包含转运信号之基因的核酸构建体 本申请涉及核酸构建体，该构建体可用于(特别是)疾病的预防或治疗的基因操作(以下称作“基因治疗”)中。
在基因治疗中，把基因导入有机体，并在有机体中按意图表达它们。这些基因表达的调节对基因治疗的预防或治疗效果具有重要意义。
专利申请PCT/GB95/02000，PCT/EP 95/03370，PCT/EP 95/03371，PCT/EP 95/03368，PCT/EP 95/03339描述了基因表达调节物。这些调节物包括激活子序列，其功能为，例如，基础转录的细胞特异性或病毒特异性激活。激活子序列的DNA序列通过其3′端连接到启动子组件的5′端，反过来，结构基因通过其5′端连接到启动子组件的3′端。
启动子组件包括与CDF和CHF或E2F和CHF族的转录因子结合的核酸序列。在细胞周期的G0和G1期，这种结合导致上游激活子序列的抑制因而导致了位于下游的结构基因(即在转录方向)的转录抑制。
在细胞分裂的G0和G1期，包含在细胞中的DNA是二倍体状态。细胞停止在G0期，在细胞周期的G1期受到抑制。G1期之后为S期，在此期发生DNA合成和基因组复制。G2期之后为细胞分裂(有丝分裂＝M期)。子细胞进入G0或G1状态。
因而，把细胞特异性或病毒特异性激活子序列与在G0和G1期抑制激活子序列的启动子组件结合，使以细胞特异性或病毒特异性和细胞周期方式调节结构基因的表达成为可能(即抑制到S和G2期)。
激活子序列和启动子组件的结合物定义为嵌合启动子。有许多在基因治疗中应用嵌合启动子的可能性，同时这些启动子的缺点也产生许多限制。
这些限制的例子为：
-对结构基因转录影响太小的弱激活子序列。
-通过选定的启动子组件不能以细胞周期依赖性方式完全抑制地激活子序列的使用。
-对结构基因转录的两种(如细胞或病毒特异性和细胞周期特异性的)调节物的限制。
-转录产物在细胞核中的不适当的保留。
-导入细胞中的结构基因转录产物的不适当的胞内转运。
制作可供使用的核酸构建体是本发明的一个目的，这种核酸构建体使以准确方式调节外源基因(转基因)在宿主细胞中的表达成为可能。因而，本发明涉及具有核保留信号(nuclear retention signal)的核酸构建体，其中核保留信号连接到转基因阅读(reading)方向下游。
优选地，所述核酸构建体在从5′端到3′端的阅读方向上至少包括下列组分：
a)一种第一非特异性、细胞特异性、病毒特异性、代谢和/或细胞周期特异性激活的启动子序列或增强子序列(I)，这种启动子序列或增强子序列激活转基因的基础转录，
b)一种作为结构基因活性化合物的转基因，
c)一种核保留信号，这种核保留信号的cDNA以其5′端直接或间接地连接到结构基因(b)的3′端。
优选地，核保留信号的转录产物具有结合核输出因子(nuclear exportfactor)的结构。
新的核酸构建体除组分a)到c)之外还具有下列组分：
d)一种附加激活核输出因子的基础转录的启动子序列或增强子序列(II)，
e)一种核酸，这种核酸与核保留信号(c)的转录产物结合从而调节转基因的转录产物向细胞核外转运的核输出因子。
第一(I)启动子序列或增强子序列(a)与第二(II)启动子序列或增强子序列(d)可以是相同的或不同的，至少组分a)或d)之一可以是非特异性、细胞特异性、病毒特异性、代谢(尤其是氧不足)或细胞周期特异性(cell-cycle-specifically)激活的。
在本发明的范围内，至少启动子序列或增强子序列(a)和(d)之一可以是嵌合启动子，其中启动子组件CDE-CHR或E2FBS-CHR和邻近的上游细胞特异性、病毒特异性或代谢激活的激活子序列相互作用，从而能影响(特别是抑制)下游基因的表达。
组分a)和d)可以是激活子反应性(activator-responsive)启动子单元。这类构建体还具有下列组分：
f)至少一种非特异性、病毒特异性、代谢或细胞特异性和/或细胞周期特异性激活的启动子序列或增强子序列，
g)至少一种激活子亚单位，这种激活子亚单位定位在启动子序列或增强子序列的下游，并且在其基础转录中被启动子序列或增强子序列(f)激活，
h)被一种或多种启动子亚单位(g)的表达产物激活的激活子反应性启动子。
在本发明的一个实施方案中，核酸构建体是其中启动子序列或增强子序列(a)和/或(d)和/或激活子反应性启动子是嵌合启动子的核酸构建体，激活子亚单位(g)是至少一种转录因子的基因，这种转录因子激活激活子反应性启动子的嵌合启动子(h)。
和SV40启动子结合的LexA操纵子是被两个激活子亚单位(g，g′)激活的激活子反应性启动子的例子。激活子亚单位(g)包含LexA DNA结合蛋白质和氨基酸1-81或1-202的cDNA，这种cDNA的3′端与Gal80蛋白质(氨基酸1-435)的cDNA的5′端连接。第二个激活子亚单位(g′)包含Gal4蛋白质的Gal80结合结构域的氨基酸851-881的cDNA。这种cDNA的3′端与氨基酸126-132的SV40大T抗原的cDNA的5′端连接，SV大T抗原的cDNA3′端再连接到HSV-1 VP16的氨基酸406-488的反式激活域的cDNA的5′端。
和SV40启动子结合的Gal4蛋白质的结合序列是由两个激活子亚单位(g，g′)激活的激活子反应性启动子的另一个例子。
激活单元(g)包含Gal4蛋白质的DNA结合结构域(氨基酸1-147)的cDNA，这种cDNA的3′端连接到Gal80蛋白质(氨基酸1-435)的cDNA的5′端。
第二个激活亚单位(g′)包含Gal4的Gal80结合结构域(氨基酸851-881)的cDNA，这种cDNA的3′端与SV40的核定位信号(SV40大T，氨基酸126-132)的cDNA的5′端连接，后者的3′端再与HSV-1 VP16反式激活域氨基酸406-488的cDNA的5′端连接。
两种激活激活子反应性启动子(其由Gal4蛋白质结合序列和SV40启动子组成)的激活子亚单位(g，g′)的另一个例子阐述如下：
-激活单元(g)包含CD4 T细胞抗原的细胞质结构域(氨基酸397-435)的cDNA，这种cDNA的5′端与HSV-1 VP16反式激活域(氨基酸406-488)的cDNA的3′端连接，HSV-1 VP16的5′端再与SV40的核定位信号(SV40大T，氨基酸126至132)的cDNA的3′端连接，
-激活单元(g′)包含SV40核定位信号(SV40大T，氨基酸126至132)的cDNA和Gal4蛋白质的DNA结合结构域(氨基酸1-147)的cDNA，这种cDNA的3′端与p56 Ick蛋白质的CD4结合序列(氨基酸1-71)的cDNA的5′端连接。
优选地，核保留信号的基因选自HIV-1或HIV-2的REV效应元件(RRE)、逆转录病毒的RRE相当的保留信号或HBV的RRE相当的保留信号。
核输出因子(e)优选地是选自病毒HIV-1、HIV-2、maedi-visna virus、公山羊关节炎脑炎病毒、马传染性贫血病毒、猫免疫缺陷病毒的rev基因和逆转录病毒的rev基因、HTLV的rev基因或hnRNP-A1蛋白质的基因或转录因子TFIII-A的基因。通常核酸是DNA。新核酸构建体通常用作载体，尤其是质粒载体或病毒载体。
通常转基因是药理上活性的活性化合物的结构基因，这种化合物选自细胞因子、生长因子、抗体或抗体片段、两配体之间(如抗体或抗体片段和细胞因子或生长因子、细胞因子或生长因子受体)的融合蛋白质、有抗增殖或抑制细胞效应的蛋白质、血管形成抑制因子、凝结因子、血栓形成诱导物和凝结抑制因子、有血纤蛋白溶解效应的物质、补体激活蛋白、病毒外壳蛋白、细菌抗原和寄生物抗原、对血液循环有影响的蛋白质、核酶。
优选地，转基因是编码灭活mRNA的核酶的结构基因，这种mRNA编码选自细胞周期控制蛋白质(尤其是细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E、E2F1-5、cdc2、cdc25C)或DP1、病毒蛋白质、细胞因子、生长因子或他们的受体的蛋白质。
在一个特定的实施方案中，转基因可以是编码触发控制性细胞死亡(即编程性细胞死亡)的蛋白质(尤其是神经磷脂酶)的结构基因。
在另一个实施方案中，转基因(b)可以是编码裂解药物前体从而形成药物的酶的结构基因。在另一个实施方案中，结构基因可以编码配体-酶融合蛋白质，这种蛋白质含有裂解药物前体从而形成药物的酶以及结合到细胞表面的配体，优选地是结合到内皮细胞或肿瘤细胞的配体。
启动子序列、增强子序列或激活子序列可以选自基因调节的核苷酸序列或HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV或HIV病毒的启动子序列，其中基因调节的核苷酸序列在内皮细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、肿瘤细胞、肝细胞、白血病细胞和神经胶质细胞中激活。
本发明也涉及包含新核酸构建体的分离的细胞或细胞系。
这类细胞可以制备治疗疾病的药物，药物制备方法包括核酸构建体导入靶细胞。这类疾病常伴随着过量的细胞增殖。
为制备药物，首先必须把核酸构建体导入靶细胞。
新核酸构建体使利用任何启动子、增强子或激活子序列，尤其是使增加导入细胞的结构基因之转录产物在细胞核中的保留时间或增加导入细胞的结构基因之转录产物在胞内转运成为可能。
用于增加细胞核中转录产物的保留时间的新核酸构建体包含下列组分：
a)一种激活结构基因基础转录的启动子序列或增强子序列I，
b)一种转基因(结构基因)，优选地是以编码合乎需要的活性化合物的cDNA形式的转基因，
c)一种核保留信号(NRS)，其cDNA优选地是5′端直接与结构基因的3′端连接。
在图1中，通过例子描述了单个组分的排列。
增加胞内转录产物转运的新核酸构建体除了启动子序列或增强子序列I(激活结构基因的基础转录)之外还有转基因(编码所需的活性化合物)、核保留信号(NRS，其cDNA在5′端与结构基因的3′端连接，其信使RNA是结合核输出因子(NEF)的结构)。
除这之外，这类的核酸构建体还含有启动子序列或增强子序列(II)，这种序列激活核输出因子(NEF)cDNA的基础转录，其表达产物结合到核保留信号(NRS)从而调节结构基因的转录产物转运出细胞核。
在图2中，通过例子描述了单个组分的排列。
在新核酸构建体中，组分a)或d)的启动子序列或增强子序列可以是相同的或不同的，而且，组分d)和e)可以定位在组分a)、b)和c)的上游或下游。
至少一种强启动子序列或增强子序列(例如来自CMV(EP-A-0173177)或SV40的或任何其它为技术人员所知的启动子序列或增强子序列)优选地用作启动子序列或增强子序列。
在一个优选的实施方案中，新的核酸构建体中至少一种启动子序列或增强子序列是细胞特异性、代谢(如氧不足)、病毒特异性或细胞周期特异性激活的。
特别优选的序列如下：
-启动子序列或增强子序列，这些序列可以以细胞特异性方式激活在内皮细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、造血细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、神经胶质细胞或肿瘤细胞中的转录，和/或
