植物中海藻糖的增强累积 本发明涉及一种在植物细胞和植物中产生海藻糖的方法。本发明尤其涉及一种通过抑制海藻糖酶对海藻糖的降解来提高植物中海藻糖的累积水平的方法。本发明进一步包括作为该方法的产物含有相对高水平海藻糖的高等植物，优选被子植物纲(Angiospermae)，以及它的某些部分。本发明进一步涉及根据本发明对其进行处理后获得的植物细胞，植物或它的某些部分。
海藻糖是对D-葡糖基D-葡糖苷的总称，它包括基于两个α-，α，β-和β，β-连接的葡萄糖分子的二糖。海藻糖，尤其是α-海藻糖α-D-吡喃葡糖(1-1)α-D-吡喃葡糖苷为广泛天然产生的二糖。然而，海藻糖通常未在植物中发现，除去一些例外，如植物种类卷柏(Selaginella Lepidophylla (Lycophyta)和(MyrothamnusFlabellifolia)。除这些种类外，海藻糖在豆科(Leguminosae)(种子植物纲(Spermatophytae)，被子植物纲)的根瘤中被发现，其中它由根瘤菌合成；如此产生的海藻糖能扩散到根细胞中。除这些偶然的情况外，属于种子植物门(Spermatophyta)的植物种类明显缺乏产生和/或积累海藻糖的能力。
在1994年6月30日以MOGEN International NV名义申请的国际专利申请WO95/01446中，描述了一种为不能天然产生海藻糖的植物提供能天然产生海藻糖能力的方法。
尽管在大多数高等植物中没有海藻糖作为底物，但相当数量地高等植物种类已报道有海藻糖降解活性的出现，包括已知缺乏海藻糖的那些植物。出现这种活性的原因可被解释为由海藻糖酶造成的。
报道认为当海藻糖被施于在体外生长的植物幼苗时，它对植物细胞是有毒性的，或抑制植物细胞的生长(Veluthambik等，1981，植物生理学68，1369-1374)。人们发现产生低水平海藻糖酶的植物细胞比显示出较高水平的海藻糖酶活性的植物对海藻糖的副作用更为敏感。海藻糖类似物，例如海藻糖胺被用于抑制幼苗中海藻糖酶的活性，这样使得有可能研究用来施于植物细胞的海藻糖的作用。产生相对高含量的海藻糖酶的植物幼苗受海藻糖酶抑制剂加入的负面影响。Kendall等，1990，植物化学29，2525-2582公开了使用有效霉素抑制各种被子植物纲的愈伤组织匀浆和悬浮培养物中的海藻糖活性。
本发明的一个目的是提供能产生和积累海藻糖的植物和植物的某些部分。
本发明提供一种在能产生海藻糖酶的植物细胞中产生海藻糖的方法，通过培育具有产生海藻糖和海藻糖酶所需遗传信息的植物细胞，或栽培包含这种植物细胞的植物或它的一部分，特征在于在海藻糖酶抑制剂存在下，培育所述植物细胞或栽培所述植物或它的一部分。优选的植物或植物的某些部分或植物细胞已被遗传改变以包含植物可以表达形式的嵌合磷酸海藻糖合酶基因。根据一个具体实施方案，所述磷酸海藻糖合酶基因包含编码植物可以表达形式的来自大肠杆菌的磷酸海藻糖合酶的开放读框。更优选编码具有磷酸海藻糖合酶和磷酸海藻糖磷酸酶活性的双向酶的基因。
根据本发明的另一方面，植物已被遗传改变以在某些组织或部分中优先产生海藻糖，例如马铃薯的(小)块茎中。根据一具体实施方案，编码来自大肠杆菌的磷酸海藻糖合酶的开放读框位于马铃薯Patatin启动子的下游，以提供马铃薯(Solanum tuberosum)的块茎和小块茎中的该基因的优先表达。
根据本发明的另一方面，该植物在体外栽培，例如在水培中。
根据另一个优选的具体实施方案，所述海藻糖酶抑制剂包括适宜于所述植物吸收形式的有效霉素A，优选浓度为100nM至10mM之间，优选为0.1至1mM的水溶液。
同样适宜的所述海藻糖酶抑制作用可通过用编码海藻糖酶信息的基因的反义基因转化所述植物而形成。
还适宜作为海藻糖酶抑制剂的为来自美洲大蠊(Periplanetaamericana)的86KD蛋白。该蛋白可被以宜于吸收的形式施加于植物，并且该植物还可用编码所述蛋白的DNA转化。
本发明进一步提供植物和植物的某些部分，该植物和植物的某些部分积累了大于0.01％量(鲜重)的海藻糖，优选茄科种类，尤其是马铃薯或烟草(Nicotiana tobacum)，尤其是含海藻糖的马铃薯的小块茎。
本发明还包括根据本发明的植物或植物的某些部分在提取海藻糖中的应用，以及其在将水从所述植物或植物某些部分中强制提取的工艺中的应用。根据本发明的另一个具体实施方案，提供了嵌合植物可表达基因，它依次包括可从优先在植物某一部分表达的基因，尤其为来自马铃著的patatin基因获得的转录起始区、5′-非翻译前导序列、编码磷酸海藻糖合酶活性的开放读框以及在所述开放读框下游的转录终止区。
根据本发明的另一个方面，提供了嵌合植物可表达基因，它依次包括可从优先在植物某一部分表达的基因，尤其为来自马铃薯的Patatin基因获得的转录起始区，5 ′-非翻译前导序列，编码以反义取向偶联的海藻糖酶的读框以及所述读框下游的转录终止区。根据本发明，优选的植物可表达基因为其中所述转录终止区可从马铃薯的蛋白酶抑制剂II基因获得的基因。本发明还提供了包含根据本发明的嵌合植物可表达基因的载体和重组植物基因组以及具有重组基因组的植物细胞，主要由该细胞组成的植物或它的一部分，根据这个方面另一个优选的植物种类为马铃薯以及它的小块茎。
本发明进一步提供了一种获得海藻糖的方法，包括培育根据本发明的植物细胞或栽培根据本发明的植物并从所述植物细胞，植物或其某些部分提取海藻糖等步骤。
下面附图进一步说明本发明。
附图描述图1：双元载体pMOG845的简图。图2：多拷贝载体pMOG1192的简图。图3：来自啤酒酵母(S.cerevisiae)的中性海藻糖酶与来自大肠杆菌的周质海藻糖酶，来自兔的小肠海藻糖酶和来自蚕，家蚕(Bombyx mori)的蛹中肠海藻糖酶的最大氨基酸相似性的比较。所有海藻糖酶的相同的残基用粗斜体铅字表示。比较氨基酸序列的保守区产生最佳吻合。氨基酸序列中的缺口用短划线表示。
基于保守氨基酸的被降解引物的位置用虚线箭头表示。图4来自大肠杆菌(Ecoli 2 treh；Ecolitreha)，家蚕(Bommotreha)，黄粉虫(Tenmotreha)，兔(Rabbitreha)，马铃薯(Potatotreha)和酵母(Yeasttreha)的海藻糖酶的最大氨基酸相似性的比较。氨基酸序列中的缺口用圆点表示。图5烟叶样品中的海藻糖酶活性。非转基因对照植物用字母a-1表示，pMOG1078的转基因植物用数字表示。图6：pMOG845(patatin驱动的TPS E.coli表达)和pMOG1027(35SCaMV反义-海藻糖酶的表达)的马铃著转基因植物的茎节上诱发的小块茎中海藻糖的累积。N表示被筛选的转基因系的总数。实验以复制结果的两个值a和b来进行。ND：未测定。
根据本发明，已发现植物和植物某些部分中的增加水平的海藻糖的积累是可行的。可利用这个重要发现，通过采用植物系统以较低的费用来生产和/或积累高水平的海藻糖。
根据本发明的一个方面，增加水平的海藻糖的累积通过抑制内源海藻糖酶实现。对海藻糖酶的抑制可基本上通过两种方式来完成：通过外源性地施加海藻糖酶抑制剂，以及通过内源性地产生海藻糖酶抑制剂，例如通过用编码海藻糖酶抑制剂的DNA序列转化植物。
这种抑制作用同样可很好地用于以能够产生海藻糖的酶转化的植物中，而且还可用于能天然合成海藻糖的植物中。
根据本发明的第一个具体实施方案，外源性地将海藻糖酶抑制剂施加到植物系统中。根据本发明可用于该方法的海藻糖酶抑制剂的实例为小单孢菌属(Micromonospora)的菌株SANK 62390(Ando等，1991，J.Antibiot.44，1165-1168)产生的trehazolin，烃氧基胺有效霉素(validoxylamine)A、B、G、D-葡糖-二氢羟氧基胺有效霉素A，L-艾杜糖-二氢烃氧基胺有效霉素A，脱氧野尻霉素(Kameda等，1987，J.Antibiot.40(4)，563-565)5-epi-trehazolin(Trehalostatin)(Kobayashi Y.等，1994，J.Antiobiot. 47，932-938)，锥栗精胺(Castanospermin)(Salleh H.M和Honek J.F. 1990.3.FEBS262(2)，359-362)和来自美洲大蠊的86KD蛋白(HayaKawa等，1989，J.Biol.Chem，264(27)，16165-16169)。
根据本发明优选的海藻糖酶抑制剂为有效霉素A(1，5，6-三脱氧-3-O-β-D-吡喃葡糖基-5-(羟甲基)-1-[[4，5，6-三羟基-3-(羟基)-2-环己烯-1-基]氨基]-D-chiro-肌醇)。海藻糖酶抑制剂以适宜于植物，植物某些部分或培养物吸收的形式施加于植物或植物某些部分或植物细胞培养物中。典型的海藻糖酶抑制剂为活性成分为1000mM至10mM之间的水溶液形式，优选为0.1至1mM之间。水溶液可以喷洒至叶片，浇灌，将其加入到水培的培养基中等形式施加于植物或植物某些部分。有效霉素的其它适宜的制剂为Solacol，一种市售农用制剂(Takeda Chem.Indust.，Tokoyo)。
另外或除了外源性地使用施加的海藻糖酶抑制剂，还可通过引入编码它的遗传信息来提供海藻糖酶抑制剂。一种形式的这种内源海藻糖酶抑制剂可由导致RNA产生的基因构建物组成，该RNA与编码海藻糖酶的内源RNA充分互补以与所述内源产物相互作用，从而抑制所述转录产物的表达。这种所谓的“反义方法”在现有技术中已为熟知(特别参见EP 0240208A和公开在WO95/01446中的抑制SPS的实施例)。
编码海藻糖酶的基因已从马铃著cDNA文库中分离并测序。SEQID NO：10所示的推测的海藻糖酶的氨基酸序列来自描述在SEQID NO：9的核苷酸序列。该序列与已知的非植物海藻糖酶的序列的比较表明它们缺乏同源性。因此怀疑用于反义方法中的该海藻糖酶序列是否能抑制植物中的海藻糖酶的表达。
当然本发明最优选的具体实施方案通过用与内源海藻糖酶基因完全匹配的反义海藻糖酶基因转化植物而获得。然而，还可采用具有高度同源性的序列。因此，用于马铃薯转化的反义海藻糖酶基因将针对于SEQ ID NO：9描述的核苷酸序列。本申请还证明了该马铃薯海藻糖酶序列也可用来抑制蕃茄中海藻糖酶的表达，因为该马铃薯的序列高度同源于该蕃茄的海藻糖酶序列。因此，预计该马铃薯的序列至少在紧密相关的种类中是适用的，但也可能在其它植物中适用。甚至是这种情况，为了取得对内源海藻糖酶的表达的有效抑制，通常认为仅表达反义定向中的同源基因的一部分就足够了(参见Vander Krol等，1990，PlantMolecular Biology，14，457-466)。而且，本申请表明马铃薯的海藻糖酶序列可用于其它种类中的同源性检测。
使用一些不同的方法可阐明其它植物的海藻糖酶基因序列。一种方法是使用分离的马铃薯cDNA作为探针来筛选含有所需植物种类的cDNA的cDNA文库。然后可分离阳性反应克隆，并亚克隆至适宜载体。
鉴定该基因的第二种方法是通过纯化与海藻糖降解有关的蛋白。该方法的一个实施例是从马铃薯块茎中纯化具有酸性蔗糖酶活性的蛋白(Burch等，Phytochemistry，vol.31，No.6，pp.1901-1904，1992)。得到的蛋自制品也显示出海藻糖水解活性。纯化步骤后获得的蛋白制品的二糖水解活性可按Dahlqvist描述的来进行监测(Analytical BiochemistryI，18-25，1964)。
在具有海藻糖水解活性的蛋白被纯化匀一后，测定N末端的氨基酸序列或蛋白质消化后的内部片段的序列。这些序列使寡核苷酸探针的设计成为可能，该寡核苷酸探针被用于聚合酶链反应(PCR)或杂交试验中以通过使用标准的分子克隆技术来分离相对应的mRNA。
另一方面，可基于从其它物种分离的海藻糖酶基因中存在的保守序列来设计简并引物。这些引物被用于PCR方法中以扩增推断的海藻糖酶基因。以序列信息或Southern印迹为基础，可鉴定海藻糖酶的PCR片段并分离相对应的cDNA。
接着将编码海藻糖降解酶的分离的cDNA融合至启动子序列中，这样转录导致了反义mRNA的合成。
另一种形式的这种内在海藻糖酶抑制剂可由导致能抑制植物中海藻糖酶活性的蛋白质产生的基因构建物组成。已从休眠的美洲大蠊成虫的血清中分离纯化了由蛋白质组成的海藻糖酶的抑制剂(Hayakawa等，见上文)。在所述出版物中已被部分描述了序列的该蛋白可根据标准的分子生物学方法，通过分离编码该蛋白的基因，将该基因融合到适宜启动子中并将所述融合基因转化到植物中而变得可表达。
启动子可选自任何能驱动植物细胞中的转录的基因。
如果仅希望海藻糖在植物某些部分累积，例如马铃薯(小)块茎，则海藻糖酶抑制DNA构建物(例如反义构建物)包含优先在(小)块茎中表达的启动子片段，从而使在植物细胞的其余部分的内源海藻糖酶水平基本上不受影响。因此，由于海藻糖的扩散引起的海藻糖对邻近植物细胞的任何反面影响通过在植物剩余部分的未受影响的内源海藻糖酶的活性而抵消。
在说明本发明的实施例中，其中磷酸海藻糖合酶在Patatin启动子片段的控制下产生，而且抑制海藻糖酶的构建物可包含Patatin基因的启动子片段。
如果要将海藻糖累积在蕃茄的果实中，则予以必要的修改，采用至少在蕃茄果实中表达的植物可表达的磷酸海藻糖合酶基因以及植物可表达的抑制海藻糖酶的DNA构建物，该构建物将在果实中优先表达，并优先不在或本质上不在果实之外表达。EP0409629A1公开了可在蕃茄果实中用于驱动DNA-构建物优先表达的启动子片段的一个实施例。不脱离本发明范围的这方面的多种修改是本发明相关领域普通技术人员很容易设想到的。
阻断不期望的酶活性的合成，例如由内源海藻糖酶导致的活性的另一个方法是将所述内源海藻糖酶基因的另外拷贝引入植物宿主的基因组中。经常观察到内源基因的转基因拷贝沉默了内源基因和转基因的表达(EP04655672A1)。
根据本发明的一个具体实施方案，在植物中产生了海藻糖的累积，其中通过引入编码磷酸海藻糖合酶(TPS)的植物可表达基因构建物引入了产生海藻糖的能力，参见例如WO95/06126。
