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1、(10)申请公布号 CN 102875658 A (43)申请公布日 2013.01.16 CN 102875658 A *CN102875658A* (21)申请号 201210388971.9 (22)申请日 2012.10.15 C07K 14/405(2006.01) C08B 37/00(2006.01) C09B 61/00(2006.01) A23K 1/14(2006.01) C11B 1/04(2006.01) C11B 1/10(2006.01) C11B 1/00(2006.01) (71)申请人 北京化工大学 地址 100029 北京市朝阳区北三环东路 15 号 (72。
2、)发明人 张栩 段美蓉 谭天伟 (74)专利代理机构 北京五月天专利商标代理有 限公司 11294 代理人 涂萧恺 (54) 发明名称 一种产油微生物能源微藻的高值化利用分离 方法 (57) 摘要 本发明涉及一种产油微生物能源微藻的高值 化利用分离方法， 包括以下步骤 ： 步骤 1 ： 将收集 的微藻湿菌体依次经过热水和离心处理， 得到上 清液 A 和沉淀 A ； 步骤 2 ： 沉淀 A 依次经过加酶和 离心处理， 得到上清液 B 和沉淀 B ； 步骤 3 ： 将上清 液 A 和上清液 B 混合后进行浓缩， 并加 4冷乙 醇静置 12 小时以上， 将混合液进行过滤得到粗多 糖沉淀 ； 步骤 4。
3、 ： 步骤 3 中所得粗多糖沉淀加水溶 解， 脱蛋白处理， 分离成蛋白沉淀和脱蛋白的多糖 溶液， 蛋白沉淀通过冷冻干燥或烘干得到粗蛋白 产品， 脱蛋白后的多糖溶液进行脱色得到精制多 糖， 沉淀 B 再经过多次处理后可以得到黄色素、 叶 绿素盐、 高蛋白成分饲料以及油脂。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1. 一种产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法， 包括以下步骤 ： 步骤 1 ： 将收集的微藻湿菌体依次经过热水和离心处理， 得到上清液 A 和沉淀 A 。
4、； 其中， 热水与湿菌体的质量比为 2030 ： 1 ； 步骤 2 ： 沉淀 A 依次经过加酶和离心处理， 得到上清液 B 和沉淀 B ； 其中， 沉淀 A 和酶的 质量比为 40-100 ： 1 ； 步骤3 ： 将上清液A和上清液B混合后进行浓缩， 并加4冷乙醇混合12小时以上， 将混 合液进行过滤得到粗多糖沉淀 ； 其中， 上清液 A 和上清液 B 的总体积浓缩到原体积的 1/5 1/4， 加冷乙醇的体积是浓缩后上清液 A 和上清液 B 总体积的 3-5 倍 ； 步骤 4 ： 步骤 3 中所得粗多糖沉淀加水溶解， 脱蛋白处理， 分离成蛋白沉淀和脱蛋白的 多糖溶液， 蛋白沉淀通过冷冻干燥或烘。
5、干得到粗蛋白产品。 2. 根据权利要求 1 所述产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法， 其特征在于 ： 步 骤 4 中所得脱蛋白后的多糖溶液进行脱色得到精制多糖。 3. 根据权利要求 1 所述产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法， 其特征在于 ： 将 步骤 2 中所得沉淀 B 的菌悬液调节 pH 值为 10-12 后， 70-80保温 1-2h， 然后加入 0.8% 的 氯化钠溶液以及正己烷与乙醇的混合液， 使最终正己烷 ： 乙醇 ： 水的体积比为 2 ： 4 ： 1.5， 震 荡 10min， 静置分成三层 ： 正己烷相 A、 中间菌体相以及醇水相 A， 最上层正己烷相 A 得到黄 色素。
