一种含二甲基砜生物降解微球及其制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103191066 A (43)申请公布日 2013.07.10 CN 103191066 A *CN103191066A* (21)申请号 201310136343.6 (22)申请日 2013.04.18 A61K 9/16(2006.01) A61K 31/10(2006.01) A61K 47/34(2006.01) A61P 19/02(2006.01) (71)申请人 中国科学院长春应用化学研究所 地址 130022 吉林省长春市人民大街 5625 号 (72)发明人 章培标 王鑫众 陈学思 唐宇锋 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 1。

2、1227 代理人 赵青朵 李玉秋 (54) 发明名称 一种含二甲基砜生物降解微球及其制备方法 (57) 摘要 本发明提供了一种含二甲基砜生物降解微球 及其制备方法， 该方法将二甲基砜溶于第一有机 溶剂， 得第一混合溶液 ； 将生物可降解性高分子 溶于第二有机溶剂， 得第二混合溶液 ； 将所述第 一混合溶液与所述第二混合溶液混合， 然后通过 膜压入连续相中， 继而进行搅拌， 得到含二甲基砜 生物降解微球。 与现有技术口服二甲基砜相比， 首 先， 本发明利用生物可降解性高分子在体内可生 物降解的作用， 延长二甲基砜在体内的作用时间， 解决了二甲基砜的突释现象， 达到缓释的效果， 提 高了药物作用时。

3、间减少了服药次数， 同时也提高 了二甲基砜的利用效果 ； 其次， 采用膜乳化技术， 使含二甲基砜生物微球具有较好的均一性及载药 量。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 附图9页 (10)申请公布号 CN 103191066 A CN 103191066 A *CN103191066A* 1/1 页 2 1. 一种含二甲基砜生物降解微球， 其特征在于， 由二甲基砜与生物可降解性高分子组 成。 2. 根据权利要求 1 所述的含二甲基砜生物降解微球， 其特征在于， 所述。

4、生物可降解性 高分子选自聚乳酸、 聚羟基乙酸、 聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物与聚己内酯中的一种。 3. 一种含二甲基砜生物降解微球的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： a) 将二甲基砜溶于第一有机溶剂， 得第一混合溶液 ； 将生物可降解性高分子溶于第二 有机溶剂， 得第二混合溶液 ； b) 将所述第一混合溶液与所述第二混合溶液混合， 得到第三混合溶液， 然后通过膜压 入连续相中， 得到 O/W 型乳状液 ； c) 将所述 O/W 型乳状液搅拌， 得到含二甲基砜生物降解微球。 4. 根据权利要求 3 所述的制备方法， 其特征在于， 所述膜为微孔膜。 5. 根据权利要求 3 所述的制备方法，。

5、 其特征在于， 所述连续相为包含表面活性剂与分 散剂的水溶液。 6. 根据权利要求 3 所述的制备方法， 其特征在于， 所述搅拌的速度为 300 700rpm/ min， 搅拌的时间为 6 8h。 7. 根据权利要求 3 所述的制备方法， 其特征在于， 所述第一有机溶剂选自乙醇、 苯、 甲 醇与丙酮中的一种。 8. 根据权利要求 3 所述的制备方法， 其特征在于， 所述第二有机溶剂选自氯仿、 二氯甲 烷与 N,N- 二甲基甲酰胺中的一种。 9. 根据权利要求 3 所述的制备方法， 其特征在于， 所述第三混合溶液中生物可降解性 高分子的浓度为 1 7wt%。 10. 根据权利要求 3 所述的制备。

6、方法， 其特征在于， 所述第三混合溶液中二甲基砜的浓 度为 1 15wt%。 权 利 要 求 书 CN 103191066 A 2 1/10 页 3 一种含二甲基砜生物降解微球及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于药物缓释载体技术领域， 尤其涉及一种含二甲基砜生物降解微球及其 制备方法。 背景技术 0002 骨性关节炎 （osteoarthritis， OA） 是一种严重影响患者生活质量和工作的常见 病、 多发病， 系关节软骨的退变和继发性骨质增生所致的一种慢性骨关节病， 膝关节 OA 发 病率最高。 由于其病因病理尚不完全清楚， 因此， OA治疗成为临床治疗的难题之一。 国内的 初步调。

7、查显示， 骨性关节炎的总患病率约为 15%， 40 岁人群的患病率为 10 17%， 60 岁以上 则达50%， 而在75岁以上人群中， 80%患有骨性关节炎， 该病的最终致残率为53%。 我国骨性 关节炎的发病情况约占总人口的 10%， 为 1 亿人左右， 1990 年， 我国只有 4000 多万骨关节炎 患者， 而 2000 年已达到 8000 万， 目前患者人数达到了 1 亿多人， 根据 WHO 预测， 到 2015 年 中国骨病患者将达到 1.5 亿， 将成为世界骨关节炎患病人数最多的国家之一。 0003 由于软骨细胞的分裂潜能及其修复能力有限， 因此应用外源性药物促进软骨损伤 的修复。

