含有生理活性肽的经粘膜给药制剂 本发明领域
本发明涉及经粘膜给药的肽制剂，该制剂至少由具有促进鼻粘膜或直肠粘膜吸收生理活性肽的吸收促进剂和具有血管扩张作用的化合物与生理活性肽混合而成。具体来讲，本发明涉及经粘膜给药的肽制剂，通过粘膜有效地吸收生理活性肽，而发挥其实用的医疗效果。
在先技术
生理活性肽，如胰岛素和降钙素，习惯上以注射方式给药。不过，注射给药时病人因为疼痛不定而担心，此外也需要一种制剂使人们能够自我给药进行治疗。
生理活性肽的口服给药在消化道的吸收性差，还会被蛋白酶水解，以及还有肝脏的首过效应，因此没有实用价值。
近来，人们为解决这些问题而作出大量努力，利用鼻粘膜或直肠粘膜的吸收性，为此使用加入了各种吸收促进剂的经粘膜给药制剂。
人们尝试了加入一种吸收促进剂的粘膜给药制剂，据报道该粘膜给药制剂中用到了一种具有表面活性剂作用的胆酸盐，如牛磺胆酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠、鹅脱氧胆酸钠、鹅脱氧胆酸赖氨酸、甘氨胆酸钠、甘氨脱氧胆酸钠、以及牛磺酸赖氨酸(特开昭59-130820、EP-A-115627、特开平1-228919、美国专利5149537)，一种阳离子表面活性剂，如环氧乙烷加成的长链胺缩合物、诸如溴化十六烷基三甲基铵、溴化十二烷基甲基铵的季铵化物，一种阴离子表面活性剂，如烷基苯磺酸盐、N-酰基-正烷基牛磺酸盐、和α-烯属磺酸酯盐，或一种非离子表面活性剂，如聚氧化烯高级醇醚、聚亚烷基烷基酚(特开平4-247034)。
据报道经粘膜给药制剂中使用了促进鼻粘膜或直肠粘膜吸收的吸收促进剂，有甘草酸盐，如甘草酸二铵、甘草酸的碱式盐(一钠或二钠盐、一钾或二钾盐)(特开平2-42027、3-5427)，有环糊精，如α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、一或二甲基化地环糊精(α-、β-、γ-)(特开昭58-189118、EP-A-94157)，具有C8-18酰基的O-酰基-L-肉毒碱(特开昭63-10735、EP-A-215697)，或螯合剂、聚丙烯酸凝胶、及癸酸钠(美国专利4476116)。
式(1)的氮杂环链烷烃衍生物，R为烷基，m为2-4的整数，n为1-15的整数，已知当n为1-3时，R为具有5-11个碳原子的烷基，该化合物是一良好的吸收促进剂(特开昭62-238261)。
诸如胆酸和梭链孢酸衍生物的吸收促进剂实例是已知的(J.Japan.Diab.Soc.，20(2)；146-152，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.82(21)；7419-7423，1985，Pharm.Res.，9(1)；52-57，1992)。这些制剂由于吸收性差及其局部刺激作用，不是令人十分满意，不过尚有实际应用。因此肽的良好吸收性是其应用中的关键。
本发明所要解决的问题
本发明提供具有良好吸收性的生理活性肽的经粘膜给药制剂，该制剂通过鼻粘膜、口腔粘膜、肺粘膜、直肠粘膜、阴道粘膜、眼粘膜和消化道粘膜吸收，以充分发挥其全身药理作用，且对粘膜没有不利作用。解决问题的方法
我们广泛研究了具有良好吸收性、安全性及较少副作用的含有生理活性肽的经粘膜给药制剂，结果发现，将已知的吸收促进剂与诸如钙通道阻滞剂或前列腺素E1、二硝酸异山梨糖醇或硝酸甘油等血管扩张剂结合起来，其吸收性有意料不到的显著提高，基于上述事实完成了本发明。
本发明目的之一是提供一种含有生理活性肽的经粘膜给药制剂，该制剂由生理活性肽与已知的吸收促进剂及血管扩张剂组合而成。从现有技术出发，该制剂具有完全意料不到的效果，因为血管扩张剂所表现出来的对吸收的促进作用，现有技术对此毫无所知或知之甚少。
本发明所用的吸收促进剂一般用来改变生物膜的透过性、提高药物的吸收性和生物利用度、并对鼻粘膜或直肠粘膜吸收生理活性肽具有促进作用。本发明所用的吸收促进剂在鼻粘膜或直肠粘膜对生理活性肽胰岛素的吸收中，与不用该吸收促进剂相比，吸收性提高了200％以上，甚至达到了500％以上。
吸收促进剂的实例是已知的对鼻粘膜或直肠粘膜吸收生理活性肽具有促进作用的吸收促进剂。这样的实例是具有表面活性剂活性的化合物，如牛磺胆酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠、鹅脱氧胆酸钠、鹅脱氧胆酸赖氨酸、甘氨胆酸钠、甘氨脱氧胆酸钠、以及牛磺酸赖氨酸；阳离子表面活性剂，如聚氧化乙烯加成的长链胺缩合物、诸如溴化十六烷基三甲基铵、溴化十二烷基甲基铵的叔铵化物；阴离子表面活性剂，如烷基苯磺酸盐、N-酰基-正烷基牛磺酸盐、和α-烯属磺酸酯盐；非离子表面活性剂，如聚氧化烯高级醇醚、聚亚烷基烷基酚；甘草酸盐，如甘草酸二铵、甘草酸的碱式盐(一钠或二钠盐、一钾或二钾盐)；环糊精，如α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、一或二甲基化的环糊精(α-、β-、γ-)；具有C8-18酰基的O-酰基-L-肉毒碱；或螯合剂、聚丙烯酸酯凝胶、及癸酸钠。