6、。 4. 根据权利要求 3 所述产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法， 其特征在于 ： 中 间菌体相经过干燥处理后当作动物膳食的高蛋白成分饲料。 5. 根据权利要求 3 所述产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法， 其特征在于 ： 醇 水相A加酸调节溶液pH至酸性后， 加入体积比为2 ： 1的正己烷与乙醇混合溶液以及0.8%的 氯化钠溶液， 醇水相 A、 正己烷 ： 乙醇混合液以及氯化钠溶液体积比为 4 ： 6 ： 1， 震荡 10min， 静置再次分层为正己烷相B和醇水相B， 正己烷相B制得油脂， 醇水相B制得叶绿素铜钠盐。 6. 根据权利要求 1 至 5 至任何一项所述产油微生物能源微藻。
7、的高值化利用分离方法， 其特征在于 ： 所述酶选自中性蛋白酶、 碱性蛋白酶以及纤维素酶中的一种或多种组合 ； 所 述纤维素酶酶活为 1200-1500U/g， 所述中性蛋白酶酶活为 59000-60000U/g， 所述碱性蛋白 酶酶活为 2105-2.02105U/g。 7. 根据权利要求 1 至 5 至任何一项所述产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法， 其特征在于 ： 步骤 1 中的热水处理温度和时间分别为 90-100和 0.5-2h。 8. 根据权利要求 1 至 5 至任何一项所述产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法， 其特征在于 ： 所述产油微生物能源微藻为小球藻、 螺旋藻或栅藻。。
8、 权 利 要 求 书 CN 102875658 A 2 1/4 页 3 一种产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法 技术领域 0001 本发明涉及微生物工程领域， 尤其涉及一种产油微生物微藻的高值化利用分离方 法。 背景技术 0002 随着石化资源日益枯竭、 人类环保意识不断增强， 清洁可再生的生物柴油的发展 显得尤为紧迫。 能源微藻以种类繁多、 分布广、 繁殖快、 成本低的特点成为重要来源之一。 另 外， 其脂肪酸组成与植物来源的食用油脂相似， 可以代替动、 植物油脂作为食用油脂， 甚至 是作为保健类功能性油脂。微藻除含有大量的脂质之外， 还含有丰富的多糖、 色素、 蛋白质 和必需氨基酸等活。
9、性成分。具有增强免疫力， 抗癌， 防辐射损伤， 抗衰老， 降血糖等功效。 0003 叶绿素是较早开发的一种绿色色素， 无毒， 可食用， 是一种很好的天然食用色素， 但由于叶绿素稳定性极差， 且不溶于水， 给应用带来一定的困难。为方便使用， 常将其制成 叶绿素铜钠应用。叶绿素铜钠盐不但溶于水而且稳定性比叶绿素强很多， 是我国食品工业 唯一允许使用的绿色色素， 是联合国粮农组织、 世界卫生组织批准使用的天然绿色素。 0004 从产油微生物能源微藻进行分离可以得到多糖、 色素、 油脂以及蛋白产品四种成 分。 0005 现阶段对四种成分的提取， 常规方法是酸法、 碱法、 酶法、 热水法、 超声波、 微。
10、波提 取法对某一种成分进行提取， 但仍没有一种方法同时对四种成分进行有效提取。 且超声、 微 波法处理量小， 工业上较难扩大再生产 ； 若直接采用酸法、 碱法用量大、 且浓度高， 对环境污 染严重， 对色素、 多糖结构破坏严重、 损失较大， 蛋白含量较高， 增加了多糖纯化的难度， 且 碱处理使水相清液中呈墨绿色， 得到的粗多糖颜色也为绿色， 油脂提取过程中， 色素杂质也 较多， 后期分离成本加大 ； 酶法破碎条件温和、 能耗低、 处理量大， 多糖得率高， 油脂浸出率 高， 但是酶的造价较高， 而在使用时又需要大量的酶才可达到较好的破碎效果， 且酶的大量 使用对色素降解作用较明显， 所以可以先对。