8、是重要的研究方向。 目前， 针对不同患者、 不同关节位置和不同病理阶段有许多治疗 方法， 但各种方法均有其局限性， 成功率极低， 不能从根本上治愈关节炎。而骨性关节炎治 疗中广泛应用的非甾体抗炎药物虽可减轻疼痛， 但具有很强的不良反应 ； 激素类药物关节 腔注射有很好的缓解症状、 改善功能的作用， 但不能促进损伤软骨的恢复。骨骼、 软骨和结 缔组织的修补与重建均要以硫为原料， 同时硫也有助于钙的吸收， 因此有学者建议多食含 硫的食物。 0004 二甲基砜是一种有机硫化物， 是人体胶原蛋白合成的必要物质， 为国外常用的保 健品， 主要用于皮肤、 毛发、 骨、 软骨等辅助治疗， 其对糖类的代谢起促。

9、进作用， 亦能促进伤 口愈合， 同时二甲基砜也是最有效的体外软骨细胞分裂素， 具有加速关节软骨代谢， 促进软 骨再生的作用。 近年来， 国外陆续有采用二甲基砜口服治疗膝骨关节炎的报道， 而许多基础 研究也表明其具有很好的防治关节软骨退变的作用， 有望成为治疗骨关节炎的有效方法之 一。 0005 国外使用二甲基砜口服结果表明， 二甲基砜与其他治疗骨性关节炎药物有协同作 用， 但其单次口服剂量较大， 且需多次服用， 有突释现象， 给患者增加了负担， 并且药物稳定 性差， 其分子量较小， 在体内的半衰期较短， 容易被机体代谢排出， 全身或局部应用的效果 均不能满足临床上治疗要求， 因此研究二甲基砜缓。

10、释剂对长期维持损伤局部的有效药物浓 度具有重要的意义。 发明内容 0006 有鉴于此， 本发明要解决的技术问题在于提供一种含二甲基砜生物降解微球及其 制备方法， 该生物降解微球解决了二甲基砜的突释问题。 0007 本发明提供了一种含二甲基砜生物降解微球， 由二甲基砜与生物可降解性高分子 说 明 书 CN 103191066 A 3 2/10 页 4 组成。 0008 优选的， 所述生物可降解性高分子选自聚乳酸、 聚羟基乙酸、 聚乳酸 - 羟基乙酸共 聚物与聚己内酯中的一种。 0009 本发明还提供了一种含二甲基砜生物降解微球的制备方法， 包括以下步骤 ： 0010 a) 将二甲基砜溶于第一有机。

11、溶剂， 得第一混合溶液 ； 将生物可降解性高分子溶于 第二有机溶剂， 得第二混合溶液 ； 0011 b) 将所述第一混合溶液与所述第二混合溶液混合， 得到第三混合溶液， 然后通过 膜压入连续相中， 得到 O/W 型乳状液 ； 0012 c) 将所述 O/W 型乳状液搅拌， 得到含二甲基砜生物降解微球。 0013 优选的， 所述膜为微孔膜。 0014 优选的， 所述连续相为包含表面活性剂与分散剂的水溶液。 0015 优选的， 所述搅拌的速度为 300 700rpm/min， 搅拌的时间为 6 8h。 0016 优选的， 所述第一有机溶剂选自乙醇、 苯、 甲醇与丙酮中的一种。 0017 优选的， 。

12、所述第二有机溶剂选自氯仿、 二氯甲烷与 N,N- 二甲基甲酰胺中的一种。 0018 优选的， 所述第三混合溶液中生物可降解性高分子的浓度为17wt%。 优选的， 所 述第三混合溶液中二甲基砜的浓度为 1 15wt%。 0019 本发明提供了一种含二甲基砜生物降解微球及其制备方法， 该方法将二甲基砜溶 于第一有机溶剂， 得第一混合溶液 ； 将生物可降解性高分子溶于第二有机溶剂， 得第二混合 溶液 ； 将所述第一混合溶液与所述第二混合溶液混合， 得到第三混合溶液， 然后通过膜压入 连续相中， 继而进行搅拌， 得到含二甲基砜生物降解微球。与现有技术口服二甲基砜相比， 本发明利用膜乳化技术将二甲基砜与。

13、可生物降解性分子制备成含二甲基砜生物降解微球， 首先， 本发明利用生物可降解性高分子在体内可生物降解的作用， 延长二甲基砜在体内的 作用时间， 解决了二甲基砜的突释现象， 达到缓释的效果， 提高了药物作用时间减少了服药 次数， 同时也提高了二甲基砜的利用效果 ； 其次， 采用膜乳化技术， 使含二甲基砜生物微球 具有较好的均一性及载药量。 附图说明 0020 图 1 为本发明实施例 1 制备得到的含二甲基砜生物降解微球的扫描电镜照片 ； 0021 图 2 为本发明实施例 2 制备得到的含二甲基砜生物降解微球的扫描电镜照片 ； 0022 图 3 为本发明实施例 3 制备得到的含二甲基砜生物降解微球。

