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1、(10)申请公布号 CN 103028005 A (43)申请公布日 2013.04.10 CN 103028005 A *CN103028005A* (21)申请号 201210378421.9 (22)申请日 2012.10.08 A61K 36/884(2006.01) A61K 9/20(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 21/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 卞毓平 地址 211224 江苏省南京市溧水县晶桥镇陈 卞村 (72)发明人 不公告发明人 (54) 发明名称 一种腰痛片的制备方法及应用 (57)。
2、 摘要 本发明提供一种腰痛片的制备方法， 由盐 炒杜仲叶 108g、 盐炒补骨脂 81g、 续断 81g、 当归 108g、 炒白术81g、 牛膝81g、 肉桂27g、 制乳香27g、 制狗脊 81g、 赤芍 43g、 泽泻 54g、 酒炒土鳖虫 43g 作为原料药制成， 采用超临界萃取和微波萃取制 备而成， 使得阿魏酸含量有很大提高， 本发明还提 供了腰痛片在制备抑制人肾癌细胞 KETR-3 细胞 增殖药物中的应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1.。
3、 一种腰痛片的制备方法， 由盐炒杜仲叶 108g、 盐炒补骨脂 81g、 续断 81g、 当归 108g、 炒白术 81g、 牛膝 81g、 肉桂 27g、 制乳香 27g、 制狗脊 81g、 赤芍 43g、 泽泻 54g、 酒炒土鳖虫 43g 作为原料药制成， 其特征在于所述的方法由下列步骤组成 ： 取当归、 肉桂、 制乳香， 加入 到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 4-6%， 萃取 压力 15-30MPa， 温度 30-50， CO2流量 1-3m1/g 生药min， 萃取时间 150-180min， 得超临 界萃取物， 备用 ； 取其余中药，。
4、 粉碎， 加入 2L 的 70% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃 取， 萃取功率 400-600W， 萃取 2 次， 每次 4-8 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 D101 大孔吸附树 脂柱上， 50% 乙醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取 物， 备用 ； 将上述超临界萃取物和微波提取物混合， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 1000 片， 每片重 0.5g。 2. 根据权利要求 1 所述一种腰痛片的制备方法， 其特征在于所述 CO2超临界萃取夹带 剂占总萃取溶剂的体积百分比为 5%。 3. 根据权利要求 1 所述。
5、一种腰痛片的制备方法， 其特征在于所述微波萃取功率 500W， 每次萃取 6 分钟。 4. 根据权利要求 1 所述一种腰痛片的制备方法， 其特征在于所述 CO2超临界萃取的萃 取压力 20MPa， 温度 40， CO2流量 2ml/g 生药min， 萃取时间 160min。 5. 根据权利要求 1 所述一种腰痛片在制备抑制人肾癌细胞 KETR-3 细胞增殖药物中的 应用。 权 利 要 求 书 CN 103028005 A 2 1/5 页 3 一种腰痛片的制备方法及应用 技术领域 0001 本发明涉及中药制剂技术领域， 具体涉及一种腰痛片的制备方法及应用。 背景技术 0002 腰痛片记载于卫生部。
6、标准 WS3-B-1053-91， 由盐炒杜仲叶 108g、 盐炒补骨脂 81g、 续断81g、 当归108g、 炒白术81g、 牛膝81g、 肉桂27g、 制乳香27g、 制狗脊81g、 赤芍43g、 泽泻 54g、 酒炒土鳖虫 43g 作为原料药制成， 能强腰补肾， 活血止痛。用于肾虚腰痛， 腰肌劳损。 0003 现有技术中， 尚未有腰痛片在提取制备方面采用超临界和微波技术的报道， 而采 用打粉和水煎煮的方法， 工艺粗糙、 落后， 杂质多， 导致患者用量过大， 不方便服用， 严重影 响了本品在临床上应用。 发明内容 0004 发明目的 ： 为了解决上述问题， 本发明的目的在于提供一种腰痛片。