11、酶进行预处理， 减少酶的用量和作用时间 ； 热水 处理， 可增大细胞通透性， 有利于胞内物质的浸出， 可控时间内热水处理对色素影响较小， 但脱单独热水处理， 多糖和油脂的提取效率低， 可作为一种预处理手段与酶法结合。 常规对 色素提取采用有机溶剂浸提， 此时目标产物必须为干菌体， 湿菌体有机溶剂提取效果甚微。 发明内容 0006 本发明设计了一种产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法， 其解决的技术问 题是现有产油微生物能源微藻分离方法无法对其含有的多糖、 油脂、 色素以及蛋白得到充 分利用， 并且分离效果不佳， 成本高。 0007 为了解决上述存在的技术问题， 本发明采用了以下方案 ： 一种。
12、产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法， 包括以下步骤 ： 步骤 1 ： 将收集的微藻湿菌体依次经过热水和离心处理， 得到上清液 A 和沉淀 A ； 其中， 热水与湿菌体的质量比为 2030 ： 1 ； 说 明 书 CN 102875658 A 3 2/4 页 4 步骤 2 ： 沉淀 A 依次经过加酶和离心处理， 得到上清液 B 和沉淀 B ； 其中， 沉淀 A 和酶的 质量比为 40-100 ： 1 ； 步骤3 ： 将上清液A和上清液B混合后进行浓缩， 并加4冷乙醇混合12小时以上， 将混 合液进行过滤得到粗多糖沉淀 ； 其中， 上清液 A 和上清液 B 的总体积浓缩到原体积的 1/5 1/。
13、4， 加冷乙醇的体积是浓缩后上清液 A 和上清液 B 总体积的 3-5 倍 ； 步骤 4 ： 步骤 3 中所得粗多糖沉淀加水溶解， 脱蛋白处理， 分离成蛋白沉淀和脱蛋白的 多糖溶液， 蛋白沉淀通过冷冻干燥或烘干得到粗蛋白产品。 0008 进一步， 步骤 4 中所得脱蛋白后的多糖溶液进行脱色得到精制多糖。 0009 进一步， 将步骤2中所得沉淀B的菌悬液调节pH值为10-12后， 70-80保温1-2h， 然后加入 0.8% 的氯化钠溶液以及正己烷与乙醇的混合液， 使最终正己烷 ： 乙醇 ： 水的体积 比为 2 ： 4 ： 1.5， 震荡 10min， 静置分成三层 ： 正己烷相 A、 中间菌体。
14、相以及醇水相 A， 最上层正 己烷相 A 得到黄色素。添加乙醇是为了使黄色素更好的进入正己烷相中。 0010 进一步， 中间菌体相经过干燥处理后当作动物膳食的高蛋白成分饲料。 0011 进一步， 醇水相 A 加酸调节溶液 pH 至酸性后， 加入体积比为 2 ： 1 的正己烷与乙醇 混合溶液以及 0.8% 的氯化钠溶液， 醇水相 A、 正己烷 ： 乙醇混合液以及氯化钠溶液体积比为 4 ： 6 ： 1， 震荡 10min， 静置再次分层为正己烷相 B 和醇水相 B， 正己烷相 B 制得油脂， 醇水相 B 制得叶绿素铜钠盐。 0012 进一步， 所述酶选自中性蛋白酶、 碱性蛋白酶以及纤维素酶中的一种。
15、或多种组合 ； 所述纤维素酶酶活为 1200-1500U/g， 所述中性蛋白酶酶活为 59000-60000U/g， 所述碱性蛋 白酶酶活为 2105-2.02105U/g。 0013 进一步， 步骤 1 中的热水处理温度和时间分别为 90-100和 0.5-2h。 0014 进一步， 所述产油微生物能源微藻为小球藻、 螺旋藻或栅藻。 藻类微生物的细胞壁 成分主要是纤维素极其结合蛋白。以适当的比例组成具有水解多糖、 蛋白等物质能力的复 合酶， 使细胞壁通透性大幅增加， 产品能够顺利溶出。 所述纤维素酶与蛋白酶的质量比优选 为 1:0.2-5 ； 所述酶与产油微生物菌体的质量比为 1:40-10。
