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1、(10)申请公布号 CN 103999773 A (43)申请公布日 2014.08.27 CN 103999773 A (21)申请号 201410226087.4 (22)申请日 2014.05.27 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 昆明凌览生物科技有限公司 地址 650217 云南省昆明市经开区经开路 3 号昆明科技创新园 B1-23 室 (72)发明人 赵平 唐军荣 罗旭璐 阚欢 刘云 李旭 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 11350 代理人 汤东凤 (54) 发明名称 一种富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培 养方法 (57)。
2、 摘要 本发明公开了一种富含咖啡酰熊果苷的樟叶 越桔的组织培养方法, 属于植物组织培养技术领 域。在不同的激素及活性炭配比浓度下, 以改良 WPM 为基本培养基, 樟叶越桔幼嫩茎段为外植体 进行组培苗培养系的建立及咖啡酰熊果苷含量的 测定。只需通过调节 6-BA 与 NAA 及活性炭的配 比就可以控制无菌苗的生长及生根诱导。外植体 诱导率达 97, 芽苗健壮, 生长快, 芽苗生根率达 94, 且根系健壮。 具有繁殖速度快、 周期短、 咖啡 酰熊果苷含量高等优点, 是大量获取咖啡酰熊果 苷的有效途径, 并为樟叶越桔优良快繁苗的规模 化生产提供可靠的技术依据。 (51)Int.Cl. 权利要求书 。
3、1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103999773 A CN 103999773 A 1/1 页 2 1. 一种富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法, 其特征在于包括以下步骤 : (1) 从叶越桔植株上获取当年生的樟叶越桔茎段作为外植体, 外植体剪除叶片剪成 4 6cm 长的茎段, 用洗洁精水浸泡 30 60min, 流水冲洗 1 2h 后再用酒精和升汞消 毒, 消毒后用无菌水冲洗, 无菌条件下切成带 1 2 个叶腋的茎段, 然后叶腋朝上斜插于 腋芽诱导培养基上。
4、进行培养, 叶腋处诱导出腋芽后继续培养 ; 所述的腋芽诱导培养基为 : WMP+6-BA1.0 3.0mg/L+NAA0.5 1.5mg/L+ 活性炭 2.0 3.0g/L, pH5.4 5.8 ; (2) 腋芽的增殖诱导 : 待腋芽长成 3cm 以上的小苗后, 将其切成 1.5 2cm 长带 1 3 个叶腋的茎段, 然后叶腋朝上斜插于腋芽增殖培养基中进行培养 ; 培养至小苗长至 3 4cm 高且叶腋处可诱导出新的不定芽小苗即得到樟叶越桔组培苗 ; 所述的腋芽增殖培养基为 : WMP+6-BA1.0 3.0mg/L+NAA0.2 1.0mg/L+ 活性炭 1.0 2.0g/L, pH5.4 5。
5、.8 ; (3) 樟叶越桔组培苗的生根诱导 : 将樟叶越桔组培苗接种于生根培养基中培养诱导生 根得到樟叶越桔生根苗 ; 所述的生根培养基为 : WMP+6-BA0.5 1.5mg/L+NAA0.1 1.0mg/ L+ 活性炭 0.1 1.0g/L, pH5.4 5.8。 2. 根据权利要求 1 所述的樟叶越桔的组织培养方法, 其特征在于 : 步骤 (1) 中所述的 消毒为 : 用 75酒精浸泡 15 30s, 再用 0.1升汞浸泡 7 12min。 3. 根据权利要求 1 所述的樟叶越桔的组织培养方法, 其特征在于 : 腋芽诱导培养基、 腋 芽增殖培养基和生根培养基中的凝胶剂是琼脂或卡拉胶, 。
6、培养基中的蔗糖为食用白糖, 培 养基中的水为自来水, 培养基 pH 值用 1mol/LNaOH 或 HCl 来调节。 4. 根据权利要求 3 所述的樟叶越桔的组织培养方法, 其特征在于 : 凝胶剂的终浓度为 4 5g/L, 蔗糖的终浓度为 20 30g/L。 5. 根据权利要求 1 所述的樟叶越桔的组织培养方法, 其特征在于 : 步骤 (1) 中所述的 培养条件为 : 培养温度 252, 光照强度 2000 2500lx, 光照周期比 14 15h:9 10h。 6. 根据权利要求 1 所述的樟叶越桔的组织培养方法, 其特征在于 : 步骤 (2) 中所述的 培养条件为 : 培养温度 272, 。