-HBV、HCV、HSV、HPV、CMV、EBV、HTLV或HIV病毒的启动子序列或增强子序列，和/或
-代谢激活的启动子序列或增强子序列，如氧不足诱导的增强子(Semenza等，美国科学院学报，88，5680(1991))或启动子(McBurney等，核酸研究，19，5755(1991)；WO95/21927)，和/或
-细胞周期特异性激活的启动子，如cdc25C基因、细胞周期蛋白A基因、cdc2基因(Lucibello等，EMBO杂志，14，132(1995)，Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995)，Zwicker等，核酸研究，23，2833(1995))、B-myb基因(Lam等，EMBO杂志，12，2705(1993))、DHFR基因(Means等，分子细胞生物学，12，1054(1992))和E2F-1基因(Johnson等，Genes Dev.8，1514(1994)，Hsiao等，Genes Dev.8，15256(1994))的启动子。
在另一个优选的实施方案中，新核酸构建体中至少一种启动子序列或增强子序列是嵌合启动子。在本发明内，嵌合启动子构成上游的、细胞特异性或代谢或病毒特异性激活的激活子序列和下游的启动子组件的结合物。启动子组件通过核苷酸序列确定其特征，这种核苷酸序列与CDF和CHF或E2F和CHF族的转录因子结合从而可抑制在细胞周期的G0期和G1期上游的激活子序列的激活(Lucibello等，EMBO杂志，14，l32(1994)，PCT/GB95/02000)。
在另一个优选的实施方案中，新核酸构建体中至少一种启动子序列或增强子序列(组分a)或d))是激活子反应性启动子单元。
激活子反应性启动子单元的部分由下列组分组成：
f)一种或多种相同的或不同的启动子序列或增强子序列，例如，这些序列是细胞周期特异性、代谢、细胞特异性或病毒特异性激活的或细胞周期特异性和代谢、细胞特异性或病毒特异性激活的(所谓的嵌合启动子)，
g)一种或多种相同的或不同的的激活子亚单位，在各种情况下，它(们)定位在启动子序列或增强子序列的下游，并且在其基础转录中被这些序列激活，
h)激活子反应性启动子，它被一种或多种激活子亚单位的表达产物激活。
优选的激活子反应性启动子单元的单个组分的排列通过图3描述。
优选的激活子反应性启动子单元插入到新核酸构建体中的序列通过，例如，图4描述。
以其最简单的形式，激活子反应性启动子单元可以，例如，阐明在图5的图形中显示的嵌合启动子构建体。
在另一个实施方案中，新的激活子反应性启动子单元可以构成与嵌合转录因子结合的序列，这种序列由DNA结合结构域、蛋白质蛋白质相互作用结构域和反式激活域组成。
优选的药理上活性的活性化合物的结构基因是核酶的基因，核酶具有结合的反义RNA、蛋白质和糖蛋白，它们选自细胞因子、生长因子、细胞因子或生长因子的受体、由配体(例如抗体或抗体片段)和细胞因子或生长因子组成的融合蛋白质、具有抗增殖或抑制细胞效应的蛋白质、血管形成抑制因子、血栓形成诱导蛋白质、血液凝固抑制因子，补体激活蛋白、病毒外壳物质和细菌外壳物质。
特别优选的是这样的核酶，这种核酶特异性地裂解蛋白质(尤其是参与细胞周期控制的蛋白质)的基因的mRNA。
这些蛋白质尤其包括细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白B、cdc2、E2F1-5、DP1和cdc25C(La Thangue，CurrentOpin.cell Biol.6，443(1994)；Müller，遗传学趋势(Trends Genet.)11，173(1995)；Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995))。
在一个优选的实施方案中，核保留信号(NRS)是这样一种核苷酸序列，这种序列阻碍连接到它上面的信使RNA前体通过核膜转运，另一方面，它是一种结合输出蛋白质的结构。这种输出蛋白质调节包含运出细胞核进入细胞质的NRS的信使RNA前体或信使RNA的转运，因而，含有NRS的信使RNA的前体或信使RNA作为结合到输出蛋白质的结果从细胞核中分泌(Fischer等，细胞，82，475)。
NRS优选地是逆转录病毒的REV效应元件(RRE)的序列。在HIV-1中，这种RRE是在env基因中包含243个核苷酸(核苷酸7362-7595；Muesing等，自然，313，450(1985))的序列(Malim等，自然，338，254；Kiems等，美国科学院学报，88，683(1991))。然而，在本发明内，核保留信号(NRS)也可以是同源的和/或功能相似的(类似的)核苷酸序列，如HBV病毒的RRE-相当物(Huang等，分子细胞生物学，13，7476(1993))。
在新的核酸构建体中，核输出因子(NEF)是蛋白质的核苷酸序列，这种蛋白质结合到NRS的mRNA上，调节包含NRS的信使RNA前体或信使RNA转运出细胞核进入细胞质中(或转运出细胞质进入细胞核)。在本发明内，尤其使用的是逆转录病毒，特别是HIV-1或HIV-2病毒的rev基因(Daly等，自然，342，816；Emerman等，细胞57，1155；Felber等，美国科学院学报86，1495(1989)；Fischer等，EMBO杂志，13，4105(1994))。
逆转录病毒rev基因的rev蛋白质通过它的N-端结构域(Zapp等，自然，342，714；Malim等，细胞，65，241)结合到mRNA前体的RRE上(Iwai等，核酸研究，20，6465(1992))。在RRE和rev蛋白质之间的键能使“没有剪接的”信使RNA前体和任何其它包含RRE的RNA从细胞核转运至细胞质中(Fischer等，EMBO杂志，13，4105(1994)；Fischer等，细胞，82，475)，因而相当大地加强了翻译。
在本发明内，和HIV-1的rev蛋白质同源的或功能相似的蛋白质的核苷酸序列(Bogerd等，细胞，82，485)，如visna-maedi virus的rev基因(VMV；Tiley等，病毒学杂志，65，3877(1991))或caprine arthritis encephalitis virus的rev基因(CAEV；Tiley等，病毒学杂志，65，3877(1991))，也可以用作NEF。
在本发明内，也可以使用与rev蛋白质无同源性或同源性很低但却和HIV-1的rev蛋白质功能相似的蛋白质的基因。
这些基因包括，例如，HTLV-1的rex基因(Cullen，微生物学综述，56，375(1992))和马传染性的贫血病毒(EIAV)的rev基因以及猫免疫缺乏病毒(FIV)的rev基因(Manusco等，病毒学杂志，68，1988(1994))。
在另一个实施方案中，NEF也可以是蛋白质的核苷酸序列，即使没有把RNA保留在核中，这种蛋白质通过NRS可使RNA从核中分泌。这些蛋白质包括，例如，转录因子TFIIIA(Gaddat等，细胞，60，619(1990))或异源的核内核糖核蛋白质A1(hnRNPA1蛋白质；Pinol-Roma等，自然，355，730)。
此外，核转运蛋白质广义地包括热击蛋白质(hsc70；Mandell等，细胞生物学杂志，111，1775(1990))和蛋白质激酶抑制剂CPKI(Fantoui等，生物化学杂志，269，2676(1994)，Wen等，生物化学杂志，269，32214(1994))。
通常NEF和它的同源的和类似的蛋白质具有的特征是有把单体蛋白质结合到NRS的RNA的多氨基端定位结构域(病毒学杂志，64，881(1990)；Kjems等，EMBO杂志，11，1119(1992))以及需要NEF转运功能的富含亮氨酸的结构域(hnRNPA1是一个例外)(Wen等，细胞，82，463；Fischer等，细胞，82，475；Malim等，病毒学杂志，65，4248(1991)；Venkatesh等，病毒学杂志，178，327(1990))。
核酸构建体优选地由DNA组成。术语核酸构建体可理解为可以在靶细胞中转录的人工核酸结构。这些构建体优选地是插入载体中，尤其优选地是质粒载体或病毒载体。
使用新的核酸构建体，转基因(组分b)可以与结构基因细胞特异性地或病毒特异性地或在特定的代谢条件下和细胞周期特异性地表达。结构基因优选地是药理上活性的活性化合物或裂解药物前体从而形成活性药物的酶的基因。选择结构基因以使这种酶与配体一起作为融合蛋白质表达，这种配体结合到细胞表面，如增生的内皮细胞或肿瘤细胞。
本发明也涉及包含新核酸构建体的酵母或哺乳动物的细胞。在一个特别优选的实施方案中，把核酸构建体导入细胞系，然后细胞系在转染后可以用于表达转基因。因而，使用这些细胞可以制备用于患者并可在患者中使用的药物来治疗疾病。新核酸构建体优选的用途包括用药物制剂治疗疾病，这种药物制剂包含核酸构建插入靶细胞的序列及其病毒特异性或靶细胞特异性和细胞周期特异性的表达产物。这种疾病通常是伴随着过量细胞增殖的疾病，药物制备方法包括将核酸构建体插入靶细胞及其在细胞增殖阶段的病毒特异性或靶细胞特异性和细胞周期特异性表达。
新核酸构建体不以天然形式存在，即转基因或活性化合物或酶或配体-酶融合蛋白质的结构基因不是天然地与核保留信号(NRS)结合，它们不是天然地连接到启动子I上，反过来，这种结合物不是天然地与包含启动子II和核输出因子(NEF)的核苷酸序列结合。
新核酸构建体的启动子I和II以及活性化合物(或酶)的结构基因依照预期的应用选择。
以下提出一些优选的应用的可能性：
1.1强的、非特异性启动子或扩增子与表达结构基因的嵌合启动子的结合。
这类结合的例子在图6中描述。
1.2表达结构基因的两种不同或相同嵌合启动子的结合。
这类结合的例子在图7中描述。
1.3表达结构基因的两种不同或相同的启动子或增强子的结合。
这类结合例子在图8中描述。
1.4激活子反应性启动子。
这类结合的例子在图9中描述。
1.5结构基因的多重控制表达的不同的启动子的多重结合。
这类结合例子在图10中描述。
依照核酸构建体计划的使用，可以选择下列的实施方案：
2.通过抑制增殖的内皮细胞治疗肿瘤和慢性炎症。
2.1.a)选择在内皮细胞中激活的启动子或激活子序列。
在本发明内，优选的由启动子或增强子组成的启动子或激活子序列包括基因调节序列或可检测的蛋白质的基因单元，尤其是在内皮细胞中(或者增殖内皮细胞最邻近区域的细胞中)。
Borrow等(Pharmac.Ther.64，155(1994))和Plate等(Brain Pathol.4，207(1994))叙述了一些这样的蛋白质。这些内皮细胞特异性蛋白质的例子尤其是：
-脑特异性，内皮葡萄糖-1-转运蛋白
Murakami等描述的启动子序列。(生物化学杂志，267，9300(1992))。
-endoglin
Bellon等(欧洲免疫学杂志，23，2340(1993))和Ge等(基因，138，201(1994))描述的启动子序列。
-血管内皮细胞生长因子受体
两种受体是不同的。(Plate等，国际癌症杂志，59，520(1994))：
·VEGF受体1(flt-1)(de Vries等，科学，255，989(1992))，