进一步优选的吸收促进剂实例为选自由下列物质组成的物质组中的一种或多种化合物：胆酸盐、梭链孢酸盐、甘草酸盐、O-酰基-L-肉毒碱盐、磷脂、非离子表面活性剂、环糊精、高级脂肪酸、1-烷基-2-吡咯烷酮衍生物、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮(Azone)、杆菌肽、薁磺酸钠、以及式(1)的氮杂环烷衍生物其中R为烷基，m为2-4整数，n为1-15整数，且若n为1-3，则R为具有5-11个碳原子的烷基。
胆酸盐的实例选自由牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠和脱氧胆酸钠组成的物质组中的一种或多种化合物。
梭链孢酸盐的实例选自由梭链孢酸钠和牛磺24，25-二氢梭链孢酸钠组成的物质组中的一种或多种化合物。
甘草酸盐的实例选自由甘草酸钠和3-琥珀酰氧基甘草酸(甘珀酸)钠组成的物质组中的一种或多种化合物。
O-酰基-L-肉毒碱盐的实例为具有C8-18酰基的O-酰基-L-肉毒碱，优选盐酸O-辛酰-L-肉毒碱、盐酸O-月桂酰-L-肉毒碱、盐酸O-棕榈酰-L-肉毒碱。
磷脂的实例选自由磷脂酰胆碱(卵磷脂)、溶血磷脂酰胆碱(溶血卵磷脂)和溶血磷脂酰甘油组成的物质组中的一种或多种化合物。
非离子表面活性剂的实例选自由聚氧化烯高级醇醚、聚氧化烯烷基酚和蔗糖脂肪酸酯组成的物质组中的一种或多种化合物，优选聚氧乙烯(9)月桂基醚(月醚-9)(Laureth-9)和聚氧乙烯(24)胆甾烯基醚(胆醚-24)(Choleth-24)。
环糊精的实例选自由α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精和二甲基β-环糊精组成的物质组中的一种或多种化合物。
高级脂肪酸的实例选自由C16-20高级脂肪酸组成的物质组中的一种或多种化合物，优选高级C18不饱和脂肪酸，即油酸、亚油酸、亚麻酸。
1-烷基-2-吡咯烷酮衍生物的实例选自由具有C4-12烷基的化合物组成的物质组中的一种或多种化合物，烷基选自由下列烷基组成的烷基组中的一种或多种：丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基。
通式(1)表示的氮杂环烷衍生物中R的实例为直链或支链烷基，基如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基(eicodecyl)，优选1-[2-(癸硫基)乙基]氮杂环戊烷-2-酮(通用名：癸烷硫代焦(pyrithiodecane)，是一种油性物质)，即式(1)中R为C10烷基，m为3，n为2。
本发明包括了任何具有促进粘膜吸收作用的化合物，而并适量于上述化合物。
本发明所用的吸收促进剂是1-[2-(癸硫基)乙基]氮杂环戊烷-2-酮、甘氨胆酸钠、溶血卵磷脂或薁磺酸钠，具有较高的安全性。
本发明的经粘膜给药制剂最优选使用的吸收促进剂是1-[2-(癸硫基)乙基]氮杂环戊烷-2-酮或溶血卵磷脂。制剂中这些化合物的含量为0.01-5重量％。
含有式(1)的氮杂环烷衍生物、优选为1-[2-(癸硫基)乙基]氮杂环戊烷-2-酮的乳液中，还可以适当含有0.01-10％(w/v)、优选0.1-5％(w/v)的甘草酸或其盐，如二钾盐。
本发明所用的血管扩张剂为分子量200-700的化合物，如钙通道阻滞剂。钙通道阻滞剂一般具有血管扩张作用，通过抑制钙进入细胞而具有延长房室传导时间的作用，因此对高血压和心律失常有效，可用于治疗各种循环疾病。
其实例为诸如盐酸地尔硫的苯并二吖康因衍生物、诸如盐酸维拉帕米及盐酸苄普地尔等苯基烷基胺衍生物、诸如盐酸硝苯地平、盐酸尼卡地平及盐酸尼莫地平等二氢吡啶衍生物、诸如桂利嗪、氟桂利嗪及盐酸fasudil等哌嗪衍生物。
其它强力的血管扩张剂有二硝酸异山梨糖醇、硝酸甘油和前列腺素E1。二硝酸异山梨糖醇与硝酸甘油已经应用于治疗心脏缺血性疾病和心绞痛的注射液、口服制剂及贴剂中。其作用机理为直接作用于血管平滑肌扩张血管，扩张冠状动脉以减小冠脉阻力，扩张副通道以增加对缺血心肌的氧供应，改善心功能。前列腺素E1具有强烈的血管扩张活性和抑制血小板聚集的活性，临床用于治疗溃疡出血并发慢性动脉闭塞。
本发明所用的血管扩张剂适量于上述范围，任何具有血管扩张作用的化合物都能用于本发明。