14、的扫描电镜照片 ； 0023 图 4 为本发明实施例 4 制备得到的含二甲基砜生物降解微球的扫描电镜照片 ； 0024 图 5 为本发明实施例 2 制备得到的含二甲基砜生物降解微球的扫描电镜照片 ； 0025 图 6 为本发明实施例 5 制备得到的含二甲基砜生物降解微球的扫描电镜照片 ； 0026 图 7 为本发明实施例 6 制备得到的含二甲基砜生物降解微球的扫描电镜照片 ； 0027 图 8 为本发明实施例 2 制备得到的含二甲基砜生物降解微球的扫描电镜照片 ； 0028 图 9 为本发明实施例 7 制备得到的含二甲基砜生物降解微球的扫描电镜照片 ； 0029 图 10 为本发明实施例 1、。

15、 2 与 3 制备得到的含二甲基砜生物降解微球的释药累积 率对时间的曲线图 ； 0030 图 11 为本发明实施例 4、 2 与 5 制备得到的含二甲基砜生物降解微球的释药累积 说 明 书 CN 103191066 A 4 3/10 页 5 率对时间的曲线图 ； 0031 图 12 为本发明实施例 4 制备得到的含二甲基砜生物降解微球的激光共聚焦照 片 ； 0032 图 13 为本发明实施例 2 制备得到的含二甲基砜生物降解微球的激光共聚焦照 片 ； 0033 图 14 为本发明实施例 5 制备得到的含二甲基砜生物降解微球的激光共聚焦照 片 ； 0034 图 15 为 MC3T3-E1 成骨细。

16、胞与本发明实施例 1、 2 与 3 制备得到的含二甲基砜生物 降解微球共培养得到的柱形图 ； 0035 图 16 为 MC3T3-E1 成骨细胞与本发明实施例 4、 2 与 5 制备得到的含二甲基砜生物 降解微球共培养得到的柱形图 ； 0036 图 17 为本发明实施例 6、 2 与 7 制备得到的含二甲基砜生物降解微球的直径对搅 拌速率的柱形图。 具体实施方式 0037 本发明提供了一种含二甲基砜生物降解微球， 由二甲基砜与生物可降解性高分子 组成。 0038 其中， 所述二甲基砜为本领域技术人员熟知的可作为药物的二甲基砜即可， 并无 特殊的限制。 0039 所述生物可降解性高分子为本领域技。

17、术人员熟知的生物可降解性高分子即可， 并 无特殊的限制， 本发明中所述生物可降解性高分子优选为聚乳酸、 聚羟基乙酸、 聚乳酸 - 羟 基乙酸共聚物或聚乙内酯。生物可降解性高分子具有良好的生物相容性、 可降解性及可吸 收等特性， 在环境保护、 组织工程、 骨折内固定和药物控释等领域有着广泛的应用。将生物 可降解性高分子应用于药物载体， 可利用其在体内可生物降解的特性， 延长药物在体内的 作用时间， 提高药物疗效， 解决二甲基砜的突释现象。 0040 本发明还提供了一种上述含二甲基砜生物降解微球的制备方法， 包括以下步骤 ： a) 将二甲基砜溶于第一有机溶剂， 得第一混合溶液 ； 将生物可降解性高。

18、分子溶于第二有机 溶剂， 得第二混合溶液 ； b) 将所述第一混合溶液与所述第二混合溶液混合， 得到第三混合 溶液， 然后通过膜压入连续相中， 得到 O/W 型乳状液 ； c) 将所述 O/W 型乳状液搅拌， 得到含 二甲基砜生物降解微球。 将二甲基砜与生物降解性高分子分别溶于第一有机溶剂与第二有 机溶剂中， 得到第一混合溶液与第二混合溶液。 其中， 所述第一有机溶剂为本领域技术人员 熟知的可溶解二甲基砜的有机溶剂即可， 并无特殊的限制， 本发明中优选为乙醇、 苯、 甲醇 或丙酮， 更优选为丙酮 ； 所述第二有机溶剂为本领域技术人员熟知的可溶解生物可降解性 高分子的有机溶剂即可， 并无特殊的限。

19、制， 本发明中优选为氯仿、 二氯甲烷或 N,N- 二甲基 甲酰胺， 更优选为丙酮。 0041 得到第一混合溶液与第二混合溶液之后， 将两者混合， 得到第三混合溶液即为分 散相。其中， 得到的第三混合溶液中生物可降解性高分子的浓度为 1 7wt%， 优选为 3 5wt% ； 第三混合溶液中二甲基砜的浓度为 1 15wt%， 优选为 5 10wt%。 0042 得到第三混合溶液后， 将第三混合溶液通过膜压入连续相中， 得到 O/W 型乳状液。 说 明 书 CN 103191066 A 5 4/10 页 6 其中， 所述膜为本领域技术人员熟知的用于膜乳化的膜即可， 并无特殊的限制， 本发明中优 选为。

