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1、(10)申请公布号 CN 104031923 A (43)申请公布日 2014.09.10 CN 104031923 A (21)申请号 201410274379.5 (22)申请日 2014.06.18 C12N 15/29(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/82(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C07K 14/415(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 南京农业大学 地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇国 家农业科技园南京农业大学基地 (72)发明人 张绍铃 黄小三 靳丛 齐开杰 (。
2、74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 傅婷婷 徐冬涛 (54) 发明名称 一个山梨抗寒转录因子 PubHLH 及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一个山梨抗寒转录因子PubHLH 及其应用。山梨 bHLH 类转录因子基因 PubHLH， 其 核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 1 所示， 在 SEQ ID NO ： 1所示序列的409-2043bp处为该基因的编 码区 ； 其编码的氨基酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 2 所示。本发明从山梨中克隆到一个新的 bHLH 基 因 PubHLH， 利用农杆菌介导的遗传转化方法将该 基因转化烟草和梨， 。
3、获得的转基因植株抗寒能力 明显提高， 经生物学功能验证， 表明本发明克隆的 PubHLH 基因具有调控抗寒功能。本发明所述的山 梨 bHLH 类转录因子基因 PubHLH 可在植物抗寒性 状改良或构建抗寒转基因植物中应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 7 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 序列表7页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104031923 A CN 104031923 A 1/1 页 2 1. 一种山梨 bHLH 类转录因子基因 PubHLH， 其特征在于核苷酸序列如。
4、 SEQ ID NO ： 1 所 示， 其中第 409-2043bp 处为该基因的编码区。 2. 权利要求 1 所述的山梨 bHLH 类转录因子编码的蛋白， 其特征在于氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 3. 用于扩增权利要求 1 所述的山梨 bHLH 类转录因子基因 cDNA 的引物对， 其特征在于 正向引物序列如 SEQ ID NO ： 3 所示， 反向引物序列如 SEQ ID NO ： 4 所示。 4. 含有权利要求 1 所述基因 PubHLH 的重组表达载体。 5. 根据权利要求 4 所述的重组表达载体， 其特征在于以 pMV 为出发载体。 6. 含有权利要求 1 所述的。
5、山梨 bHLH 类转录因子基因 PubHLH 的宿主菌。 7.权利要求1所述的山梨bHLH类转录因子基因PubHLH在植物抗寒性状改良或构建抗 寒转基因植物中的应用。 8.权利要求2所述的山梨bHLH类转录因子基因PubHLH编码的蛋白在植物抗寒性状改 良或构建抗寒转基因植物中的应用。 9. 权利要求 4 所述的重组表达载体在植物抗寒性状改良或构建抗寒转基因植物中的 应用。 权 利 要 求 书 CN 104031923 A 2 1/9 页 3 一个山梨抗寒转录因子 PubHLH 及其应用 技术领域 0001 本发明属于植物基因工程领域， 涉及一个山梨抗寒转录因子 PubHLH 及其应用， 具 。
