用能产生人IgG1重链-κ轻链小鼠作为制备人源化单克隆抗体和应用 【技术领域】
本发明涉及到一种人源化小鼠单克隆抗体的制备和应用，属于生物工程领域。
背景技术
单克隆抗体在肿瘤、病毒性感染、类风湿性关节炎、心血管疾病以及器官移植等疾病诊断、治疗及预防方面拥有广阔的应用前景，因此成为目前生物技术药物领域最引人注目的研究热点。
抗体是动物免疫系统在外来抗原刺激下产生的蛋白质，其特异性取决于抗原分子的决定簇。由于各种抗原分子具有很多决定簇，所以免疫动物产生的抗体实际上是多种抗体的混合物。要通过这种方法制备抗体是不可行的，原因是抗体的含量少、分离也很困难，且动物抗体注入人体会产生严重的过敏反应。通过小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞杂交得到地杂交瘤细胞，能在体外大量生产单一成分的抗体，只识别一种特定的抗原，称为单克隆抗体。
单克隆抗体技术由英国生化学家米尔斯坦(Milstein)和德国免疫学家科勒(Kohler)于1975年首度研制。单抗药物包括单抗制品和单抗偶联物，由于单抗对相应靶分子(抗原)具有高度的特异性，所以单抗药物已用于肿瘤、病毒性感染、类风湿性关节炎、心血管疾病以及器官移植中的抗排异反应。研发中的单抗药物大多针对肿瘤，原因在于：
单抗药物存在的主要问题包括免疫学和药理学两个方面。免疫学方面，多年来用于临床研究的单抗药物大多使用小鼠单抗，往往导致人体的免疫反应；药理学方面，主要问题是到达肿瘤、病毒性感染部位、或其它病变部位的药量不足。单抗药物在体内运送过程受多种因素影响，由于它是异体蛋白，会被网状内皮系统摄取，有相应数量将积聚于肝、脾和骨髓，同时单抗药物是大分子物质，通过毛细血管内皮层以及穿透肿瘤细胞外间隙均受到限制。解决上述问题的主要途径是降低单抗药物免疫原性，使鼠原性单抗人源化或研制完全的人体。
目前一些嵌入式或拟人化的单抗产品在国外获准生产。单抗人源化主要通过基因工程技术制备嵌合抗体或改形抗体。转基因动物技术的发展，使所有的单克隆抗体人源化成为可能，并可大大降低免疫排斥反应。
目前美国Abgenix和Medarex公司已得到了小鼠的转基因株。前者开发了两个产品，一个是用于牛皮癣治疗的药物正在临床研究，另一个用于治疗癌症的药物尚处于临床前开发阶段。Medarex第一个用于治疗类风湿关节炎的人源化单克隆抗体已进入一期临床研究。
从上世纪80年代中期开始，鼠源抗体的人源化就一直是解决这些问题的努力方向，到目前为止，已经报道的人源化方案主要有：
(1)人—鼠嵌合抗体：嵌合抗体是鼠源抗体人源化最早采取的方案，也是相当成功的方案。其方法是：克隆抗体的轻链和重链可变区基因，按读框要求分别插入人的轻链恒定区(一般都用k链)和重链恒定区(可选择各种重链恒定区，但从效应功能出发常用某种g链)的上游，再进行表达即可。嵌合抗体的优点是技术比较简单，现在已经有多种和可变区克隆方法(主要是读框)配套的嵌合抗体制作载体，用RT-PCR得到抗体的可变区基因后，很快就可以表达出嵌合抗体。此外，制作嵌合抗体可基本达到抗体人源化的两个目的：得到有效的效应功能；大幅度降低或基本消除HAMA反应(排斥反应的出现低于5％)。然而，排斥反应并没有从被百分之百地消除，这被归结于因为嵌合抗体的可变区仍然是鼠源性的。