可采用植物细胞中的DNA特异性或组成性表达所必需的调节要素控制下的任何磷酸海藻糖合酶，只要它能产生有活性的磷酸海藻糖合酶活性。最优选的为磷酸海藻糖合酶基因，其还含有磷酸海藻糖磷酸酶活性的编码序列，即所谓的双向酶。这种基因，以前仅已知存在于酵母中(参见例如WO93/17093)，也可在大多数植物中找到。本申请描述了为来自向日葵(Helianthus annuus)的这种基因，同时还给出了在烟草中存在同源基因的证据。应认为使用双向酶增加了海藻糖的产生，因为它使在一个且是同一位置从UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸转化为海藻糖的代谢途径能够完成。因此，两步合成简化成一步反应，从而加快了反应速度以及后来的海藻糖的产率。
由于参与海藻糖合成的基因，尤其是编码双向酶的基因可从其它来源得到，因此，可以相似的方式采用这些基因来获得根据本发明的植物可表达海藻糖合成基因。
用于分离海藻糖合成活性的来源包括微生物(如细菌、酵母、真菌)，但这些基因还可在植物和动物中找到。
本发明还包括核酸序列，该核酸序列通过修饰编码海藻糖合成中具有活性的酶的核酸序列而获得，所述修饰通过突变一个或多个密码子而由此导致被编码的蛋白质中氨基酸变化来完成，只要氨基酸序列的突变没有完全消除海藻糖合成活性。
根据本发明的另一个具体实施方案，将植物进行遗传改变以在植物的特定部分产生和累积海藻糖，基于以下考虑选择植物的特定部分：例如酶底物的可得性，植物的某一部分对海藻糖作用于植物细胞的任何推测的反作用的不敏感性等，优选的海藻糖合成酶的表达部位为植物的淀粉贮藏部分。特别是马铃薯块茎被认为是适宜的植物部分。实现马铃薯小块茎和块茎中选择性酶表达的优选的启动子可从马铃薯patatin基因的开放读框上游区获得。
提供仅仅编码磷酸海藻糖合酶基因的植物可通过引入编码能将磷酸海藻糖转化为海藻糖的磷酸酶的另外基因而进一步被修饰。至少在马铃薯块茎或小块茎，马铃薯叶子和烟草叶和根中看来存在内源磷酸酶活性，这样引入磷酸海藻糖磷酸酶(TPP)基因不是绝对必需的。
种子植物中的优选植物宿主为被子植物纲的，特别是双子叶植物纲，包括尤其是茄科作为代表科以及单子叶植物纲，包括尤其是禾本科作为代表科。本发明上下文定义的适宜的宿主植物包括植物(以及所述植物的某些部位和细胞)和它们的后代，所述植物和它们的后代通过使用重组DNA技术被遗传修饰，以在所需植物或植物器官中导致或增强海藻糖的产生，在加工中可直接使用这些植物(如产生可食部分的植物种类)或从所述宿主中提取和/或纯化海藻糖。根据本发明的具有可食部分的作物包括具有花，例如花椰菜(BrassicaOleracea)、莱蓟(Cynara Scolymus)、果实，例如苹果(Malus，例如家种的)、香蕉(芭蕉属，例如acuminata)、浆果(例如茶藨子属，茶藨子，例如红核)、樱桃(例如欧洲甜樱桃，樱桃属(Prunus)例如avium)、黄瓜(黄瓜属(cucumis，例如Sativus)、葡萄(葡萄属(Vitis)，例如酿酒葡萄(Vinifera)、柠檬(Citrus Cimon)、甜瓜(Cucunnis melo)坚果(例如核桃、胡桃属(Juglans)、例如regia；落花生，花生(Arachishypogeae)、橙(柑桔属(Citrus，例如maxima)、桃子(桃属(Prunus)，例如桃)、梨(Pyra，例如普通的)、胡椒(茄属(Solanum)，例如辣椒)、李(李属(Prunus)，例如家种的)、草莓(草莓属，例如moschata)、蕃茄(蕃茄属(Lycopersicon，例如可食的)，叶，例如苜蓿(Medicago Sativa)、甘蓝(例如卷心菜(Brassica oleracea)、苣蕒菜(菊苣属(Cichoreum，例如苣菜)、欧洲韭(Allium porrum)、莴苣(Lactuca Sativa)、菠菜(Spinaciao-leraceae)、烟草(Nicotiana tobacum)、根，例如木薯(Maranta arundinacea)、甜菜(Beta Vulgaris)、胡萝卜(Daucus carota)、木薯(Manihot esculenta)、芜菁(Brassica rapa)、萝卜(Raphanus sativus)、薯蓣(Dioscorea esculenta)、番薯(Ipomoea batatas)和种子，例如豆(Phaseolus Vulgaris)、豌豆(PisumSativum)、大豆(Glycinmax)、小麦(Triticum Aestivum)、大麦(HordeumVulgare)、玉米(Zea mays)、稻(Oryza Sativa)，块茎，例如甘蓝(Brassicaoleraceae)、马铃薯(Solanum tuberosum)等。由于存在植物可表达磷酸海藻糖合酶基因，可在其中产生的增强的海藻糖水平存在下通过干燥保存可食部分。
将编码海藻糖合成酶的植物可表达基因或任何其它的有义或反义基因引入受体植物细胞的方法不是关键，只要该基因在所述植物细胞中表达。优选使用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)介导的转化，但其它方法对将DNA引入植物细胞也是可行的。实施例为使用钙/聚乙二醇方法，电穿孔，显微注射和包被DNA的颗粒轰击对原生质体进行转化(Potrykus，1990，Bio/Technol.8，535-542)。也可组合使用土壤杆菌和有被颗粒轰击。还可采用牵涉到非土壤杆菌属的其它活载体的转化方法，例如病毒载体(如来自花椰菜嵌合病毒(CaMV)和/或土壤杆菌和病毒载体的结合，该方法称为土壤感染(agroinfection(Grimsley N.等，8 January 1987，1，8，Nature 325，177-179)。选择和/或筛选后，使用现有技术中已知的方法将已被转化的原生质体、细胞或植物的某些部分再生到整个植物中(Horsch等，1985，Science 225，1229-1231)。
能繁殖的单子叶作物组织培养系统的开发，以及将遗传物质导入植物细胞的方法，使得转化容易实施。目前，对单子叶(monocot)种类进行转化的优选方法是，使用超剧毒的土壤杆菌菌株、外植体或悬浮细胞的微粒轰击以及直接的DNA摄取或电穿孔(Shimamoto等，1989，自然338，274-276)进行转化。在水稻中土壤杆菌介导的转化效果很好(WO94/00977)。通过微粒轰击，将吸水链霉菌(Streptomyceshydroscopicus)bar基因导入玉米悬浮培养物的处于胚胎发育细胞中而获得转基因玉米植株，其中bar基因编码Phosphinothrichin乙酰转移酶(一种使除草剂phosphinothricin失活的酶)(Gordon-Kamm，1990，植物细胞，2，603-618)。将遗传物质导入其它单子叶作物如小麦和大麦的糊粉原生质体，现已有报道(Lee，1989，Plant Mol.Biol13，21-30)。已通过仅选择用于建立胚胎发生悬浮培养物的结团和结瘤胚胎发生愈伤组织，从胚胎发生悬浮培养物中再生出大麦(Vasil，1990 Bio/Technol 8，429-434)。
用于控制植物可表达基因(包括标记基因)表达的合适DNA序列，如转录起始区、增强子、非转录的前导区等，可来源于任一在植物细胞中被表达的基因。也可以采用结合了各种启动子功能部分的杂合启动子或它的合成的等同物。根据本发明，除组成型启动子外，诱导型启动子，或另外受其表达方式调节的启动子，如改进型或细胞类型特异性的启动子均可用于控制植物可表达基因的表达，只要这些可表达基因是在含TPS底物的植物部分中表达的。
为选择或筛选用于转化的细胞，优选其含一标记基因，该标记基因与根据本发明的将要被转化入植物细胞的植物可表达基因连接。在植物转化中合适标记基因的选择对本领域普通技术人员来说是熟知的；常规使用的一些标记基因的实例为给予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶基因(EP-B131623)、给予谷胱甘肽衍生的除草剂抗性的来自大鼠肝脏的谷胱甘肽-S-转移酶基因(EP-A-256223)、给予谷氨酰胺合成酶抑制剂如phosphinothricin过表达抗性的谷氨酰胺合成酶基因、给予选择剂phosphinothricin抗性的来自产绿色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)的乙酰转移酶基因(EP-A-275957)、给予膦酰基甲基甘氨酸耐性的编码5-烯醇莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因、给予双丙氨酰膦抗性的bar基因(如WO91/02071)等等。标记的实际选择不是关键，只是它在与所选植物细胞组合时起作用(即，选择性)。
不必将标记基因和目的基因连接起来，因为在植物转化中非连接基因的共转化(美国专利4,399,216)也是一种有效方法。
用于转化的优选植物材料，特别是双子叶作物为圆叶，其易被转化并具有良好的再生能力(Horsch R.B.等，(1985)Science 227，1229-1231)。
对于本发明来说，如何使两个或多个基因存在于同一植株中并不重要。可特别通过下述方法之一完成这一工作：(a)使用含多于1个导入基因的多基因构建物转化植物细胞系，(b)同时向一个植物细胞系中共转化不同的构建物，(c)用要导入的基因连续循环转化同一植物，(d)将两种植物杂交，每种植物都含有一个要导入同一植物的不同基因，或(e)将上述方法结合使用。
本发明的应用领域为农业和园艺业，例如由于改良植物的改善性能(例如耐应激性，如耐寒、特别是耐旱、植物和植物产品的收获后的质量及储存期均提高)，也可应用于各种工业中，其中在干燥或冷冻干燥这种迫使水分抽出的工艺过程中使用或将使用海藻糖。可以使用或销售海藻糖，例如呈纯化形式或混合物形式的海藻糖，或呈植物产品形式，如含海藻糖的块茎、果实、花等，其为天然状态或(部分)脱水形式。可以同样的方式使用或销售含(增高水平的)磷酸海藻糖或海藻糖的植物部分，或者加工这些植物而不必添加海藻糖。
也可以从产生海藻糖的植物或植物部分提取和/或纯化海藻糖，并随后将其用于工业生产中。食品工业中，可通过在干燥前将海藻糖加入食物中来利用海藻糖。食品干燥是一种重要的保存方法。海藻糖看来特别有用于保藏通过常规的空气干燥的食品，并且，加水后能使高质量产品快速复原(Roser等，July 1991，Trends in Food Science and Technology，第166-169页)。其优点包括保留了新鲜食品天然的风味/香味、味道及营养价值(蛋白质和维生素)。已表明海藻糖具有稳定疫苗、酶和膜这些蛋白质的能力，并能形成一种化学惰性的稳定的玻璃体。这种彻底干燥食品的低水活性能防止引起腐败的化学反应。
长久以来，农作物如谷类、木薯、马铃薯、甜菜和甘蔗被用作批量生产糖产品(淀粉和蔗糖)的天然原料。通过基因工程手段在这些植物品种中进行海藻糖的生物合成途径，使得在这些作物中生产海藻糖变得容易，从而能开发这种用来生产海藻糖的基因工程作物。
海藻糖也可用于干燥或储存生物大分子，如肽、酶、多核苷酸等。
本说明书引用的所有文献表明了本发明相关领域的技术水平。本说明书在先或之后引用的所有出版物，无论是专利还是其它文献，均在此引作参考，正如其中的每一篇曾单独引为参考一样。特别是在这里引用的，描述通过基因操作在高等植物中生产海藻糖的WO95/01446，被本文引作参考。
下述实施例说明了本发明，在任何意义上都不限制本发明的范围。实验DNA操作
所有DNA操作(从E.Coli中分离DNA、限制、连接、转化等)均按标准手册(Sambrook等(1989)Molecular Cloning：a laboratorymanul，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，NewYork)实施。菌株
在所有实施例中使用E.Coli K-12菌株DH5α进行克隆。用于植物转化实验的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株为EHA105和MOG101(Hood等1993，Trans.Research2，208-218)。 Patatin启动子的分离/pMOG546的构建
使用聚合酶链反应从马铃薯(Solanum tuberosum CV.Bintje)的基因组DNA中分离patatin启动子片段。合成了含下列序列的与λpat21 patatin基因上游区域序列互补的一组寡核苷酸(Bevan，M.，Barker，R，Goldsbrough，A.，Javis，M.，Kavanagh，T.和Iturriaga，G.(1986)Nucleic Acids Res.14：5564-5566)：
5′AAG CTT ATG TTG CCA TAT AGA GTA G3′ Pat B 33.2
(SEQ ID NO：3)
5′GTA GTT GCC ATG GTG CAA ATG TTC 3′Pat ATG 2
(SEQ ID NO：4)
使用从马铃薯cv.Bintje分离的基因组DNA为模板，将这些引物用于PCR扩增一个1123bp的DNA片段。扩增片段显示与λpat21 patatin序列高度的相似性，并使用EcoRI接头克隆入pUC18载体，得到质粒pMOG546。pMOG799的构建
pMOG799含有受双倍增强的35S花椰菜嵌合启动子控制的来自E.Coli的TPS基因。此双载体构建物被详细描述于被本文引作参考的国际专利申请WO95/01446中。pMOG845的构建
用NcoI-KpnI消化含patatin启动子的质粒pMOG546，在dATP和dCTP存在下将质粒与E.Coli DNA聚合酶I一起温育，由此破坏NcoI和KpnI位点，随后将该质粒释放。从所得载体中分离出一个含patatin启动子的1.1kb EcoRI-SmaI片段，并将其克隆入以SmaI-EcoRI线性化的pMOG798中(详述于WO95/01446)，由此用35S CaMV启动子替换patatin启动子。所得载体以Hind III线性化并用下面的寡核苷酸双链连接：