6、体涉及从山梨 (Poncirus trifoliata) 中克隆得到一个 bHLH(basic helix-loop-helix， 碱 性螺旋-环-螺旋)家族转录因子PubHLH， 然后将该基因分别导入到烟草和梨中， 获得的转 基因植株抗寒性明显提高。 背景技术 0002 植物经常遭受一系列的环境胁迫， 包括干旱、 高温、 低温、 盐碱等， 其中， 低温是影 响作物生长发育和产量及限制植物地理分布最为重要的因素之一。在长期的演化的过程 中， 植物已经形成一套复杂的机制来应对和适应这些非生物逆境。 近二十年来， 国内外科学 家在对植物响应非生物逆境分子机理解析方面已经取得了长足的进步(Qin e。
7、t al.,2011)。 现在清楚的是， 植物逆境响应是一个非常复杂的多个信号途径的过程。外界胁迫信号由已 知或未知的传感元件识别， 激活第二信使(如钙离子， 活性氧和肌醇磷酸盐)。 之后， 由不同 的信号元件转导、 传达、 放大胁迫信号， 最终导致一系列的生理和代谢改变。人们在鉴定参 与逆境响应答的信号转导元件中已经取得了很大的进步。 0003 前人的研究的表明， 在复杂的逆境信号传导途径包括了大量的逆境响应基因， 根据基因产物的功能大体上可以分为两类。一类是由直接保护细胞免受损伤的功能蛋 白组成， 另一类是由在信号转导和基因表达起调控作用的调节蛋白组成 (Agarwal et al.,20。
8、06 ； Chinnusamy et al.,2006 ； Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki2007 ； Lata and Prasad,2011)。对逆境响应基因的研究不仅能够了解逆境响应机制， 而且也使得人们 通过转基因创造抗性增强的转基因植物 (Wang et al.,2003 ； Qin et al.,2011 ； Lata and Prasad,2011)。大量研究表明， 通过过量表达功能基因和调控因子能够显著提高植物的抗 逆性。但是， 功能基因和转录因子在组成性表达的结果可能不同 (Agarwal et al.,2006)。 与功能基因相比， 转录。
9、因子在提高植物的抗性功能更强大。一个转录因子的超表达能够激 活一系列的靶基因， 它们可以会一起来共同应对逆境， 而不是一个转入的功能基因起作用。 因此， 转录因子遗传转化是植物抗性遗传改良的一种 重要途径和手段。 0004 植物基因组拥有大量的转录因子 ； 例如， 拟南芥中有多于 1500 个转录因子， 占它 的基因组将近 6 (Riechmann et al.,2000)， 其中 bHLH(basic helix-loop-helix， 碱性螺 旋 - 环 - 螺旋 ) 类转录因子是调控网络中重要的成员， 该家族蛋白具有 bHLH 域， HLH 区域 位于 bHLH 模体的 C 端， 由约 。
10、60 个氨基酸组成的两个功能明显不同 bHLH 模体组成。HLH 模 体参与同型二聚体或异质二聚体的形成是由于 - 螺旋的相互作用。碱性区域位于 bHLH 模体的 N 端， 含有大约 15 个碱性氨基酸， 它决定着 DNA 和蛋白互作的特异性 (Buck and Atchley,2003 ； Toledo-Ortiz et al.,2003 ； Li et al.,2006)。 bHLH转录因子在真核生物中 广泛分布， 如在拟南芥和水稻中分别有 147 和 167 个基因 (Li et al.,2006 ； Toledo-Ortiz et al.,2003)。在动物中， bHLH 家族成员的功。
11、能已经被广泛研究， 但在植物中的研究相对 较少。自第一个植物 bHLH 蛋白 (Lc) 在玉米中被报道 (Ludwig et al.,1989) 以来， 在一 说 明 书 CN 104031923 A 3 2/9 页 4 些植物中鉴定了部分 bHLH 转录因子。已经表明， 植物 bHLH 蛋白在不同的生物学过程起转 录调控作用， 包括皮毛或根毛发育 (Bernhardt et al.,2003 ； Tominaga-Wada et al.,2012 ； Karas et al.,2009)、 叶绿体发育 (Monte et al.,2004)， 类黄酮生物碱和花青素合成 (Nesi et al。