20、微孔膜， 更优选为 SPG 膜。 0043 本发明中， 所述连续相为本领域技术人员熟知的膜乳化法中所用的连续相即可， 并无特殊的限制， 优选为包含表面活性剂与分散剂的水溶液。 其中， 所述表面活性剂为本领 域技术人员熟知的表面活性剂即可， 并无特殊的限制， 优选为十二烷基硫酸钠或脂肪酸山 梨坦 ； 所述连续相中表面活性剂的含量优选为0.56g/L， 更优选为24g/L ； 所述分散剂 为本领域技术人员熟知的分散剂即可， 并无特殊的限制， 优选为聚乙烯醇或聚山梨酯 ； 所述 连续相中分散剂的含量优选为 0.5 4g/L， 更优选为 1 2g/L。两者皆可降低表面张力和 表面自由能。 0044 本。

21、发明利用膜乳化技术将二甲基砜与可生物降解性分子制备成含二甲基砜生物 降解微球， 首先， 本发明利用生物可降解性高分子在体内可生物降解的作用， 延长二甲基砜 在体内的作用时间， 解决了二甲基砜的突释现象， 达到缓释的效果， 提高了药物作用时间减 少了服药次数， 同时也提高了二甲基砜的利用效果 ； 其次， 采用膜乳化技术， 使含二甲基砜 生物微球具有较好的均一性及载药量。 0045 得到 O/W 型乳状液后， 将其恒温搅拌， 在此过程中随着分散相中的有机溶剂不断 向连续相扩散并逐渐挥发除去， 得到含二甲基砜生物降解微球。 其中， 所述恒温的温度优选 为 12 20， 更优选为 12 15； 所述搅。

22、拌的速度优选为 300 700rpm/min， 更优选 为 400 600rpm/min ； 所述搅拌的时间优选为 6 8h， 更优选为 7 8h。 0046 在搅拌的过程中， 有机相不断向连续相扩散并逐渐挥发除去， 逐渐有固体析出， 然 后固化成含二甲基砜生物降解微球， 最终形成含二甲基砜生物降解微球的悬浮液， 本发明 优选将此悬浮液离心， 洗涤， 干燥后得到含二甲基砜生物降解微球。 所述离心的转速优选为 6000 9000r/min， 离心的时间优选为 20 40min ； 为了防止二甲基砜升华， 所述干燥优选 为冷冻干燥。 0047 为了进一步说明本发明， 以下结合实施例对本发明提供的一。

23、种含二甲基砜生物降 解微球及其制备方法进行详细描述。 0048 以下实施例中所用的试剂均为市售。 0049 实施例 1 0050 1.1 将聚乳酸与二甲基砜分别溶于氯仿和丙酮中， 并充分搅拌， 然后将两者共混， 超声均匀， 得到分散相， 分散相中聚乳酸的含量为 3wt%， 二甲基砜的含量为 4.5wt%。 0051 1.2 将 1.1 中得到的分散相加入储存器中， 在外加压力作用下， 将分散相通过多孔 玻璃膜 （SPG 微孔膜） 压入连续相中， 从而制备出单分散的 O/W 型乳状液， 连续相为 300ml 含 十二烷基硫酸钠 （SDS） 2g/L 和聚乙烯醇 1g/L ； SPG 膜孔径为 0。

24、.6m。 0052 1.3将1.2中得到的O/W型乳状液迅速转移至15恒温槽中， 500rpm/min搅拌7h， 随着分散相溶剂氯仿及丙酮不断向连续相扩散并逐渐挥发除去， 固化成含二甲基砜生物降 解微球， 最终形成含二甲基砜生物降解微球的悬浮液， 8000r/min 离心 30min， 去离子水洗 涤 3 次， 冷冻干燥后得到含二甲基砜生物降解微球。 0053 取少量 1.3 中得到的含二甲基砜生物降解微球悬浮于蒸馏水中， 用 1ml 移液器 吸取少量滴在硅片上， 使其均匀摊开， 自然晾干， 用双面胶固定在样品台上， 真空条件下喷 金处理后， 利用扫描电镜对其进行分析， 得到其扫描电镜照片， 。

25、如图 1 所示， 其比例尺为 说 明 书 CN 103191066 A 6 5/10 页 7 100m。 0054 将 1.3 中得到的含二甲基砜生物降解微球置于蒸馏水中进行超声分散， 采用扫描 电镜进行观察， 通过统计扫描电镜照片上 200 个微球的粒径通过公式计算得到含二甲基砜 生物降解微球平均粒径和粒径分布， 平均粒径 （Dn） 公式 ： Dn=( di)/n， di为微球直径， n 为 统计的微球数量， 分散性 （CV） 的计算公式为 ： CV=SD/Dn， SD 为标准差。1.3 中得到的含二甲 基砜生物降解微球的 Dn=4.78m， CV=26.35%。 0055 称量 20.0m。