7、的制备方法。 0005 本发明的另一个目的在于提供一种腰痛片在制备抑制人肾癌细胞 KETR-3 细胞增 殖药物中的应用。 0006 技术方案 ： 本发明的目的是通过如下的方案实现的 ： 0007 一种腰痛片的制备方法， 由盐炒杜仲叶 108g、 盐炒补骨脂 81g、 续断 81g、 当归 108g、 炒白术 81g、 牛膝 81g、 肉桂 27g、 制乳香 27g、 制狗脊 81g、 赤芍 43g、 泽泻 54g、 酒炒土 鳖虫 43g 作为原料药制成， 所述的方法由下列步骤组成 ： 取当归、 肉桂、 制乳香， 加入到 CO2 超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比。
8、为 4-6%， 萃取压力 15-30MPa， 温度 30-50， CO2 流量 1-3m1/g 生药 min， 萃取时间 150-180min， 得超临界萃取 物， 备用 ； 取其余中药， 粉碎， 加入 2L 的 70% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取 功率 400-600W， 萃取 2 次， 每次 4-8 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 D101 大孔吸附树脂柱上， 50% 乙醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 备用 ； 将上述超临界萃取物和微波提取物混合， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 1000。
9、 片， 每片重 0.5g。 0008 上述一种腰痛片的制备方法， 所述 CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百 分比为 5%。 0009 上述一种腰痛片的制备方法， 所述微波萃取功率 500W， 每次萃取 6 分钟。 0010 上述一种腰痛片的制备方法， 所述 CO2超临界萃取的萃取压力 20MPa， 温度 40， CO2流量 2ml/g 生药min， 萃取时间 160min。 0011 上述腰痛片在制备抑制人肾癌细胞 KETR-3 细胞增殖药物中的应用。 0012 现有技术中， 腰痛片每片0.5g， 每次6片， 一日3次， 采用本发明制备成的腰痛片每 片 0.5g， 每次仅需 3 片， 。
10、一日服用 3 次， 在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。 此结论可以通过下述试验证明。 0013 试验一、 不同方法制备的腰痛片中阿魏酸含量的比较 说 明 书 CN 103028005 A 3 2/5 页 4 0014 1、 仪器及试药本发明腰痛片 ： 按实施例3方法制备， 使用815g原料药， 经提取制成 1000片， 每片重0.5g。 原腰痛片， 按部颁标准方法制备， 使用815g原料药， 经提取制成1000 片， 每片重 0.5g。Agilent 1200 高效液相色谱仪 ； METTLER AE240 电子分析天平 ； 阿魏酸对 照品 ( 中国药品生物制品检定所 )。 0015。
11、 2、 方法 0016 色谱条件与系统适用性试验 ： 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ； 甲醇 - 水 - 磷 酸 （40 ： 60 ： 0.2） 为流动相 ； 检测波长为 280nm。理论板数按阿魏酸峰计算， 应不低于 3000。 0017 对照品溶液的制备 ： 精密称取在 60减压干燥 4 小时的阿魏酸对照品适量， 加甲 醇制成每 1ml 含 18g 的溶液， 即得。 0018 供试品溶液的制备 ： 取本发明腰痛片和原腰痛片， 研细， 混匀， 取 1g， 精密称定， 精 密加入 70% 乙醇 20ml， 密塞， 超声处理 10 分钟， 离心， 取上清液， 即得。 0019 测定法分别精密吸。
12、取对照品溶液与供试品溶液各 20l， 注入液相色谱仪， 测定， 即得。 0020 3、 结果 0021 结果表明， 本发明腰痛片中阿魏酸的含量为 1.12mg/ 片 ； 而原腰痛片中阿魏酸的 含量为 0.14mg/ 片， 在服用量减少的情况下， 阿魏酸含量有很大提高。 0022 上述研究表明， 采用本发明制备的腰痛片， 有效成分含量高于部颁标准法制备的 腰痛片。 具体实施方式 0023 以下通过实施例形式， 对本发明的上述内容再作进一步的详细说明， 但不应将此 理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例， 凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。 0024 实施例 1 0025 。