12、.,2000 ； Yamada et al.,2011)。 一些bHLH蛋白， 诸如PIF3(光敏色素相互作用因子3)、 PIF4 及 HFR1 参与光诱导的信号转导 (Ni et al.,1998 ； Huq and Quail,2002 ； Fairchild et al.,2000)。然而， 植物 bHLH 转录因子在环境胁迫应答方面却不多。其它与胁迫应答有关 的 bHLH 转录因子包括 AtbHLH38、 AtbHLH39、 FIT， 它们能被缺铁所诱导， AtbHLH38、 AtbHLH39 的过量表达能增强植物对铁或镉的吸收 (Yuan et al.,2008 ； Lignam e。
13、t al.,2011 ； Wu et al.,2012)， 表明它们在重金属毒害应答中起作用。此外， 水稻的一个 bHLH 基因也被发现参 与干旱胁迫应答 (Seo et al.,2011)。可见， 虽然鉴定 bHLH 基因比较容易， 但是预测不同物 种中 bHLH 基因的功能需要花费大量的创造性劳动。 0005 山梨是梨产业中应用较广泛的一种砧木， 极抗寒， 是研究木本植物抗寒性及克隆 有关抗寒基因的理想材料。因此， 克隆山梨抗寒有关基因是抗寒基因工程的关键和基础。 发明内容 0006 本发明目的是提供一种从极抗寒的山梨 (Pyrus ussuriensis) 中克隆出的一个 bHLH 类转。
14、录因子 PubHLH。 0007 本发明的另一目的是提供该基因的应用。 0008 本发明的目的通过以下技术方案实现 ： 0009 一种山梨bHLH类转录因子基因PubHLH， 其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO ： 1所示， 在 SEQ ID NO ： 1 所示序列的 409-2043bp 处为该基因的编码区 ； 其编码的氨基酸序列如序列 表 SEQ ID NO ： 2 所示， 它包含 1635bp 的开放阅读框， 编码 544 个氨基酸， 等电点为 5.8， 预测 的分子量为 58.9kD。 0010 克隆上述的基因 PubHLH 的 cDNA 序列的引物对， 其核苷酸序列如下所示 ： 。
15、0011 正向引物 ： 5 -TTGCTGCCATGCTGCCGAGGCTGAACGGTGGTG-3 (SEQ ID NO ： 3) ； 0012 反向引物 ： 5 -GGGGTACCCTACACCATGCCATGGAACCCG-3 (SEQ ID NO ： 4)。 0013 含有本发明所述基因 PubHLH 的重组表达载体， 优选以 pCAMBIA1302 为出发载体。 0014 含有本发明所述的山梨 bHLH 类转录因子基因 PubHLH 的宿主菌。 0015 本发明所述的山梨bHLH类转录因子基因PubHLH在植物抗寒性状改良或构建抗寒 转基因植物中的应用。 0016 本发明所述的山梨b。
16、HLH类转录因子基因PubHLH编码的蛋白在植物抗寒性状改良 或构建抗寒转基因植物中的应用。 0017 本发明所述的重组表达载体在植物抗寒性状改良或构建抗寒转基因植物中的应 用。 0018 有益效果 ： 本发明从山梨中克隆到一个新的 bHLH 基因 PubHLH， 利用农杆菌介导的 遗传转化方法将该基因转化烟草和梨， 获得的转基因植株抗寒能力明显提高， 经生物学功 能验证， 表明本发明克隆的 PubHLH 基因具有调控抗寒功能。本发明为植物抗非生物逆境分 子设计育种提供了新的基因资源， 为实施绿色农业、 节水农业提供新的遗传资源， 该遗传资 源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。 。
17、说 明 书 CN 104031923 A 4 3/9 页 5 附图说明 0019 图 1 是本发明的技术流程图。 0020 图 2 是本发明的 PubHLH 基因在低温胁迫切 (4处理 ) 下的表达。横坐标为相应 时间点取样， 纵坐标为采用实时定量 PCR 分析本发明基因的相对表达量。 0021 图 3 是本发明的 PubHLH 基因亚细胞定位。其中 ： 图 3A， GFP 基因 ( 对照 ) 在明场 ( 图左 )、 紫外线 (UV) 光 ( 右 ) 上的成像 ； 图 3B， PubHLH 基因在明场 ( 左 )、 UV 光 ( 右 ) 下 的成像。 0022 图 4 是本发明的 PubHLH。