本发明所用的具有血管扩张活性的化合物一般来自用于治疗循环疾病的市售医药品，将其加入到局部粘膜给药的制剂中，在这种情况下，血管扩张剂作为一种添加剂，其加入量适量，只要该血管扩张剂显示出对生理活性肽的有效吸收作用，优选为血管扩张剂最小有效量的1/2以下，更优选为1/5以下。例如，盐酸地尔硫的最小使用剂量为10mg，作为本发明一种添加剂，优选使用其1/2量以下，更优选为1/5量以下。前列腺素E1注射液的最小使用剂量为20μg，作为本发明一种添加剂，优选使用其1/2量(10μg)以下，更优选为1/5量(4μg)以下。在一次给药的剂量中，最低限量为0.1μg以上，优选为1μg以上。
本发明所用的生理活性肽是由3个以上氨基酸组成的肽，分子量约300-10000。肽的实例有胰岛素、降钙素、人PTH(1-34)、降钙素基因相关的肽(CGRP)、血管紧张肽II、加压素、乙酸去氨加压素、乙酸布舍瑞林、乙酸戈舍瑞林、乙酸那法瑞林、乙酸亮丙瑞林、生长抑素、高血糖素、缩宫素、胰泌素、LH-RH、ACTH、TRH、TSH、ANP或含有其合成或半合成化合物的衍生物。
降钙素例如包括天然降钙素，如鳗降钙素、鲑降钙素、人降钙素、猪降钙素、鸡降钙素，半合成降钙素如ASU1-7鳗降钙素或ASU1-7鸡降钙素。胰岛素的实例为人胰岛素、猪胰岛素、牛胰岛素。
本发明最优选使用的肽为鳗降钙素和人胰岛素。
本发明的经粘膜给药制剂配方如下文所述。
本发明制剂中生理活性肽的用量可依据肽的活性和剂量需要进行选择，这取决于鼻粘膜对肽的吸收性。例如，经粘膜给药的水剂中生理活性肽的浓度优选为0.000001-5％(w/v)，更优选为0.00001-1％(w/v)。
本发明的经粘膜给药制剂可用于鼻粘膜、口腔粘膜、肺粘膜、直肠粘膜、阴道粘膜及眼粘膜给药。制剂可以是溶液、固体或半固体形式，优选为喷雾剂、适于滴液的水剂或栓剂。水剂或栓剂中含有水溶性或油溶性的基本成分，如蒸馏水、甘油、丙二醇、Witepsol、可可脂、豆油、天然脂肪酸甘油三酸酯或聚乙烯吡咯烷酮。
水剂的制备是使其中含有生理活性肽、一种或多种选自上述的吸收促进剂和一种或多种选自上述的血管扩张剂，如果必要的话，再加入适量的pH调节剂、等渗剂、防腐剂、稳定剂、增溶剂或乳化剂，加入适量蒸馏水使这些成分增溶或乳化，制得溶液或乳液。如果需要其稳定，通过冷冻干燥或喷雾干燥可制得固体制剂。
制剂pH的选择要使其不影响生理活性肽的稳定性，对鼻粘膜损伤很小，且不发生沉淀。pH一般优选4-8。pH调节剂的实例为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、盐酸、硫酸或诸如磷酸盐、乙酸盐、乳酸盐或柠檬酸盐的缓冲系。渗透压优选为等渗的。
等渗剂的实例为甘油、氯化钠、甘露糖醇和葡萄糖。药学上可接受的防腐剂都能用在这里。其实例为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯乙醇、氯丁醇、苯酚、甲苯酚、乙基汞硫代水杨酸钠、脱氢乙酸和山梨酸。优选的防腐剂浓度根据所选择的防腐剂而定，为0.01％-2％(w/v)。
本发明的制剂可按常规方法进行制备。水剂的制备例如可通过在注射用水中加入胰岛素、溶血卵磷脂、前列腺素E1和上述添加剂，搅拌使溶解，加入pH调节剂如氢氧化钠或盐酸调节pH。溶液在无菌条件下例如可用0.22μm滤膜过滤，灌入小瓶(Sanvagon公司，U-SAVE)中制得水剂。
使用剂量取决于给药目的。鼻饲制剂对人给药时，用定量喷雾器(每压一次喷出0.05-0.1ml)喷入一侧或两侧鼻腔，每日1-3次。
鼻粘膜或直肠粘膜给药制剂在制备时可加入必要量的Witepsol、可可脂、聚乙二醇、丙二醇或甘油。
本发明制剂的给药途径一般为利用喷雾装置以雾状喷入粘膜中，发挥全身作用。本发明的制剂粘附于大面积粘膜上，完全渗入粘膜，实现肽的全身释放。因此，本发明的经粘膜给药的含肽制剂对病人不会引起因注射而带来的疼痛，也能实现自我给药。
该制剂也能被制成经鼻粘膜、口腔粘膜、肺粘膜、直肠粘膜、阴道粘膜及眼粘膜给药的形式。
附图的简要说明
图1：鳗降钙素鼻饲给药后血中浓度曲线。
图2：鳗降钙素皮下注射(AUC)的吸收率(％)。
图3：人胰岛素鼻饲给药后血中浓度曲线。
图4：人胰岛素鼻饲给药后血中浓度曲线。
图5：LH-RH鼻饲给药后血中浓度曲线。
本发明的实施方式
下列实施例和参考例对本发明作出了说明，但不解释为对本发明的限制。进一步的实验例说明了本发明的效果。参考例1
将5毫克甘氨胆酸钠(SGC：美国希格玛公司)溶于1毫升pH6.0的等渗磷酸盐缓冲溶液中。向1毫升此溶液中加入鳗降钙素400单位/小瓶(冷冻干燥)，制得400单位/毫升的鳗降钙素溶液(对照1)。参考例2
将10毫克盐酸地尔硫(DTZ：美国希格玛公司)溶于2毫升pH6.0的等渗磷酸盐缓冲溶液中。向1毫升此溶液中加入鳗降钙素400单位/小瓶(冷冻干燥)，制得400单位/毫升的鳗降钙素溶液(对照2)。实施例1