(2)可变区的人源化：如上所述，嵌合抗体没有完全解决患者对抗体的排斥反应，起原因被归结于抗体的可变区是鼠源性是。这一观点促使人们对可变区继续进行人源化改造。这种改造主要有两种途径，一是构建重构型(re-shape)抗体，即用基因工程的方法将鼠源性抗体的可变区的框架区更换成人源的，而负责与抗原结合的超变区仍然保留小鼠的。这是一种基于序列的抗体改造方案，所以常常会造成抗体亲和力的降低。另一种途径是基于抗原亲和力的，即链置换(chain-shift)方案。通过先后更换轻链和重链，在亲和力的引导下，从人源噬菌体抗体库中得到针对抗原的完全是人源的抗体可变区基因。再通过基因工程加上人的恒定区基因，即可表达出抗原特异性人源抗体。此外，也可直接用抗原在人源噬菌体抗体库中筛选得到人源化抗体的可变区基因。这些可变区人源化方案都可得到完全是人源的抗体基因，其缺点是要经过较多的基因工程操作才能表达出有实用价值的抗体蛋白。
(3)最典型的技术是Tomizuka K.et al.Double trans-chromosomic mice：Maintenanceof two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and k loci andexpression of fully human antibodies.PNAS.97：722-727，2000.报道的通过改造小鼠的遗传背景使小鼠以人源抗体进行免疫应答。其简介如下：这种方案实际上已经不是对鼠源抗体进行人源化，而是直接得到人源抗体的方法了。其技术核心建立在近年来对小鼠进行遗传学操作的方法上，即小鼠基因剔除和转基因小鼠技术上。首先用基因剔除的方法分别去除小鼠的JH基因和Ck基因，从而灭活小鼠的免疫球蛋白轻链k和重链H基因位点，使之不能表达自身的IgH和Igk。再通过培育小鼠，使两种突变进入同一小鼠。这种小鼠由于没有抗原受体表达而不能产生B淋巴细胞。同时，通过转基因小鼠技术用包含有人免疫球蛋白k链基因(Vk-Jk-Ck，约1.5Mb)和人免疫球蛋白重链(VH-D-JH-CH，约1.5Mb)的酵母人工染色体DNA制作转基因小鼠(也可通过ES细胞转染，显微注射制作嵌合小鼠的途径进行)。再次通过小鼠交配，即可得到小鼠免疫球蛋白k基因和重链基因被灭活、而且带有人的免疫球蛋白k和重链基因的小鼠。这种小鼠有正常的B细胞发育。当受到抗原刺激后可以进行正常的抗体应答，但所产生的免疫球蛋白的重链均为人源的，轻链的95％为人的k链(剩下的5％为小鼠的1链，若将小鼠的1链用基因剔除方法灭活，则所有的抗体轻链均为人的k链)。用抗原免疫小鼠后，可髓时用杂交瘤技术获得针对抗原的特异性人源化单克隆抗体。
这一方法从理论上可以彻底解决人源化抗体的产生问题。但是，其主要存在问题是1.技术难度大；2.虽然剔除小鼠的免疫球蛋白基因从技术上来说不存在问题，但完整地转入人的免疫球蛋白基因却并非易事——长达1.5Mb的DNA分子的操作容易带来结构上的变化；3.进入小鼠细胞后有无重组、整合位点对表达的影响；4.重组后整个基因重排模式是否是正常的，这将影响转基因鼠表达人抗体的量和抗体与抗原的结合活性。这些问题都对成功地建立这类小鼠品系至关重要。
然而，即使是完全的人源化抗体，其可变区对于接受抗体治疗的患者仍然具有免疫源性。如上所述，抗体可变区基因是在体细胞水平经过基因重排和突变产生的，这种每天都在产生的新蛋白的氨基酸序列对机体无疑是抗原性刺激，所以在临床使用上，针对人源抗体也会产生抗抗体。抗体可变区的骨架区在种内存在较大的多样性，而在种间有较高的同源性，在人和小鼠间，有些抗体可变区序列在种间的保守性要高于种内不同可变区家族间的序列同源性。所以，如果人体对于自身的抗体可变区的免疫原性可以耐受，那么对小鼠的抗体可变区的免疫原性亦可至少有一定的耐受性。而剩余的免疫原性和人源抗体的使用一样，可以通过用药途径、方案等的改变来加以排除。众多的人-鼠嵌合抗体已经被批准临床使用或进入临床试验，说明至少在针对某些抗原的抗体，可变区带来的免疫原性是可以被忽略的。