18、 基因转录激活鉴定。图 4pDESTTM32 是空载体转化的酵母 在不同培养基上的生长情况 ； pDESTTM32-PubHLH 是融合载体转化的酵母在不同培养基上的 生长情况。 0023 图 5 是 PMV 质粒图谱 0024 图 6 为一种 PubHLH 基因转基因植株的 PCR 鉴定示意图。利用 PubHLH 基因特异引 物进行 PCR 鉴定烟草后 T0 代转基因植株。M ： Marker， P ： 质粒 pMV-PubHLH， WT ： 野生型植株， 4、 5、 9、 13 ： 转基因株系。 0025 图 7 为烟草转基因植株中外源基因 PubHLH 的表达量分析 ( 半定量 RT-P。
19、CR)。WT 为野生型， 其它作为转基因系。 0026 图 8 是本发明中实施例转 PubHLH 基因株系 (#4 和 #9) 及野生型 (WT) 非转基因植 株 (WT) 低温处理表型和成活率统计。其中 ： 图 8A 是 30 天大的烟草植株在室温生长和 0 处理 2 天的表型 ； 图 8B 是 30 天大的烟草植株在室温生长和 0处理 2 天的成活离统计。 具体实施方式 0027 以下结合具体实施对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施， 本领 域技术人员可以确定本发明的基本特征， 并且在不偏离本发明精神和范围的情况下， 可以 对本发明做出各种改变和修改， 以使其适用各种用途和条件。
20、。 0028 实施例 1PubHLH 基因克隆及表达分析 0029 4低温处理下从山梨叶片抽提 RNA 并反转录， 所得的第一链 cDNA 用于扩增 PubHLH 基因全长。扩增基因 PubHLH 引物对为 ： 正向引物 ： PubHLH Forward,5 -TTGCTGCCA TGCTGCCGAGGCTGAACGGTGGTG-3 (SEQ ID NO ： 3) ； 反向引物 ： PubHLH Reverse,5 -GGGGTACCC TACACCATGCCATGGAACCCG-3 (SEQ ID NO ： 4)。50l 的反应体系中包括 100ng cDNA,1 缓 冲液 (TransSt。
21、art FastPfu Buffer),10mM dNTP,1U Taq 聚合酶 (TransStart FastPfu DNA Polymerase)( 前述缓冲液和 Taq 聚合酶购自 TRANS 公司 )， 1.0M 上述引物。PCR 反应在 Roche480(Applied Biosystem) 扩增仪上按以下程序完成 ： 95 ,1 分钟， 95变性 20 秒， 58退火 20 秒， 72延伸 60 秒， 40 个循环 ； 循环完成后 72延伸 5 分钟。产生一条单一 PCR 条带产物， 经 1的琼脂糖凝胶电泳后， 用 E.Z.N.DNA 凝胶回收试剂盒 ( 购自 Omega 公司，。
22、 美国 ) 回收特异带， 提取步骤参照使用说明。回收纯化的 DNA 溶液与 pMD18-T 载体 ( 购自 TaKaRa 公司 ) 进行连接反应 , 按说明书操作 , 连接反应体系中插入 PubHLH 基因与 pMD18-T 载体的摩尔比为 3:1 连接反应总体积是 10l， 其中包括 5l 的 2 缓冲液 ( 购 自宝生物工程大连有限公司 )， 4.5l 纯化的 PCR 产物， 0.5l T 载体。16过夜连接。取 说 明 书 CN 104031923 A 5 4/9 页 6 10l 连接产物， 采用热击法 ( 参照 分子克隆实验手册 第三版， 科学出版社， 2002) 转化 大肠杆菌 DH。
23、5， 在含有 50mg/L 氨苄霉素的 LB 固体平板中筛选阳性克隆， 挑取 3 个克隆 测序 ( 由南京金斯瑞科技有限公司完成 )， 测序结果表明， 本发明克隆 PubHLH 基因全长为 1650bp， 通过测序、 比对确定是本发明需要的目的基因， 序列如 SEQ ID NO ： 1 所示， 将这个基 因命名为 PubHLH， 它包括 1635bp 的编码阅读框， 编码 544 个氨基酸， 等电点为 5.8， 预测的 分子量为 58.9kD。BLASTX 分析该序列与已知的 bHLH( 所有已发表的文献和数据库 ) 序列 同源。推导的 PubHLH 基因的氨基酸序列与报道的苹果 (MdbHL。
24、H,ABS50251) 的序列虽然同 源性达91,但是苹果MdbHLH这个基因的功能与抗寒没有关系， 其主要功能是控制苹果的 色素。多序列比对结果显示 PubHLH 有 C 末段保守结构域， bHLH-ZIP 结构域 , 和一个 SUMO 结构域。ExPASy 分析表明编码的氨基酸 PubHLH 有二个核定位信号 (NLS)。SMART 预测氨基 酸 PubHLH 有 1 转录激活区域。 0030 为 分 析 PubHLH 基 因 是 否 对 响 应 低 温 处 理， 采 用 实 时 定 量 PCR( 正 向 引 物 PubHLH-F2 ： 5 -CCCTTGAGTCCTTC-3 (SEQ I。