将10毫克盐酸地尔硫卓(DTZ：美国希格玛公司)溶于2毫升0.5％甘氨胆酸钠水溶液(pH6.0的等渗磷酸盐缓冲溶液)中，制得含有0.5％SGC和0.5％ DTZ的溶液。向1毫升此溶液中加入鳗降钙素400单位/小瓶(冷冻干燥)，制得400单位/毫升的鳗降钙素溶液。实施例2
先将50毫克N-乙烯基-2-吡咯烷酮(日本和光纯药公司)和5毫克甘氨胆酸钠(SGC：美国希格玛公司)溶于1毫升pH6.0的等渗磷酸盐缓冲溶液中，制得0.5％甘氨胆酸钠溶液，再将10毫克盐酸维拉帕米(VP：美国希格玛公司)溶于2毫升此0.5％甘氨胆酸钠溶液中，制得含有0.5％ SGC和0.5％ VP的溶液。向1毫升此溶液中加入鳗降钙素400单位/小瓶(冷冻干燥)，制得400单位/毫升的鳗降钙素溶液。实施例3
先将100毫克N-乙烯基-2-吡咯烷酮(日本和光纯药公司)和5毫克甘氨胆酸钠(SGC：美国希格玛公司)溶于1毫升pH6.0的等渗磷酸盐缓冲溶液中，制得0.5％甘氨胆酸钠溶液，再将10毫克盐酸苄普地尔(BP：美国希格玛公司)溶于2毫升此0.5％甘氨胆酸钠溶液中，制得含有0.5％ SGC和0.5％ BP的溶液。向1毫升此溶液中加入鳗降钙素400单位/小瓶(冷冻干燥)，制得400单位/毫升的鳗降钙素溶液。实施例4
将10毫克盐酸fusidil(FS：日本旭化成化学公司)溶于2毫升0.5％甘氨胆酸钠水溶液(pH6.0的等渗磷酸缓冲溶液)中，制得含有0.5％SGC和0.5％ FS的溶液。向1毫升此溶液中加入鳗降钙素400单位/小瓶(冷冻干燥)，制得400单位/毫升的鳗降钙素溶液。实施例1
大鼠体内观察鳗降钙素的吸收：(体内实验)
雄性Wistar大鼠(日本SLC，体重200-250克)禁食过夜，每4只为一组，用戊巴比妥(戊巴比妥注射液：日本大日本制药公司)麻醉。
切开颈部，将聚乙烯管插入气管。在食管切开术后将聚乙烯管插入鼻后的空间。用微量移液管将25微升所制备的药液注入右侧鼻孔，进行给药。分别在给药前和给药后从股静脉收集200微升血样。血样经离心(15000转每分/10分钟/5℃)、-30℃贮藏至用于进行分析。
将0.25毫升20单位/毫升的鳗降钙素(生理盐水溶液)皮下给药，进行吸收率的比较(对比1)。定量方法
血液浓度按RIA进行测定。结果
血中鳗降钙素的时间依赖曲线如图1所示。
与含有鳗降钙素和0.5％甘氨胆酸钠的对照组1(■-■)相比，加入了鳗降钙素、0.5％甘氨胆酸钠和0.5％盐酸地尔硫的实施例1给药组(▲-▲)中观察到鳗降钙素的血清浓度有显著提高。比较实验组与对照1的曲线下面积(AUC)可以看出，鼻粘膜对鳗降钙素的吸收提高了约3.6倍。含有鳗降钙素和盐酸地尔硫的对照2给药组(●-●)中几乎没有观察到鼻粘膜的吸收。因此，盐酸地尔硫本身没有吸收促进作用。结论是，将吸收促进剂甘氨胆酸钠与盐酸地尔硫、钙阻滞剂的血管扩张剂结合起来，表现出良好的吸收促进作用。进一步地，实施例2、3、4中盐酸维拉帕米(图1，○-○)、盐酸苄普地尔(图1△-△)，、盐酸fasudil(图1，□-□)给药组也显示出与盐酸地尔硫同样提高了的吸收性。
图2显示了各种钙通道阻滞剂所具有的吸收促进作用。
按下列等式用曲线下面积(AUC)计算对比1中的吸收率。其中I.N.：鼻饲给药，S.C.：皮下给药。从图2中可以明显看出，与单用甘氨胆酸钠本身相比，使用吸收促进剂甘氨胆酸钠和钙通道阻滞剂后，鼻饲给药的鳗降钙素吸收提高了2倍以上。参考例3
将10单位/小瓶的r-人胰岛素(由基因重组酵母得到：特效活性26单位/毫克：德国Boehringer Mannheim公司)(冷冻干燥)溶于1毫升pH7.4的等渗磷酸盐缓冲溶液，制得10单位/毫升的人胰岛素溶液(对照3)。参考例4
将5毫克L-α-溶血卵磷脂(LPC：美国希格玛公司)溶于1毫升pH7.4的等渗磷酸盐缓冲溶液，制得含有0.5％ LPC的溶液。向1毫升此溶液中加入10单位/小瓶的r-人胰岛素(冷冻干燥)，制得10单位/毫升的r-人胰岛素溶液(对照4)。实施例5
将10毫克盐酸地尔硫(DTZ：美国希格玛公司)溶于2毫升0.5％L-α-溶血卵磷脂溶液(pH6.0的等渗磷酸盐缓冲溶液)中，制得含有0.5％ LPC和0.5％ DTZ的溶液。向1毫升此溶液中加入10单位/小瓶的r-人胰岛素(冷冻干燥)，制得10单位/毫升的人胰岛素溶液。实施例6
将20微克注射用前列腺素R20(前列腺素E1：PGE1：日本小野制药公司)溶于2毫升0.5％ L-α-溶血卵磷脂(LPC)溶液(pH7.4的等渗磷酸盐缓冲溶液)中，制得含有0.5％ LPC和0.001％ PGE1的溶液。向1毫升此溶液中加入10单位/小瓶的r-人胰岛素(冷冻干燥)，制得10单位/毫升的人胰岛素溶液。实验例2