通过对已有的技术的简介可知，目前，人们在用于各种疾病的治疗中所获得的人源化抗体的制备还存在以下不足：1.要经过较多的基因工程操作才能表达出有实用价值的抗体蛋白；2.技术难度大；3.研制转基因鼠时，长达1.5Mb的DNA分子的操作容易带来结构上的变化；4.进入小鼠细胞后有无重组、整合位点对表达的影响和重组后整个基因重排模式是否是正常的，其技术精度要求很高。
【发明内容】
本发明的目的是要克服现有技术存在的：1.要经过较多的基因工程操作才能表达出有实用价值抗体蛋白；2.技术难度大；3.长达1.5Mb的DNA分子的全基因操作容易带来结构上的变化；4.难以明确进入小鼠细胞后有无重组、整合位点对表达的影响和重组后整个基因重排模式是否正常这些不足；并提供一种用能产生人IgG1重链-k轻链的小鼠作为制备单克隆抗体和应用，特提出本发明的技术解决方案。
本发明的基本思路是：不采用Ig全基因和k轻链全基因的克隆方式；而是在小鼠的Ig轻链k恒定区基因和Ig重链g1恒定区基因位点上，分别敲入人的Igk恒定区和IgG1恒定区基因；所得到的小鼠在对抗原进行抗体应答时，直接产生人—鼠嵌合抗体；在此基础上，建立从获得的嵌合抗体小鼠上通过细胞融合，得到分泌嵌合抗体的杂交瘤的技术路线。
本发明所提出的用能产生人IgG1重链-k轻链小鼠作为制备人源化单克隆抗体，包括：基因克隆、构建载体、转化细胞、转化小鼠、筛选表达、免疫小鼠、细胞融合、抗体制备，其特征在于：所采用的小鼠是在小鼠的Ig轻链k恒定区基因和Ig重链g1恒定区基因位点上，分别敲入人的Igk恒定区和IgG1恒定区基因，而培育产生人IgG1重链-k轻链的小鼠；所制备的人源化单克隆抗体是，其抗体的恒定区与人抗体完全相同，而与抗原结合的可变区则是与小鼠相同的人—鼠嵌合抗体；筛选表达具有人IgG1重链-k轻链的嵌合抗体鼠；通过抗原免疫、细胞融合，获得可分泌人源化嵌合型单克隆抗体的杂交瘤细胞系；嵌合抗体制备步骤是：
第一步，从129sv小鼠的基因组DNA文库中克隆小鼠的Igκ链和IgG1链基因组基因；
第二步，基因敲入载体的构建
轻链载体——将完整的人Igκ基因片段插入小鼠的Igκ基因位点，使得小鼠κ基因5’端的一小段编码区被缺失，以在插入人κ基因的同时保证灭活小鼠κ基因，人κ基因下游插入正筛选基因neo(neomycinphosphotransferase)表达单位，在3’同源区下游插入负筛选基因白喉毒素A单位(DTA)表达单位，5’和3’同源区的大小分别为6kb和8kb；
重链载体——在人分泌型IgG1基因的下游插入小鼠IgM的膜外显子，再在下游插入正筛选基因表达单位，将构建的这一片段插入小鼠的IgM基因编码区靠近5’端处，使得插入这一基因片段的同时完全灭活小鼠的IgM基因，同源区下游插入负筛选标志，5’和3’同源区的大小分别为5kb和7kb；
第三步，在ES细胞中进行同源重组
培养小鼠ES细胞系E14，用电穿孔法分别将构建的基因敲入载体转染入ES细胞中，在G418存在下进行培养和筛选；
第四步，嵌合小鼠的产生
交配C57BL/6小鼠，在交配后4.5天时从妊娠的小鼠子宫收集囊胚，将同源重组的ES细胞通过显微注射，注射入C57BL/6小鼠的囊胚腔中，再将囊胚移植到假孕的ICR小鼠的子宫中，出生的小鼠根据眼的颜色和毛色判断嵌合程度；
第五步，将轻链小鼠与重链小鼠进一步交配，得到轻链和重链基因位点上都是敲入的基因的小鼠；
第六步，人源化单克隆抗体的制备。
使用本发明所述的用能产生人IgG1重链-κ轻链小鼠作为制备人源化单克隆抗体的应用，其特征在于：所制备的单克隆抗体是针对肿瘤抗原、或病毒抗原，或细菌抗原，或人CD及细胞因子抗原具有特异性的抗体；其应用方法的步骤是：
