 (Xn或 Xm) 上。特别合适的融合伴侣是天然存在于微生物优选大肠杆菌 (Escherischia coli) 或枯草杆菌 (Bacillus subtilis) 中的蛋白。这类融合伴侣的实例 是序。
34、列yaad(SEQ ID NO ： 16， 于WO2006/082251中)， yaae(SEQ ID NO ： 18， 于WO2006/082251 中 )、 泛素和硫氧还蛋白。 0045 十分合适的还有这些序列的片段或衍生物， 其只包含有一些例如 70 至 99、 优选 说 明 书 CN 102892443 A 7 6/9 页 8 5至50和更优选10至40的所述序列， 或与所述序列相比其中个体氨基酸或核苷酸已经 改变， 在上述情况中所述百分比都是基于氨基酸的数目。 替代完整的融合伴侣， 使用截短的 残基可能是有利的。 0046 特别是， 所述截短的残基可以包含至少 20 个、 优选至少 。
35、35 个氨基酸。在一个更优 选的实施方案中， 所述融合疏水蛋白以及作为Xn或Xm基团之一或作为所述基团的末端组成 的所述融合伴侣还具有所谓的亲和域(亲和标记物/亲和尾部)。 原则上已知的是， 这包括 够锚定基团， 所述锚定基团与特定的互补基团相互作用， 并且能使蛋白的后处理和纯化更 简单。所述亲和域的实例包括 (His)k、 (Arg)k、 (Asp)k、 (Phe)k或 (Cys)k基团， 其中 k 通常 为 1 至 10 的自然数。其可以优选是 (His)k基团， 其中 k 是 4 至 6。这种情况中， Xn和 / 或 Xm基团可以只由此亲和域组成， 或者天然或非天然键合到疏水蛋白的Xn或。
36、Xm基团被末端亲 和域延长。 0047 本发明使用的疏水蛋白也可以在其多肽序列上被修饰， 例如通过糖基化、 乙酰化 或通过化学交联 ( 例如使用戊二醛 )。所述疏水蛋白也可以与多糖例如肝素交联。 0048 已经发现， 开发在植入医疗装置时不会不利的影响涂料的涂覆的装置是有利的。 此外， 此类疏水蛋白涂覆的装置使得医生能够简单而准确地将所述医疗装置放置在目标区 域。 也已经发现， 开发医疗装置的疏水蛋白涂料是有利的， 所述涂料使得能够精确控制药物 ( 例如肝素 ) 从医疗装置的流出的速率。 0049 本发明的主题还包括疏水蛋白涂覆的装置， 其使得释放一种或多种通过不同分子 机制起作用而影响细胞增。
37、殖的活性剂。 0050 为了测试目的， 将商业可用的胆管塑料支架用单独的疏水蛋白涂覆或用疏水蛋白 和抗生素和 / 或肝素涂覆。在人胆汁内温育 28 天后， 研究涂覆的支架表面的阻塞物质是否 减少。已经发现， 具有疏水蛋白的塑料支架的涂覆能够明显减少支架表面的粘附物质。 0051 还测试了将氨苄西林 / 舒巴坦或左氧氟沙星连接到疏水蛋白涂覆的支架上。发现 具有疏水蛋白或具有疏水蛋白和肝素的胆管塑料支架的涂覆是一种延缓阻塞过程的有前 途的方法。 0052 如果临床环境需要支架放置较长时间， 通常需要更换内窥镜支架， 但是已经发现 具有较长通畅率的疏水蛋白涂覆的胆管支架的开发是特别有用的。在一个体外。
38、模型中， 测 试了具有疏水蛋白的商用胆管塑料支架的不同涂覆。发现了阻塞过程的降低。而且， 将抗 生素和肝素与该蛋白 ( 疏水蛋白 ) 偶联以进一步改进塑料支架的性能。该观点产生于表明 细微的线似乎在阻塞过程中起关键作用的电子扫描显微研究的结果。 0053 实施例 1 0054 接下来的研究中， 使用直径为 10French， 两瓣之间的长度为 8 厘米的胆管塑料支 架 ( 聚乙烯， Cotton-Leung型， Fa.CookMedical)。 0055 原本的 (Native) 塑料支架和疏水蛋白涂覆的支架放入人体胆汁中 28 天。然后通 过扫描电子显微法检测所述支架。 0056 在开始涂覆。