(HindIII) PstI KpnI HindIII
5′AGCT CTGCAG TGA GGTACC A 3′TCV 11
(SEQIDNO：5)
3′GACGTC ACT CCATGG TTCGA 5′TCV 12
(SEQIDNO：6)
检查导入的寡核苷酸双链的方向后，用PstI-HindIII使所得载体线性化，然后再插入一个含马铃薯蛋白酶抑制剂II终止子(PotPiII)的950bp PstI-HindIII片段(An，G.，Mitra，A.，Choi，H.K.，Costa，M.A.，An，K.，Thornburg，R.W.和Ryan，C.A.(1989)ThePlant Cell 1：115-122)。用分离自马铃薯cv.Desiree的基因组DNA为模板及下组寡核苷酸，通过PCR扩增分离出Pot Pi II终止子。
5′GTACCCTGCAGTGTGACCCTAGAC 3′TCV 15
(SEQ ID NO：7)
5′TCGATTCATAGAAGCTTAGAT 3′TCV 16
(SEQ ID NO：8)随后，将此TPS表达盒作为EcoRI-HindIII片段克隆入双载体pMOG402，从而得到pMOG845(图1)。含pMOG845的E.coli Dhα菌株的样品已于1995年1月4日保藏于CentraalBureau voor Schimmelcultures，Oosterstraat 1，P.O.Box 273，3740AG Barrn The Netherlands；由国际保藏机构(theInternationalDepositary Institution)给出的保藏号为CBS 101.95。三亲本交配
在三亲本交配中用含质粒pRK2013的E.coli菌株HB101(Ditta G.Stanfield，S.，Corbih，D.，和Helinski，D.R.等(1980)ProcNatl.Acad.Sci.USA 77，7347)将双载体转入根癌土壤菌株MOG101或EHA105，并用于转化。烟草(Nicotina tabacum SR1)的转化
通过将植物组织与含上述目的双载体的根癌土壤杆菌菌株MOG 101共培养来转化烟草。根据Horsch等1985，Science 227，1229-1231所述方法，使用烟草(Nicotiana tabacum SR1)的圆叶片的共培养完成转化。从生长于含卡那霉素的选择性培养基上的幼苗再生出转基因植物，让植物长出根并将其转移至土壤中。马铃薯圆块茎的转化
用含目的双载体的土壤杆菌EHA105转化马铃薯(Solanumtuberorum cv.Kardal)。基本培养基为MS30R3培养基，由MS盐(Murashige，T.和Skoog，F.(1962)Physiol.Plan.14473)、R3维生素(Ooms等(1987)Theor.Appl.Genet.73，744)、30g/l蔗糖、0.5g/l MES组成，最终pH5.8(以KOH调节，必要时用8g/lDaichin琼脂固化。将马铃薯块茎削皮，通过在96％乙醇中燃烧5秒钟使表面灭菌。用无菌水熄灭火焰，并切片约2mm厚。用一个钻孔从其脉管组织上切下小圆片，并在MS30R3培养基中温育20分钟，该培养基包含1-5×108个细菌/ml的具有双载体的土壤杆菌EHA105。用MS30RS培养基洗涤块茎圆片，并将其转移至固化的后培养基(PM)。PM由补充有3.5mg/l玉米素核苷和0.03mg/l吲哚乙酸(IAA)的MS30R3组成。两天后，圆片被转移至含有200mg/l头孢噻肟和100mg/l万古霉素的新鲜P M培养基。三天后，块茎圆片被转移至幼苗诱导培养基(SIM)，该培养基由含250mg/l羟苄青霉素和100mg/l卡那霉素的PM培养基组成。4-8周后，将从圆片上萌发的幼苗切下，种在生根培养基中(MS30RS培养基，含有100mg/l头孢噻肟，50mg/l万古霉素和50mg/l卡那霉素)。切去分生组织，纯性繁殖出根。马铃薯茎部分的转化方法
根据Newell C.A.等，Plant Cell Reports 10：30-34，1990所述的类似方法，使用茎节间完成马铃薯转化实验。小块茎的导入
含有辅助分生组织的离体马铃薯茎部分被转移至小块茎诱导培养基。小块茎诱导培养基含1×MS-盐，补充有R3维生素、0.5g/l MES(以KOH调节终pH为5.8)、以8g/l Daishin琼脂固化，60g/l蔗糖和2.5mg/l细胞分裂素。在暗处24℃下生长3至5周后，小块茎形成。海藻糖测定
通过带有脉冲电流探测装置的阴离子交换色谱来定量测定海藻糖。向1g冷冻材料中加入1ml沸水，随后于100℃加热15秒，从而制备提取物。在装备有一个4×250mm Dionex 35391 carbopac PA-1柱和一个4×50mm Dionex 43096 carbopac PA-1柱的Dionex DX-300液相色谱设备上分析样品(25μl)。用100mM NaOH 1ml/min洗脱。用脉冲电流探测器(Dionex，PAD-2)检测糖。市售海藻糖(Sigma)用作标准。有效霉素A的分离
根据Kendall等(1990)Phytochemistry，Vol.29，No.8，第2525-2528页所述方法，从一种市售农药制剂Solacol(Takeda Chem.Indust.，Tokyo)中分离有效霉素A。此过程包含对3％农药制剂Solacol进行离子交换色谱(QAE-Sephadex A-25(Pharmacia)，床体积10ml，平衡缓冲液为pH7的0.2mM Na-Pi)。在柱上装载1ml Solacol，用水洗脱7个馏分，在馏分4差不多回收到所有的有效霉素。
以使用该方法的100％的回收率为基础，在MS-缓冲液中有效霉素A的浓度被调至110-3M，以用于海藻糖积累测试。
或者也可根据Iwasa T等1971，在The Journal ofAntibiotics 24(2)，119-123中所述方法从吸水链霉素柠檬变种(Streptomyces hyroscopicus var.Limoneux)中直接纯化有效霉素A和B，此文献内容被本文作为参考。pMOG1027的构建
pMOG1027含有来自Solanum tuberosum cv.Kardal的海藻糖酶基因，该基因呈反方向受控于双倍增强的35S花椰菜启动子。此载体的构建与pMOG799的构建非常相似，任何一名本领域技术人员均可实施。通过三亲本交配将此双载体迁移入土壤杆菌后，该菌株能用于转化植物细胞，并产生海藻糖酶活性水平降低的转基因植物。pMOG1028的构建
pMOG1028含有来自Solanum tuberosum cv.Kardal的海藻糖酶基因，该基因呈反方向受控于块茎特异的patatin启动子。此载体的构建与pMOG845很相似，任何一名本领域技术人员都可实施。通过三亲本交配将该双载体迁移入土壤杆菌后，此菌株能用于马铃薯转化实验，产生块茎组织中海藻糖酶活性水平降低的转基因植物。pMOG1078的构建
为易化双表达盒的构建，该盒含在“有义”方向受控于双倍增强的35SCaMV启动子的海藻糖酶cDNA克隆，通过基于点突变的PCR从海藻糖酶cDNA编码区(不改变氨基酸序列)移出两个HindIII位点。以这种方式人工改造了BamHI片段，其含有完整的海藻糖酶开放读框。随后将此片段用于克隆入双载体pMOG800，其位于构建的脱35SCaMV启动子之后，产生pMOG1078。pMOG800源自pMOG402；恢复了多接头中的KpnI位点。pMOG402源自pMOG23(见WO95/01446)，含有一个恢复的新霉素磷酸转移酶基因(Yenofsky R.L.Fine M.，Pellow J.W.Proc NatlAcad Sci USA 87：3435-3439，1990)。
实施例1
在pMOG799转化的烟草植物中海藻糖的生产
使用根癌土壤杆菌以双载体pMOG799转化烟草圆叶片。在卡那霉素上选择转基因幼苗。将转基因植物转移至温室，开花，自交(S1)后长出种子。将这些转基因植物的种子表面灭菌，让其在含卡那毒素的培养基上体外萌发。将卡那霉素抗性的幼苗和野生型烟草植株转移至补充有10-3M有效毒素A的MS-培养基中。作为对比，将转基因的幼苗和野生型植物转移至没有有效霉素A的培养基中。分析生长于有效霉素A的植株的叶和根，与对照植株相比，其显示出增高的海藻糖水平(表1)。在野生型烟草植株中未检测出海藻糖。表1
含有有效霉素A 无有效霉素A
叶 根 叶 根pMOG 799.1 0.0081 0.0044 - 0.003pMOG 799.13 0.0110 0.0080 - -pMOG 799.31 0.0008 0.0088 - -野生型 SR1 - - - -
实施例2
在pMOG845转化的土豆小块茎中的海藻糖的生产
用含双载体pMOG845的根癌土壤杆菌EHA105转化马铃薯Solanum tuberosum CV.Kardal圆块茎。在卡那霉素上选择转基因幼苗。在转基因植株和野生型植株的茎部分诱导小块茎，这些植株培养于10-3M有效霉素A的小块茎诱导培养基中。作为对比，在不含有效霉素A的培养基上诱导小块茎。与生长于不含有效霉素A培养基中的小块茎相比，在含有效霉素A的培养基中诱导的小块茎海藻糖水平增高(表2)。野生型小块茎中未检测出海藻糖。表2
海藻糖(％鲜重)
+有效霉素A -有效霉素A845-2 0.016 -845-4 - -845-8 0.051 -845-13 0.005 -845-22 0.121 -845-25 0.002 -WT Kardal - -
实施例3
在pMOG799转化的烟草植株水培中
海藻糖的生产
将以双载体pMOG799转化的自交烟草植株的种子表面灭菌，并使其在含50μg/ml卡那霉素的MS20MS培养基中体外萌发。卡那霉素抗性的幼苗被转移至土壤，并于温室中(温度23℃，16小时光照/天)生长。4周后，幼苗被转移至含ASEF粘土颗粒的约450ml培养基中水培。该培养基含有溶解于钠-水缓冲液中的40g/l Solacol，以0.5g/l MES调pH为6.0，通过一过滤器筛去固体颗粒。加入POKONTM(1.5ml/l)补充必需的盐。加入下列抗菌素以防止微生物生长：500μg/ml羧苄青霉素、40μg/ml制霉菌素和100μg/ml万古霉素。作为对比，转基因幼苗和野生型植株被转移到不含Solacol的培养基中。对生长于Solacol的植物的叶子进行分析，与对照植株相比，其显示出增高水平的海藻糖。在野生型烟草植株中未检测到海藻糖。表3
Solacol 海藻糖(％w/w)pMOG 799.1-1 + 0.008pMOG 799.1-2 + 0.004pMOG 799.1-3 - - pMOG 799.1-4 - -pMOG 799.1-5 + 0.008pMOG 799.1-6 - -pMOG 799.1-7 + 0.005pMOG 799.1-8 - -pMOG 799.1-9 - -pMOG 799.1-10 + 0.007野生型SR1-1 - -野生型SR1-2 + -野生型SR1-3 - -野生型SR1-4 + -
实施例4
来自马铃薯块茎的编码海藻糖酶全部长度cDNA的克隆
使用已知海藻糖酶基因(大肠杆菌、酵母、兔、B.mori)(图3)保守区的氨基酸序列，设计出四个简并引物：
C C C CGT GT A TTAT
GG GGI G TT IGA T TA TGGGAC Tase24(SEQIDNO：11)
T A A TAA AG C CGGC
TAA GT
GTICCIGGIGGICGITT IGA T Tase25(SEQIDNO：12)
CGT AG
T GA TG A A
GGIGG TGI ICGI IAG TA GTA Tase26(SEQIDNO：13)
C CT CA G G
C G AT A
I C TTI CCATCC AAICCITC Tase27(SEQIDNO：l4)
G A GC G
在PCR实验中将这些引物与作为模板的分别来自S.tuberosumCV.Kardal叶子和块茎材料的基因组DNA和cDNA结合，得到几个所需长度的片段。由引物Tase24和Tase26结合获得的大量190bp片段被亚克隆入pGEMT载体并被测序。所分析的几个克隆表明与已知海藻糖酶序列同源。为避免非植物源海藻糖酶序列的分离，用来自马铃薯cv.Kardal的gDNA进行Southern印迹分析。分离出的大量克隆没有与Kardal基因组DNA杂交，而将其放弃。有两个分离出的克隆是等同的，是来源于基因组PCR实验的gTase15.4和源自cDNA PCR的cTase 52，在Southern印迹分析中两者均表明是杂交的。检测出一条单一杂交带(EcoRI 1.5kb，Hind III 3Kb和长于12kb的BamHI)，表明仅存在所分离PCR片段的一个拷贝。
使用Stratagene cDNA合成试剂盒和载体L ambda ZAPII，从来自马铃薯块茎(cv.Kardal)的poly A+ RNA构建cDNA文库。用放射性标记的cTase 5.2 PCR片段筛选重组噬菌体(500.000)，鉴定出3个阳性克性。纯化后，两个克隆的特征在于分别含限制性酶的外露的2.15和2.3kb的插入物。它们的核苷酸序列100％相同。来自马铃薯包含开放读框的这些海藻糖酶cDNA克隆之一的核苷酸序列示于SEQ ID NO：9，同时来源于这一核苷酸序列的氨基酸序列示于SEQ ID NO：10。包含一个具有编码海藻糖酶遗传信息的插入物的质粒，于1995年12月8日保藏于CentraalBureau voor Schimmelcultures，Oostertraat 1，P.O.Box 273 3740 AGBaarn，the Netherlands，保藏号CBS 804.95。
实施例5
来自马铃薯和其它茄科(Solanaceae)的海藻糖酶基因间的同源性