第一步，采用肿瘤抗原、或病毒抗原、或细菌毒素抗原、或人CD抗原免疫产生人IgG1重链-κ轻链品系的小鼠；
第二步，取免疫鼠脾脏与骨髓瘤细胞进行融合，克隆化，培养；
第三步，筛选产生抗肿瘤抗原、或抗病毒抗原、或抗细菌毒素抗原、或抗人CD抗原特异性的人源化单克隆抗体的杂交瘤细胞系；
通过酶联免疫吸附实验、免疫荧光实验、免疫组化实验等进行筛选；
第四步，制备产生抗肿瘤抗原、或抗病毒抗原、或抗细毒素菌抗原、或抗人CD抗原特异性的人源化单克隆抗体，是按常规法制备腹水或细胞培养法制备人源化单克隆抗体；
本发明得主要优点是：①所操作的DNA分子小，其大小不足百K，操作简单，技术难度小；②因为所操作的DNA分子小，重组正确率高，很少引起结构变化而影响抗体表达；③敲入人Ig基因的恒定区，而不包括人Ig基因的可变区，所以不影响抗体表达时Ig基因的可变区的基因重排模式，更容易获得高亲和力抗体人-鼠嵌合抗体，这样可以在保持小鼠的遗传稳定性的同时，使抗体得到人源化。④所制备的人源化抗体针对肿瘤抗原、或病毒抗原、或细菌毒素抗原、或人CD抗原具有特异性。
【具体实施方式】
实施例1：
帝恩生物技术工程公司利用基因工程技术和转基因技术，建立能产生人IgG1重链-κ轻链的小鼠作为研制单克隆抗体平台，其步骤如下：
第一步，从129sv小鼠的基因组DNA文库中克隆小鼠的Igκ链和IgG1链基因组基因。
第二步，基因敲入载体的构建
①轻链载体——以小鼠k链基因组基因片段为同源区，将完整的人Igk基因片段插入小鼠的Igk基因位点，使得小鼠k基因5’端的一小段编码区被缺失，以在插入人k基因的同时保证灭活小鼠k基因，人k基因下游插入正筛选基因neo(neomycinphosphotransferase)表达单位，在3’同源区下游插入负筛选基因白喉毒素A单位(DTA)表达单位，5’和3’同源区的大小分别为6kb和8kb，使得同源重组能以满意的效率发生；②重链载体——在人分泌型Igg1基因的下游插入小鼠Igm的膜外显子，再在下游插入正筛选基因表达单位，将构建的这一片段插入小鼠的Igm基因编码区靠近5’端处，使得插入这一基因片段的同时完全灭活小鼠的Igm基因，3’同源区下游插入负筛选标志，5’和3’同源区大小分别是5kb和7kb；
第三步，在ES细胞中进行同源重组
培养小鼠ES细胞系E14，用电穿孔法分别将构建的基因敲入载体转染入ES细胞中，在G418存在下进行培养和筛选，约一星期后，将在G418筛选下存活的细胞克隆挑取出来，扩增培养后一部分冻存，一部分用来提取基因组DNA，用限制酶消化后进行Southern杂交，将发生同源重组的克隆扩增后，再次用Southern杂交确定其基因型，然后冻存；
第四步，嵌合小鼠的产生
交配C57BL/6小鼠，在交配后4.5天时从妊娠的小鼠子宫收集囊胚，将Southern杂交证明有同源重组发生的ES细胞克隆扩增后，通过显微注射，注射入C57BL/6小鼠的囊胚腔中，再将囊胚移植到假孕的ICR小鼠的子宫中，出生的小鼠根据眼的颜色和毛色判断嵌合程度；
第五步，小鼠交配
取嵌合程度高的小鼠与C57BL/6小鼠交配，在出生的小鼠中取黄褐色的小鼠，取尾巴提取基因组DNA进行Southern杂交，确定敲入的基因的种系传递(germlinetransmission)，将轻链小鼠与重链小鼠进一步交配，得到轻链和重链基因位点上都是敲入的基因的小鼠；
第六步，用常规方法制备人源化单克隆抗体；
第七步，产生人IgG1重链-κ轻链的小鼠品系的鉴定
目的：鉴定产生人IgG1重链-κ轻链的小鼠品系是否建立成功。