·VEGF受体2(flk-2，KDR)(Terman等，BBRC，187，1579(1992))。
两种受体几乎专一地在内皮细胞中找到(Senger等，Cancer Metast.Rev.12，303(1993))。
-其它的内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶
·til-l或til-2(Partanen等，分子细胞生物学，12，1698(1992)，Schnijrch和Risau，发展(Devlopment)，119，957(1993)，Dumont等，癌基因，7，1471(1992))
·B61受体(Eck受体)(Bartley等，自然，368，558(1994)，Pandey等，科学，268，567(1995)，van der Geer等，细胞生物学年评，10，251(1994))
-B61
B61分子是B61受体的配体。(Holzman等，J.Am.Soc.Nephrol.4，466(1993)，Bartley等，自然368，558(1994))
-内皮肽，尤其是
内皮肽B
由Benatti等(J.Clin.Invest.91，1149(1993))描述的启动子序列。
·内皮肽1
Wilson等(分子细胞生物学，10，4654(1990))描述启动子序列。
-内皮肽受体，尤其内皮肽B受体
(Webb等，分子药理学，47，730(1995)，Haendler等，J.Cardiovasc.Pharm.20，1(1992))。
-6-磷酸甘露糖受体
Ludwig等(基因，142，311(1994)，Oshima等，生物化学杂志，263，2553(1988))和Pohlmann等(美国科学院学报，84，5575(1987))描述的启动子序列。
-von Willebrand因子
Jahroudi和Lynch(分子细胞生物学，14，999(1994))，Ferreira等(生物化学杂志，293，641(1993))和Aird等(美国科学院学报，92，4567(1995))描述的启动子序列。
-IL-1α和IL-1β
由von Hangen等(Mol.Carcinog.2，68(1986))、Turner等(免疫学杂志，143，3556(1989))、Fenton等(免疫学杂志，138，3972(1987))、Bensi等(细胞生长分化，1491(1990))、Hiscott等(分子细胞生物学，13，6231(1993))和Mori等(血液，84，1688(1994))描述的启动子序列。
-IL-1受体
由Ye等(美国科学院学报，90，2295(1993))描述的启动子序列。
-血管细胞粘着分子
由Neish等(分子细胞生物学，15，2558(1995))、Ahmad等(生物化学杂志，270，8976(1995))、Neish等(J.Exp.Med.176，1583(1992))、lademarco等(生物化学杂志，267，16323(1992))和Cybulsky等(美国科学院学报，88，7859(1991))描述的启动子序列。
-合成的激活子序列
作为天然的内皮细胞特异性启动子的替代物，可以使用包含寡聚化的转录因子的结位点合成的激活子序列，这种转录因子在内皮细胞中是优先地或选择性激活的。这种序列的一个例子是转录因子GATA-2，它在内皮肽-1基因中的结合位点是5′-TTATCT-3′(Lee等，生物化学，266，16188(1991)，Dorfmann等，生物化学杂志，267，1279(1992)和Wilson等，分子细胞生物学，10，4854(1990))。
2.1.b)在激活的内皮细胞附近的细胞中激活的启动子或激活子序列的选择
在增殖内皮细胞中，对于从血液中衍生的大分子，通过开放紧密连接(opened tight junction)，相邻的细胞是可接近的。因为功能和结构上的相互关系，与激活的内皮细胞邻近的细胞是本发明内的靶细胞。
-VEGF
VEGF基因的基因调节序列是
·VEGF基因的启动子序列(5′侧翼区)(Michenko等，细胞分子生物学研究，40，35(1994)，Tischer等，生物化学杂志，266，11947(1991))或
·VEGF基因的增强子序列(3′侧翼区)(Michenko等，细胞分子生物学研究，40，35(1994))或
·c-Src基因(Mukhopadhyay等，自然，375，577(1995)，Bonham等，致癌基因8，1973(1993)，Parker等，分子细胞生物学，5，831(1985)和Anderson等分子细胞生物学，5，112(1985))或
·V-Scr基因(Mukhodpadhyay等，自然，375，577，Anderson等，分子细胞生物学，5，112(1985)和Gibbs等，病毒学杂志，53，19(1985))
-类固醇激素受体及其启动子单元(Truss和Beato，Endocr.V.14，459(1993))，尤其是
·小鼠乳房肿瘤病毒启动子
由Chalepakis等(细胞，53，371(1988))和Truss与Beato(Endocr.V.14，459(1993))描述的MMTV的长末端重复区之启动子区的cDNA序列。
2.2.抗肿瘤(或抗炎症)物质的结构基因
2.2.a)增殖抑制因子
在本发明内，抗肿瘤或抗炎症物质可理解为抑制内皮细胞的增殖的蛋白质的DNA序列。这些DNA序列的蛋白质的例子是：
-成视网膜细胞瘤蛋白质(pRb/p100)或它的类似物p107和120
-p53蛋白质
-p21(WAF-1)蛋白质
-p16蛋白质
-其它CdK抑制因子
-GADD45蛋白质
-bak蛋白质。
为了防止这些细胞周期抑制物的快速的胞内灭活，优选地是使用那些表达蛋白质灭活位点突变以至没有这些蛋白质的功能，从而被损伤的基因。
通过磷酸化灭活成视网膜细胞瘤蛋白质(pRb)和有关的p107和p130蛋白质。因此，优选地是使用点突变pRb/p110的cDNA序列，p107的cDNA序列或p130的cDNA序列，点突变是使非磷酸化的氨基酸取代蛋白质的磷酸化位点。
2.2.b)凝结诱导因子和血管形成抑制因子
抗肿瘤或抗炎症的物质还可理解为诱导凝结和/或抑制血管形成的蛋白质的DNA序列，这些蛋白质的例子是：
-组织因子(TF)及其活性凝结片段(Morrissey等，细胞，50，129(1987)，Scarpati等，生物化学，26，5234(1987)，Spicer等，美国科学院学报，84，5148(1987)，Rehemtulla等，Thromb.Heamost.，65，521(1991)) -血纤维蛋白质溶酶原激活子抑制剂(PAI-1) -PAI-2 -PAI-3 -angiostatin -干扰素
·IFNα
·IFNβ
·IFNγ -血小板因子4 -IL-12 -TIMP-1 -TIMP-2 -TIMP-3 -白血病抑制因子(LIF)。
2.2.c)抑制细胞的和细胞毒素的蛋白质
然而，抗肿瘤或抗炎症的物质可以理解为直接或间接地对肿瘤表现抑制细胞效应的蛋白质的DNA序列。这些蛋白质尤其包括： -抗体或抗体片段 -穿孔素 -粒酶 -IL-2 -IL-4 -IL-12 -干扰素，例如
·IFNα
·IFNβ
·IFNγ -TNF
·TNFα
·TNFβ -制癌素M -鞘磷脂酶(Jarvis等，美国科学院学报，91，73，(1994)) -瓜蟾抗菌肽和瓜蟾抗菌肽衍生物(Cruciani等，美国科学院学报，88，3792(1991)；Jacob等，Ciba Found.Symp，186，197(1994)；Peck-Miller等，Cancer Chemoth.Pharmac，32，109(1993))。
2.2.d)炎症诱导物：
抗肿瘤物理解为这样的蛋白质的DNA序列，这种蛋白质除了抗肿瘤效应外适当刺激炎症反应，因而对消除肿瘤细胞起作用。这些蛋白质的例子尤其是： -RANTES(Mcp-2) -单核细胞趋化的和激活因子(MCAF) -IL-8 -巨噬细胞炎症性蛋白质1(MIP-lα，-β) -嗜中性的激活蛋白质2(NAP-2)
-IL-3
-IL-5
-人类白血病抑制因子(LIF)
-IL-7
-IL-11
-IL-13
-GM-CSF
-G-CSF
-M-CSF
-功能上对应于人类补体因子C3b(即可以结合到补体因子B上，由裂解因子后，形成C3转化酶)的眼镜蛇毒因子(CVF)或CVF组分序列。CVF及其组分的DNA序列由Fritzinger等(美国科学院学报，91，12775(1994))发表。
-人类补体因子C3或其组分序列C3b。C3的DNA序列及其组分序列由DeBruijn等(美国科学院学报，82，708(1985))发表。
-功能和结构与CVF类似的人类补体因子C3的裂解产物。这类裂解产物由OKeefe等(生物化学杂志，263，12690(1988))描述。
-激活补体或诱导炎症的细菌蛋白质，如鼠伤寒沙门氏菌的孔蛋白质(Galdiero等，传染和免疫，46，559(1984))，金黄色葡萄球菌、(Espersen ActaPath.Microb.et Imm.Scandin.Sect C93，59(1985))、modulins、尤其是革兰氏阴性细菌(Henderson等，炎症研究，44，187(1995))的聚集因子，军团菌属(Bellinger-Kawahara等，J.Exp.Med.172，1201(1990))或B型流感嗜血杆菌(Hetherington等。传染和免疫，60，19)或克雷伯氏杆菌属(Alberti等，传染和免疫，61，852(1993))或G族链球菌的M分子(Campo等，传染病杂志，171，601(1995))的主要外膜蛋白质。
一方面，融合蛋白质的DNA序列由所列出的细胞因子或生长因子和细胞膜上受体的配体(例如对内皮细胞或肿瘤细胞特异性的抗体或人类免疫球蛋白质的Pc部分)形成，另一方面，融合蛋白质的DNA序列也可以用作本发明内的活性物质。这类的DNA序列及其制剂在，例如，EP-A 0 464 633 A1中描述。
2.2.e)激活细胞抑制剂前体的酶
然而，抗肿瘤或抗炎症物质也可以理解为这样的酶的DNA序列，这种酶能把抗肿瘤活性化合物前体转化为抗肿瘤活性化合物。
这类酶可以裂解非活性前体物质(药物前体)从而形成活性的细胞抑制剂(药物)，有关的药物前体和药物，每种情况已经分别由Deonarain等(英国癌症杂志，70，786)、Mullen(Pharmac.Ther.63，199(1994))、Harris等(基因治疗，1，170(1994))综述。
例如，使用下列酶之一的DNA序列：
-疱疹单性病毒胸苷激酶(Garapin等，美国科学院学报，76，3755(1979)，Vile等，癌症研究，53，3860(1993)，Wagner等，美国科学院学报，78，1441(1981)，Moelten等，癌症研究，46，5276(1986)，国家癌症研究所杂志，82，297(1990))
-varicella zoster virus(水痘zoster病毒)胸苷激酶(Huber等，美国科学院学报，88，8039(1991)，Snoeck，国际抗微生物药剂杂志，4，211(1994))