25、D NO ： 5) ； 反向引物 PubHLH-R2 ： 5 -CCCATCTCCCTCTT-3 (SEQ ID NO ： 6) 分析该基因在 4处理 0 48 小时下的表达。结 果表明 4低温 ( 见图 2) 处理能诱导该基因表达， 表明它是一个低温应答候选基因。 0031 实施例 2PubHLH 基因亚细胞定位、 转录激活分析 0032 由于PubHLH基因有1个核定位信号(NLS)， 本发明利用洋葱表皮来研究PubHLH基 因的亚细胞定位。利用 RT-PCR 扩增出 PubHLH 基因整个 ORF 阅读框， 并在其扩增引物两端 分别加上 NcoI 和 SpeI 两个酶切位点。其扩增引物为。
26、 ( 正向引物 PubHLH-F1 ： 5 -CCATGGAT GCTGCCGAGGCTGAACGGTGGTG-3 (SEQ ID NO ： 11) ； 反向引物 PubHLH-R1 ： 5 -GGACTAGTCACCATG CCATGGAACCCGAT CAA-3 (SEQ ID NO ： 12)， 首先将扩增产物进行酶切。同时用 NcoI 和 SpeI 双酶切 pCAMBIA1302， 回收产物并连接， 从而得到 pCAMBIA1302-PubHLH-GFP 重组载体， 并将 其转入农杆菌 EHA105。农杆菌侵染洋葱表皮按如下方法进行 ： (1) 划平板， 挑单克隆 ( 含有 重组质粒的。
27、农杆菌 ) 于 3 毫升 YEB 培养基 ( 含卡那霉素 40g/ml， 利福平 25mg/L)， 28震 荡培养 24 小时， 至 OD600约 0.6。(2) 用手术刀将洋葱内表皮划成 1cm2大小， 撕下置于 MS 基 本培养基 ( 含 3蔗糖， 0.75琼脂， 不含激素 ) 上暗培养 24 小时。(3) 按体积比为 1 ： 1000 比例， 接种 50l 农杆菌菌液于 50 毫升 YEB( 含卡那霉素 40g/ml， 利福平 25g/ml) 中， 28振荡培养 12-24 小时。(4)4000rpm， 4离心 10 分钟， 弃上清。(5) 加入 50 毫升 YEB 培 养基 ( 含有 。
28、10mM MgCl2)， 将洋葱表皮放入菌液中浸泡 30 分钟。(6) 吸干表面菌液， 置于 MS 基本培养基 ( 含 3蔗糖， 0.75琼脂， 不含激素 ) 上 28暗培养两天。用 Olympus BX71 型 显微镜观察报告基因定位情况， 结果表明， 对照载体转化时整个细胞中均有荧光 ( 图 3A)， 而重组载体转化的细胞中荧光只能在核中检测到(图3B)， 说明PubHLH是一个核定位蛋白。 0033 实施例 3 植物转化超表达载体构建 0034 根据 pMV 载体 ( 专利申请号 201210258254.4) 的多克隆位点和 PubHLH 基因的编 码区序列上的酶切位点分析， 选择 X。
29、hol 和 KpnI 作为内切酶。首先将以 PubHLH 基因的克隆 子为模板进行 PCR 扩增 ( 扩增引物对正向引物 ： PubHLH Forward,5 -TTGCTGCCATGCTGCCGAG GCTGAACGGTGGTG-3 (SEQ ID NO ： 3) ； 反向引物 ： PubHLH Reverse,5 -GGGGTACCCTACACCATGCC ATGGAACCCG-3 (SEQ ID NO ： 4)， 接后将 PCR 产物连同 pMV 载体一起在在 37下进行酶切， 酶 切 3-4h 后纯化回收。连接反应体系中 PubHLH 基因与载体 pMV 比率为 3 ： 1， 反应总体。
30、积 为 说 明 书 CN 104031923 A 6 5/9 页 7 10l， 10T4 连接缓冲液 1l， T4 连接酶 1l， 16连接 13-16 小时。连接产物转化大肠 杆菌菌株DH5， 在含有100mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选， 挑单克隆PCR检测呈阳性 后抽提质粒进行酶切， 测序确定序列无误后， 即 pMV-PubHLH 重组载体构建成功。应用冻融 法将重组载体导入到根癌农杆菌 GV3103 中并保菌。 0035 实施例 4 烟草遗传转化 0036 根癌农杆菌介导的烟草遗传转化步骤如下 ： 0037 1. 根癌农杆菌培养 ： 取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液， 在添加了卡。