7、光照强度 2100 2300lx, 光照周期比 12h:12h。 7. 根据权利要求 1 所述的樟叶越桔的组织培养方法, 其特征在于 : 步骤 (3) 中所述的 培养条件为 : 培养温度 282, 光照强度 1700 1800lx, 光照周期比 10h:14h。 8. 根据权利要求 1 所述的樟叶越桔的组织培养方法, 其特征在于 : 还包括咖啡酰熊果 苷含量的测定。 9. 根据权利要求 8 所述的樟叶越桔的组织培养方法, 其特征在于 : 咖啡酰熊果苷含量 的测定方法包括如下步骤 : (1) 将样品在自然条件下风干、 粉碎后称取 0.5g 置于 10mL 容量瓶中, 加入 60甲醇 10mL, 。
8、称重, 超声 3 次, 每次 30min, 静置 24h 后用 60甲醇补足至前面所称重量, 过微孔滤 膜 d 0.45m, 得供试样品溶液 ; (2) 高效液相色谱测定咖啡酰熊果苷的含量, 条件如下 : 色谱柱 Agilent Analytical Eclipse XDB-C18(4.6mm150mm, 0.5m), 流动相 : 甲醇 / 水体系 ( 含冰醋酸 1 ), 洗脱 体系 : 0 5min5甲醇, 5 10min5 15甲醇, 10 50min15 65甲醇, 50 55min6595甲醇, 流速 : 1.0mL/min, 进样量40L, 检测波长280nm, 柱温30; 通过咖 。
9、啡酰熊果苷标准品的面积外标法进行含量测定, 对照品线性方程为y1152.3x+190.03, R2 0.9998。 权 利 要 求 书 CN 103999773 A 2 1/4 页 3 一种富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法 技术领域 0001 本发明属于植物组织培养技术领域, 具体涉及一种富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔 的组织培养方法。 背景技术 0002 樟叶越桔(Vaccinium dunalianum)是杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium) 植物, 常绿灌木。主产于云南、 四川、 贵州、 西藏等地, 我国台湾以及锡金、 不丹、 印度 ( 东北 部 )、 缅甸 (。
10、 东北部 ) 至越南亦有分布, 在云南省境内则主要分布于云南西北部经滇中高原 至滇南和滇东南。其幼嫩叶芽, 因形似雀嘴呈锥状, 在云南彝族民间又称 “雀嘴茶” , 据记载 自明代开始就作为一种茶代用品长期饮用至今, 具有祛风除湿、 舒筋活络等功效。越桔属 植物富含多种营养成分, 并具有多方面的生理活性, 同时也是广泛应用于化妆品行业的熊 果苷 (arbutin) 原料的主要植物来源之一。熊果苷是源于绿色植物的天然活性物质, 是当 今流行的最为安全有效的美白原料, 也是国际公认的二十一世纪的理想皮肤美白祛斑活性 剂。 由于熊果苷作为次生代谢产物通常以微量形式存在于植物体中, 且天然植物来源困难,。
11、 因此, 筛选熊果苷高产天然植株或寻找熊果苷天然替代品已经成为当务之急。 0003 申请人前期研究发现, 樟叶越桔是一种富含咖啡酰熊果苷类物质的特殊资 源植物, 其中 6 -O- 咖啡酰熊果苷的得率高达植物材料干重的 22 (Zhao P,Tanaka T,Hirabayashi K,et al,2008.Caffeoyl arbutin and related compounds from the buds of Vaccinium dunalianum.Phytochemistry,69(18):3087-3094.), 并对其制备方法进行了专 利保护 ( 赵平 , 张颖君 , 许敏 , 。
12、杨崇仁 ,2007.6 -O- 咖啡酰基熊果甙的制备方法 . 授权专 利号 : ZL200710065956.X)。生物活性研究结果表明, 该化合物的酪氨酸酶抑制活性和抗氧 化等活性均优于熊果苷, 且毒性仅为熊果苷的 1/2, 可望作为熊果苷天然替代品加以应用, 具有重要的开发价值。由于樟叶越桔处于野生状态, 生长缓慢, 分布有限, 加之随着雀嘴茶 的关注度不断提高, 导致其连年遭受破坏性采摘, 野生樟叶越桔数量急剧减少。 现有技术目 前尚无采用组织培养技术获得高含量咖啡酰熊果苷植物材料的报道, 有必要采用现代生物 技术手段解决当前樟叶越桔的资源匮乏问题。 发明内容 0004 本发明的目的在于。