-细菌硝基还原酶(Michaei等，FEMS微生物学通信，125，195，(1994)，Bryant等，生物化学杂志，266，4126(1991)，Watanabe等，核酸研究，18，1059(1990))
-细菌β-葡糖苷酸酶(Jefferson等，美国科学院学报，83，8447(1986))
-黑麦β-葡糖苷酸酶(Schulz等，植物化学，26，933(1987))
-人类β-葡糖苷酸酶(Bosslet等，英国癌症杂志，65，234(1992)，Oshima等，美国科学院学报，84，685(1987))
-人类羧肽酶(CB)，例如
·肥大细胞CB-A(Reynolds等，J.Clin.Invest.89，273(1992))
·胰腺CB-B(Yamamoto等，生物化学杂志，267，2575(1992)，Catasus等，生物化学杂志，270，6651(1995))
·细菌羧肽酶(Hamilton等，细菌学杂志，174，1626(1992)，Osterman等，蛋白质化学杂志，11，561(1992))
-细菌β-内酰胺酶(Rodrigues等，癌症研究，55，63(1995)，Hussain等，细菌学杂志，164，223(1985)，Coque等，EMBO杂志，12，631(1993))
-细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等，美国科学院学报，89，33(1992)，Austin等，分子药理学，43，380(1993)，Danielson等，分子微生物学，6，1335(1992)) -人类过氧化氢酶或过氧物酶(Ezurum等，核酸研究，21，1607(1993)) -磷酸酶，尤其是：
·人类碱性磷酸酶(Gum等，癌症研究，50，1085(1990))
·人类酸性前列腺磷酸酶(Sharieff等，美国人体基因杂志，49，412(1991)，Song等，基因，129，291(1993)，Tailor等，核酸研究，18，4928(1990))
·5型酸性磷酸酶(基因，130，201) -氧化酶，尤其是：
·人类赖氨酰氧化酶(Kimi等，生物化学杂志，270，7176(1995))
·人类酸性D-氨基氧化酶(Fukui等，生物化学杂志，267，18631(1992)) -过氧化物酶，尤其是：
·人类谷胱甘肽过氧化物酶(Chada等，Genomics 6，268(1990)，Ishida等，核酸研究，15，10051(1987))
·人类嗜曙红细胞过氧物酶(Ten等，J.Exp.Med.169，1757(1989)，Sahamaki等，生物化学杂志，264，16828(1989))
·人类甲状腺过氧物酶(Kimura，美国科学院学报，84，5555(1987))。
-半乳糖苷酶
为了促进所列出的酶的分泌，各种情况下DNA序列包含的同源信号序列可由促进胞外分泌异源信号序列取代。
这样，例如，β-葡糖苷酸酶的信号序列(DNA位置≤27至93；Oshima等，美国科学院学报，84，685(1987))，可以用免疫球蛋白质的信号序列(DNA位置≤63至≥107；Riechmann等，自然，332，323(1988))或用CEA信号序列(DNA位置≤33至≥134；Schrewe等，分子细胞生物学，10，2738(1990)，Berling等，癌症研究，50，6534(1990))或用人类呼吸合胞体病毒糖蛋白的信号序列(氨基酸的cDNA≤38至≥50或48至65；Lichtenstein等，普通病毒学杂志，77，109(1996))。
此外，优选地是选择这样的酶的的DNA，作为点突变的结果，这种酶在溶酶体更少贮存而分泌更多。β-葡糖苷酸酶的这类点突变已有描述，例如(Shiplex等，生物化学杂志，268，12193(1993))。
为了把酶锚定(anchor)进酶形成细胞的细胞膜，可以把序列或横跨膜结构域作为替代物插入或附加到信号序列上。
这样，在启动子的DNA序列和酶(如β-葡糖苷酸酶)的DNA序列之间可以插入序列，例如，人类巨噬细胞菌落刺激因子的横跨膜序列(DNA位置≤1485至≥1554；Cosman等，Behring Inst.Mitt.83，15(1988))或人类呼吸合胞病毒(RSV)糖蛋白G信号区与横跨膜区的DNA序列(氨基酸1至63或它们的组分序列，氨基酸38至63；Vijaya等，分子细胞生物学，8，1709(1988)，Lichtenstein等，普通病毒学杂志，77，109(1996))或流感病毒神经氨酸酶的信号区和横跨膜区的DNA序列(氨基酸7至35或组分序列氨基酸7至27；Brown等，病毒学杂志，62，3824(1988))。
为了加强翻译可以在启动子3′端和直接在信号的起始信号(ATG)的5′端之前或横跨膜序列中插入核苷酸序列
GCCACC
或
GCCGCC
然而，为了锚定在酶形成细胞细胞膜上的酶，有可以插入糖磷酸酯锚(glycophospholipid anchor)的核苷酸序列。
在酶的核苷酸序列的3′端插入糖磷酸酯锚，这种插入可以是附加到信号序列的插入序列上。
已经描述的糖磷酸酯锚有，例如，CEN(DNA位置≤893至≥1079，Berling等，癌症研究，50，6534(1990))、N-CAM(Cunningham等，科学，236，799(1987))以及其它膜蛋白质，如Thy-1(Clissold，生物化学杂志，281，129(1992))或CD16(Selvaray等，自然，333，565(1988))。
Ferguson等(生物化学年评，57，285(1988))发表了糖磷酸酯-锚定的膜蛋白质的综述。
按照本发明把酶锚定到细胞膜上的另一个选择是使用配体-酶融合蛋白质的DNA序列。这种融合蛋白质的配体特异地针对存在于增殖的内皮细胞或肿瘤细胞的细胞膜上的膜结构。
结合在增殖的内皮细胞表面的配体包括，例如，直接针对内皮细胞膜结构的抗体或抗体片段，这已经由，例如，Burrow等(Pharmac.Ther.64，155(1994))、Hughes等(癌症研究，49，6214(1989))和Maruyama等(美国科学院学报，87，5744)描述。这些抗体尤其包括针对VEGF受体的抗体。
鼠单克隆抗体优选地以人化的(humanized)形式使用。人化以Winter等(自然，349，293(1991))和Hoogenbooms等(Ref.Tr.Transfus.Hemobiol.36，19(1993))描述的方式起作用。抗体片段按照本领域的方法制备，例如以Winter等(自然，349，293(1991))，Hoogenboom等(Ref.Tr.Transfus.Hemobiol.36，19(1993)；Girol.Mol.Immunol.28，1379(1991)或Huston等(国际免疫学综述，10，195(1993))描述的方法制备。
而且，配体还包括和内皮细胞膜结构或膜受体结合的所有活性化合物。例如，它们包括末端包含甘露糖，以及IL-1、生长因子、它们的片段或组分序列的物质，这些物质结合到由内皮细胞表达的受体，如PDGF，bFGF，VEGF，TGFβ(Pusztain等，病理学杂志，169，191(1993))。此外，它们还包括和激活的和/或增殖的内皮细胞结合的粘着分子，这类的粘着分子，如SLex，LFA-1，MAC-1或VLA-4已有描述(Augustin-Voss的综述，细胞生物学杂志，119，483(1992)，Pauli等，Cancer Metast.Rev.9，175(1990)和Honn等，Cancer Metast.Rev.11，353(1992))。
然而，配体也包括直接针对肿瘤细胞膜的肿瘤特异性或与肿瘤结合的抗原的抗体及其片段。
这类抗原和附属抗体的例子在由Sedlacek等(Contrib.Oncol.32(1988)和Contrib.Oncol.43(1992))描述。抗体-酶融合蛋白质也有描述，例如，Bosslet等(英国癌症杂志，65，234(1992))。为了使所列出的配体-酶融合蛋白质易于分泌，各种情况下包含在酶的DNA序列中的同源信号序列(如已经描述的)可以用促进胞外分泌的异源信号序列取代。
2.2.f)核酶
然而，抗肿瘤或抗炎症物质也可理解为这样的核酶的DNA序列，这种核酶能裂解，从而灭活，细胞周期调控蛋白质基因的转录产物(信使RNA)。
这类核酶的优选的底物是细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E、cdc2、cdc25C和DP1基因的信使RNA。
在核苷酸位置(301)CUG CC GUC C AUG(312)
裂解细胞周期蛋白D1的mRNA的核酶的DNA寡核苷酸序列(xiong等，细胞，665，691(1991))是，例如，
SEQ ID NO：1
5′-AGCTTCCGCATGCTGATGAGGCCGCAAGGCCGAAACGGCAG-3′
SEQ ID NO：2
5′-AATTCTGCCGTTTCGGCCTTGCGGCCTCATCAGCATGCGGA-3′
在核苷酸位置
(406)UUC CU GUC G CUG(417)(xiong等，1991)
的裂解细胞周期蛋白D1的mRNA的另一个核酶的DNA寡核苷酸序列是，例如，
SEQ ID NO：3
5′-AGCTTCCAGCCTGATGAGGCCGCAAGGCCGAAACAGGAAG-3′
SEQ ID NO：4
5′-AATTCTTCCTGTTTCGGCCTTGCGGCCTCATCAGGCTGGA-3′
在核苷酸位置(208)GCA GUC UGU(216)(xiong等，1991)
的裂解细胞周期蛋白E的mRNA的核酶的DNA寡核苷酸序列(Koff等，细胞，66，1217(1991))是，例如，
SEQ ID NO：5
5′-AGCTTGCACACTGATGAGGCCGCAAGGCCGAAACTGCG-3′
SEQ ID NO：6
5′-AATTCGCAGTTTCGGCCTTGCGGCCTCATCAGTGTGCA-3′
在核苷酸位置
(481)GAA GUC UAU(489)(xiong等，1991)
的裂解细胞周期蛋白E的mRNA的另一个核酶的DNA寡核苷酸序列是，例如，
SEQ ID NO：7
5′-AGCTTGAAGTTTATACTGATGAGGCCGCAAGGCCGAAACTTCAG-3′
SEQ ID NO：85′-AATTCTGAAGTTTCGGCCTTGCGGCCTCATCAGTATAAACTTCA-3′
2.3.几种抗肿瘤或抗炎症物质的结合
本发明还涉及这样的核酸构建体，其中包含几种相同的抗肿瘤或抗炎症物质(A，A)或不同的抗肿瘤物质(A，B)的DNA序列的结合。为了表达两种DNA序列，内部核糖体进入位点(IRES)的cDNA优选的是作为调节单元插入。这通过图11说明。
这类的IRES序列已有描述，例如，Mountford和Smith(TIG 11，179(1995)，Kaufman等，核酸研究，19，4485(1991)，Morgan等，核酸研究，20，1293(1992)，Dirks等，基因，128，247(1993)，Pelletier和Sonenberg，自然，334，320(1988)和Sugitomo等，生物技术，12，694(1994)。