从蕃茄(Lycopersicon esculentum CV.Money maker)、烟草(Nicotianan tabacum CV.Petit havanna，SR1)和马铃薯(Solanumtuberosum CV.Kardal)中分离基因组DNA，随后用限制酶BamHI、BglII、NcoI、SpeI、AccI、HindIII和EcoRI消化。凝胶电泳和Southern印迹分析之后，将[32P]-α dCTP标记的海藻糖酶马铃薯cDNA探针与印迹杂交。在有马铃薯和蕃茄基因组的泳道中观察到强度几乎相似的杂交信号，表明了高度的同一性。仅在含烟草基因组DNA的泳道中观察到一个微弱的杂交信号，表明同一性程度低。类似方法可被用于鉴别来自其它作物的海藻糖酶基因，通过反义表达方式使用具有足够同源性的异源海藻糖酶cDNA克隆筛选那些海藻糖酶活性可被去除的作物。或者，也可分离出同源海藻糖酶cDNA克隆，并用于反义表达方式中。
实施例6
马铃薯海藻糖酶cDNA在烟草(Nicotiana tabacum)中的超表达
使用根癌土壤杆菌，以双载体pMOG 1078转化烟草圆叶片。在卡那霉素上选择转基因幼苗，并转移至温室。在26株转基因植物和12株非转基因对比植物的叶子样品中测定海藻糖酶活性(图5)。与非转基因植物对照样品相比，测得海藻糖酶活性达约17μg海藻糖/h/μg蛋白，非转基因植物为1μg海藻糖/h/μg蛋白。这明显证实了马铃薯海藻糖酶cDNA的同一性。
实施例7
用pMOG 1027转化pMOG 845转基因马铃薯植株
为了用一个反义海藻糖酶构建物(pMOG 1027)超转化pMOG845转基因马铃薯系，从体外培养的转基因pMOG845的马铃薯幼苗中切下茎部分。选择三个亲代系，pMOG845/11、/22和/28，当其生长在有效霉素A中时表现出能在小块茎中积累海藻糖。利用根癌土壤杆菌以双载体pMOG1027转化茎部分。在潮霉素上选择出超转化体，并于体外生长。
实施例8
pMOG845和pMOG1027的转基因马铃著植株块茎中海藻糖的生产
使用不含海藻糖酶抑制剂有效霉素A的培养基，在pMOG1027超转化的pMOG845转基因马铃薯植株的外植体上诱导小块茎。在这种超转化系中注意到海藻糖积累达0.75mg·g-1鲜重，证明了在这些系中使用反义海藻糖酶表达方式时，海藻糖酶活性减小(图6)。
实施例9
来自向日葵(Helianthus annuus)的二分TPS/TPP基因的分离
为了从向日葵分离二分克隆，使用两个简并引物TPS-deg2和TPS-deg5进行PCR扩增实验。这个引物组与作为模板的构建于向日葵叶RNA的cDNA结合使用。约650bp的DNA片段被扩增，当与来自大肠杆菌和酵母的tps编码区相比时，具有高度相似的氨基酸水平。基于此核苷酸序列，设计了同源引物，并用于Marathon RACE方案(clontech)中以分离相应的tps cDNA的5′和3′部分。在RACE PCR中使用引物结合物SUNGSP1(或2)/AP1，未发现区带，而使用NSUNGSP1(或2)/AP2嵌套PCR(nestedPCR)产生了几个DNA片段。Southern印迹分析后，这些片段中的某些与32P标记的向日葵tps片段杂交。从凝胶中分离出大约1.2kb和1.7kb的两个片段，分别相应于5′和3′部分，将其亚克隆并测序。核苷酸序列显示出与已知tps和tpp序列明显的同源性，表明了所分离cDNA(SEQ ID NO1)的二分性质。利用存在于两个片段中的单一XmaI位点，获得一完整的TPS/TPP二分编码区，并将其亚克隆入pGEM-I(Promega)，产生pMOG1192(图2)。 TPSdeg2： tig git kit tyy tic aya yic cit tyc c(SEQIDNO：23) TPSdeg5： gyi aci arr ttc ati ccr tci c (SEQIDNO：27) SUNGSP1： cga aac ggg ccc atc aat ta (SEQIDNO：15) SUNGSP2： tcg atg aga tca atg ccg ag (SEQIDNO：16) AP1(Clontech)：cca tcc taa tac gac tca cta tag ggc (SEQIDNO：17) NSUNGSP1： cac aac agg ctg gta tcc cg (SEQIDNO：18) NSUNGSP2： caa taa cga act ggg aag cc (SEQIDNO：19) AP2(Clontech)：act cac tat agg gct cga gcg gc (SEQIDNO：20)
实施例10
从烟草(Nicotuana tabacum)中分离二分TPS/TPP基因
从植物或其它生物中分离二分TPS/TPP基因的另一方法包括在单一PCR反应中结合使用TPS和TPP引物。例如，使用产生于烟草叶全部RNA的cDNA和引物组TPS deg1和TRE-TPP-16进行PCR。利用每一次反应的带有TPS deg2和TRE-TPP-15的扩增混合物为模板的嵌套PCR得到约1.5kb的DNA片段。带有TPS deg2和TRE-TPP-10的原始扩增混合物的嵌套PCR产生了一个约1.2kb的DNA片段。
使用引物组合TPS degl和TRE-TPP-6进行初始扩增，随后用引物组合TPS deg2和TRE-TPP-15进行嵌套PCR，得到一个约1.5kb的DNA片段。
根据序列分析，1.2kb和1.5kb的扩增DNA片段显示出与TPS和TPP编码区具有高度同一性，表明它们编码二分TPS/TPP蛋白。TPSdeg1： GAY ITI ATI TGG RTI CAY GAY TAY CA (SEQIDNO：21)TRE-TPP-16： CCI ACI GTR CAI GCR AAI AC (SEQIDNO：22)TPSdeg2： TlG GIT KIT TYY TIC AYA YIC CIT TYC C (SEQIDNO：23)TRE-TPP-15： TGR TCI ARI ARY TCY TTI GC (SEQIDNO：24)TRE-TPP-10： CCR TGY TCI GCI SWI ARI CC (SEQIDNO：25)TRE-TPP-6： TCR TCI GTR AAR TCR TCI CC (SEQIDNO：26)
序列表(1)一般信息： (i)申请人：
(A)姓名：MOGEN INTERNATIONAL NV
(B)街道：Einsteinweg 97
(C)城市：Leiden
(E)国家：荷兰
(F)邮政编码(ZIP)：2233 CB
(G)电话：(31)71-5258282
(H)传真：(31)71-5221471 (ii)发明名称：植物中海藻糖的增强累积 (iii)序列数：27 (iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOC/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO：1的信息 (i)序列特征
(A)长度：2621碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：双链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA至mRNA (iii)假拟：否 (ix)特征：
(A)名称/键：CDS
(B)位置：25..2485
(D)其它信息：/功能＝“磷酸海藻糖合酶和磷酸海藻糖磷酸酶”/产物＝“双向酶” (ix)特征：
(A)名称/键：未确定
(B)位置：1609..1611 (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：CTGATCCTGC GGTTTCATCA CAAT ATG ATA CTC TTA CAT CTG ATG CCC CTT 51
Met Ile Leu Leu His Leu Met Pro Leu
1 5CAG ATG CTC CCA AAT AGG TTG ATT GTC GTA TCG AAT CAG TTA CCC ATA 99Gln Met Leu Pro Asn Arg Leu Ile Val Val Ser Asn Gln Leu Pro Ile 10 15 20 25ATC GCT AGG CTA AGA CTA ACG ACA ATG GAG GGT CCT TTT GGG ATT TCA 147Ile Ala Arg Leu Arg Leu Thr Thr Met Glu Gly Pro Phe Gly Ile Ser
30 35 40CTT GGG ACG AGA GTT CGA TTT ACA TGC ACA TCA AAG ATG CAT TAC CCG 195Leu Gly Thr Arg Val Arg Phe Thr Cys Thr Ser Lys Met His Tyr Pro
45 50 55CAG CCG TTG AGG TTT TCT ATT CTT GGC GAT CCA CTA AGG GCT GAC GTT 243Gln Pro Leu Arg Phe Ser Ile Leu Gly Asp Pro Leu Arg Ala Asp Val
60 65 70GGC CCT ACC GAA CAA GAT GAC GTG TCA AAG ACA TTG CTC GAT AGG TTT 291Gly Pro Thr Glu Gln Asp Asp Val Ser Lys Thr Leu Leu Asp Arg Phe
75 80 85AAT TGC GTT GCG GTT TTT GTC CCT ACT TCA AAA TGG GAC CAA TAT TAT 339Asn Cys Val Ala Val Phe Val Pro Thr Ser Lys Trp Asp Gln Tyr Tyr 90 95 100 105CAC TGC TTT TGT AAG CAG TAT TTG TGG CCG ATA TTT CAT TAC AAG GTT 387His Cys Phe Cys Lys Gln Tyr Leu Trp Pro Ile Phe His Tyr Lys Val
110 115 120CCC GCT TCT GAC GTC AAG AGT GTC CCG AAT AGT CGG GAT TCA TGG AAC 435Pro Ala Ser Asp Val Lys Ser Val Pro Asn Ser Arg Asp Ser Trp Asn
125 130 135GCT TAT GTT CAC GTG AAC AAA GAG TTT TCC CAG AAG GTG ATG GAG GCA 483Ala Tyr Val His Val Asn Lys Glu Phe Ser Gln Lys Val Met Glu Ala
140 145 150GTA ACC AAT CGT AGC AAT TAT GTA TGG ATA CAT GAC TAC CAT TTA ATG 531Val Thr Asn Arg Ser Asn Tyr Val Trp Ile His Asp Tyr His Leu Met
155 160 165ACG CTA CCG ACT TTC TTG AGG CGG GAT TTT TGT CGT TTT AAA ATC GGT 579Thr Leu Pro Thr Phe Leu Arg Arg Asp Phe Cys Arg Phe Lys Ile Gly170 175 180 185TTT TTT CTG CAT AGC CCG TTT CCT TCC TCG GAG GTT TAC AAG ACC CTA 627Phe Phe Leu His Ser Pro Phe Pro Ser Ser Glu Val Tyr Lys Thr Leu
190 195 200CCA ATG AGA AAC GAG CTC TTG AAG GGT CTG TTA AAT GCT GAT CTT ATC 675Pro Met Arg Asn Glu Leu Leu Lys Gly Leu Leu Asn Ala Asp Leu Ile
205 210 215GGG TTC CAT ACA TAC GAT TAT GCC CGT CAT TTT CTA ACG TGT TGT AGT 723Gly Phe His Thr Tyr Asp Tyr Ala Arg His Phe Leu Thr Cys Cys Ser
220 225 230CGA ATG TTT GGT TTG GAT CAT CAG TTG AAA AGG GGG TAC ATT TTC TTG 771Arg Met Phe Gly Leu Asp His Gln Leu Lys Arg Gly Tyr Ile Phe Leu
235 240 245GAA TAT AAT GGA AGG AGC ATT GAG ATC AAG ATA AAG GCG AGC GGG ATT 819Glu Tyr Asn Gly Arg Ser Ile Glu Ile Lys Ile Lys Ala Ser Gly Ile250 255 260 265CAT GTT GGT CGA ATG GAG TCG TAC TTG AGT CAG CCC GAT ACA AGA TTA 867His Val Gly Arg Met Glu Ser Tyr Leu Ser Gln Pro Asp Thr Arg Leu
270 275 280CAA GTT CAA GAA GTC CAA AAA CGT TCG AAG GAA ATC GTG CTA CTG GGA 915Gln Val Gln Glu Val Gln Lys Arg Ser Lys Glu Ile Val Leu Leu Gly
285 290 295GTT GAT GAT TTG GAT ATA TTC AAA GGT GTG AAC TTC AAG GTT TTA GCG 963Val Asp Asp Leu Asp Ile Phe Lys Gly Val Asn Phe Lys Val Leu Ala