31、那霉素 50mg/L 的 LB 平板上划线， 刮取划线菌斑， 加入液体 MS 基本培养基中， 28 180 转 / 分钟振 荡培养， 待菌液浓度达到 OD600 0.5 时作浸染。 0038 2. 浸染 ： 取未转基因的烟草叶片， 切成 0.5cm0.5cm 大小， 然后放入制备好的根 癌农杆菌菌液中， 浸泡 5 分钟 , 期间不断振荡。 0039 3. 共培养 ： 取浸染后的烟草叶片， 无菌滤纸吸干上面的的菌液， 然后接种于共培 养培养基上暗培养 3 天。 0040 4. 筛选培养 ： 经共培养 3 天后的烟草叶片， 用无菌水冲洗 3 5 次， 再转移入添加 了 100mg/L 卡那霉素和 。
32、400mg/L 头孢霉素的筛选培养基中。 0041 5. 生根培养 ： 待筛选培养基上的不定芽长到 1cm 左右时， 切下并转入添加了 100mg/L Km 和 500mg/L Cef 的生根培养基上。 0042 6. 烟草苗转入土培 ： 待生根后的转化苗长满培养瓶， 由生根培养基中取出， 用自 来水洗净转化苗上的培养基， 并栽植于灭菌的营养土中。 0043 实施例 5 梨遗传转化 0044 根癌农杆菌介导的梨遗传转化步骤如下 ： 0045 1. 根癌农杆菌培养 ： 取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液， 在添加了卡那霉素 50mg/L 的 LB 平板上划线， 刮取划线菌斑， 加入液体 MS 基。
33、本培养基中， 28 180 转 / 分钟振 荡培养， 待菌液浓度达到 OD600 0.8 时作浸染。 0046 2. 浸染 ： 选取试管苗健康幼嫩的叶片， 用无菌刀片垂直于叶片中脉横切 2 4 个 伤口， 然后放入制备好的根癌农杆菌菌液中， 浸泡 5 10 分钟 , 期间不断振荡。 0047 3. 共培养 ： 取浸染后的梨叶片， 无菌滤纸吸干上面的的菌液， 然后接种于共培 养 培养基上暗培养 3 天， 叶片背面朝下接种于不定芽诱导培养基上， 暗培养温度 252 ； 所 述的共培养培养基为 ： NN69+TDZ1.0 3.0mg/L+IBA0.2 0.5mg/L+ 蔗糖 30 50g/L+ 琼 。
34、脂 5.0 6.5g/L,PH 值为 5.8 ； 0048 4. 筛选培养 ： 经共培养 3 天后的梨叶片， 用无菌水冲洗 3 5 次， 再转移入添 加了 100mg/L 卡那霉素和 400mg/L 头孢霉素的筛选培养基中。所用的筛选培养基为 ： NN69+TDZ1.03.0mg/L+IBA0.20.5mg/L+蔗糖3050g/L+琼脂5.06.5g/L+100mg/ L 卡那霉素 +400mg/L 头孢霉素 ,PH 值为 5.8 ； 0049 5. 生根培养 ： 待筛选培养基上的不定芽长到 1cm 左右时， 切下并转入添加了 100mg/L Km和500mg/L Cef的生根培养基上。 所述。
35、的生根培养基为 ： 1/2MS+IBA0.6mg/L+蔗 糖 60g/L+ 琼脂 6g/L， 培养基 pH 值为 5.8。 0050 实施例 6 转基因植株的分子鉴定 0051 1、 叶片 DNA 提取 说 明 书 CN 104031923 A 7 6/9 页 8 0052 取适量的叶片放入 1.5mL 离心管中， 加液氮， 充分研磨后 ； 加入 700l65预热的 DNA 提取缓冲液十六烷基三乙基溴化铵 ( 简称 CTAB， 配方 ： 100mM Tris-HCl(pH8.0)， 1.5M NaCl， 50mM EDTA(pH8.0) 溶液加 1聚乙烯吡咯烷酮， 2 ( 体积 )CTAB， 。
36、65水浴充分溶解 备用， 用前在65水浴预热后， 加入1-4(体积)巯基乙醇， 混匀)， 65温浴60-90分钟, 隔 15 分钟取出上下轻轻颠倒混匀 ； 10000g， 离心 10 分钟 ； 取上清， 加 600l 氯仿， 颠倒混 匀静置 3 分钟 ； 10000g， 离心 15 分钟 ； 取上清 450l， 加入 900l 预冷无水乙醇， 420l5M NaCl， 混匀后， 冰冻 30 分钟， 10000g， 离心 10 分钟 ； 弃上清后， 用 l ml75的乙醇， 洗涤 3 次 后， 加适量双蒸水溶解。 0053 2、 半定量 RT-PCR 检测 PubHLH 基因的超表达 0054 。