26、g1.3 中得到的含二甲基砜生物降解微球， 溶于 10ml 硝酸中， 利用电感 耦合等离子体发射光谱仪 （ICP-AES） 进行分析， 测定其中硫元素的含量， 通过二甲基砜中硫 元素所占分子量计算二甲基砜含量， 取 3 个平行样。含二甲基砜生物降解微球的药物载药 量及包埋率按以下公式计算 ： 载药量 （DL） = （微球中二甲基砜的含量 / 微球的质量） 100% ； 药物包埋率 （EE） =（载药量 * 微球总质量 / 理论微球中二甲基砜的质量） 100%， 得到结果 见表 1。 0056 将10.0mg1.3中得到的含二甲基砜生物降解微球与1.5ml PBS缓冲液 （pH=7.4） 混 合。

27、， 置于 37恒温振荡器以 120r/min 的速度进行振摇孵育， 模拟生理条件下的体外药物释 放， 于 12h、 24h、 48h、 72h、 96h、 120h、 168h、 196h、 244h 和 504h 离心分离， 取出 1.0ml 上清液， 同时补入 1.0ml 新鲜 PBS 缓冲液， 利用 ICP-AES 测定上清液中二甲基砜浓度， 样品每个时间 点设 3 个平行样， 结果取平均值， 将释药累积率对时间做曲线， 结果如图 10 中 - - 所示。 0057 利用四唑蓝显色反应药敏实验 （MTT 实验） 检测在含 1.3 中制备的含二甲基砜生物 降解微球培养条件下成长的 MC3T。

28、3-E1 成骨细胞， 得到柱形图， 如图 15 中 a 所示。 0058 实施例 2 0059 2.1 将聚乳酸与二甲基砜分别溶于氯仿和丙酮中， 并充分搅拌， 然后将两者共混， 超声均匀， 得到分散相， 分散相中聚乳酸的含量为 3wt%， 二甲基砜的含量为 4.5wt%。 0060 2.2 将 2.1 中得到的分散相加入储存器中， 在外加压力作用下， 将分散相通过多孔 玻璃膜 （SPG 微孔膜） 压入连续相中， 从而制备出单分散的 O/W 型乳状液， 连续相为 300ml 含 十二烷基硫酸钠 （SDS） 2g/L 和聚乙烯醇 1g/L ； SPG 膜孔径为 5.1m。 0061 2.3将2.2。

29、中得到的O/W型乳状液迅速转移至15恒温槽中， 500rpm/min搅拌7h， 随着分散相溶剂氯仿及丙酮不断向连续相扩散并逐渐挥发除去， 固化成含二甲基砜生物降 解微球， 最终形成含二甲基砜生物降解微球的悬浮液， 8000r/min 离心 30min， 去离子水洗 涤 3 次， 冷冻干燥后得到含二甲基砜生物降解微球。 0062 取少量 2.3 中得到的含二甲基砜生物降解微球悬浮于蒸馏水中， 用 1ml 移液器吸 取少量滴在硅片上， 使其均匀摊开， 自然晾干， 用双面胶固定在样品台上， 真空条件下喷金 处理后， 利用扫描电镜对其进行分析， 得到其扫描电镜照片， 如图2、 图5与图8所示， 图2比。

30、 例尺为 100m， 图 5 的比例尺为 20m， 图 8 的比例尺为 10m。 0063 将 2.3 中得到的含二甲基砜生物降解微球置于蒸馏水中进行超声分散， 采用扫描 电镜进行观察， 通过统计扫描电镜照片上 200 个微球的粒径通过公式计算得到含二甲基砜 生物降解微球平均粒径和粒径分布， 平均粒径 （Dn） 公式 ： Dn=( di)/n， di为微球直径， n 为 统计的微球数量， 分散性 （CV） 的计算公式为 ： CV=SD/Dn， SD 为标准差。2.3 中得到的含二甲 基砜生物降解微球的 Dn=26.24m， CV=8.65%。 0064 称量 20.0mg2.3 中得到的含二甲。

31、基砜生物降解微球， 溶于 10ml 硝酸中， 利用电感 说 明 书 CN 103191066 A 7 6/10 页 8 耦合等离子体发射光谱仪 （ICP-AES） 进行分析， 测定其中硫元素的含量， 通过二甲基砜中硫 元素所占分子量计算二甲基砜含量， 取 3 个平行样。计算含二甲基砜生物降解微球的药物 载药量 （DL） 及包埋率 （EE） ， 得到结果见表 1。 0065 将10.0mg2.3中得到的含二甲基砜生物降解微球与1.5ml PBS缓冲液 （pH=7.4） 混 合， 置于 37恒温振荡器以 120r/min 的速度进行振摇孵育， 模拟生理条件下的体外药物释 放， 于 12h、 24h。