300 305 310TTG GAG AAG TTA CTT AAA TCA CAC CCG AGT TGG CAA GGG CGT GTG GAA 1011Leu Glu Lys Leu Leu Lys Ser His Pro Ser Trp Gln Gly Arg Val Glu
315 320 325AAG GTG CAA ATC TTG AAT CCT CTG CGC CGT TGC CAA GAC GTC GAT GAG 1059Lys Val Gln Ile Leu Asn Pro Leu Arg Arg Cys Gln Asp Val Asp Glu330 335 340 345ATC AAT GCC GAG ATA AGA ACA GTC TGT GAA AGA ATC AAT AAC GAA CTG 1107Ile Asn Ala Glu Ile Arg Thr Val Cys Glu Arg Ile Asn Asn Glu Leu
350 355 360GGA AGC CCG GGA TAC CAG CCC GTT GTG TTA ATT GAT GGG CCC GTT TCG 1155Gly Ser Pro Gly Tyr Gln Pro Val Val Leu Ile Asp Gly Pro Val Ser
365 370 375TTA AGT GAA AAA GCT GCT TAT TAT GCT ATC GCC GAT ATG GCA ATT GTT 1203Leu Ser Glu Lys Ala Ala Tyr Tyr Ala Ile Ala Asp Met Ala Ile Val
380 385 390ACA CCG TTA CGT GAC GGA CTG AAT CTT ATC CCG TAC GAG TAC GTC GTT 1251Thr Pro Leu Arg Asp Gly Leu Asn Leu Ile Pro Tyr Glu Tyr Val Val
395 400 405TCC CGA CAA AGT GTT AAT GAC CCA AAT CCC AAT ACT CCA AAA AAG ACC 1299Ser Arg Gln Ser Val Asn Asp Pro Asn Pro Asn Thr Pro Lys Lys Ser410 415 420 425ATG CTA GTG GTC TCC GAG TTC ATC GGT GTT TCA CTA TCT TTA ACC GGG 1347Met Leu Val Val Ser Glu Phe Ile Gly Val Ser Leu Ser Leu Thr Gly
430 435 440GCC ATA CGG GTC AAC CCA TGG GAT GAG TTG GAG ACA GCA GAA GCA TTA 1395Ala Ile Arg Val Asn Pro Trp Asp Glu Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu
445 450 455TAC GAC GCA CTC ATG GCT CCT GAT GAC CAT AAA GAA ACC GCC CAC ATG 1443Tyr Asp Ala Leu Met Ala Pro Asp Asp His Lys Glu Thr Ala His Met
460 465 470AAA CAG TAT CAA TAC ATT ATC TCC CAT GAT GTA GCT AAC TGG GCT AGC 1491Lys Gln Tyr Gln Tyr Ile Ile Ser His Asp Val Ala Asn Trp Ala Ser
475 480 485TTC TTT CAA GAT TTA GAG CAA GCG TGC ATC GAT CAT TCT CGT AAA CGA 1539Phe Phe Gln Asp Leu Glu Gln Ala Cys Ile Asp His Ser Arg Lys Arg490 495 500 505TGC ATG AAT TTA GGA TTT GGG TTA GAT ACT AGA GTC GTC TTT TTG ATG 1587Cys Met Asn Leu Gly Phe Gly Leu Asp Thr Arg Val Val Phe Leu Met
510 515 520AGA AGT TTA GCA AGT TGG ATA AAG ATG TCT TGG AAG AAT GCT TAT TCC 1635Arg Ser Leu Ala Ser Trp Ile Lys Met Ser Trp Lys Asn Ala Tyr Ser
525 530 535ATG GCT CAA AAT CGG GCC ATA CTT TTG GAC TAT GAC GGC ACT GTT ACT 1683Met Ala Gln Asn Arg Ala Ile Leu Leu Asp Tyr Asp Gly Thr Val Thr
540 545 550CCA TCT ATC AGT AAA TCT CCA ACT GAA CCT GTT ATC TCC ATG ATC AAC 1731Pro Ser Ile Ser Lys Ser Pro Thr Glu Ala Val Ile Ser Met Ile Asn
555 560 565AAA CTG TGC AAT GAT CCA AAG AAC ATG GTG TTC ATC GTT AGT GGA CGC 1779Lys Leu Cys Asn Asp Pro Lys Asn Met Val Phe Ile Val Ser Gly Arg570 575 580 585AGT AGA GAG AAA ATC TTG GCA GTT GGT TCG GCG CGT GTG AGA ACC CGC 1827Ser Arg Glu Lys Ile Leu Ala Val Gly Ser Ala Arg Val Arg Thr Arg
590 595 600CAT TGC ACT GAG CAC GGA TAC TTT ATA AGG TGG GCG GGT GAT CAA GAA 1875His Cys Thr Glu His Gly Tyr Phe Ile Arg Trp Ala Gly Asp Gln Glu
605 610 615TGG GAA ACG TGC GCA CGT GAG AAT AAT GTC GGG TGG ATG GAT GGA AAT 1923Trp Glu Thr Cys Ala Arg Glu Asn Asn Val Gly Trp Met Asp Gly Asn
620 625 630CTG AGG CCG GTT ATG AAT CTT TAT ACA GAA ACT ACT GAC GGT TCG TAT 1971Leu Arg Pro Val Met Asn Leu Tyr Thr Glu Thr Thr Asp Gly Ser Tyr
635 640 645ATT GAA AAG AAA GAA ACT GCA ATG GTT TGG CAC TAT GAA GAT GCT GAT 2019Ile Glu Lys Lys Glu Thr Ala Met Val Trp His Tyr Glu Asp Ala Asp650 655 660 665AAA GAT CTT GGG TTG GAG CAG GCT AAG GAA CTG TTG GAC CAT CTT GAA 2067Lys Asp Leu Gly Leu Glu Gln Ala Lys Glu Leu Leu Asp His Leu Glu
670 675 680AAC GTG CTC GCT AAT GAG CCC GTT GGA GTG AAT CGA ACA GGT CAA TAC 2115Asn Val Leu Ala Asn Glu Pro Val Gly Val Asn Arg Thr Gly Gln Tyr
685 690 695ATT GTA GAA GTT AAA CCA CAG TCC CCC ATT AAT TAC CTT CTT GTT ATG 2163Ile Val Glu Val Lys Pro Gln Ser Pro Ile Asn Tyr Leu Leu Val Met
700 705 710ACA TTC ATA GGC ACT GAT TGT AGA ATC TTT AAC TTA AAT TTC TTT AAA 2211Thr Phe Ile Gly Thr Asp Cys Arg Ile Phe Asn Leu Asn Phe Phe Lys
715 720 725TAT GAA TGC AAT TAT AGG GGG TCA CTA AAA GGT ATA GTT GCA GAG AAG 2259Tyr Glu Cys Asn Tyr Arg Gly Ser Leu Lys Gly Ile Val Ala Glu Lys730 735 740 745ATT TTT GCG TTC ATG GCT AAA AAG GGA AAA CAG GCT GAT TTC GTG TTG 2307Ile Phe Ala Phe Met Ala Lys Lys Gly Lys Gln Ala Asp Phe Val Leu
750 755 760ACG TTG AAT GAT AGA AGT GAT GAA GAC ATG TTT GTG GCC ATT GGG GAT 2355Thr Leu Asn Asp Arg Ser Asp Glu Asp Met Phe Val Ala Ile Gly Asp
765 770 775GGA ATA AAA AAG GGT CGG ATA ACT AAC AAC AAT TCA GTG TTT ACA TGC 2403Gly Ile Lys Lys Gly Arg Ile Thr Asn Asn Asn Ser Val Phe Thr Cys
780 785 790GTA GTG GGA GAG AAA CCG AGT GCA GCT GAG TAC TTT TTA AAT GAT GTC 2451Val Val Gly Glu Lys Pro Ser Ala Ala Glu Tyr Phe Leu Asn Asp Val
795 800 805TCG AGA AGC TCC GGG TGT CTC AGC AAC CAA GGA T GATCCGGAAG 2495Ser Arg Ser Ser Gly Cys Leu Ser Asn Gln Gly810 815 820CTTCTCGTGA TCTTTATGAG TTAAAAGTTT TCGACTTTTT CTTCATCAAG ATTCATGGGA 2555AAGTTGTTCA ATATGAACTT GTGTTCTTGG TTCTGGATTT TAGGGAGTCT ATGGATATAA 2615CATTTC 2621(2)SEQ ID NO：2信息 (i)序列特征
(A)长度：820氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：蛋白质 (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Ile Leu Leu His Leu Met Pro Leu Gln Met Leu Pro Asn Arg Leu 1 5 10 15Ile Val Val Ser Asn Gln Leu Pro Ile Ile Ala Arg Leu Arg Leu Thr
20 25 30Thr Met Glu Gly Pro Phe Gly Ile Ser Leu Gly Thr Arg Val Arg Phe
35 40 45Thr Cys Thr Ser Lys Met His Tyr Pro Gln Pro Leu Arg Phe Ser Ile
50 55 60Leu Gly Asp Pro Leu Arg Ala Asp Val Gly Pro Thr Glu Gln Asp Asp 65 70 75 80Val Ser Lys Thr Leu Leu Asp Arg Phe Asn Cys Val Ala Val Phe Val
85 90 95Pro Thr Ser Lys Trp Asp Gln Tyr Tyr His Cys Phe Cys Lys Gln Tyr
100 105 110Leu Trp Pro Ile Phe His Tyr Lys Val Pro Ala Ser Asp Val Lys Ser
115 120 125Val Pro Asn Ser Arg Asp Ser Trp Asn Ala Tyr Val His Val Asn Lys
130 135 140Glu Phe Ser Gln Lys Val Met Glu Ala Val Thr Asn Arg Ser Asn Tyr145 150 155 160Val Trp Ile His Asp Tyr His Leu Met Thr Leu Pro Thr Phe Leu Arg
165 170 175Arg Asp Phe Cys Arg Phe Lys Ile Gly Phe Phe Leu His Ser Pro Phe
180 185 190Pro Ser Ser Glu Val Tyr Lys Thr Leu Pro Met Arg Asn Glu Leu Leu
195 200 205Lys Gly Leu Leu Asn Ala Asp Leu Ile Gly Phe His Thr Tyr Asp Tyr
210 215 220Ala Arg His Phe Leu Thr Cys Cys Ser Arg Met Phe Gly Leu Asp His225 230 235 240Gln Leu Lys Arg Gly Tyr Ile Phe Leu Glu Tyr Asn Gly Arg Ser Ile