基因敲入小鼠的B细胞分化发育的观察：
(1)取小鼠骨髓细胞，用流式细胞仪(FACS)分析pro-B、pre-B和未成熟B细胞的分化状态。
(2)分析小鼠脾脏的组织学结构，与野生型小鼠进行比较。分离脾脏B细胞，用FACS分析B细胞表面标志，与野生型进行比较。用抗人免疫球蛋白刺激小鼠脾脏B细胞，观察其增殖及凋亡反应。
(3)酶联免疫吸附实验(ELISA)用分析小鼠血清Ig的水平和类别。
检测结果表明，基因敲入小鼠的B细胞分化发育与野生型小鼠无明显差异。
乙型肝炎表面抗原(HBSAg)蛋白免疫嵌合抗体小鼠，用ELISA观察血清中抗HBSAg抗体的滴度变化和类别变化。结果基因敲入小鼠与野生型小鼠血清中HBSAg抗体的滴度均可达到10-7，抗体类别均IgG1为主。其中基因敲入小鼠所产生的IgG1类抗体的恒定区经鉴定，人类的IgG1类抗体的恒定区相同。表明基因敲入小鼠完全成功。
实施例2：
帝恩生物技术工程公司用能产生人IgG1重链-κ轻链的小鼠作为制备抗肿瘤单克隆抗体的应用。
细胞发生转化时，经常伴随着细胞膜表面糖脂或糖蛋白糖链的改变。sTn(NeuAcα2→6GalNAcα1→O-Ser/Thr)是一种二糖结构，可表达于各种腺癌组织，而在正常组织中则很少或不表达。免疫制备抗糖抗原sTn的单克隆抗体mAb，目的在于检验产生人IgG1重链-κ轻链的小鼠品系在制备抗肿瘤单克隆抗体方面的可行性，并为建立检测sTn的方法以其作为靶向抗体进行导向治疗提供试剂，其具体步骤如下：
第一步，所采用的抗原免疫鼠及相关材料
抗原免疫动物为产生人IgG1重链-κ轻链的小鼠品系，小鼠骨髓瘤细胞系X63Ag8.653。14例结肠直肠癌组织、10例乳腺癌组织由临床病理科提供。所有标本均经100mL/L福尔马林固定、脱水、常规石蜡包埋，切片后，进行免疫组织化学染色。抗sTn标准抗体(anti-TAG72)，购自美国Neomarker公司；
第二步，取免疫鼠脾脏与骨髓瘤细胞进行融合、克隆化、培养
以肿瘤抗原为免疫原免疫转基因鼠后，取其脾细胞与X63Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞的融合、克隆化，扩大培养及制备腹水均按常规方法；
第三步，筛选产生抗肿瘤抗原特异性抗原的人源化的单克隆抗体的杂交瘤细胞系
经反复筛选、3次克隆化后，获得抗糖抗原sTn杂交瘤细胞3株，分别命名为2B10，3F5和3H2；
第四步，按常规的方法，制备产生抗肿瘤特异性抗原的人源化单克隆抗体；
第五步，对mAb特性的鉴定与分析
①效价测定：杂交瘤细胞培养上清及其诱生的腹水中mAb的效价测定采用间接ELISA法；②IgG类别鉴定：采用琼脂双向扩散实验；③表位分析：采用硫酸铵沉淀法及DEAE52层析法纯化的腹水mAb标记HRP，做间接ELISA，检测抗sTn标准抗体(anti-TAG72)及所制备的mAb对酶标记抗体的封闭情况；效价测定：3株mAb的腹水效价分别为10-6、10-5、10-6；细胞培养上清的效价分别为1∶128，1∶64和1∶128。IgG类别鉴定：3株mAb均为IgG1，κ轻链。
肿瘤组织的免疫组化染色 以mAb3H2作为一抗，对10例乳腺癌组织及14例结肠直肠癌组织进行了免疫组化染色，阳性者分别为5例和12例。染色部位位于肿瘤细胞的胞浆和胞膜。部分正常结肠粘膜可见有局限于腺管内的轻度染色。乳腺癌组织中sTn的表达阳性率为50％(5/10)，结肠直肠癌组织中为86％(12/14)。