这样，骨髓炎灰质病毒IRES序列的cDNA(位置为5′UTR的140至630；Pelletier和Sonenberg，自然，334，320(1988))可用来和抗炎症物质A的DNA(在3′端)和抗炎症物质B的DNA(在5′端)连接。
在本发明内，这类活性化合物依赖于结合表现出加合性(A+A，A+B1)或协同作用。
3.治疗血细胞形成缺陷的活性化合物
3.1.造血细胞启动子或者激活子序列的选择
在本发明内，优选地使用由启动子或增强子组成的启动子或激活子序列，这种启动子或增强子是基因调节序列或较强而选择性地表达的蛋白质的基因单元。这种基因调节序列包括细胞因子或它的受体的基因的启动子序列，这种启动子序列在未成熟的造血细胞中(或相邻的细胞中，如基质)表达先于随后的细胞因子。这种细胞因子对造血细胞产生影响并可期望作为活性物质。这样的对未成熟的造血细胞产生影响的细胞因子的例子是：
-干细胞生长因子
-IL-1
-IL-3
-IL-6
-GM-CSF
3.2.造血细胞活性物质结构基因的选择
在本发明内，活性物质可理解为表达蛋白质促进血细胞的增殖和/或分化的DNA序列。
4.治疗自体免疫疾病、过敏反应、和预防器官排斥的活性化合物
4.1.特别用于自体免疫疾病的启动子或激活子序列的选择
那些免疫反应期间在巨噬细胞和/或淋巴细胞中较大程度上形成的蛋白质基因的基因调节序列用作由启动子或增强子组成的启动子或激活子序列。这类蛋白质的例子是：
-IL-1
-IL-1β
-IL-1受体
-IL-2
-IL-2受体
-IL-3
-IL-3受体
-IFNγ
-IL-4
-IL-4受体
-IL-5
-IL-6
-LIF
-IL-7
-IL-10
-IL-11
-IL-12
-IL-13
-GM-CSF
-GM-CSF受体
-整联蛋白质β2蛋白质
4.2.特别用于自体免疫疾病的活性物质基因的选择
在本发明内，活性物质是细胞因子、趋化因子、生长因子或它们的抑制因子之一的DNA序列，催化这些DNA序列之一的转录产物的核酶的DNA序列，催化细胞周期控制蛋白质的基因的转录产物的DNA序列，抗体、抗体片段、酶的DNA序列，由酶抗体、细胞因子或生长因子的和酶融合成的蛋白质的DNA序列。
选择活性物质取决于治疗的潜伏的疾病和选择的启动子序列。
5.治疗关节炎的活性化合物
5.1.关节炎的启动子或激活子序列的选择
在本发明内，优选地使用得自基因的启动子、增强子或基因调节序列组成启动子、激活子序列，这些启动子或激活子序列与转录因子在内皮细胞、滑液细胞和炎症细胞中相互作用。在本发明内，优选的启动子序列包括基因调节序列或在内皮细胞、滑液细胞细胞和炎症细胞中特异地表达的蛋白质的基因单元。
5.2.关节炎活性物质结构基因的选择
在本发明内，活性物质可理解为这样的DNA序列，其表达蛋白质直接或间接地抑制(如在关节中)和/或促进关节胞外基质(软骨和结缔组织)的重建。
6.抗传染剂的活性化合物的制备
活性化合物可制备成两种完全不同的形式：
-用于治疗病毒感染和寄生物侵染或其它疾病
-用于预防由病毒、细菌或寄生物引起的传染病。
用疫苗来预防传染病。然而，以常规方式制备有效的疫苗的可能性受到限制(Brown，Int.J.Technol.Assessm.Health Care，10，161(1994))，Ellis，Adv.Exp.Med.Biol.327，263(1992))和Amen等，FASEB杂志，6，265(1992))。
因而，发展了DNA疫苗技术。然而，这些DNA疫苗出现了关于功效、安全和副作用的问题(Fynan等，Int.J.Immunopharm.17，79(1995)，Donnelly等，免疫学，2，20(1994))。
在本发明内，预防传染病的活性化合物由于其细胞特异性和细胞周期调节有显著的高度安全性。
6.1.启动子或激活子序列的选择
6.1.a)用于治疗传染病的启动子或激活子序列的选择
活性特定地通过细菌寄生物感染改变的细胞基因的启动子序列或转化它们侵染的细胞并刺激这些细胞增殖的病毒的启动子序列可选择作为激活子序列。
这些病毒包括，例如，HBV，HCV，HSV，HPV，HIV，EBV和HTLV。
6.2.活性物质结构基因的选择
6.2.a)用于治疗传染病的活性物质结构基因的选择
选择这种表现抑制细胞的、细胞毒素的或抗病毒效应的蛋白质的DNA作为活性物质。细胞毒素的或抑制细胞的蛋白质的例子已在上面列举。当选定一种酶，随后必须使用可由这种酶裂解的而且是抗病毒的、细胞毒素的或抗寄生的物质的前体。
抗病毒的活性细胞因子和生长因子也是本发明内的抗病毒的蛋白质的活性物质。它们包括，例如，下列活性物质的DNA序列：
-IFNα
-IFNβ
-IFNγ
-TNFβ
-TNFα
-IL-1
-TGFβ
然而，一方面，蛋白质的DNA序列由所列出的细胞因子、生长因子或受体的胞外成分和配体融合形成，另一方面，这种蛋白质的DNA序列也可用作本发明内的活性物质；例如，包含人类免疫球蛋白质的Fc成分的融合蛋白质已在EP-A 0 464 633 A1中描述。
用于消化细胞周期控制蛋白质基因的mRNA或病毒mRNA的核酶的基因也可作为活性物质。例如，催化HIV的核酶由Christoffersen等(J.Med.Chem.38，2033(1995)综述。
在本发明内，活性物质也可以是特异性抗体的DNA序列，这种DNA序列能够灭活特定的病毒或它的包含VH和包含VL的片段，或通过接头连接的VH和VL片段，这种DNA序列可按照，例如，Marasco等(美国科学院学报，90，7889(1993))描述的方法制备。特异性针对病毒的抗体列于Section8.4。
6.2.b)用于预防传染病的活性物质结构基因的选择
选择由传染剂形成的并通过触发免疫反应(即通过抗体结合和/或通过T-淋巴细胞作用)导致病原体的中和(neutralization)和/或破坏的蛋白质的DNA作为活性物质。这类所谓的中和抗原已经用作疫苗抗原(参见Ellis的综述，Adv.Exp.Med.Biol.327，263(1992))。中和抗原的DNA序列的例子可从下列出版物得到：
-流感A-病毒抗原
(Ulmer等，科学，259，1745(1993)，Robinson等，疫苗，11，957(1993)，Fynan等，Int.J.Immunopharmac.17，79(1995))
-HIV抗原
(Wang等，美国科学院学报，90，4156(1993))
-狂犬病病毒抗原
(Donnelly等，免疫学，2/1，20(1994))
-HSV(疱疹单病毒)抗原
(Fleckenstein等，自然，274，57(1978))
-RSV(呼吸合胞体病毒)抗原(Du等，生物技术，12，813(1994)，Hall，科学，265，1393(1993))
-副流感病毒抗原
(Du等，生物技术，12，813(1994))
-rotavirus抗原
(Albert等，临床微生物学杂志，25，183(1987)，Anderson等，传染病杂志，153，823(1986)，Battaglia等，传染病杂志，155，140(1987)，Chanock等，传染病杂志，148，49(1983)，Dyall-Smith等，病毒学杂志，38，1099(1981)，Glass等，科学，265，1389(1994))
-VZV(水痘zoster病毒)抗原
(Straus等，国际医学年评，109，438(1988)，Gershon，Pediatr.Infect.Dis.2，171(1991)，Kinchington等，病毒学杂志，64，4540(1990))
-CMV(细胞肥大病毒)抗原
(Plotkin，科学，265，1383(1994))
-麻疹病毒抗原
(Katz和Kellin，科学，265，1391(1994))
-HPV(人类乳头瘤病毒)抗原
(Tindl和Frazer，Curr.Topics Microbiol.Immunol.186，217(1994))
-HBV(肝炎B病毒)抗原
(Valenzuela等，自然，280，815，Heerman等，病毒学杂志，52，396(1984))
-HCV(肝炎C病毒)抗原
(Cerny等，Curr.Topics Microbiol.Immunol.189，169(1994)，Esteban等，Progr.Liver Dis.10，253(1992)，Jung等，Eur.J.Clin.Invest.24，641(1994))
-HDV(肝炎D病毒)抗原
(Iwarson，Scand.J.Infect.Dis.24，129(1992)，Consolo等，Nephron.61，251(1992))
-HEV(肝炎E病毒)抗原
(Iwarson，Scand.J.Infect.Dis.24，129(1992)，Consolo等，Nephron.61，251(1992))
-HAV(肝炎A病毒)抗原
(d′Hondt，疫苗，10，48(1992)，Andre，传染病杂志，171，33(1995)，Lemon等，疫苗，10，40，Melnick等，疫苗，10，24(1992)，Flehmig，Baillieres Clin.Gastroenterol.4，707(1990))
-霍乱弧菌抗原
(Levine和Kaper，疫苗，11，207(1993))
-布氏疏螺旋体抗原
(Schaible等，免疫学通信，36，219(1993)，Wallich等，Lab.Med.17，669(1993))
-幽门螺杆菌抗原
(Crabtree等，Lancet，338，332(1991)，Blaser，传染病杂志，161，626(1990)，Cover和Blaser，生物化学杂志，267，10570(1993)，Cover等，传染免疫学，58，603(1990)，Dunn等，生物化学杂志，265，9464(1990)，Dunn等，传染免疫学，60，1946(1992)，Lage等，Acta Gastroenterol.Belg.56(增刊)，61(1993)，Mobley幽门螺杆菌等，Scand.J.Gastroint.26(增刊187)，39(1991))
-疟疾抗原
(Nussenzweig和Long，科学，265，1381，Maurice，科学，267，320(1995)，Enders等，疫苗，10，920(1992)，Knapp等，传染免疫学，60，2397(1992))。
然而，在本发明内，这类活性物质也包括抗独特型抗体或它的抗原结合片段的DNA，这种抗原结合片段的抗原结合结构和补体决定域构成蛋白质复制物或传染剂的中和抗原的碳水化物结构。
这类抗独特型抗体尤其在细菌传染剂的情况下可以取代碳水化物抗原。
这类抗独特型抗体及其裂解产物已由Hawkins等(免疫治疗杂志，14，273(1993))和Westerink与Apicella(Springer Semenars in Immunopathol.15，227(1993))综述。
6.3.用于传染病治疗或预防的相同的或不同的活性物质的结合
本发明还涉及这样一种活性化合物，这种活性化合物有相同的活性物质(A，A)或不同的活性物质(A，B)的DNA序列的结合。为表达两种序列，优选地把内部核糖体进入位点(IRES)的cDNA作为一个调节单元插入。