245 250 255Glu Ile Lys Ile Lys Ala Ser Gly Ile His Val Gly Arg Met Glu Ser
260 265 270Tyr Leu Ser Gln Pro Asp Thr Arg Leu Gln Val Gln Glu Val Gln Lys
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325 330 335Leu Arg Arg Cys Gln Asp Val Asp Glu Ile Asn Ala Glu Ile Arg Thr
340 345 350Val Cys Glu Arg Ile Asn Asn Glu Leu Gly Ser Pro Gly Tyr Gln Pro
355 360 365Val Val Leu Ile Asp Gly Pro Val Ser Leu Ser Glu Lys Ala Ala Tyr
370 375 380Tyr Ala Ile Ala Asp Met Ala Ile Val Thr Pro Leu Arg Asp Gly Leu385 390 395 400Asn Leu Ile Pro Tyr Glu Tyr Val Val Ser Arg Gln Ser Val Asn Asp
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435 440 445Asp Glu Ieu Glu Thr Ala Glu Ala Leu Tyr Asp Ala Leu Met Ala Pro
450 455 460Asp Asp His Lys Glu Thr Ala His Met Lys Gln Tyr Gln Tyr Ile Ile465 470 475 480Ser His Asp Val Ala Asn Trp Ala Ser Phe Phe Gln Asp Leu Glu Gln
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500 505 510Leu Asp Thr Arg Val Val Phe Leu Met Arg Ser Leu Ala Ser Trp Ile
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530 535 540Leu Leu Asp Tyr Asp Gly Thr Val Thr Pro Ser Ile Ser Lys Ser Pro545 550 555 560Thr Glu Ala Val Ile Ser Met Ile Asn Lys Leu Cys Asn Asp Pro Lys
565 570 575Asn Met Val Phe Ile Val Ser Gly Arg Ser Arg Glu Lys Ile Leu Ala
580 585 590Val Gly Ser Ala Arg Val Arg Thr Arg His Cys Thr Glu His Gly Tyr
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610 615 620Asn Asn Val Gly Trp Met Asp Gly Asn Leu Arg Pro Val Met Asn Leu625 630 635 640Tyr Thr Glu Thr Thr Asp Gly Ser Tyr Ile Glu Lys Lys Glu Thr Ala
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690 695 700Ser Pro Ile Asn Tyr Leu Leu Val Met Thr Phe Ile Gly Thr Asp Cys705 710 715 720Arg Ile Phe Asn Leu Asn Phe Phe Lys Tyr Glu Cys Asn Tyr Arg Gly
725 730 735Ser Leu Lys Gly Ile Val Ala Glu Lys Ile Phe Ala Phe Met Ala Lys
740 745 750Lys Gly Lys Gln Ala Asp Phe Val Leu Thr Leu Asn Asp Arg Ser Asp
755 760 765Glu Asp Met Phe Val Ala Ile Gly Asp Gly Ile Lys Lys Gly Arg Ile
770 775 780(2)SEQ ID NO：3信息 (i)序列特征
(A)长度：25碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：DNA(基因组) (iii)假拟：是 (iii)反义：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：AAGCTTATGT TGCCATATAG AGTAG 25(2)SEQ ID NO：4信息 (i)序列特征
(A)长度：24碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：DNA(基因组) (iii)假拟：是 (iii)反义：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO：4：GTAGTTGCCA TGGTGCAAAT GTTC 24(2)SEQ ID NO：5信息 (i)序列特征
(A)长度：20碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：DNA(基因组) (iii)假拟：是 (xi)序列描述：SEQ ID NO：5：AGCTCTGCAG TGAGGTACCA 20(2)SEQ ID NO：6信息 (i)序列特征
(A)长度：20碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：DNA(基因组) (iii)假拟：是 (xi)序列描述：SEQ ID NO：6：GACGTCACTC CATGGTTCGA 20(2)SEQ ID NO：7信息 (i)序列特征
(A)长度：24碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：DNA(基因组) (iii)假拟：是 (xi)序列描述：SEQ ID NO：7：GTACCCTGCA GTGTGACCCT AGAC 24(2)SEQ ID NO：8信息 (i)序列特征
(A)长度：21碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：DNA(基因组) (iii)假拟：是 (xi)序列描述：SEQ ID NO：8：TCGATTCATA GAAGCTTAGA T 21(2)SEQ ID NO：9的信息 (i)序列特征
(A)长度：2207碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：双链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA至mRNA (iii)假拟：否 (iii)反义：否 (vi)原始来源：
(A)生物体：solanum tuberosum
(B)菌株：kardal (ix)特征：
(A)名称/键：CDS
(B)位置：161..1906 (ix)特征：
(A)名称/键：miSc_特征
(B)位置：842..850
(D)其它信息：/功能＝“推定的糖基化位点” (xi)序列描述：SEQ ID NO：9：CTTTTCTGAG TAATAACATA GGCATTGATT TTTTTTCAAT TAATAACACC TGCAAACATT 60CCCATTGCCG GCATTCTCTG TTCTTACAAA AAAAAACATT TTTTTGTTCA CATAAATTAG 120TTATGGCATC AGTATTG AC CCTTTAACTT GTTATACAAT ATG GGT AAA GCT ATA 175
Met Gly Lys Ala Ile
1 5ATT TTT ATG ATT TTT ACT ATG TCT ATG AAT ATG ATT AAA GCT GAA ACT 223Ile Phe Met Ile Phe Thr Met Ser Met Asn Met Ile Lys Ala Glu Thr
10 15 20TGC AAA TCC ATT GAT AAG GGT CCT GTA ATC CCA ACA ACC CCT TTA GTG 271Cys Lys Ser Ile Asp Lys Gly Pro Val Ile Pro Thr Thr Pro Leu Val
25 30 35ATT TTT CTT GAA AAA GTT CAA GAA GCT GCT CTT CAA ACT TAT GGC CAT 319Ile Phe Leu Glu Lys Val Gln Glu Ala Ala Leu Gln Thr Tyr Gly His
40 45 50AAA GGG TTT GAT GCT AAA CTG TTT GTT GAT ATG TCA CTG AGA GAG AGT 367Lys Gly Phe Asp Ala Lys Leu Phe Val Asp Met Ser Leu Arg Glu Ser
55 60 65CTT TCA GAA ACA GTT GAA GCT TTT AAT AAG CTT CCA AGA GTT GTG AAT 415Leu Ser Glu Thr Val Glu Ala Phe Asn Lys Leu Pro Arg Val Val Asn 70 75 80 85GGT TCA ATA TCA AAA AGT GAT TTG GAT GGT TTT ATA GGT AGT TAC TTG 463Gly Ser Ile Ser Lys Ser Asp Leu Asp Gly Phe Ile Gly Ser Tyr Leu
90 95 100AGT AGT CCT GAT AAG GAT TTG GTT TAT GTT GAG CCT ATG GAT TTT GTG 511Ser Ser Pro Asp Lys Asp Leu Val Tyr Val Glu Pro Met Asp Phe Val
105 110 115GCT GAG CCT GAA GGC TTT TTG CCA AAG GTG AAG AAT TCT GAG GTG AGG 559Ala Glu Pro Glu Gly Phe Leu Pro Lys Val Lys Asn Ser Glu Val Arg
120 125 130GCA TGG GCA TTG GAG GTG CAT TCA CTT TGG AAG AAT TTA AGT AGG AAA 607Ala Trp Ala Leu Glu Val His Ser Leu Trp Lys Asn Leu Ser Arg Lys
135 140 145GTG GCT GAT CAT GTA TTG GAA AAA CCA GAG TTG TAT ACT TTG CTT CCA 655Val Ala Asp His Val Leu Glu Lys Pro Glu Leu Tyr Thr Leu Leu Pro150 155 160 165TTG AAA AAT CCA GTT ATT ATA CCG GGA TCG CGT TTT AAG GAG GTT TAT 703Leu Lys Asn Pro Val Ile Ile Pro Gly Ser Arg Phe Lys Glu Val Tyr
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185 190 195TAT GAA ACT GCA AAA GGG ATT GTG ACT AAT CTG GTT TCT CTG ATA GAT 799Tyr Glu Thr Ala Lys Gly Ile Val Thr Asn Leu Val Ser Leu Ile Asp
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215 220 225AGT CAG CCT CCT GTC CTG GCC ACG ATG ATT GTT GAC ATA TTC AAT CAG 895Ser Gln Pro Pro Val Leu Ala Thr Met Ile Val Asp Ile Phe Asn Gln230 235 240 245ACA GGT GAT TTA AAT TTG GTT AGA AGA TCC CTT CCT GCT TTG CTC AAG 943Thr Gly Asp Leu Asn Leu Val Arg Arg Ser Leu Pro Ala Leu Leu Lys
250 255 260GAG AAT CAT TTT TGG AAT TCA GGA ATA CAT AAG GTG ACT ATT CAA GAT 991Glu Asn His Phe Trp Asn Ser Gly Ile His Lys Val Thr Ile Gln Asp
265 270 275GCT CAG GGA TCA AAC CAC AGC TTG AGT CGG TAC TAT GCT ATG TGG AAT 1039Ala Gln Gly Ser Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Met Trp Asn