13、针对现有技术存在的不足, 基于咖啡酰熊果苷在樟叶越桔植物 体的分布特点及其所具有的药理活性, 提供一种培养过程简单、 高效且富含咖啡酰熊果苷 的樟叶越桔的组织培养方法。该方法具有繁殖速度快、 周期短、 咖啡酰熊果苷含量高等优 点, 是获取大量高含量咖啡酰熊果苷的樟叶越桔材料的有效途径。 0005 为了实现本发明的目的, 本发明提供了如下技术方案 : 0006 一种富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法, 包括以下步骤 : 0007 (1) 从叶越桔植株上获取当年生的樟叶越桔茎段作为外植体, 外植体剪除叶片剪 成 4 6cm 长的茎段, 用洗洁精水浸泡 30 60min, 流水冲洗 1 2h 。
14、后再用酒精和升汞 说 明 书 CN 103999773 A 3 2/4 页 4 消毒, 消毒后用无菌水冲洗, 无菌条件下切成带 1 2 个叶腋的茎段, 然后叶腋朝上斜插于 腋芽诱导培养基上进行培养, 叶腋处诱导出腋芽后继续培养 ; 所述的腋芽诱导培养基为 : WMP+6-BA1.0 3.0mg/L+NAA0.5 1.5mg/L+ 活性炭 2.0 3.0g/L, pH5.4 5.8。 0008 (2) 腋芽的增殖诱导 : 待腋芽长成 3cm 以上的小苗后, 将其切成 1.5 2cm 长带 1 3 个叶腋的茎段, 然后叶腋朝上斜插于腋芽增殖培养基中进行培养 ; 培养至小苗长至 3 4cm 高且叶腋。
15、处可诱导出新的不定芽小苗即得到樟叶越桔组培苗 ; 反复将 3 4cm 高 的组培苗切成 1.5 2cm 长带 1 3 个叶腋的茎段在腋芽增殖培养基上进行增殖培养, 可 以使得樟叶越桔进行快速大量的扩繁 ; 所述的腋芽增殖培养基为 : WMP+6-BA1.0 3.0mg/ L+NAA0.2 1.0mg/L+ 活性炭 1.0 2.0g/L, pH5.4 5.8。 0009 (3) 樟叶越桔组培苗的生根诱导 : 将樟叶越桔组培苗接种于生根培养基中培养诱 导生根得到樟叶越桔生根苗 ; 所述的生根培养基为 : WMP+6-BA0.5 1.5mg/L+NAA0.1 1.0mg/L+ 活性炭 0.1 1.0。
16、g/L, pH5.4 5.8。 0010 步骤 (1) 中所述的消毒优选为 : 用 75酒精浸泡 15 30s, 再用 0.1升汞浸泡 7 12min。 0011 步骤(1)中所述的培养条件优选为 : 培养温度252, 光照强度20002500lx, 光照周期比 14 15h:9 10h。 0012 步骤(2)中所述的培养条件优选为 : 培养温度272, 光照强度21002300lx, 光照周期比 12h:12h。 0013 步骤(3)中所述的培养条件优选为 : 培养温度282, 光照强度17001800lx, 光照周期比 10h:14h。 0014 上述方法中腋芽诱导培养基、 腋芽增殖培养基。
17、和生根培养基中的凝胶剂可以是 琼脂或卡拉胶, 其终浓度优选为 4 5g/L ; 培养基中的蔗糖为食用白糖, 其终浓度优选为 20 30g/L ; 培养基中的水为自来水 ; 培养基的 pH 值优选为用 1mol/LNaOH 或 HCl 来调节。 0015 上述富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法还可进一步包括咖啡酰熊果 苷含量的测定。 0016 优选的, 咖啡酰熊果苷含量的测定方法包括如下步骤 : 0017 (1) 将样品在自然条件下风干、 粉碎后称取 0.5g 置于 10mL 容量瓶中, 加入 60甲 醇 10mL, 称重, 超声 3 次, 每次 30min, 静置 24h 后用 60甲醇。