大鼠体内观察胰岛素的吸收：(体内实验)
雄性Wistar大鼠(日本SLC，体重200-250克)禁食过夜，每4只为一组，用戊巴比妥(戊巴比妥注射液：日本大日本制药公司)麻醉。
切开颈部，将聚乙烯管插入气管，保持气管畅通。聚乙烯管端口用棉花封住，在食管切开术后将聚乙烯管插入鼻后的空间，以防止药液从鼻腔漏到食管。用微量移液管将25微升所制备的药液注入右侧鼻孔，进行给药。分别在给药前和给药后从股静脉收集200微升血样。血样经离心(15000转每分/10分钟/5℃)、-30℃贮藏至用于进行分析。定量方法
采用人胰岛素化验试剂(德国Boehringer Mannheim公司)，按EIA一步复合方法测定血液浓度，该方法使用2种类型的单克隆抗体。结果
血中胰岛素浓度的时间依赖曲线如图3所示。图3中，胰岛素溶液给药组、即对照3(●-●)中鼻粘膜几乎没有吸收。与加入了胰岛素和0.5％ L-α-溶血卵磷脂(LPC)的对照4(○-○)相比，加入了胰岛素、0.5％盐酸地尔硫和0.001％ PGE1的组中观察到吸收有显著提高。加入了0.5％盐酸地尔硫的实施例5的制剂给药组(■-■)的曲线下面积(AUC)，以及加入了0.001％ PGE1的实施例6的制剂给药组(▲-▲)的曲线下面积分别提高了1.7和1.8倍，该曲线下面积代表鼻粘膜对胰岛素的吸收。实施例7
1毫升经粘膜给药制剂中含有：
1.鳗降钙素 1000单位
2.甘氨胆酸钠 5毫克
3.盐酸地尔硫卓 5毫克
4.甘油 22毫克
5.对羟基苯甲酸甲酯 1毫克
6.盐酸/氢氧化钠适量，调至pH5.5
7.注射用水 加至1毫升
制备含有上述成分的制剂。将溶液进行无菌过滤(0.22微米滤膜)和无菌包装，每只鼻饲给药用自动定量喷雾器专用小瓶中装入3毫升，制得产品。该产品含有1000单位/毫升的鳗降钙素，每按一次喷雾器控钮，即实现100单位鳗降钙素的定量喷雾给药。实施例8
1毫升经粘膜给药制剂中，含有：
1. 鳗降钙素 1000单位
2. L-α-溶血卵磷脂 5毫克
3. 前列腺素E1 10微克
4. 甘油 22毫克
5. 对羟基苯甲酸甲酯 1毫克
6. 盐酸/氢氧化钠适量，调至pH5.5
7. 注射用水 加至1毫升
制备含有上述成分的制剂。将溶液进行无菌过滤(0.22微米滤膜)和无菌包装，每只鼻饲给药用自动定量喷雾器专用小瓶中装入3毫升，制得产品。该产品含有1000单位/毫升的鳗降钙素，每按一次喷雾器按钮，即实现100单位鳗降钙素的定量喷雾给药。实施例9
1毫升经粘膜给药制剂中含有：
1. 鳗降钙素 1000单位
2. L-α-溶血卵磷脂 5毫克
3. 二硝酸异山梨糖醇 0.1毫克
4. 甘油 17.6毫克
5. D-山梨糖醇 10毫克
6. 盐酸/氢氧化钠适量，调至pH5.5
7. 注射用水 加至1毫升
制备含有上述成分的制剂。将溶液进行无菌过滤(0.22微米滤膜)和无菌包装，每只鼻饲给药用自动定量喷雾器专用小瓶中装入3毫升，制得产品。该产品含有1000单位/毫升的鳗降钙素，每按一次喷雾器按钮，即实现100单位鳗降钙素的定量喷雾给药。实施例10
1毫升经粘膜给药制剂中含有：
1. r-人胰岛素 100单位
2. 甘氨胆酸钠 5毫克
3. 盐酸地尔硫 5毫克
4. 甘油 22毫克
5. 对羟基苯甲酸甲酯 1毫克
6. 盐酸/氢氧化钠适量，调至pH6.0
7. 注射用水 加至1毫升
制备含有上述成分的制剂。将溶液进行无菌过滤(0.22微米滤膜)和无菌包装，每只鼻饲给药用自动定量喷雾器专用小瓶中装入3毫升，制得产品。该产品含有100单位/毫升的r-人胰岛素，每按一次喷雾器按钮，即实现10单位人胰岛素的定量喷雾给药。实施例11
1毫升经粘膜给药制剂中含有：
1. r-人胰岛素 100单位
2. L-α-溶血卵磷脂 5毫克
3. 前列腺素E1 10微克
4. 甘油 22毫克
5. 苯扎氯铵 0.1毫克
6. 盐酸/氢氧化钠适量，调至pH6.0
7. 注射用水 加至1毫升
制备含有上述成分的制剂。将溶液进行无菌过滤(0.22微米滤膜)和无菌包装，每只鼻饲给药用自动定量喷雾器专用小瓶中装入3毫升，制得产品。该产品含有100单位/毫升的r-人胰岛素，每按一次喷雾器按钮，即实现10单位人胰岛素的定量喷雾给药。实施例12
1毫升经粘膜给药制剂中含有：
1. r-人胰岛素 100单位
2. L-α-溶血卵磷脂 5毫克
3. 二硝酸异山梨糖醇 0.1毫克
4. 甘油 17.6毫克
5. 苯扎氯铵 0.1毫克
6. D-山梨糖醇 10毫克
7. 盐酸/氢氧化钠适量，调至pH6.0
8. 注射用水 加至1毫升
制备含有上述成分的制剂。将溶液进行无菌过滤(0.22微米滤膜)和无菌包装，每只鼻饲给药用自动定量喷雾器专用小瓶中装入3毫升，制得产品。该产品含有100单位/毫升的r-人胰岛素，每按一次喷雾器按钮，即实现10单位人胰岛素的定量喷雾给药。参考例5