肿瘤组织中sTn表达的检测：采用免疫组织化学染色法。石蜡切片常规脱蜡至水，PBS振洗，加30mL/LH2O2作用20min，阻断内源性过氧化物酶。继用100mL/L羊血清封闭30min后，加入mAb(培养上清)，以anti-TAG72抗体作为阳性对照、PBS作为阴性对照，4℃孵育过夜，PBS振洗，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(室温40min)，同上振洗后，以DAB显色、苏木精衬染，脱水、透明、封片，光镜观察。肿瘤细胞染色＞5％者判为阳性。
本发明制备的抗sTnmAb4F10具有较强的肿瘤特异性且对肿瘤组织中sTn的检出率较高，有望试用于临床体内诊断与治疗；也可用其纯化相应的抗原，制备肿瘤疫苗，以及筛选和建立表达sTn的细胞系，研究sTn在肿瘤发生、发展中的生物学意义等。
实施例3：
帝恩生物技术工程公司利用产生人IgG1重链-κ轻链的小鼠品系在制备抗乙型肝炎病毒单克隆抗体中的应用。
乙型肝炎病毒是目前危害非常严重的一种传染病，抗乙型肝炎表面抗原的抗体对人体抵抗乙型肝炎病毒的感染具有保护作用。本发明研制人源抗乙型肝炎表面抗原的单克隆抗体将为用产生人IgG1重链-κ轻链的小鼠品系在制备抗病毒人源化单克隆抗体，应用于人体治疗提供基础。其方法步骤如下：
第一步，采用能产生人IgG1重链-κ轻链抗原免疫鼠
取乙型肝炎表面抗原(HBSAg)蛋白免疫嵌合抗体小鼠，用EIISA观察血清中抗HBSAg抗体的滴度变化和类别变化，结果基因敲入小鼠与野生型小鼠血清中HBSAg抗体的滴度均可达到10-5，抗体类别均IgG1为主；
第二步，取免疫小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞系X63Ag8.653融合、克隆化、培养；
第三步，筛选产生抗乙型肝炎病毒特异性抗原的人源化单克隆抗体杂交瘤细胞系；
第四步，按常规方法，制备抗乙型肝炎病毒特异性抗原的人源化单克隆抗体；
第五步，鉴定与结果分析
选择抗体滴度高的细胞进行克隆化，进一步对所产生的单克隆抗体进行鉴定。对所获得的26株抗HBSAg单克隆抗体鉴定结果表明，有18株单克隆抗体的重链属于人IgG1，在这18株单克隆抗体中的17株轻链是人k链。该结果为进一步进行临床试验提供了基础。筛选能在G418存在下生存的融合细胞，用ELISA检测其分泌人-鼠嵌合抗HBSAg抗体的能力。结果融合率达到70％，产生抗HBSAg抗体的阳性率为28％。这一结果说明利用产生人IgG1重链-κ轻链的小鼠品系在制备抗病毒单克隆抗体中的应用是成功的。
实施例4：
帝恩生物技术工程公司利用产生人IgG1重链-κ轻链的小鼠品系在制备抗人CD抗原单克隆抗体中的应用。
抗人CD抗原、单克隆抗体在临床上具有抗移植排斥、抑制血液病发展、控制自身免疫性疾病发展等广泛的应用。
人白细胞因子5(hIL5)人源化单克隆抗体制备步骤如下：
第一步，采用的抗原免疫产生入IgG1重链-κ轻链品系的小鼠及相关材料采用能产生人IgG1重链-κ轻链抗原免疫鼠，
抗原采用：hIL5(人淋巴细胞因子5抗原)
第二步，取免疫小鼠脾细胞与骨髓细胞进行融合、克隆化、培养mAb的制备采用脾内加腹腔免疫，按常规方法融合、筛选及克隆化；
第三步，筛选产生抗人CD抗原特异性的人源化单克隆抗体杂交瘤细胞系TF1细胞密度的选择收集处于对数生长期的TF1细胞，洗涤3次后，用含10％FCS的RPMI-1640调整细胞数为1.6×1010/L，经倍比稀释后加于96孔培养板，每孔100μL，每个稀释度设3个复孔；每孔再加入10μg/LhIL□5标准品。37□CO2孵箱中培养60h后，每孔加入20μlMTT液置CO2孵箱中培养4h～6h；每孔加入100μl裂解液过夜，于酶标仪(BIO-RAD)上测定A570nm的光吸收值，选出最适细胞生长密度；