39、步骤之前， 将支架切成 1 厘米的小段 ( 适于最后的扫描电子显微法 )。 通过使用具有修饰的疏水蛋白的涂料来完成表面修饰和 / 或各种活性物质的靶向。 0057 这 种 蛋 白 “H*蛋 白 A”的 生 成 和 性 质 已 经 描 述 在 Wohlleben W， Subkowski T， Bollschweiler C 等 在 Eur Biophys J， 2009 发 表 的 “Recombinantly produced 说 明 书 CN 102892443 A 8 7/9 页 9 hydrophobins from fungal analogues as highly surface。
40、-active performance proteins” 中。 0058 在第一个试验中， 使用了 14 个原本的支架。通过通常的涂覆技术， 将 11 个支架使 用疏水蛋白(H*蛋白A， BASF SE)涂覆， 将3个支架使用疏水蛋白(H*蛋白A联合氨苄西林+ 舒巴坦 (Unacid ， Pfizer Pharma) 涂覆。此外， 对组合 H*蛋白 A/ 左氧氟沙星 (Tavanic ， Sanofi Aventis) 和 H*蛋白 A/ 肝素进行测试。 0059 在制备10mg疏水蛋白(H*蛋白A)/mL的无菌蒸馏水溶液后， 将蛋白在涂覆缓冲液 ： 50mM Tris-HCl pH 8.0。
41、， 1mM CaCl2中稀释到 1mg/mL。将支架在 80、 在 1mL 的 H*蛋白 A 溶 液中培育过夜， 在蒸馏水中洗涤三次， 然后干燥。 0060 实施例 2( 表面上的疏水蛋白的检测 ) 0061 通过定向于蛋白的六 -His 标签的特异性抗体检测 H*蛋白 A 涂覆 ： 0062 - 将涂覆和未涂覆的支架培育在 TTBS 缓冲液 (20mM Tris-HCl pH 7.5， 150mM NaCl， 0.05吐温 20) 中的 1的封闭液 (Roche 1921673) 里 ； 室温 (RT) 下 1 小时 0063 - 使用 TTBS 缓冲液洗涤三次 0064 - 使用抗 -po。
42、ly-His-POD 抗体共轭物 (Sigma A7058) 培育， 以 1 2000 稀释于 TTBS 缓冲液 /0.01 BSA(Sigma A7888) 中 ； 室温下 1 小时 0065 - 使用 TTBS 缓冲液洗涤两次 0066 - 使用 TBS 缓冲液 (20mM Tris-HCl pH 7.5， 150mM NaCl) 洗涤 0067 - 使用 pH4.9 的 100mM 醋酸钠洗涤 0068 - 加入过氧化物酶底物 ： 0069 1 片 TMB 底物 (Sigma T5525) 在 100L 的 DMSO 中 0070 10mL 0.1M 的醋酸钠， pH 4.9 0071 。
43、14.7L 3的 H2O2 0072 - 在室温下培育 5 分钟 0073 - 在 405nm 下检测 0074 实施例 3( 具有疏水蛋白和肝素的塑料支架的涂覆 ) 0075 将肝素偶联至支架的 H*蛋白 A 涂料中。新制备肝素 ( 肝素钠盐， Sigma H4784) 与 偶联剂 1- 乙基 -3-(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳二亚胺 (EDC)(Sigma 7750)1mg/mL 的于 100mM 的 pH4.5 的 MES 缓冲液 (Sigma M2933) 中的混合物。肝素的终浓度为 50U/mL/500U/mL 和 5000U/mL。在旋转器中使用 1mL 的偶联溶液在室温下培育支。
44、架两小时后， 通过使用无菌蒸 馏水的三次洗涤步骤结束所述反应。 0076 通过游离羧基基团， 肝素偶联到H*蛋白A的氨基基团 ： EDC用作羧基活化剂用于偶 联伯胺得到酰胺键。 0077 实施例 4( 使用 H*蛋白 A 和氨苄西林 + 舒巴坦 (Unacid ， Pfizer Pharma) 涂覆的 支架 ) 0078 将 Unacid 溶解在无菌蒸馏水中至 100mg/mL 的总浓度 ( 氨苄西林 + 舒巴坦 )。通 过添加100g/mL最终总浓度的Unacid和终浓度为0.05的戊二醛(Aldrich34， 085-5) 在蒸馏水中与支架表面上的 H*蛋白 A 进行反应。在室温下过夜培育。