32、、 48h、 72h、 96h、 120h、 168h、 196h、 244h 和 504h 离心分离， 取出 1.0ml 上清液， 同时补入 1.0ml 新鲜 PBS 缓冲液， 利用 ICP-AES 测定上清液中二甲基砜浓度， 样品每个时间 点设 3 个平行样， 结果取平均值， 将释药累积率对时间做曲线， 结果如图 10 中 - - 所示与 图 11 中 - - 所示。由图 10 及图 11 可知， 制备的含二甲基砜生物降解微球到达平台期所 需的时间为 7 10 天， 生物降解微球达到 50% 释放率的释药时间在 3 天以上， 因此可认为 达到了良好的缓释效果， 没有明显的突释现象， 其释药。

33、速率随膜孔径的降低和聚乳酸中二 甲基砜质量比的增高而加快， 由于药物释放的机理是由药物扩散和载体材料的降解同时控 制， 释药速率可能是与微球尺寸、 比表面积及内部结构有关， 但在前 10 天主要是由疏水的 聚乳酸介导的药物扩散控制起决定作用。 0066 按上述方法制备含少量异硫氰酸荧光素 （FITC） 的含二甲基砜生物降解微球， 将微 球置于蒸馏水中超声分散， 平铺与载玻片上， 室温干燥后采用激光共聚焦显微镜观察微球 内部结构， 得到激光共聚焦照片， 如图 13 所示。 0067 利用四唑蓝显色反应药敏实验 （MTT 实验） 检测在含 2.3 中制备的含二甲基砜生物 降解微球培养条件下成长的 。

34、MC3T3-E1 成骨细胞， 得到柱形图， 如图 15 中 b 所示及图 16 中 c所示。 0068 实施例 3 0069 3.1 将聚乳酸与二甲基砜分别溶于氯仿和丙酮中， 并充分搅拌， 然后将两者共混， 超声均匀， 得到分散相， 分散相中聚乳酸的含量为 3wt%， 二甲基砜的含量为 4.5wt%。 0070 3.2 将 3.1 中得到的分散相加入储存器中， 在外加压力作用下， 将分散相通过多孔 玻璃膜 （SPG 微孔膜） 压入连续相中， 从而制备出单分散的 O/W 型乳状液， 连续相为 300ml 含 十二烷基硫酸钠 （SDS） 2g/L 和聚乙烯醇 1g/L ； SPG 膜孔径为 10.。

35、1m。 0071 3.3将3.2中得到的O/W型乳状液迅速转移至15恒温槽中， 500rpm/min搅拌7h， 随着分散相溶剂氯仿及丙酮不断向连续相扩散并逐渐挥发除去， 固化成含二甲基砜生物降 解微球， 最终形成含二甲基砜生物降解微球的悬浮液， 8000r/min 离心 30min， 去离子水洗 涤 3 次， 冷冻干燥后得到含二甲基砜生物降解微球。 0072 取少量 3.3 中得到的含二甲基砜生物降解微球悬浮于蒸馏水中， 用 1ml 移液器 吸取少量滴在硅片上， 使其均匀摊开， 自然晾干， 用双面胶固定在样品台上， 真空条件下喷 金处理后， 利用扫描电镜对其进行分析， 得到其扫描电镜照片， 如。

36、图 3 所示， 其比例尺为 100m。 0073 将 3.3 中得到的含二甲基砜生物降解微球置于蒸馏水中进行超声分散， 采用扫描 电镜进行观察， 通过统计扫描电镜照片上 200 个微球的粒径通过公式计算得到含二甲基砜 生物降解微球平均粒径和粒径分布， 平均粒径 （Dn） 公式 ： Dn=( di)/n， di为微球直径， n 为 统计的微球数量， 分散性 （CV） 的计算公式为 ： CV=SD/Dn， SD 为标准差。3.3 中得到的含二甲 基砜生物降解微球的 Dn=35.18m， CV=3.24%。 说 明 书 CN 103191066 A 8 7/10 页 9 0074 称量 20.0mg。

37、3.3 中得到的含二甲基砜生物降解微球， 溶于 10ml 硝酸中， 利用电感 耦合等离子体发射光谱仪 （ICP-AES） 进行分析， 测定其中硫元素的含量， 通过二甲基砜中硫 元素所占分子量计算二甲基砜含量， 取 3 个平行样。计算含二甲基砜生物降解微球的药物 载药量 （DL） 及包埋率 （EE） ， 得到结果见表 1。 0075 将10.0mg3.3中得到的含二甲基砜生物降解微球与1.5ml PBS缓冲液 （pH=7.4） 混 合， 置于 37恒温振荡器以 120r/min 的速度进行振摇孵育， 模拟生理条件下的体外药物释 放， 于 12h、 24h、 48h、 72h、 96h、 120h。