这类IRES序列的已有描述，例如Montford和Smith(TIG 11，179(1995)，Kaufman等，核酸研究，19，4485(1991)，Morgan等，核酸研究，20，1293(1992)，Dirks等，基因，128，247(1993)，Pelletier和Sonnenberg，自然，334，320(1988)和Sugitomo等，生物技术，12，694(1994)。
这样，脊髓灰质炎病毒IRES序列的cDNA(位置5′UTR的140至630(Pelletier和Sonenberg，自然，334，320(1988))可用于连接抗病毒物质A的DNA(在3′端)和抗病毒的物质B的DNA终点(在5′端)。这通过图12说明。
这类的活性化合物在本发明内依赖于结合表现加合性(A+A，A+B1)或协同效应。
这样，两种相同的或不同的抗病毒活性物质可以相互结合用于治疗，例如，病毒病。
在预防传染病中，几种一种传染剂或不同传染剂的不同抗原的活性物质可以相互结合。而且，一种传染剂抗原的活性物质可以和细胞因子或细胞因子受体的活性物质结合。
由此形成的细胞因子或细胞因子受体(注射活性化合物以后)同时作为传染剂可以影响发展的免疫反应的性质和强度。
扩大体液免疫反应的细胞因子和细胞因子受体的DNA序列已经在6.2.d)中描述，同时那些扩大细胞免疫反应的细胞因子和细胞因子受体的DNA已在6.2.a)和6.2.c)中描述。
作为一个整体扩大免疫反应的细胞因子的DNA序列的例子是：
-IL-1α(Fenton，Int.J.Immunopharm.14，401(1992)，Furntani等，核酸研究，14，3167(1986)，Lafage等，血液，73，104(1989)，March等，自然，315，641(1985))
-IL-1β(Bensi等，基因，52，95(1987)，Auron等，美国科学院学报，81，7907(1984)，Clark等，核酸研究，14，7897(1986))
-IL-2(Fletscher等，Lymphok.Res.6，45(1987)，Matsui等，淋巴因子，12，1(1985)，Tanaguchi等，自然，302，305(1983))
-GM-CSF(Gough等，自然，309，763(1984)，Nicola等，生物化学杂志，254，5290(1979)，Wong等，科学，228，810(1985))
7.治疗白血病和肿瘤的活性化合物
7.1.白血病启动子或激活子序列的选择
把在白血病细胞或肿瘤细胞形成或激活并与转录因子相互作用的基因调节核苷酸序列，可以作为启动子或激活子序列。
在本发明内，优选的启动子或激活子序列包括基因调节序列或特定地在白血病细胞或肿瘤细胞中形成的蛋白质的基因单元。
7.2.用于白血病活性物质结构基因的选择
在本发明内，活性物质可理解为这样的DNA序列，它的表达蛋白质直接或间接地抑制细胞也尤其是白血病细胞或肿瘤细胞增殖。这些活性物质包括，例如，如前所述的抑制的、抑制细胞的、编程性细胞死亡诱导的、细胞毒素的蛋白质或酶的DNA序列。
活性物质可进一步理解为催化细胞周期控制蛋白质的基因mRNA裂解的核酶。
8.血管闭塞中抑制平滑肌细胞增殖的活性化合物
8.1.平滑肌细胞启动子或激活子序列的选择
在本发明内，基因调节序列或特定地在平滑肌细胞中形成的蛋白质的基因单元优选地用作由启动子或增强子组成的启动子或激活子序列。
8.2.平滑肌细胞活性物质结构基因的选择
在本发明内，活性物质可理解为这样DNA序列，它的表达蛋白质抑制平滑肌细胞增殖。这些增殖的抑制因子包括在2.2.a)和2.2.c)中提到的蛋白质。
然而，活性物质也可理解为这样的酶的DNA序列，这种酶转化非活性的细胞抑制剂前体成为细胞抑制剂(参见2.2.e))。
然而，活性物质也可理解为对细胞周期控制蛋白质基因的mRNA特异的核酶的DNA序列(参见2.2.f)。
9.抑制或促进凝结的活性化合物
9.1.抑制凝结的启动子或激活子序列的选择
在本发明内，基因调节序列或可在平滑肌细胞、激活的内皮细胞、激活的巨噬细胞、或激活的淋巴细胞中检测到的蛋白质的基因单元优选地用作启动子或激活子序列。
9.1.a)平滑肌细胞
平滑肌细胞基因的启动子序列的例子已经提到。
9.1.b)激活的内皮细胞
尤其在激活的内皮细胞中形成的蛋白质的例子已经由Burrow等描述(Pharmac.Ther.64，155(1994))。这些在内皮细胞中更多产生的蛋白质尤其包括，例如，已经在上面列出的蛋白质及其基因的启动子序列。
9.1.c)激活的巨噬细胞和/或激活的淋巴细胞
在本发明内，激活子序列也可理解为这样的蛋白质基因的启动子序列，这种蛋白质免疫反应期间更多地在巨噬细胞和/或淋巴细胞中形成。这类蛋白质已经列出。
9.2.抑制或促进凝结的活性物质结构基因的选择
在本发明内，直接或间接抑制血小板聚或血液凝结因子或刺激血纤蛋白溶解的蛋白质的DNA序列用作抑制凝结的活性物质。
把这类活性物质定名为凝结抑制剂。例如，血纤蛋白质溶酶原激活子(PA)PA组织、尿激酶型纤溶酶激活子(uPA)、蛋白质C、抗凝血酶III，C-1S抑制剂，μl抗胰蛋白质酶，组织因子途径抑制物(TFPI)或水蛭素的基因可用作凝结抑制剂。
在本发明内，直接或间接促进血液凝结的蛋白质的DNA序列用作促进凝结的活性物质。这些蛋白质包括，例如，血液凝结因子VIII，血液凝结因子IX或血液凝结因子XIII。
10.防止CNS损伤的活性化合物
10.1.由防止CNS损伤的活性化合物的启动子或增强子组成的启动子或激活子序列。
10.1.a)内皮细胞中激活的启动子或激活子序列。
这些尤其包括内皮细胞特异性蛋白质基因的启动子序列。
10.I.b)在神经胶质细胞中激活的启动子或激活子序列
优选的激活子序列还可理解为核苷酸序列(启动子序列或增强子序列)，这种序列和神经胶质细胞中特定程度上形成的或活性的转录因子相互作用。
10.2.)神经特异因子结构基因的选择
在本发明内，神经特异因子可理解为神经生长因子DNA序列。
解释本发明的实施例
下列的实施例阐述本发明。
实施例1
激活子反应性启动子单元的制备和测试，激活子反应性启动子是结合LexA的序列。
新的激活子反应性启动子单元由下列在下游方向相互连接的不同核苷酸序列组成：
激活子亚单位A
-cdc25C基因的启动子
(核酸-290至+121；Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995)；Zwicker等，核酸研究，23，3822(1995))
-LexA蛋白质的DNA结合结构域的cDNA
(氨基酸1至81；Kim等，科学，255，203(1992))或整个LexA蛋白质(氨基酸1至202；Brent等，细胞，43，729(1985))
-GAL80的cDNA
(氨基酸1至435；Leuther等，科学，256，1333(1992))
激活子亚单位B
-von Willebrand因子基因的启动子
(核酸-487至+247；Jahroudi和Lynch，分子细胞生物学，14，999(1994))
-Gal4的Gal80结合结构域的cDNA(氨基酸851至881；Leuther等，科学，256，1333(1992))
-SV40的核定位信号(NLS)
(SV40大T；氨基酸126至132：PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16，478(1991))
-HSV-1 VP16酸性反式激活结构域(TAD)
(氨基酸406至488；Triezenberg等，Genes Developm.2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Op.Gen.Developm.5，190(1995))
激活子反应性启动子
-结合包含核苷酸序列
SEQ ID NO：9
5′-TACTGTATGTACATACAGTA-3′
的LexA(LexA操纵子)的序列(Brent等，自然，612，312(1984))和SV40的基础启动子偶联(核酸48至5191；Tooze(ed.)，DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，纽约；冷泉港实验室)。
激活子反应性启动子单元的核苷酸序列顺序在图13中描述。
叙述的激活子序列所起的功能如下：
-cdc25C启动子以细胞周期特异性方式调节Lex DNA-结合蛋白质和Gal80的结合cDNA序列的转录。
-vWF启动子限制Gal4和Gal80结合结构域、SV40 NSL和内皮细胞的TAD的偶联cDNA的转录。
-激活子亚单位A和B的表达产物通过Gal4的Gal80-结合结构域结合到Gal80上二聚化。
在图14中，以图表形式描述了这种二聚化。
-二聚体蛋白质构成LexA操纵子激活子反应性启动子的嵌合转录因子。
启动子以其3′端与GCCACC序列连接，(Kocak，细胞生物学杂志，108，229(1989))，这个启动子与免疫球蛋白质信号肽的cDNA连接(核苷酸序列≤63至≥107；Riechmann等，自然332，323(1988))，然后如图15表示β-葡糖苷酸酶的cDNA(核苷酸序列≤93至≥1982；Oshima等，美国科学院学报，84，685(1987))连接到这个序列上。
把用这种方式制备的核苷酸构建体克隆进pUC18/19或Bluescript衍生的质粒载体中，这两种载体直接或在胶体分散系统中用于活体用药。
构建体的单个组分用适当的限制位点连接，这些位点通过PCR扩增引入到不同单元的末端。连接用对限制位点特异的和为专业技术人员所知的酶和DNA连接酶的帮助起作用。这些酶在商业上是可得到的。
保持在培养基中的人类脐带内皮细胞和成纤维细胞(Wi-38)使用专业技术人员所知的方法用所述的质粒转染(Lucibello等，EMBO杂志，14，132(1995))，由内皮细胞产生的β-葡糖苷酸酶的量利用4-methylumbelliferyl-β-葡糖苷酸作为底物测定。
为了检验细胞周期特异性，内皮细胞通过提取蛋氨酸在G0/G1期同步化48小时(Nettelbeck等，准备发表)。细胞的DNA含量用Hoechst33258染色后在荧光激活的细胞分选仪中测定(Lucibello等，EMBO杂志，14，132(1995))。
得到的结果如下：
与非转染的成纤维细胞相比，转染的成纤维细胞中没有检测到β-葡糖苷酸酶的增加。
转染的内皮细胞比没有转染内皮细胞表达更多β-葡糖苷酸酶。
增殖的内皮细胞(DNA＞2S)比在G0/G1同步化的内皮细胞(DNA＝2S)分泌更多的β-葡糖苷酸酶。
因而，描述过的激活子反应性启动子单元导致β-葡糖苷酸酶结构基因的细胞特异性的、细胞周期依赖性的表达。
下列地方的应用，例如在肿瘤位点或下列颅内的或蛛网膜下的用药，或系统的，优选的静脉内的或动脉内的用药，因为激活物应答的启动子单元的细胞周期特异性和内皮细胞特异性，按照本发明的活性化合物具有能够主要地(如果不是唯一地)只使增殖的内皮细胞分泌β-葡糖苷酸酶的作用，这种β-葡糖苷酸酶裂解有耐受力的被注射的阿霉素-β-葡糖苷酸(Jacquesy等，EPO 0511 917 A1)成为有细胞抑制作用的阿霉素。阿霉素抑制内皮细胞增殖并对这些细胞以及邻近的肿瘤细胞有细胞抑制作用，这导致肿瘤生长的抑制。