制备含有5毫克癸烷硫代焦(1-[2-(癸硫基)乙基]-氮杂环戊烷-2-酮)(日本久光制药公司)作为吸收促进剂、10毫克甘草酸二钾作为乳化剂和22毫克甘油作为等渗剂的蒸馏水溶液，用超声波法使其均匀，向该溶液中加入1N氢氧化钠调至pH6.0。将该溶液体积定量至1毫升，制得0.5％癸烷硫代焦溶液。向1毫升此溶液中加入10单位/小瓶的r-人胰岛素(冷冻干燥)，制得10单位/毫升的人胰岛素液体制剂(对照5)。参考例6
制备含有0.05毫克前列腺素E1(PGE1：注射用前列腺素R20，日本小野制药公司)和25.7毫克作为等渗剂的甘油的蒸馏水溶液，向该溶液中加入1N氢氧化钠调至pH6.0。将该溶液体积定量至1毫升，制得0.005％PGE1溶液。向1毫升此溶液中加入100单位/小瓶的r-人胰岛素(冷冻干燥)，制得10单位/毫升的胰岛素液体制剂(对照6)。实施例13
制备含有5毫克癸烷硫代焦作为吸收促进剂、10毫克甘草酸二钾作为乳化剂、22毫克甘油作为等渗剂和0.01毫克血管扩张剂前列腺素E1(PGE1：注射用前列腺素R20，小野制药公司制)的蒸馏水溶液，用超声波法使其均匀，向该溶液中加入1N氢氧化钠调至pH6.0。将该溶液体积定量至1毫升，制得0.5％癸烷硫代焦和0.001％ PGE1溶液。向1毫升此溶液中加入10单位/小瓶的r-人胰岛素(冷冻干燥)，制得10单位/毫升的人胰岛素液体制剂。实施例14
制备含有5毫克癸烷硫代焦作为吸收促进剂、10毫克甘草酸二钾作为乳化剂、17.6毫克甘油作为等渗剂和0.1毫克血管扩张剂二硝酸异山梨糖醇(ISDN：Nitorol注射液，日本卫材公司)的蒸馏水溶液，用超声波法使其均匀，向该溶液中加入1N氢氧化钠调至pH6.0。将该溶液体积定量至1毫升，制得0.5％癸烷硫代焦和0.01％ ISDN溶液。向1毫升此溶液中加入10单位/小瓶的r-人胰岛素(冷冻干燥)，制得10单位/毫升的人胰岛素液体制剂。实施例15
制备含有5毫克癸烷硫代焦作为吸收促进剂、10毫克甘草酸二钾作为乳化剂、13.2毫克甘油作为等渗剂和0.2毫克血管扩张剂二硝酸异山梨糖醇(ISDN：Nitorol注射液，日本卫材公司)的蒸馏水溶液，用超声波法使其均匀，向该溶液中加入1N氢氧化钠调至pH6.0。将该溶液体积定量至1毫升，制得0.5％癸烷硫代焦和0.02％ ISDN溶液。向1毫升此溶液中加入10单位/小瓶的r-人胰岛素(冷冻干燥)，制得10单位/毫升的人胰岛素液体制剂。实施例16
制备含有5毫克癸烷硫代焦作为吸收促进剂、10毫克甘草酸二钾作为乳化剂、17.6毫克甘油作为等渗剂和0.1毫克血管扩张剂硝酸甘油(硝酸甘油注射液，日本化药公司)的蒸馏水溶液，用超声波法使其均匀，向该溶液中加入1N氢氧化钠调至pH6.0。将该溶液体积定量至1毫升，制得0.5％癸烷硫代焦和0.01％硝酸甘油溶液。向1毫升此溶液中加入10单位/小瓶的r-人胰岛素(冷冻干燥)，制得10单位/毫升的人胰岛素液体制剂。实验例3
大鼠体内观察胰岛素的吸收(2)：(体内实验)
雄性Wistar大鼠(日本SLC，体重200-250克)禁食过夜，每4只为一组，用戊巴比妥(戊巴比妥注射液：日本大日本制药公司)麻醉。
切开颈部，将聚乙烯管插入气管，保持气管畅通。聚乙烯管端口用棉花封住，在食管切开术后将聚乙烯管插入鼻后的空间，以防止药液从鼻腔漏到食管。用微量移液管将25微升所制备的药液注入右侧鼻孔，进行给药。分别在给药前和给药后从股静脉收集200微升血样。血样经离心(15000转每分/10分钟/5℃)、-30℃贮藏至用于进行分析。定量方法
采用人胰岛素测定试剂(德国Boehringer Mannheim公司)，按EIA一步复合方法测定血液浓度，该方法使用2种类型的单克隆抗体。结果
血中胰岛素浓度的时间依赖曲线如图4所示。图4中，胰岛素溶液给药组、即对照3(●-●)中鼻粘膜几乎没有吸收。类似地，含有胰岛素和0.005％ PGE1(对照6)的溶液给药组(○-○)也几乎没有吸收。与含有胰岛素和0.5％癸烷硫代焦的常规制剂给药组、即对照5(△-△)相比，加入了胰岛素、0.5％癸烷硫代焦和0.001％ PGE1的实施例13的制剂给药组(■-■)、加入了0.01％ ISDN的实施例14的制剂给药组(▲-▲)、加入了0.02％ ISDN的实施例15的制剂给药组(□-□)、以及加入了0.01％硝酸甘油的实施例16的制剂给药组(+-+)中都观察到了鼻粘膜对胰岛素的吸收有显著提高。这些制剂给药组的曲线下面积(AUC；0-2小时)与对照6的给药组相比，分别显著提高了1.7倍、1.9倍、2.0倍和2.4倍。实施例17
1毫升经粘膜给药制剂中含有：
1. r-人胰岛素 100单位
2. 癸烷硫代焦 5毫克