280 285 290AAG CCC CGT CCA GAA TCG TCA ACT ATA GAC AGT GAA ACA GCT TCC GTA 1087Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Thr Ile Asp Ser Glu Thr Ala Ser Val
295 300 305CTC CCA AAT ATA TGT GAA AAA AGA GAA TTA TAC CGT GAA CTG GCA TCA 1135Leu Pro Asn Ile Cys Glu Lys Arg Glu Leu Tyr Arg Glu Leu Ala Ser310 315 320 325GCT GCT GAA AGT GGA TGG GAT TTC AGT TCA AGA TGG ATG AGC AAC GGA 1183Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp Met Ser Asn Gly
330 335 340TCT GAT CTG ACA ACA ACT AGT ACA ACA TCA ATT CTA CCA GTT GAT TTG 1231Ser Asp Leu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ile Leu Pro Val Asp Leu
345 350 355AAT GCA TTC CTT CTG AAG ATG GAA CTT GAC ATT GCC TTT CTA GCA AAT 1279Asn Ala Phe Leu Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile Ala Phe Leu Ala Asn
360 365 370CTT GTT GGA GAA AGT AGC ACG GCT TCA CAT TTT ACA GAA GCT GCT CAA 1327Leu Val Gly Glu Ser Ser Thr Ala Ser His Phe Thr Glu Ala Ala Gln
375 380 385AAT AGA CAG AAG GCT ATA AAC TGT ATC TTT TGG AAC GCA GAG ATG GGG 1375Asn Arg Gln Lys Ala Ile Asn Cys Ile Phe Trp Asn Ala Glu Met Gly390 395 400 405CAA TGG CTT GAT TAC TGG CTT ACC AAC AGC GAC ACA TCT GAG GAT ATT 1423Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Thr Asn Ser Asp Thr Ser Glu Asp Ile
410 415 420TAT AAA TGG GAA GAT TTG CAC CAG AAC AAG AAG TCA TTT GCC TCT AAT 1471Tyr Lys Trp Glu Asp Leu His Gln Asn Lys Lys Ser Phe Ala Ser Asn
425 430 435TTT GTT CCG CTG TGG ACT GAA ATT TCT TGT TCA GAT AAT AAT ATC ACA 1519Phe Val Pro Leu Trp Thr Glu Ile Ser Cys Ser Asp Asn Asn Ile Thr
440 445 450ACT CAG AAA GTA GTT CAA AGT CTC ATG AGC TCG GGC TTG CTT CAG CCT 1567Thr Gln Lys Val Val Gln Ser Leu Met Ser Ser Gly Leu Leu Gln Pro
455 460 465GCA GGG ATT GCA ATG ACC TTG TCT AAT ACT GGA CAG CAA TGG GAT TTT 1615Ala Gly Ile Ala Met Thr Leu Ser Asn Thr Gly Gln Gln Trp Asp Phe470 475 480 485CCG AAT GGT TGG CCC CCC CTT CAA CAC ATA ATC ATT GAA GGT CTC TTA 1663Pro Asn Gly Trp Pro Pro Leu Gln His Ile Ile Ile Glu Gly Leu Leu
490 495 500AGG TCT GGA CTA GAA GAG GCA AGA ACC TTA GCA AAA GAC ATT GCT ATT 1711Arg Ser Gly Leu Glu Glu Ala Arg Thr Leu Ala Lys Asp Ile Ala Ile
505 510 515CGC TGG TTA AGA ACT AAC TAT GTG ACT TAC AAG AAA ACC GGT GCT ATG 1759Arg Trp Leu Arg Thr Asn Tyr Val Thr Tyr Lys Lys Thr Gly Ala Met
520 525 530TAT GAA AAA TAT GAT GTC ACA AAA TGT GGA GCA TAT GGA GGT GGT GGT 1807Tyr Glu Lys Tyr Asp Val Thr Lys Cys Gly Ala Tyr Gly Gly Gly Gly
535 540 545GAA TAT ATG TCC CAA ACG GGT TTC GGA TGG TCA AAT GGC GTT GTA CTG 1855Glu Tyr Met Ser Gln Thr Gly Phe Gly Trp Ser Asn Gly Val Val Leu550 555 560 565GCA CTT CTA GAG GAA TTT GGA TGG CCT GAA GAT TTG AAG ATT GAT TGC 1903Ala Leu Leu Glu Glu Phe Gly Trp Pro Glu Asp Leu Lys Ile Asp Cys
570 575 580TAATGAGCAA GTAGAAAAGC CAAATGAAAC ATCATTGAGT TTTATTTTCT TCTTTTGTTA 1963AAATAAGCTG CAATGGTTTG CTGATAGTTT ATGTTTTGTA TTACTATTTC ATAAGGTTTT 2023TGTACCATAT CAAGTGATAT TACCATGAAC TATGTCGTTC GGACTCTTCA AATCGGATTT 2083TGCAAAAATA ATGCAGTTTT GGAGAATCCG ATAACATAGA CCATGTATGG ATCTAAATTG 2143TAAACAGCTT ACTATATTAA GTAAAAGAAA GATGATTCCT CTGCTTTAAA AAAAAAAAAA 2203AAAA(2)SEQ ID NO：10信息 (i)序列特征
(A)长度：581氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：蛋白质 (xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Met Gly Lys Ala Ile Ile Phe Met Ile Phe Thr Met Ser Met Asn Met 1 5 10 15Ile Lys Ala Glu Thr Cys Lys Ser Ile Asp Lys Gly Pro Val Ile Pro
20 25 30Thr Thr Pro Leu Val Ile Phe Leu Glu Lys Val Gln Glu Ala Ala Leu
35 40 45Gln Thr Tyr Gly His Lys Gly Phe Asp Ala Lys Leu Phe Val Asp Met
50 55 60Ser Leu Arg Glu Ser Leu Ser Glu Thr Val Glu Ala Phe Asn Lys Leu 65 70 75 80Pro Arg Val Val Asn Gly Ser Ile Ser Lys Ser Asp Leu Asp Gly Phe
85 90 95Ile Gly Ser Tyr Leu Ser Ser Pro Asp Lys Asp Leu Val Tyr Val Glu
100 105 110Pro Met Asp Phe Val Ala Glu Pro Glu Gly Phe Leu Pro Lys Val Lys
115 120 125Asn Ser Glu Val Arg Ala Trp Ala Leu Glu Val His Ser Leu Trp Lys
130 135 140Asn Leu Ser Arg Lys Val Ala Asp His Val Leu Glu Lys Pro Glu Leu145 150 155 160Tyr Thr Leu Leu Pro Leu Lys Asn Pro Val Ile Ile Pro Gly Ser Arg
165 170 175Phe Lys Glu Val Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile Arg Gly Leu
180 185 190Leu Ala Ser Lys Met Tyr Glu Thr Ala Lys Gly Ile Val Thr Asn Leu
195 200 205Val Ser Leu Ile Asp Gln Phe Gly Tyr Val Leu Asn Gly Ala Arg Ala
210 215 220Tyr Tyr Ser Asn Arg Ser Gln Pro Pro Val Leu Ala Thr Met Ile Val225 230 235 240Asp Ile Phe Asn Gln Thr Gly Asp Leu Asn Leu Val Arg Arg Ser Leu
245 250 255Pro Ala Leu Leu Lys Glu Asn His Phe Trp Asn Ser Gly Ile His Lys
260 265 270Val Thr Ile Gln Asp Ala Gln Gly Ser Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr
275 280 285Tyr Ala Met Trp Asn Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Thr Ile Asp Ser
290 295 300Glu Thr Ala Ser Val Leu Pro Asn Ile Cys Glu Lys Arg Glu Leu Tyr305 310 315 320Arg Glu Leu Ala Ser Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg
325 330 335Trp Met Ser Asn Gly Ser Asp Leu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ile
340 345 350Leu Pro Val Asp Leu Asn Ala Phe Leu Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile
355 360 365Ala Phe Leu Ala Asn Leu Val Gly Glu Ser Ser Thr Ala Ser His Phe
370 375 380Thr Glu Ala Ala Gln Asn Arg Gln Lys Ala Ile Asn Cys Ile Phe Trp385 390 395 400Asn Ala Glu Met Gly Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Thr Asn Ser Asp
405 410 415Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Lys Trp Glu Asp Leu His Gln Asn Lys Lys
420 425 430Ser Phe Ala Ser Asn Phe Val Pro Leu Trp Thr Glu Ile Ser Cys Ser
435 440 445Asp Asn Asn Ile Thr Thr Gln Lys Val Val Gln Ser Leu Met Ser Ser
450 455 460Gly Leu Leu Gln Pro Ala Gly Ile Ala Met Thr Leu Ser Asn Thr Gly465 470 475 480Gln Gln Trp Asp Phe Pro Asn Gly Trp Pro Pro Leu Gln His Ile Ile
485 490 495Ile Glu Gly Leu Leu Arg Ser Gly Leu Glu Glu Ala Arg Thr Leu Ala
500 505 510Lys Asp Ile Ala Ile Arg Trp Leu Arg Thr Asn Tyr Val Thr Tyr Lys
515 520 525Lys Thr Gly Ala Met Tyr Glu Lys Tyr Asp Val Thr Lys Cys Gly Ala
530 535 540Tyr Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Met Ser Gln Thr Gly Phe Gly Trp Ser545 550 555 560Asn Gly Val Val Leu Ala Leu Leu Glu Glu Phe Gly Trp Pro Glu Asp