因为活性化合物提供高度安全的保证，它的细胞特异性与它的细胞周期特异性，可以以高剂量用于肿瘤疾病的治疗，如果需要，每隔几天或几周治疗几次。
实施例2
具有核保留信号(NRS)和核输出因子(NEF)的多重启动子的制备
新的多重启动子由下列不同的核苷酸序列组成，它们下游方向相互连接：
元件A
-cdc25C基因的启动子
(核酸-290至+121；Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995)；Zwicker等，核酸研究，23，3822(1995))
-GCCACC序列
(Kodak，细胞生物学杂志，108，229(1989))
-免疫球蛋白质信号肽的cDNA(核苷酸序列≤63至≥1107；Riechmann等，自然，332，323(1988))
-β-葡糖苷酸酶的cDNA(核苷酸序列≤93至≥1982；Oshima等，美国科学院学报，84，685(1987))
作为核保留信号(NRS)的HIV-1病毒RER的cDNA(核苷酸序列7357至7602；Ratner等，自然，313，277(1985)；Malim等，自然，338，254(1989))。
元件B
-von Willebrand因子(vWF)基因的启动子
(核酸-487至+247；Jahroudi和Lynch，分子细胞生物学，14，999，(1994))
-作为核输出因子(NEF)的HIV-1病毒REV的cDNA(氨基酸序列1-117；Ratner等，自然，313，277(1985))。
元件A和元件B的核苷酸序列按照在图16中的图表连接。
把用这种方式制备的核苷酸构建体克隆进pUC18/19或Bluescript衍生的质粒载体中，这两种载体直接或在胶体分散系统中用于活体用药。
构建体的单个组分用适当的限制位点连接，这些位点通过PCR扩增引入到不同单元的末端。连接用对限制位点特异的和为专业技术人员所知的酶和DNA连接酶的帮助起作用。这些酶在商业上是可得到的。
保持在培养基中的人类脐带内皮细胞和成纤维细胞(Wi-38)使用专业技术人员所知的方法用所述的质粒转染(Lucibello等，EMBO杂志，14，132(1995))，由内皮细胞产生的β-葡糖苷酸酶的量利用4-methylumbelliferyl-β-葡糖苷酸作为底物测定。
为了检验细胞周期特异性，内皮细胞通过提取蛋氨酸在G0/G1期同步化48小时(Nettelbeck等，准备发表)。细胞的DNA含量用Hoechst33258染色后在荧光激活的细胞分选仪中测定(Lucibello等，EMBO杂志，14，132(1995))。
得到的结果如下：
与非转染的成纤维细胞相比，转染的成纤维细胞中没有检测检测到β-葡糖苷酸酶的增加。
转染的内皮细胞比没有转染内皮细胞表达更多β-葡糖苷酸酶。
增殖的内皮细胞(DNA＞2S)比在G0/G1同步化的内皮细胞(DNA＝2S)分泌更多的β-葡糖苷酸酶。
因而，描述过的激活子反应性启动子单元导致β-葡糖苷酸酶结构基因的细胞特异性的、细胞周期依赖性的表达。
实施例3
激活子反应性启动子单元的制备，其中激活子反应性启动子是结合Gal4的序列。
新的激活子反应性启动子单元有下列在下游方向相互连接的不同核苷酸序列组成：
激活子亚单位A
-cdc25C基因的启动子
(核酸-290至+121；Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995)；Zwicker等，核酸研究，23，3822(1995))
-Gal4蛋白质的DNA结合结构域的cDNA
(氨基酸1至147；Chasman和Kornberg，分子细胞生物学，10，2916(1990))
-GAL80的cDNA
(氨基酸1至435；Leuther等，科学，256，1333(1992))
激活子亚单位B
-von Willebrand因子基因的启动子
(核酸-487至+247；Jahroudi和Lynch，分子细胞生物学，14，999(1994))
-Gal4的Gal80结合结构域的cDNA(氨基酸851至881；Leuther等，科学，256，1333(1992))
-SV40的核定位信号(NLS)
(SV40大T；氨基酸126至132：PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16，478(1991))
-HSV-1 VP16酸性反式激活结构域(TAD)
(氨基酸406至488；Triezenberg等，Genes Developm.2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Op.Gen.Developm.5，190(1995))
激活子反应性启动子
-结合Gal4的序列，这种序列含有和SV40基础启动子(核酸48-5191；Tooze(ed.))与DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，纽约；冷泉港实验室)偶联的核苷酸序列5′-CGGACAACTGTTGAC-3′(Chasman和Kornberg，分子细胞生物学，10，2916(1990))。
激活子反应性启动子单元的核苷酸序列的顺序在图17中描述。
已描述的激活子序列所起的作用如下：
-cdc25C启动子以细胞周期特异性方式调节Lex DNA-结合蛋白质和Gal80的结合cDNA序列的转录。
-vWF启动子限制Gal4和Gal80结合结构域、SV40 NSL和内皮细胞的TAD的偶联cDNA的转录。
-激活子亚单位A和B的表达产物通过Gal4的Gal80-结合结构域结合到Gal80上二聚化。
在图18中，以图表形式描述了这种二聚化。
-二聚体蛋白质构成激活子反应性启动子的嵌合转录因子(Gal4结合结构域/SV40启动子的DNA序列)。
启动子以其3′端与GCCACC序列连接，(Kocak，细胞生物学杂志，108，229(1989))，这个启动子与免疫球蛋白质信号肽的cDNA连接(核苷酸序列≤63至≥107；Riechmann等，自然332，323(1988))，然后如图15表示β-葡糖苷酸酶的cDNA(核苷酸序列≤93至≥1982；Oshima等，美国科学院学报，84，685(1987))连接到这个序列上。
把用这种方式制备的核苷酸构建体克隆进pUC18/19或Bluescript衍生的质粒载体中，这两种载体直接或在胶体分散系统中用于活体用药。
构建体的单个组分用适当的限制位点连接，这些位点通过PCR扩增引入到不同单元的末端。连接用对限制位点特异的和为专业技术人员所知的酶和DNA连接酶的帮助起作用。这些酶在商业上是可得到的。
保持在培养基中的人类脐带内皮细胞和成纤维细胞(Wi-38)使用专业技术人员所知的方法用所述的质粒转染(Lucibello等，EMBO杂志，14，132(1995))，由内皮细胞产生的β-葡糖苷酸酶的量利用4-methylumbelliferyl-β-葡糖苷酸作为底物测定。
为了检验细胞周期特异性，内皮细胞通过提取蛋氨酸在G0/G1期同步化48小时(Nettelbeck等，准备发表)。细胞的DNA含量用Hoechst33258染色后在荧光激活的细胞分选仪中测定(Lucibello等，EMBO杂志，14，132(1995))。
得到的结果如下：
与非转染的成纤维细胞相比，转染的成纤维细胞中没有检测检测到β-葡糖苷酸酶的增加。
转染的内皮细胞比没有转染内皮细胞表达更多β-葡糖苷酸酶。
增殖的内皮细胞(DNA＞2S)比在G0/G1同步化的内皮细胞(DNA＝2S)分泌更多的β-葡糖苷酸酶。
因而，描述过的激活子反应性启动子单元导致β-葡糖苷酸酶结构基因的细胞特异性的、细胞周期依赖性的表达。
实施例4
另一种激活子反应性启动子单元的制备和测试，其中激活子反应性启动子是结合Gal4的序列。
新的激活子反应性启动子单元由下列在下游方向相互连接的不同核苷酸序列组成：
激活子亚单位A
-cdc25C基因的启动子
(核酸-290至+121；Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995)；Zwicker等，核酸研究，23，3822(1995))
-SV40的核定位信号(NLS)
(SV40大T；氨基酸126至132：PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16，478(1991))
-HSV-1 VP16酸性反式激活结构域(TAD)
(氨基酸406至488；Triezenberg等，Genes Developm.2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5，190(1995))
CD4糖蛋白的细胞质部分的cDNA(氨基酸397-435；Simpson等，Oncigene，4，1141(1989)；Maddon等，细胞，42，93(1985))
激活子亚单位B
-cdc25C基因的启动子(核酸-290至+121；Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995)；Zwicker等，核酸研究，23，3822(1995))
-SV40的核定位信号(NLS)(SV40大T；氨基酸126至132：PKKKRKV；Dingwall等，TIBS 16，478(1991))
-Gal4蛋白质的DNA结合结构域(氨基酸1至147；Chasman和Kornberg，分子细胞生物学，10，2916(1990))的cDNA
-p56 Ick蛋白质的CD4结合序列(氨基酸1-71；Shaw等，细胞，59，627(1989)；Turner等，细胞，60，755(1990)；Perlmutter等细胞生物化学杂志，38，117(1988))的cDNA
激活子反应性启动子
-含有核苷酸序列5′-CGGACAATGTTGACCG-3′的Gal4结合蛋白质的10×结合序列(Chasman和Kornberg，分子细胞生物学，10，2916(1989))
-SV40基础启动子(核酸48-5191；Tooze(ed).DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，纽约，冷泉港实验室)
效应基因
-虫荧光素酶的cDNA(报道基因)(Nordeen，生物技术，6，454(1988))
叙述的激活子序列所起的功能如下：
-cdc25C启动子以细胞周期特异性方式调节VP16的反式激活域和CD4(激活亚单位)的细胞质部分的结合cDNA序列的转录。
-cdc25C启动子以细胞周期特异性方式还调节Gal4的DNA结合蛋白质和p56 Ick蛋白质的CD4结合部分(激活亚单位B)的结合cDNA序列的转录。
-激活子亚单位A和B通过CD4结构域结合到p56 Ick结构域二聚体化的转录产物的表达。
-二聚体蛋白质构成用于作用于效应基因(＝报告基因＝虫荧光素酶基因)转录的激活子反应性启动子(Gal4结合结构域/SV40启动子的DNA序列)。
把用这种方式制备的核苷酸构建体克隆进pXP2质粒载体(Nordeen，生物技术，6，454(1988))，这种载体直接或在胶体分散系统中用于活体用药。