3. PGE1 0.005毫克
4. 甘草酸二钾 10毫克
5. 甘油 22毫克
6. 苯扎氯铵 0.1毫克
7. 盐酸/氢氧化钠适量，调至pH6.0
8. 注射用水 加至1毫升
制备含有上述成分的制剂。将溶液进行无菌过滤(0.22微米滤膜)和无菌包装，每只鼻饲给药用自动定量喷雾器专用小瓶中装入3毫升，制得产品。该产品含有100单位/毫升的r-人胰岛素，每按一次喷雾器按钮，即实现10单位人胰岛素的定量喷雾给药。实施例18
1毫升经粘膜给药制剂中含有：
1. r-人胰岛素 500单位
2. 癸烷硫代焦 5毫克
3. PGE1 0.01毫克
4. 甘草酸二钾 10毫克
5. 甘油 22毫克
6. 苯扎氯铵 0.1毫克
7. 盐酸/氢氧化钠适量，调至pH6.0
8. 注射用水 加至1毫升
制备含有上述成分的制剂。将溶液进行无菌过滤(0.22微米滤膜)和无菌包装，每只鼻饲给药用自动定量喷雾器专用小瓶中装入3毫升，制得产品。该产品含有100单位/毫升的r-人胰岛素，每按一次喷雾器按钮，即实现10单位人胰岛素的定量喷雾给药。实施例19
1毫升经粘膜给药制剂中含有：
1. r-人胰岛素 100单位
2. 癸烷硫代焦 5毫克
3. 二硝酸异山梨糖醇 0.1毫克
4. 甘草酸二钾 10毫克
5. 甘油 17.6毫克
6. 苯扎氯铵 0.1毫克
7. D-山梨糖醇 10毫克
8. 盐酸/氢氧化钠适量，调至pH6.0
9. 注射用水 加至1毫升
制备含有上述成分的制剂。将溶液进行无菌过滤(0.22微米滤膜)和无菌包装，每只鼻饲给药用自动定量喷雾器专用小瓶中装入3毫升，制得产品。该产品含有100单位/毫升的r-人胰岛素，每按一次喷雾器按钮，即实现10单位人胰岛素的定量喷雾给药。实施例20
1毫升经粘膜给药制剂中含有：
1. r-人胰岛素 100单位
2. 癸烷硫代焦 5毫克
3. 二硝酸异山梨糖醇 0.2毫克
4. 甘草酸二钾 10毫克
5. 甘油 13.2毫克
6. 苯扎氯铵 0.1毫克
7. D-山梨糖醇 20毫克
8. 盐酸/氢氧化钠适量，调至pH6.0
9. 注射用水 加至1毫升
制备含有上述成分的制剂。将溶液进行无菌过滤(0.22微米滤膜)和无菌包装，每只鼻饲给药用自动定量喷雾器专用小瓶中3毫升，制得产品。该产品含有100单位/毫升的r-人胰岛素，每按一次喷雾器按钮，即实现10单位人胰岛素的定量喷雾给药。实施例21
1毫升经粘膜给药制剂中含有：
1. r-人胰岛素 100单位
2. 癸烷硫代焦 5毫克
3. 硝酸甘油 0.1毫克
4. 甘草酸二钾 10毫克
5. 甘油 17.6毫克
6. 苯扎氯铵 0.1毫克
7. D-甘露糖醇 20毫克
8. 盐酸/氢氧化钠适量，调至pH6.0
9. 注射用水 加至1毫升
制备含有上述成分的制剂。将溶液进行无菌过滤(0.22微米滤膜)和无菌包装，每只鼻饲给药用自动定量喷雾器专用小瓶中装入3毫升，制得产品。该产品含有100单位/毫升的r-人胰岛素，每按一次喷雾器按钮，即实现10单位人胰岛素的定量喷雾给药。参考例7
制备含有0.1毫克二硝酸异山梨糖醇(ISDN：Nitorol注射液，日本卫材公司)和25.7毫克甘油作为等渗剂的蒸馏水溶液，加入1N氢氧化钠调pH6.0。将该溶液定量至1毫升，制得0.01％ ISDN溶液。向1毫升此溶液中加入100微克/小瓶的黄体形成激素释放激素(LH-RH，美国希格玛公司)(冷冻干燥)，制得100微克/毫升的LH-RH液体制剂(对照7)。参考例8
制备含有5毫克癸烷硫代焦作为吸收促进剂、10毫克甘草酸二钾作为乳化剂和22毫克甘油作为等渗剂的蒸馏水溶液，用超声波法使其均匀，向其中加入1N氢氧化钠调pH6.0。将此溶液体积定量至1毫升，制得0.5％癸烷硫代焦溶液。向1毫升此溶液中加入100微克/小瓶的黄体形成激素释放激素(LH-RH，美国希格玛公司)(冷冻干燥)，制得100微克/毫升的LH-RH液体制剂(对照8)。实施例22
制备含有5毫克癸烷硫代焦作为吸收促进剂、10毫克甘草酸二钾作为乳化剂、17.6毫克甘油作为等渗剂和0.1毫克血管扩张剂二硝酸异山梨糖醇(ISDN：Nitorol注射液，日本卫材公司)的蒸馏水溶液，用超声波法使其均匀，向该溶液中加入1N氢氧化钠调pH6.0。将此溶液体积定量至1毫升，制得0.5％癸烷硫代焦和0.01％ ISDN溶液。向1毫升此溶液中加入100微克/小瓶的黄体形成激素释放激素(LH-RH，美国希格玛公司)(冷冻干燥)，制得100微克/毫升的LH-RH液体制剂。实验例4
大鼠体内观察LH-RH的吸收：(体内实验)
雄性Wistar大鼠(日本SLC，体重200-250克)禁食过夜，每4只为一组，用戊巴比妥(戊巴比妥注射液：日本大日本制药公司)麻醉。