16、0。 0015 本发明使用的微藻湿菌体由藻类微生物菌体发酵液通过离心处理获得， 藻类微生 物菌体发酵液的制备方法为取种子液对数期进行接种， 接种量为 20%， 初始 pH 值为 7.5， 温 度 27， 光照 4000lx， 通无菌空气培养 8 天则达到稳定期。 0016 本发明在提取油脂时优选采用六号溶剂萃取， 六号溶剂是各种低级烷烃的混合 物， 具有工业己烷类似的性质且不与水互溶， 形成的双水相可以分离脂溶性的油脂和水溶 性的叶绿素酸。浸提后离心得到油相层， 利用旋转蒸发仪脱溶得到油脂。 0017 该产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法与现有方法相比， 具有以下有益效 果 ： （1） 本。
17、发明产油微生物能源微藻的利用分离方法， 在确保能够不影响油脂提取， 以及得 到较高的产物得率的情况下， 对提取顺序进行了优化， 可以依次得到蛋白、 多糖、 色素以及 油脂产品四种成分。 0018 （2） 本发明设计用热水处理作为预处理手段， 增大细胞通透性， 适当破坏细胞壁结 构， 减少酶法酶法作用时间和酶的使用量， 通过热水抽提和酶解作用， 得到产品多糖和少量 的粗蛋白。 说 明 书 CN 102875658 A 4 3/4 页 5 0019 （3） 本发明通过油脂和叶绿素在碱性条件下可以变成水溶性的物质， 得到胡萝卜 素等黄色素产品。 0020 （4） 本发明油脂在酸性条件下仍能变成脂溶性。
18、的游离脂肪酸， 叶绿素仍是水溶性 的叶绿素酸， 从而分离成油脂和叶绿素， 得到的油脂产品色素杂质极少， 油脂品质较好。 0021 （5） 本发明中叶绿素可以直接转化成叶绿素铜钠盐， 且叶绿素转化充分。 具体实施方式 0022 结合下列实施例， 对本发明做进一步说明 ： 实施例 1 ： 选用小球藻 将小球藻发酵液以 4000rpm/min 离心 10min， 去除上清液获得小球藻湿菌体， 称取小球 藻湿菌体1.0g于100ml三角烧瓶中， 加入25ml去离子水， 90加热1.5h， 冷却， 离心得上清 液 A 和沉淀 A。称取 0.065g 纤维素酶， 0.035g 中性蛋白酶， 纤维素酶酶活为。
19、 1200U/g， 中性 蛋白酶酶活为 60000U/g， 加入 pH=5 的柠檬酸 - 柠檬酸钠缓冲溶液， pH=5 是实验中选定的最 优酶作用的 pH 反应体系。定容至 100ml， 取 25ml 酶溶液加入到小球藻湿菌体沉淀 A 中， 水 解温度为42， 搅拌4h， 90灭酶10min。 将水解后的悬浊液进行4000r/min下离心10min， 得到上清液 B 和沉淀 B， 合并两次上清液 A 和上清液 B， 浓缩该上清混合液至原体积的 1/5， 加入 3 倍体积的冷乙醇 4震荡混合均匀， 静置 12h， 过滤得粗多糖沉淀。 0023 取 10ml 水溶解粗多糖沉淀， 用三氯乙酸调节 p。
20、H 到 3， 混匀， 静置 2h， 加入 15 倍三 氯乙酸体积的正丁醇， 搅拌， 静置 1h， 离心， 水溶液回收多糖， 重复 2 次。多糖提取率 82.3%。 用水溶解多糖， 以 2BV/h 的流速对 2.5mg/ml 的粗多糖溶液进行吸附脱色， 测得色素脱除率 92.4%， 多糖保留率为 88.97%。pH=3 时蛋白质溶解度较低且多糖损失较小， 是实验中最优反 应体系。 正丁醇的使用也是为了降低蛋白质的水溶性， 从而和多糖分离。 此处单独使用TCA 方法也可以， 增加重复提取的次数。 0024 沉淀 B 的菌悬液用 2mol/L 的氢氧化钠调节 pH 为 11， 70反应 60min，。