37、本研究采用半定量 RT-PCR 分析转基因梨及烟草植株中外源基因 PubHLH 的表 达量， 转基因株系叶片 RNA 提取使用 Trizol 试剂盒， 其步骤如下 ： 1、 研钵预冷。研钵用 0.5MNaOH 浸泡 10min， 再用灭菌 DEPC 洗 3-4 次， 加液氮预冷 ( 铝箔放冰上预冷冷藏叶片 ) ； 2、 称重 0.1g 叶片于 1.5ml 离心管， 液氮研磨后， 加 1ml Trizol 混匀 ( 裂解 cell 并保护 RNA)。3、 4 10000-12000g， 离心 15min， 取上清， 加 200L 氯仿， 用力摇 15s 孵育 2min， 4 10000-1200。
38、0g， 离心 15min。4、 取上清， 加 500L 异丙醇， 孵育 10min。4 12000g， 离心 10min。配 75的酒精。5、 弃上清， 加 1ml75的酒精 ( 用灭菌 DEPC 水配 ) 轻摇。 4 7200g， 5min 离心。6、 弃上清， 风干， 沉淀用 30-50L DEPC 水溶解， -80保存。7、 取 1-2L 检测 RNA 的浓度和质量。将 RNA 反转录成 cDNA 其方法同第二章， 半定量所用 引物为 PubHLH 基因特异引物 ( 正向引物 PubHLH-F2 ： 5 -CCCTTGAGTCCTTC-3 (SEQ ID NO ： 5) ； 反向引物 P。
39、ubHLH-R2 ： 5 -CCCATCTCCCTCTT-3 (SEQ ID NO ： 6)， 反应程序为 94 时 3 分钟， 94变性 30 秒， 60退火 45 秒， 72延伸 45 秒， 30 个循环 ； 循环完成后 72 延伸 10 分钟。转基因烟草外源基因表达量采用半定量 PCR 分析， 转基因烟草分析用 Tubulin 做内参， 引物序列为 ： 正向引物 Tubulin-F ： 5-TCCAGGACAAGGAGGGTAT-3(SEQ ID NO ： 7) ； 反向引物 Tubulin-R ： 5-CATCAACAACAGGCAACCTAG-3(SEQ ID NO ： 8)。梨 A。
40、ctin 正向引物 Actin-F1 ： 5-CAATGTGCCTGCCATGTATG-3(SEQ ID NO ： 9) ； 反向引物 Actin-R1 ： 5-CCAGCAGCTTCCATTCCAAT-3(SEQ ID NO ： 10)。结果表明， 在转基因株系中的 PubHLH 基因 表达均比野生型高， 分别选取烟草 (#4 和 #9) 两个超表达系用于抗性研究。梨中有 5 个系 的表达水平比野生型明显增强， 其中两个系用于抗寒性评价。 0055 实施例 7 转基因植株的抗性评价 0056 同批收的烟草未转化植株 (WT) 和转 PubHLH 超表达纯系 (#4、 #9) 将 WT、 #4。
41、 和 #9 在 MS 生长培养基上生长 30 后移栽到盆中生长 7 天后， 正常生长的植株没有差别， 但在 0 处理 2 天后， WT 植株均出现萎蔫， 而 #4 和 #9 植株生长仍然正常， 表明转基因植株的抗寒能 力明显比野生型强 ( 图 8A)， 统计成活率， 结果表明， 两个转基因系的成活率明显高于野生 型 ( 图 8B)， 上述研究表明转 PubHLH 基因的烟草植株抗寒能力比未转化植株 (WT) 明显增 强。 0057 为了评估 PubHLH 转基因梨超表达对低温的抗性， 正常生长情况下， 对照及超表达 系形态没有明显的差异， 在 0处理 48 小时后， 发现野生型比转基因系萎蔫更。
42、严重且呈水 渍状 ； 25恢复生长 5 天， 转基因的两个系恢复快而对照不能恢复正常生长变成枯黄， 且顶 芽已经死亡。上述研究结果表明， 转基因系的抗寒能力比野生型强。 说 明 书 CN 104031923 A 8 7/9 页 9 0058 主要参考文献如下 ： 0059 1.Agarwal PK,Agarwal P,Reddy MK,Sopory SK(2006)Role of DREB transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance in plants.Plant Cell Rep25:1263-1274 0060 。
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