18、补足至前面所称重量, 过微孔 滤膜 d 0.45m, 得供试样品溶液。 0018 (2) 高效液相色谱 (HPLC) 测定咖啡酰熊果苷的含量, 条件如下 : 色谱柱 Agilent Analytical Eclipse XDB-C18(4.6mm150mm, 0.5m), 流动相 : 甲醇 / 水体系 ( 含冰醋酸 1 ), 洗脱体系 : 0 5min5甲醇, 5 10min5 15甲醇, 10 50min15 65 甲醇, 50 55min65 95甲醇, 流速 : 1.0mL/min, 进样量 40L, 检测波长 280nm, 柱 温 30 ; 通过咖啡酰熊果苷标准品的面积外标法进行含量测。
19、定, 对照品线性方程为 y 1152.3x+190.03, R2 0.9998。 0019 与现有技术相比, 本发明的优异性在于 : 0020 (1) 本发明使用的改良 WPM 培养基比传统的 WPM 基本培养基更有利于樟叶越桔无 菌苗的诱导、 增殖和生长。 0021 (2) 所使用的蔗糖为食用白糖, 水为民用自来水, 价格低廉, 来源广泛。 说 明 书 CN 103999773 A 4 3/4 页 5 0022 (3) 本发明的特点在于激素配比简单, 可靠调节激素及活性炭的配比来控制无菌 苗的生长或生根诱导。 0023 (4) 本发明方法外植体诱导率达 97, 芽苗健壮, 生长快, 芽苗生根。
20、率达 94, 且 根系健壮 ; 本发明方法周期短, 成本低, 完全能满足大面积规模化栽培的需求, 具有良好的 应用前景。 0024 本方法结合了微型扦插及组织培养的技术, 从幼嫩樟叶越桔的茎段叶腋处诱导出 腋芽, 待长成无菌苗后不断诱导扩繁, 不经脱分化和再分化, 周期短, 遗传性状稳定, 芽苗健 壮, 培养过程简单。 另一方面, 经高效液相色谱检测发现樟叶越桔组培苗中含有高含量咖啡 酰熊果苷物质。 樟叶越桔组织培养方法的建立, 是大量获取咖啡酰熊果苷的有效途径, 并可 为樟叶越桔优良快繁苗的规模化生产提供可靠的技术依据。 附图说明 0025 为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚, 下。
21、面将结合附图为本发明做进 一步的详细描述, 其中 : 0026 图 1 为本发明实施例 1 中得到的樟叶越桔组培苗生根照片。 0027 图 2 为本发明实施例 2 中得到的樟叶越桔组培苗高效液相色谱图。 具体实施方式 0028 通过以下实施例对本发明做进一步的详细说明, 但本发明的内容并不局限于此。 0029 实施例 1 0030 (1) 腋芽诱导的启动培养 0031 在健壮的樟叶越桔植株上获取当年生幼嫩的樟叶越桔茎段作为外植体, 外植体剪 除叶片剪成 4 6cm 长的茎段, 用洗洁精水浸泡 30 60min, 流水冲洗 1 2h 后进行消毒, 消毒采用 75的酒精和 0.1的升汞组合, 75。
22、酒精浸泡 15 30s, 0.1升汞浸泡 7 12min, 消毒后用无菌水冲洗45次, 于消毒过的滤纸上将其切成带12个叶腋的茎段并 吸干茎段上的水分, 然后叶腋朝上斜插于腋芽诱导培养基 (WPM+6-BA2.5mg/L+NAA1.0mg/L+ 活性炭 2.5g/L, 其中白糖 20 30g/L、 琼脂 4-6g/L, pH5.5) 上培养, 培养温度为 252, 光照强度为 2000lx, 光照周期比 14h:10h。培养 25d 后, 芽诱导率为 95。 0032 (2) 腋芽的增殖诱导 0033 待腋芽长成 3cm 以上的小苗后, 将其切成 1.5 2cm 长带 1 3 个叶腋的茎段, 。
23、然 后叶腋朝上斜插于腋芽增殖培养基 (WPM+6-BA2.0mg/L+NAA0.8mg/L+ 活性炭 1.5g/L, 其中 白糖2030g/L、 琼脂46g/L, pH5.6)中进行培养, 培养温度272, 光照强度2300lx, 光照周期比 12h:12h。30d 后, 小苗可长至 3 4cm 高, 同时在叶腋处可诱导出新的不定芽 小苗, 反复将 3 4cm 高的小苗切成 1.5 2cm 长带 1 3 个叶腋的茎段转到相同的腋芽 增殖培养基上进行增殖培养, 可以使得樟叶越桔进行快速大量的扩繁, 其增殖系数为 3。 0034 (3) 樟叶越桔组培苗的生根诱导 0035 将生长健壮的组培苗转接于。