21、 冷却， 加入 适量 0.8% 的氯化钠溶液和正己烷与乙醇的混合液正己烷与乙醇的体积比为 2 ： 4， 使最终正 己烷 ： 乙醇 ： 水的体积比为 2 ： 4 ： 1.5， 震荡 10min， 收集正己烷相， 再加入初始 1/3 体积的正 己烷重复两次， 正己烷相 A 加无水硫酸钠去除微量水， 回收溶剂并得到胡萝卜素等黄色素。 中间层悬浮的菌体经干燥后粗蛋白含量为 38.7%， 十八水解氨基酸含量充分， 完全可以作 为富含蛋白、 氨基酸的成分当作蛋白饲料成为动物膳食饲料的部分替代品。醇水相 A 中加 1mol/L 的硫酸调节 pH 到 3， 85反应 90min， 冷却， 加入体积比为 2 ：。
22、 1 的正己烷 : 乙醇溶液 和 0.8% 的氯化钠溶液， 醇水相 A、 正己烷 ： 乙醇混合液以及氯化钠溶液体积比 ： 4 ： 6 ： 1， 震荡 10min， 静置再次分层为正己烷相 B 和醇水相 B， 重复两次， 正己烷相 B 加无水硫酸钠去除微 量水， 回收溶剂并得到油脂产品， 油脂提取率为 79.4%。醇水相 B 浓缩到原体积的 1/3， 加入 10% 的硫酸铜溶液， 醇水相 B ： 硫酸铜体积比为 2 ： 3， 搅拌均匀， 60搅拌 90min。趁热过滤， 滤液加入 2 倍纯水， 析出叶绿素铜， 静置 90min 过滤。析出的叶绿素铜的滤饼用乙醇溶解， 缓慢加入 5% 氢氧化钠 -。
23、 乙醇溶液， 调节 pH 为 11， 搅拌成盐， 过滤， 滤液于 60加热蒸发得 到墨绿色结晶物， 60烘箱烘干得到叶绿素铜钠盐成品， 叶绿素铜钠盐得率 75.6%。 0025 实施例 2 ： 选用栅藻 将栅藻发酵液以 4000rpm/min 离心 10min， 去除上清获得栅藻菌体， 称取栅藻湿菌体 说 明 书 CN 102875658 A 5 4/4 页 6 1.0g 于 100ml 三角烧瓶中， 加入 25ml 去离子水， 90加热 1.5h， 冷却， 离心得上清液 A 和沉 淀 A。称取 0.075g 纤维素酶， 0.025g 碱性蛋白酶， 纤维素酶酶活为 1200U/g， 碱性蛋白酶。
24、酶 活为 2105U/g， 加入 pH=4 的柠檬酸 - 柠檬酸钠缓冲溶液定容至 100ml， 取 25ml 酶溶液加 入到栅藻湿菌体沉淀A中， 水解温度为40， 搅拌4h， 90灭酶10min， 将水解后的悬浊液进 行 4000r/min 下离心 10min， 得到上清液 B 和沉淀 B。之后步骤同实施例 1。 0026 最终产物， 多糖提取率 78.14%。测得色素脱除率 90.92%， 多糖保留率为 89.23%。 粗蛋白含量为 36.7%， 油脂提取率为 78.88%， 叶绿素铜钠盐得率 77.26%。 0027 实施例 3 ： 选用螺旋藻 将螺旋藻发酵液以 4000rpm/min 离。
25、心 10min， 去除上清获得螺旋菌体， 称取螺旋湿菌体 0.8g 于 100ml 三角烧瓶中， 加入 25ml 去离子水， 90加热 1.5h， 冷却， 离心得上清液 A 和沉 淀 A。称取 0.067g 中性蛋白酶， 碱性蛋白酶酶活为 60000U/g， 加入 pH=7 的柠檬酸 - 柠檬酸 钠缓冲溶液定容至 100ml， 取 20ml 酶溶液加入到栅藻湿菌体中， 水解温度为 42， 搅拌 6h， 90灭酶 10min。将水解后的悬浊液进行 4000r/min 下离心 10min， 得到上清液 B 和沉淀 B。 之后步骤同实施例 1。 0028 最终产物， 多糖提取率 75.74%。测得色素脱除率 91.22%， 多糖保留率为 89.75%。 粗蛋白含量为 38.97%， 油脂提取率为 78.28%， 叶绿素铜钠盐得率 72.86%。 0029 上面结合实施例对本发明进行了示例性的描述， 显然本发明的实现并不受上述方 式的限制， 只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进， 或未经改进将本发 明的构思和技术方案直接应用于其它场合的， 均在本发明的保护范围内。 说 明 书 CN 102875658 A 6 。