565 570 575Leu Lys Ile Asp Cys
580(2)SEQ ID NO：11信息 (i)序列特征
(A)长度：33碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：DNA(基因组) (iii)假拟：是 (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：6
(D)其他信息：/修饰的碱基＝i
(ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：15
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (xi)序列描述：SEQ ID NO：11：GGYGGNMGMT TYRWNGARKT MTAYKRYTGG GAC 33(2)SEQ ID NO：12信息 (i)序列特征
(A)长度：26碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：DNA(基因组) (iii)假拟：是 (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：3
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：6
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：9
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：12
(D)其它信息：修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：15
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：21
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (xi)序列描述：SEQ ID NO：12：GTNCCNGGNG GNCGNTTYRW NGARKT 26(2)SEQ ID NO：13信息 (i)序列特征
(A)长度：26碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：DNA(基因组) (iii)假拟：是 (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：3
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：9
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：12
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：15
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：18
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (xi)序列描述：SEQ ID NO：13：GGNGGYTGNS WNCGNYRNAG RTARTA 26(2)SEQ ID NO：14信息 (i)序列特征
(A)长度：24碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：DNA(基因组) (iii)假拟：是 (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：1
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：7
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：19
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：22
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (xi)序列描述：SEQ ID NO：14：NSCRTTNRYC CATCCRAANC CNTC 24(2)SEQ ID NO：15的信息 (i)序列特征
(A)长度：20碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (iii)假拟：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO：15：CGAAACGGGC CCATCAATTA 20(2)SEQ ID NO：16的信息 (i)序列特征
(A)长度：20碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (iii)假拟：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO：16：TCGATGAGAT CAATGCCGAG 20(2)SEQ ID NO：17的信息 (i)序列特征
(A)长度：27碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (iii)假拟：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO：17：CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC 27(2)SEQ ID NO：18的信息 (i)序列特征
(A)长度：20碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (iii)假拟：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO：18：CACAACAGGC TGGTATCCCG 20(2)SEQ ID NO：19的信息 (i)序列特征
(A)长度：20碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (iii)假拟：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO：19：CAATAACGAACTGGGAAGCC 20(2)SEQ ID NO：20的信息 (i)序列特征
(A)长度：23碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (iii)假拟：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO：20：ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC 23(2)SEQ ID NO：21的信息 (i)序列特征
(A)长度：26碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (iii)假拟：否 (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：4
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：6
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：9
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：15
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (xi)序列描述：SEQ ID NO：21：GAYNTNATNT GGRTNCAYGA YTAYCA 26(2)SEQ ID NO：22的信息 (i)序列特征
(A)长度：20碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (iii)假拟：否 (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：3
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：6
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：12
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：18
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (xi)序列描述：SEQ ID NO：22：CCNACNGTRC ANGCRAANAC 20(2)SEQ ID NO：23的信息 (i)序列特征
(A)长度：28碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (iii)假拟：否 (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：2
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：5
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：8
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：14
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：20
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：23
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (xi)序列描述：SEQ ID NO：23：TNGGNTKNTT YYTNCAYAYN CCNTTYCC 28(2)SEQ ID NO：24的信息 (i)序列特征
(A)长度：20碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (iii)假拟：否 (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：6
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：9
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：18
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (xi)序列描述：SEQ ID NO：24：TGRTCNARNA RYTCYTTNGC 20(2)SEQ ID NO：25的信息 (i)序列特征
(A)长度：20碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (iii)假拟：否 (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：9
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：12
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：15
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：18
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (xi)序列描述：SEQ ID NO：25：CCRTGYTCNG CNSWNARNCC 20(2)SEQ ID NO：26的信息 (i)序列特征
(A)长度：20碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (iii)假拟：否 (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：6
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：17
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (xi)序列描述：SEQ ID NO：26：TCRTCNGTRA ARTCRTCNCC 20(2)SEQ ID NO：27的信息 (i)序列特征
(A)长度：22碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (iii)假拟：否 (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：3
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：6
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：15
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的碱基
(B)位置：21
(D)其它信息：/修饰的碱基＝i (xi)序列描述：SEQ ID NO：27：GYNACNARRT TCATNCCRTC NC 22