13、取盐炒杜仲叶 108g、 盐炒补骨脂 81g、 续断 81g、 当归 108g、 炒白术 81g、 牛膝 81g、 肉桂 27g、 制乳香 27g、 制狗脊 81g、 赤芍 43g、 泽泻 54g、 酒炒土鳖虫 43g， 将当归、 肉桂、 制 乳香， 加入到 CO2 超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 4%， 萃取压力 15MPa， 温度 30， CO2 流量 1m1/g 生药 min， 萃取时间 150min， 得超临界萃取 物， 备用 ； 取其余中药， 粉碎， 加入 2L 的 70% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取 功率 400W， 萃取 。
14、2 次， 每次 4 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 D101 大孔吸附树脂柱上， 50% 乙 醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 备用 ； 将上 述超临界萃取物和微波提取物混合， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 1000 片， 每片重 0.5g。 0026 经检测， 成品中阿魏酸的含量为 1.15mg/ 片。 0027 实施例 2 0028 取盐炒杜仲叶 108g、 盐炒补骨脂 81g、 续断 81g、 当归 108g、 炒白术 81g、 牛膝 81g、 肉桂 27g、 制乳香 27g、 制狗脊 81g、 赤芍 43。
15、g、 泽泻 54g、 酒炒土鳖虫 43g， 将当归、 肉桂、 制乳 香， 加入到CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%， 萃取压力 30MPa， 温度 50， CO2流量 3m1/g 生药min， 萃取时间 180min， 得超临界萃取物， 说 明 书 CN 103028005 A 4 3/5 页 5 备用 ； 取其余中药， 粉碎， 加入2L的70%乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率 600W， 萃取 2 次， 每次 8 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 D101 大孔吸附树脂柱上， 50% 乙醇洗 脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 。
16、减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 备用 ； 将上述超 临界萃取物和微波提取物混合， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 1000 片， 每片 重 0.5g。 0029 经检测， 成品中阿魏酸的含量为 1.09mg/ 片。 0030 实施例 3 0031 取盐炒杜仲叶 108g、 盐炒补骨脂 81g、 续断 81g、 当归 108g、 炒白术 81g、 牛膝 81g、 肉桂 27g、 制乳香 27g、 制狗脊 81g、 赤芍 43g、 泽泻 54g、 酒炒土鳖虫 43g， 将当归、 肉桂、 制乳 香， 加入到CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取。
17、溶剂的体积百分比为5%， 萃取压力 20MPa， 温度 40， CO2流量 2m1/g 生药min， 萃取时间 160min， 得超临界萃取物， 备用 ； 取其余中药， 粉碎， 加入2L的70%乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率 500W， 萃取 2 次， 每次 6 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 D101 大孔吸附树脂柱上， 50% 乙醇洗 脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 备用 ； 将上述超 临界萃取物和微波提取物混合， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 1000 片， 每片 重 0.5g。 0032。
18、 经检测， 成品中阿魏酸的含量为 1.12mg/ 片。 0033 实施例 4 ： 腰痛片抑制 KETR-3 细胞增殖的实验研究资料 0034 1 实验材料 0035 1.1 实验用细胞株 0036 人 肾 癌 细 胞 KETR-3 细 胞， 南 京 正 宽 医 药 科 技 有 限 公 司 实 验 室 细 胞 库， DMEM+10%FBS 常规培养。 0037 1.2 实验药物 0038 研究药物 ： 本发明腰痛片 ： 按实施例 3 方法制备。 0039 药液储液 ： 称取 100mg 腰痛片， 溶于 5ml 无水乙醇中， 0.2m 滤器过滤， 500l doff 管分装， -20存储， 同时 。