45、后， 使用无菌蒸馏水洗 涤支架三次。 在所述反应条件下作为Unacid 中两种活性化合物之一的氨苄西林能够被偶 说 明 书 CN 102892443 A 9 8/9 页 10 联 ： 通过戊二醛使氨苄西林的伯氨基和 H*蛋白 A 中易接近的氨基基团交联。 0079 实施例 5( 使用 H*蛋白 A 和左氧氟沙星 (Tavanic ， Sanofi Aventis) 涂覆的支 架 ) 0080 将 Tavanic 溶解在 pH 4.5 的 100mM MES 缓冲液中至 1.3mg/mL 的终浓度， 并与 EDC( 终浓度 1.6mg/mL) 混合。与 H*蛋自 A 涂覆的支架的反应在室温下进行。
46、 2.5 小时。最 后使用无菌蒸馏水洗涤支架三次。 0081 通过形成酰胺将左氧氟沙星偶联到 H*蛋白 A 上 ： 通过 EDC 使左氧氟沙星的羧基与 H*蛋白 A 的氨基交联。 0082 实施例 6( 在人胆汁中培育 ) 0083 将所有涂覆的支架在充满人胆汁 ( 经皮经肝胆管引流收集， 患者对于使用其胆汁 已知情同意 ) 的管中储存 28 天。使用如图 1 所示的装置以 2rpm( 每分钟的转数 ) 的速度 转动管。 0084 在图 1 中， 缩写 T 是储存支架的含有人胆汁的管， B 是缓慢钟摆移动的板， E 是电动 机。进行所述装置中的这种处理以模拟胆汁流动。在 37的恒温下进行培育。。
47、 0085 实施例 7( 电子扫描显微法 ) 0086 培育 28 天后， 所有支架使用无菌蒸馏水洗涤， 固定并储存于 4的缓冲的戊二 醛中。在用等级系列的乙醇脱水后， 将所有样品用临界点干燥仪干燥， 用粘性箔粘附在柱 (stub) 上， 然后用 15nm 的金 - 钯溅射涂覆。使用带有数字输出的 Philips 场致发射 SEM 进 行 SEM 测定。 0087 首先将未涂覆支架的测定结果与涂覆有 H*蛋白 A 的支架进行比较。然后将涂覆 有 H*蛋白 A 的支架与涂覆有 H*蛋白 A 和抗生素药物化合物或肝素的支架进行比较。 0088 发现如下结果 ： 0089 a) 未涂覆的支架 009。
48、0 28 天的培育后， 电子扫描显微法显示未涂覆支架的内表面和外表面具有相似量的 附着物质。发现所述物质在支架内表面上更加融合 (confluent)， 而在外表面上更加波动 (undulating)。在附着物质的组成方面并没有区别。所述组分主要是无定形物质， 其具有 不同量的细菌和接近于细菌以及不依赖于它们的存在的微小结构。 0091 b)H*蛋白 A 涂覆的支架 0092 本研究中使用的修饰疏水蛋白由构巢曲霉 (Aspergillus nidulans) 的疏水蛋白 DewA、 N 端融合蛋白 yaad 和 C 端六 -His 标签组成。因为这种标签序列的特异性抗体， 可以 进行表面上的蛋。
49、白质的 “类蛋白质印迹 (western blot like)” 检测。所述 POD( 偶联至抗 体的 ) 酶可以通过特异底物的颜色产生进行检测。 0093 405nm 的光密度检测 0094 未涂覆的支架 ( 对照 ) 涂覆的支架 0.10 0.59 0.14 0.68 说 明 书 CN 102892443 A 10 9/9 页 11 0095 通过扫描电子显微法在低倍下可以看出， 相比未涂覆的支架， 附着物质的程度减 少了。 0096 未涂覆支架上显示的成分同样出现在涂覆的支架上 ( 无定形物质， 细菌和接近及 远离细菌的微小结构 )。接近支架表面处可检测到十分薄的层 ( 疏水蛋白层 )。 0097 c)H*蛋白 A 和氨苄西林 + 舒巴坦 (Unacid ， Pfizer Pharma) 涂覆的支架 0098。