构建体的单个组分用适当的限制位点连接，这些位点通过PCR扩增引入到不同单元的末端。连接用对限制位点特异的和为专业技术人员所知的酶和DNA连接酶的帮助起作用。这些酶在商业上是可得到的。
保持在培养基中的3T3成纤维细胞使用专业技术人员所知的方法用所述的质粒转染(Lucibello等，EMBO杂志，14，132(1995))，由成纤维细胞产生的β-葡糖苷酸酶的量通过Heber等(癌基因，9，1295(1994))和Lucibello等(EMBO杂志，14，132(1995))描述的方法测定。
为了检验细胞周期特异性，成纤维细胞通过提取血清在G0/G1期同步化48小时。细胞的DNA含量用Hoechst33258染色后在荧光激活的细胞分选仪中测定(Lucibello等，EMBO杂志，14，132(1995))。
得到的结果如下：
与没有转染的成纤维细胞相比，在转染的成纤维细胞中可以检测到在虫荧光素酶的显著增加。
增殖的成纤维细胞(DNA＞2S)比在G0/G1(DNA＝2S)期同步化的成纤维细胞形成更多的虫荧光素酶。
因而，所述的激活子反应性启动子单元导致虫荧光素酶报道基因的细胞周期依赖性表达。
下列地方的应用，例如在肿瘤位点或下列颅内的或蛛网膜下的用药，或系统的，优选的静脉内的或动脉内的用药，因为激活物应答的启动子单元的细胞周期特异性和内皮细胞特异性，按照本发明的活性化合物有实现，主要地(如果不是唯一地)只使增殖的内皮细胞分泌β-葡糖苷酸酶的作用，这种β-葡糖苷酸酶裂解有耐受力的被注射的阿霉素-β-葡糖苷酸(Jacquesy等，EPO 0511 917 A1)成为有细胞抑制作用的阿霉素。阿霉素抑制内皮细胞增殖并对这些细胞以及邻近的肿瘤有细胞细胞抑制效应，这导致肿瘤生长的抑制。
【附图说明】
图1：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
图2：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
图3：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
图4：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
图5：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
图6：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
图7：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
图8：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
图9：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
图10：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
图11：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
图12：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
图13：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
图14：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
图15：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
图16：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
图17：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
图18：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
图19：说明本发明的核酸构建体的清楚明了的图解。
序列表(1)一般信息： (i)申请人：
(A)名称：Hoechst Aktiengesellschaft
(B)街道：-
(C)城市：Frankfurt
(D)州：-
(E)国家：德国
(F)邮区代码(ZIP)：65926
(G)电话：069-305-3005
(H)传真：069-35-7175
(I)电传：412 34 700 hod (ii)发明名称：包含转运信号之基因的核酸构建体 (iii)序列数：9 (iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：Patentln Release#1.0，版本#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO：1的信息： (i)序列特征：
(A)长度：41个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：DNA(基因组) (ix)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：1..41
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：AGCTTCCGCA TGCTGATGAG GCCGCAAGGC CGAAACGGCA G41 (2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：41个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(ix)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：1..41
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：AATTCTGCCG TTTCGGCCTT GCGGCCTCAT CAGCATGCGG A41
(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：40个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子型：DNA(基因组)
(ix)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：1..40
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：AGCTTCCAGC CTGATGAGGC CGCAAGGCCG AAACAGGAAG40 (2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：40个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子型：DNA(基因组)
(ix)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：1..40
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：AATTCTTCCT GTTTCGGCCT TGCGGCCTCA TCAGGCTGGA40
(2)SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：38个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子型：DNA(基因组)
(ix)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：1..38
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：AGCTTGCACA CTGATGAGGC CGCAAGGCCG AAACTGCG38 (2)SEQ ID NO：6的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：38个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子型：DNA(基因组)
(ix)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：1..38
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：AATTCGCAGT TTCGGCCTTG CGGCCTCATC AGTGTGCA38
(2)SEQ ID NO：7的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：44个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子型：DNA(基因组)
(ix)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：1..44
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：AGCTTGAAGT TTATACTGAT GAGGCCGCAA GGCCGAAACTTCAG 44
(2)SEQ ID NO：8的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：44个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子型：DNA(基因组)
(ix)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：1..44
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：AATTCTGAAG TTTCGGCCTT GCGGCCTCAT CAGTATAAACTTCA 44 (2)SEQ ID NO：9的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
(D)类型：核酸
(D)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子型：DNA(基因组)
(ix)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)位置：1..20
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：TACTGTATGT ACATACAGTA 20