19、0.2m 滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。 0040 1.3 实验试剂 0041 DMEM （GIBCO公司Cat.No.12100-061 Lot.No.758137） ； 胎牛血清 （浙江天杭生物科 技有限公司 Lot.No.100419） ； NaHCO3 （上海久亿化学试剂有限公司 Cat.No.11810-033 Lot. No.1088387） ； Trypsin（AMRESCO 公司批号 ： 2010/04） ； EDTA（AMRESCO 公司批号 ： 2009/10） ； Penicillin G Sodium Salt （AMRESCO公司批号 ： 2010242） ； St。
20、reptomycin Sulfate （AMRESCO 公司批号 ： 2010382） ； 无水乙醇 （南京化学试剂有限公司批号 ： 080310182） ； MTT(Biosharp 批 号 ： 0793);PBS（实验室自配） ； 0042 1.4 实验器材 0043 莱卡倒置显微镜 （德国 Leica 型号 ： DM1L） ； 可见 - 紫外光微孔板检测仪 （美国 MD 公司型号 ： SPECTRAMAX 190） ； CO2 培养箱 （FORMA 型号 ： 3111） ； 超净台 （苏净集团安泰公司 制造型号 ： SW-CJ-ZFD） ； 纯水仪 （美国 Spring 公司型号 ： S。
21、/N 020579） ； 精密移液器 （法国 吉尔森公司型号 ： P2） ； 电子天平 （德国赛多利斯有限公司型号 ： BT323S） ； 全自动高压灭菌 锅 （日本 SANYO 公司型号 ： MLS-3020） ； 台式电热鼓风干燥箱 （上海精密实验设备公司型号 ： 说 明 书 CN 103028005 A 5 4/5 页 6 DHG9123A） ； 冰箱 （西门子公司型号 ： KG18V21TI） ； 液氮罐 （CBS 型号 ： 2001） ； 低速离心机 （上 海安亭科学仪器厂型号 ： KA-1000） ； 0.2m 滤器 （MILLIPORE 型号 ： SLGP033RB） ； 10c。
22、m 培养 皿 (NEST 公司 )、 96 孔培养板 （NEST 公司） ； 细胞计数板 ； 离心管、 移液管、 Tips 若干。 0044 2 实验方法 0045 1） KETR-3 细胞用 DMEM+10%FBS 于 37、 5%CO2 进行常规培养 （10cm 培养皿） ， 当细胞生长至对数期时， 收集细胞， 弃去培养液， PBS 轻洗 3 遍， 加入 3ml 0.25% 胰蛋白 酶-0.04%EDTA， 37消化2min后， 向其中加入5ml完全培养基中和反应， 吹打细胞后将其转 入离心管中， 1000rpm 离心 5min， 调整细胞悬液浓度 3104 个 /ml。 0046 2） 。
23、将细胞种入 96 孔培养板中， 每孔加入细胞悬液 180l， 培养板放入细胞培养箱 中 （37， 5%CO2） 常规培养。 0047 3） 根据细胞生长情况， 一般长至 50%-70%， 加入腰痛片溶液， 继续培养 24h。 0048 4） 24h 后加入 20l MTT 溶液 （5mg/ml， 即 0.5%MTT） ， 继续培养 4h。 0049 5） 4h 后扣板法倒去上清， 用吸水纸轻轻拍干， 每孔加入 200l 二甲基亚砜， 置摇 床上低速振荡10min， 使结晶物充分溶解。 在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。 0050 6） 同时设置本底 （不加细胞， 只加培养液） ， 。
24、对照孔 （细胞、 相同浓度的药物溶解介 质、 培养液、 MTT、 二甲基亚砜） ， 每组设定 6 个复孔。 0051 7） 结果以药物对细胞的抑制率表示 ： 0052 细胞增值抑制率 （%） =（对照孔 OD 值 - 给药孔 OD 值） / 对照孔 OD 值 100%。实 验重复 3 次。 0053 3 统计处理 0054 采用 Microsoft Excel 2003 软件中的相关分析和 Student t 检验， 数据以 meanS.D. 表示。 0055 4 实验结果 0056 MTT 法实验后统计结果显示， 与对照组比较， 当剂量达到 5mg/ml 时， 对 KETR-3 细 胞增殖抑制有差异 （P0.05） ， 剂量在 10mg/ml 时该差异具有显著性 （P0.01） ， 当剂量达到 15-20mg/ml 时有极显著性差异 （P0.001） 。 0057 表 1 腰痛片对 KETR-3 细胞增殖抑制影响研究 0058 0059 注 ： 与对照组比较， *P0.01 ； *P0.001 0060 5 实验结论 0061 腰痛片可以抑制KETR-3细胞增殖， 减少KETR-3细胞的细胞生长数目， 该作用呈剂 说 明 书 CN 103028005 A 6 5/5 页 7 量依赖性。 说 明 书 CN 103028005 A 7 。