38、、 168h、 196h、 244h 和 504h 离心分离， 取出 1.0ml 上清液， 同时补入 1.0ml 新鲜 PBS 缓冲液， 利用 ICP-AES 测定上清液中二甲基砜浓度， 样品每个时间 点设 3 个平行样， 结果取平均值， 将释药累积率对时间做曲线， 结果如图 10 中 - - 所示。 0076 利用四唑蓝显色反应药敏实验 （MTT 实验） 检测在含 3.3 中制备的含二甲基砜生物 降解微球培养条件下成长的 MC3T3-E1 成骨细胞， 得到柱形图， 如图 15 中 c 所示。由图 15 可知， 随着培养时间的增长， 各组的细胞个数逐渐增加， 在含实施例2中膜孔径为5.1m制 。

39、备得到的含二甲基砜生物降解微球的条件下培养的细胞增殖情况优于其他两组， 培养 1 天 时， a 与 b 比有显著性差异 （P 0.05） ， 与 c 相比有增殖趋势， 但没有显著性差异 ； 在培养 3 天时， b 与其他两组相比有增殖趋势， 但没有显著性差异 ； 当培养 7 天时， b 与其他两组相比 增殖趋势更为明显， 并有显著性差异 （P 0.05） 。 0077 表 1 不同膜孔径制备的含二甲基砜生物降解微球的药物载药量及包埋率 0078 0079 实施例 4 0080 4.1 将聚乳酸与二甲基砜分别溶于氯仿和丙酮中， 并充分搅拌， 然后将两者共混， 超声均匀， 得到分散相， 分散相中聚。

40、乳酸的含量为 3wt%， 二甲基砜的含量为 0.9wt%。 0081 4.2 将 4.1 中得到的分散相加入储存器中， 在外加压力作用下， 将分散相通过多孔 玻璃膜 （SPG 微孔膜） 压入连续相中， 从而制备出单分散的 O/W 型乳状液， 连续相为 300ml 含 十二烷基硫酸钠 （SDS） 2g/L 和聚乙烯醇 1g/L ； SPG 膜孔径为 5.1m。 0082 4.3将4.2中得到的O/W型乳状液迅速转移至15恒温槽中， 500rpm/min搅拌7h， 随着分散相溶剂氯仿及丙酮不断向连续相扩散并逐渐挥发除去， 固化成含二甲基砜生物降 解微球， 最终形成含二甲基砜生物降解微球的悬浮液， 。

41、8000r/min 离心 30min， 去离子水洗 涤 3 次， 冷冻干燥后得到含二甲基砜生物降解微球。 0083 取少量 4.3 中得到的含二甲基砜生物降解微球悬浮于蒸馏水中， 用 1ml 移液器 吸取少量滴在硅片上， 使其均匀摊开， 自然晾干， 用双面胶固定在样品台上， 真空条件下喷 金处理后， 利用扫描电镜对其进行分析， 得到其扫描电镜照片， 如图 4 所示， 其比例尺为 20m。 0084 将 4.3 中得到的含二甲基砜生物降解微球置于蒸馏水中进行超声分散， 采用扫描 电镜进行观察， 通过统计扫描电镜照片上 200 个微球的粒径通过公式计算得到含二甲基砜 说 明 书 CN 103191。

42、066 A 9 8/10 页 10 生物降解微球平均粒径， 得到结果为 28.64m。 0085 称量 20.0mg4.3 中得到的含二甲基砜生物降解微球， 溶于 10ml 硝酸中， 利用电感 耦合等离子体发射光谱仪 （ICP-AES） 进行分析， 测定其中硫元素的含量， 通过二甲基砜中硫 元素所占分子量计算二甲基砜含量， 取 3 个平行样。计算含二甲基砜生物降解微球的药物 载药量 （DL） 及包埋率 （EE） ， 得到结果见表 2。 0086 将10.0mg4.3中得到的含二甲基砜生物降解微球与1.5ml PBS缓冲液 （pH=7.4） 混 合， 置于 37恒温振荡器以 120r/min 的。

43、速度进行振摇孵育， 模拟生理条件下的体外药物释 放， 于 12h、 24h、 48h、 72h、 96h、 120h、 168h、 196h、 244h 和 504h 离心分离， 取出 1.0ml 上清液， 同时补入 1.0ml 新鲜 PBS 缓冲液， 利用 ICP-AES 测定上清液中二甲基砜浓度， 样品每个时间 点设 3 个平行样， 结果取平均值， 将释药累积率对时间做曲线， 结果如图 11 中 - - 所示。 0087 按上述方法制备含少量异硫氰酸荧光素 （FITC） 的含二甲基砜生物降解微球， 将微 球置于蒸馏水中超声分散， 平铺与载玻片上， 室温干燥后采用激光共聚焦显微镜观察微球 内。