切开颈部，将聚乙烯管插入气管，保持气管畅通。聚乙烯管端口用棉花封住，在食管切开术后将聚乙烯管插入鼻后的空间，以防止药液从鼻腔漏到食管。用微量移液管将10微克/0.1毫克/千克所制备的药液注入右侧鼻孔，进行给药。分别在给药前和给药后从股静脉收集200微升血样。血样经离心分离(15000转每分/10分钟/5℃)、-30℃贮藏至用于进行分析。定量方法
采用LH-RH测定试剂(美国Peninsula公司)按一种竞合型EIA方法测定血液浓度。结果
血中LH-RH浓度的时间依赖曲线如图5所示。图5中，含有LH-RH和0.01％ ISDN的对照7的制剂给药组(●-●)中鼻粘膜几乎没有吸收。与含有LH-RH和0.5％癸烷硫代焦的常规制剂的对照8的制剂给药组(▲-▲)相比，加入了本发明的LH-RH、0.5％癸烷硫代焦和0.01％ ISDN的实施例22的给药组(■-■)中观察到了吸收有显著提高。本发明给药组的曲线下面积(AUC；0-2小时)与对照8的AUC相比，提高了1.5倍。实施例23
1毫升经粘膜给药制剂中含有：
1. LH-RH 5毫克
2. 癸烷硫代焦 5毫克
3. 二硝酸异山梨糖醇 0.1毫克
4. 甘草酸二钾 10毫克
5. 甘油 17.6毫克
6. 苯扎氯铵 0.1毫克
7. D-山梨糖醇 10毫克
8. 盐酸/氢氧化钠适量，调至pH6.0
9. 注射用水 加至1毫升
制备含有上述成分的制剂。将溶液进行无菌过滤(0.22微米滤膜)和无菌包装，每只鼻饲给药用自动定量喷雾器专用小瓶中装入3毫升，制得产品。该产品含有5毫克/毫升的LH-RH，每按一次喷雾器按钮，即实现0.5毫克LH-RH的定量喷雾给药。参考例9
将0.2毫克二硝酸异山梨糖醇(ISDN：Nitorol注射液，日本卫材公司)溶于1毫升pH7.4的等渗磷酸盐缓冲溶液中，制得含有0.02％ ISDN的溶液。向1毫升此溶液中加入10单位/小瓶的r-人胰岛素(冷冻干燥)制得10单位/毫升的人胰岛素溶液(对照9)。实施例24
将0.1毫克二硝酸异山梨糖醇(ISDN：Nitorol注射液，日本卫材公司)溶于1毫升0.5％ L-α-溶血卵磷脂溶液(pH7.4的等渗磷酸盐缓冲溶液)中，制得含有0.5％ LPC和0.01％ ISDN的溶液。向1毫升此溶液中加入10单位/小瓶的r-人胰岛素(冷冻干燥)，制得10单位/毫升的人胰岛素溶液。实施例25
将0.1毫克硝酸甘油(硝酸甘油注射液，日本化药公司)溶于1毫升0.5％ L-α-溶血卵磷脂溶液(pH7.4的等渗磷酸盐缓冲溶液)中，制得含有0.5％ LPC和0.01％硝酸甘油的溶液。向1毫升此溶液中加入10单位/小瓶的r-人胰岛素(冷冻干燥)，制得10单位/毫升的人胰岛素溶液。实验例5
大鼠体内观察胰岛素的吸收(3)：(体内实验)
雄性Wistar大鼠(日本SLC，体重200-250克)禁食过夜，每4只为一组，用戊巴比妥(戊巴比妥注射液：日本大日本制药公司)麻醉。
切开颈部，将聚乙烯管插入气管，保持气管畅通。聚乙烯管端口用棉花封住，在食管切开术后将聚乙烯管插入鼻后的空间，以防止药液从鼻腔漏到食管。用微量移液管将25微升所制备的药液注入右侧鼻孔，进行给药。分别在给药前和给药后从股静脉收集200微升血样。血样经离心(15000转每分/10分钟/5℃)、-30℃贮藏至用于进行分析。定量方法
采用人胰岛素测定试剂(德国Boehringer Mannheim公司)，按EIA一步复合方法测定血液浓度，该方法使用2种类型的单克隆抗体。结果
胰岛素给药组、即对照3中，鼻粘膜几乎没有吸收。类似地，含有胰岛素和0.02％二硝酸异山梨糖醇(ISDN)的溶液给药组(对照6)也几乎没有吸收。与已知含有胰岛素和0.5％ L-α-溶血卵磷脂(LPC)的常规制剂的对照4相比，加入了胰岛素、0.5％ LPC和0.01％ ISDN或0.01％硝酸甘油的实施例24的制剂给药组以及加入了0.01％硝酸甘油的实施例25的制剂给药组中，均观察到了鼻粘膜对胰岛素的吸收有显著提高。这些给药组的曲线下面积(AUC；0-2小时)与对照4给药组相比分别提高了1.7和1.5倍。实施例26
1毫升经粘膜给药制剂中含有：
1. r-人胰岛素 100单位
2. L-α-溶血卵磷脂 5毫克
3. 硝酸甘油 0.1毫克
4. 甘油 17.6毫克
5. 苯扎氯铵 0.1毫克
6. D-甘露糖醇 10毫克
7. 盐酸/氢氧化钠适量，调至pH6.0
8. 注射用水 加至1毫升
制备含有上述成分的制剂。将溶液进行无菌过滤(0.22微米滤膜)和无菌包装，每只鼻饲给药用自动定量喷雾器专用小瓶中装入3毫升，制得产品。该产品含有100单位/毫升的r-人胰岛素，每按一次喷雾器按钮，即实现10单位人胰岛素的定量喷雾给药。
本发明的效果
本发明的含有生理活性肽的经粘膜给药制剂仅用少量的吸收促进剂即提高了从鼻粘膜的吸收作用，对粘膜没有不利影响。