第四步，按常规方法制备抗人CD抗原特异性的人源化单克隆抗体；
第五步，鉴定和结果分析
hIL5浓度的选择将不同稀释度的hIL5标准品加于96孔培养板，每个稀释度设3个复孔，再每孔加100μl2×109/L细胞密度的TF1细胞悬液，同上进行MTT比色测定，选出hIL5的最适工作浓度。
mAb对TF1细胞增殖的抑制作用将最适TF1细胞悬液及最适hIL5工作液，加于96孔培养板，每孔再加入不同稀释度的7株抗hIL5mAb腹水(每孔20μl)；同时设hIL5和培养基对照，同法进行MTT比色测定，并计算mAb对TF1细胞增殖的抑制率。
mAb的制备以人工合成的19肽为免疫原，进行脾内和腹腔基础免疫，经融合、筛选及克隆化，得到5株抗hIL5mAb的杂交瘤细胞(3D6，2H10，3E12，和3D4)。将7株杂交瘤细胞连续培养2月余，分泌mAb的特性不变，并可在小鼠体内诱生出mAb腹水。
抗hIL5mAb对TF1细胞增殖的抑制作用，5株mAb中有3株的阻断抑制率超过50％，分别为81.3％，67.8％和57.1％
IL5主要由T淋巴细胞产生。我们制备抗hIL5的mAb。经细胞融合获得7株对hIL□5具有结合活性的mAb，其中有5株mAb具有抑制TF1细胞增殖的活性，表明这些mAb具有较好的特异性，为进一步应用打下了良好的基础。
实施例5：
帝恩生物技术工程公司利用产生人IgG1重链-κ轻链的小鼠品系在制备细菌毒素单克隆抗体中的应用。
α毒素是A型产气荚膜梭菌所致严重创伤性气性坏疽的主要致死因素，至今尚无有效的防治方法，使用抗生素和多价抗毒素效果不明显。为此，本发明采用细胞融合技术，制备了抗α毒素的单克隆抗体(mAb)，为治疗气性坏疽患者的α毒素中毒提供可能性。
具体步骤是：
第一步，采用能产生人IgG1重链-κ轻链抗原免疫鼠
α毒素抗原系重组菌株BL21的表达产物，进行提取；
第二步，取该鼠的脾脏与骨髓细胞融合，克隆化、培养
抗α毒素mAb的制备动物免疫、细胞融合筛选、克隆化及腹水制备，均为常规方法；
第三步，筛选抗细菌毒素抗原特异性的人源化单克隆抗体的杂交瘤细胞系；
第四步，按常规方法，制备抗细菌毒素抗原特异性抗原的人源化单克隆抗体；
第五步，鉴定和结果分析
1、抗α毒素mAb的制备免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合率为63.19％，抗体阳性率为30.63％。经克隆化后，共获得3株阳性克隆细胞株，分别命名为1A8，2C3和3D2；
2、mAb的效价测定3株杂交瘤细胞的培养上清和腹水，用间接ELISA检测，效价分别为1∶512～1024及106～108；
3、mAb的Ig亚类鉴定用双扩法进行鉴定mAb的Ig亚类均为IgG1，3株的轻链均为κ型；
4、mAb的中和活性测定将腹水与等量的α毒素混合，于37□作用1h后，分别接种于卵黄琼脂平板和血液琼脂平板上，观察有无分解卵磷脂和溶血环的现象；mAb的保护试验取8周龄Balb/c小鼠，随机分为4组，每组5只，分别腹腔注入1个LD100的α毒素。然后在0h，4h和8h经腹腔注入抗α毒素的mAb1A8，1C3或1F1，同时设生理盐水对照组，连续1周观察各组小鼠的死亡情况。结果，1A8mAb在体内、体外均具有保护活性，体内保护率达80％以上。
α毒素是A型产气荚膜梭菌最主要的毒力因子，能引起人类创伤的气性坏疽。为探索有效的治疗方法，我们在克隆成功α毒素保护性抗原基因的基础上，研制出抗α毒素的mAb。其中mAb1A8具有抵抗致死性α毒素腹腔攻击小鼠的保护作用。可为临床上试用于治疗α毒素中毒提供新的途径。