44、部结构， 得到激光共聚焦照片， 如图 12 所示。 0088 利用四唑蓝显色反应药敏实验 （MTT 实验） 检测在含 4.3 中制备的含二甲基砜生物 降解微球培养条件下成长的 MC3T3-E1 成骨细胞， 得到柱形图， 如图 16 中 b所示， a为空 白试验对照即成骨细胞在只含聚乳酸不含二甲基砜的生物降解微球的培养条件下成长。 0089 实施例 5 0090 5.1 将聚乳酸与二甲基砜分别溶于氯仿和丙酮中， 并充分搅拌， 然后将两者共混， 超声均匀， 得到分散相， 分散相中聚乳酸的含量为 3wt%， 二甲基砜的含量为 8.6wt%。 0091 5.2 将 5.1 中得到的分散相加入储存器中，。

45、 在外加压力作用下， 将分散相通过多孔 玻璃膜 （SPG 微孔膜） 压入连续相中， 从而制备出单分散的 O/W 型乳状液， 连续相为 300ml 含 十二烷基硫酸钠 （SDS） 2g/L 和聚乙烯醇 1g/L ； SPG 膜孔径为 5.1m。 0092 5.3将5.2中得到的O/W型乳状液迅速转移至15恒温槽中， 500rpm/min搅拌7h， 随着分散相溶剂氯仿及丙酮不断向连续相扩散并逐渐挥发除去， 固化成含二甲基砜生物降 解微球， 最终形成含二甲基砜生物降解微球的悬浮液， 8000r/min 离心 30min， 去离子水洗 涤 3 次， 冷冻干燥后得到含二甲基砜生物降解微球。 0093 取。

46、少量 5.3 中得到的含二甲基砜生物降解微球悬浮于蒸馏水中， 用 1ml 移液器 吸取少量滴在硅片上， 使其均匀摊开， 自然晾干， 用双面胶固定在样品台上， 真空条件下喷 金处理后， 利用扫描电镜对其进行分析， 得到其扫描电镜照片， 如图 6 所示， 其比例尺为 20m。 0094 将 5.3 中得到的含二甲基砜生物降解微球置于蒸馏水中进行超声分散， 采用扫描 电镜进行观察， 通过统计扫描电镜照片上 200 个微球的粒径通过公式计算得到含二甲基砜 生物降解微球平均粒径， 得到结果为 20.58m。 0095 称量 20.0mg5.3 中得到的含二甲基砜生物降解微球， 溶于 10ml 硝酸中， 。

47、利用电感 耦合等离子体发射光谱仪 （ICP-AES） 进行分析， 测定其中硫元素的含量， 通过二甲基砜中硫 元素所占分子量计算二甲基砜含量， 取 3 个平行样。计算含二甲基砜生物降解微球的药物 载药量 （DL） 及包埋率 （EE） ， 得到结果见表 2。 0096 将10.0mg5.3中得到的含二甲基砜生物降解微球与1.5ml PBS缓冲液 （pH=7.4） 混 合， 置于 37恒温振荡器以 120r/min 的速度进行振摇孵育， 模拟生理条件下的体外药物释 说 明 书 CN 103191066 A 10 9/10 页 11 放， 于 12h、 24h、 48h、 72h、 96h、 120h。

48、、 168h、 196h、 244h 和 504h 离心分离， 取出 1.0ml 上清液， 同时补入 1.0ml 新鲜 PBS 缓冲液， 利用 ICP-AES 测定上清液中二甲基砜浓度， 样品每个时间 点设 3 个平行样， 结果取平均值， 将释药累积率对时间做曲线， 结果如图 11 中 - - 所示。 0097 按上述方法制备含少量异硫氰酸荧光素 （FITC） 的含二甲基砜生物降解微球， 将微 球置于蒸馏水中超声分散， 平铺与载玻片上， 室温干燥后采用激光共聚焦显微镜观察微球 内部结构， 得到激光共聚焦照片， 如图 14 所示。由图 12 图 14 可知， 本发明含二甲基砜生 物降解微球内部结构为多孔结构， 且随着其中二甲基砜浓度的增高， 孔结构逐渐呈网络状， 当二甲基砜浓度为 8.6wt% 时， 呈典型的放射状多孔结构， 此结构更有利于药物的担载与释 放。 0098 利用四唑蓝显色反应药敏实验 （MTT 实验） 检测在含 5.3 中制备的含二甲基砜生 物降解微球培养条件下成长的 MC3T3-E1 成骨细胞， 得到柱形图， 如图 16 中 d所示。由图 16 可知， d组细胞增殖情况优于其他含二甲基砜生物降解微球的两组 ； 培养 1 天时， c和 b、 d分别有显著性差异 （P 0.05） ， 说明在 1 天时， 实施例 2 中制备的含二甲基砜生物 降解微球对 。