24、生根培养基 (WPM+6-BA1.3mg/L+NAA0.8mg/L+ 活性炭 0.8g/L, 其中白糖 20 30g/L、 琼脂 4-6g/L, pH5.8) 中培养, 培养温度 282, 光照强度 1800lx, 光照周期比 10h:14h。培养 35d 后, 组培苗 ( 见图 1) 即可生长出数条根系, 生根率 说 明 书 CN 103999773 A 5 4/4 页 6 为 92。 0036 樟叶越桔组培苗中咖啡酰熊果苷的含量用高效液相色谱 (HPLC) 测定, 按发 明内容中的方法制备供试样品溶液, HPLC 条件如下 : Agilent Analytical Eclipse XDB-。
25、C18(4.6mm150mm, 0.5m) 色谱柱, 流动相 : 甲醇 / 水体系 ( 含冰醋酸 1 ), 洗脱 体系 : 0 5min5甲醇, 5 10min5 15甲醇, 10 50min15 65甲醇, 50 55min6595甲醇, 流速 : 1.0mL/min, 进样量40L, 检测波长280nm, 柱温30, 通过咖 啡酰熊果苷标准品的面积外标法进行含量测定 ( 咖啡酰熊果苷保留时间为 26min), 对照品 线性方程为 y 1152.3x+190.03, R2 0.9998。 0037 经 HPLC 分析, 得出该条件下诱导培养的樟叶越桔组培苗中咖啡酰熊果苷的含量 为 0.132。
26、。 0038 实施例 2 0039 (1) 腋芽诱导的启动培养 0040 在健壮的樟叶越桔植株上获取当年生幼嫩的樟叶越桔茎段作为外植体, 外植体剪 除叶片剪成 4 6cm 长的茎段, 用洗洁精水浸泡 30 60min, 流水冲洗 1 2h 后进行消毒, 消毒采用 75的酒精和 0.1的升汞组合, 75酒精浸泡 15 30s, 0.1升汞浸泡 7 12min, 消毒后用无菌水冲洗 4 5 次, 于消毒过的滤纸上将其切成带 1 2 个叶腋的茎段 并吸干茎段上的水分, 然后叶腋朝上斜插于腋芽诱导培养基 (WPM+6-BA2mg/L+NAA1.5mg/L+ 活性炭 3g/L, 其中白糖 20 30g/。
27、L、 琼脂 4 6g/L, pH5.4) 上培养, 培养温度为 272, 光照强度为 2500lx, 光照周期比 15h:9h。培养 30d 后, 芽诱导率为 92。 0041 (2) 腋芽的增殖诱导 0042 待腋芽长成 3cm 以上的小苗后, 将其切成 1.5 2cm 长带 1 3 个叶腋的茎段, 然 后叶腋朝上斜插于腋芽增殖培养基 (WPM+6-BA2.0mg/L+NAA1.0mg/L+ 活性炭 1.3g/L, 其中 白糖2030g/L、 琼脂46g/L, pH5.6)中进行培养, 培养温度282, 光照强度2100lx, 光照周期比 12h:12h。30d 后, 小苗可长至 3 4cm。
28、 高, 同时在叶腋处可诱导出新的不定芽 小苗, 反复将 3 4cm 高的小苗切成 1.5 2cm 长带 1 3 个叶腋的茎段转到相同的腋芽 增殖培养基上进行增殖培养, 可以使得樟叶越桔进行快速大量的扩繁, 其增殖系数为 3。 0043 (3) 樟叶越桔组培苗的生根诱导 0044 将生长健壮的组培苗转接于生根培养基 (WPM+6-BA1.3mg/L+NAA0.7mg/L+ 活性炭 0.9g/L, 其中白糖 20 30g/L、 琼脂 4 6g/L, pH5.8) 中培养, 培养温度 262, 光照强度 1700lx, 光照周期比 10h:14h。培养 35d 后, 组培苗即可生长出数条根系, 生根。
29、率为 94。 0045 樟叶越桔组培苗中咖啡酰熊果苷的含量用高效液相色谱 (HPLC) 测定, 按发 明内容中的方法制备供试样品溶液, HPLC 条件如下 : Agilent Analytical Eclipse XDB-C18(4.6mm150mm, 0.5m) 色谱柱, 流动相 : 甲醇 / 水体系 ( 含冰醋酸 1 ), 洗脱 体系 : 0 5min5甲醇, 5 10min5 15甲醇, 10 50min15 65甲醇, 50 55min6595甲醇, 流速 : 1.0mL/min, 进样量40L, 检测波长280nm, 柱温30, 通过咖 啡酰熊果苷标准品的面积外标法进行含量测定 ( 咖啡酰熊果苷保留时间为 26min), 对照品 线性方程为 y 1152.3x+190.03, R2 0.9998。 0046 经HPLC分析(图2), 得出该条件下诱导培养的樟叶越桔组培苗中咖啡酰熊果苷的 含量为 0.147。 说 明 书 CN 103999773 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103999773 A 7 。