一种神经坏死病毒重组蛋白疫苗及其编码序列和用途 【技术领域】
本发明涉及一种神经坏死病毒重组蛋白疫苗、编码该重组蛋白的核苷酸序列，以及该重组蛋白在制备鱼用抗神经坏死病毒疫苗制品中的应用。
背景技术
石斑鱼是驰名世界的名贵海产鱼类之一，销售市场稳定、价格昂贵。近年来石斑鱼养殖密度增高，病害日益严重。其中，病毒性神经坏死病(viral nervous necrosis，VNN)是严重危害鱼苗的重大病害之一，可造成重大的经济损失，甚至使育苗生产被迫停止。广东省大亚湾水产试验中心1999年开始进行斜带石斑鱼人工育苗试验，2000年育苗期间暴发病毒性神经坏死病，仅五月份第一批种苗生产中，死亡斜带石斑鱼仔鱼达600万尾，直接经济损失达200多万元。2001-2002年育苗期间此病再次发生，鱼苗死亡率达90％以上。
鱼类病毒性神经坏死病(viral nervous necrosis，VNN)是由诺达病毒科(Nodaviridae)的β诺达病毒属(Betanodaviruses)的种类感染而致的一种传染病，海水鱼类的仔稚鱼易受感染，感染死亡率高达90％以上，甚至100％。目前，除非洲以外，其他各大洲均有海水鱼类受到该病毒感染的相关报道。受感染的鱼类多，已报道过的患病毒性神经坏死病的海水鱼类达40余种。诺达病毒科包括两个属：β诺达病毒属和α诺达病毒属(alphanodaviruses)，β诺达病毒属主要感染鱼类，而α诺达病毒属主要感染昆虫。诺达病毒是一类个体细小、呈二十面体、无囊膜病毒，病毒基因组由两条单链的正链RNA组成，两条RNA的5’端都有帽子结构，3’端没有poly(A)尾。小片断RNA2大小通常为1.3-1.4kb，编码主衣壳蛋白(MCP)的前体蛋白；大片断RNA1大小为3.0-3.2kb，编码蛋白A，蛋白A是病毒的依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)地组成单位。
患神经坏死病的鱼常出现游泳不协调、螺旋状游泳、瞎眼、体色异常、食欲下降、生长缓慢等现象。目前对此病毒病还没有特效药物可以治疗。要减少和防止VNN的发生，首先是选择健康、无病毒亲鱼、鱼卵、鱼苗进行育苗生产和养殖；其次是加强管理，做好各项消毒工作；另外，研制成本低、效价高的抗病毒疫苗将是防治该病的最有效方法之一。众多的研究资料表明，鱼类虽是一类低等的脊椎动物，但它仍有较完善的免疫系统，真骨鱼类的头肾、肾、脾、胸腺、消化道的淋巴组织、血液和淋巴是产生免疫应答的主要器官和组织。更大量的试验证明，鱼类具有类似哺乳动物的T淋巴细胞和B淋巴细胞。因此，从理论上说，应用疫苗对鱼类传染性疾病进行免疫预防是可行的。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种神经坏死病毒重组蛋白疫苗及其编码序列，以及该重组蛋白疫苗在制备鱼用抗神经坏死病毒疫苗制品中的应用。
本发明通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆了斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白基因的cDNA。通过DNA重组技术和原核表达方法获得了含有神经坏死病毒主衣壳蛋白基因编码的多肽的重组蛋白。经试验证明，该重组蛋白用于免疫鱼类，能有效提高鱼体对神经坏死病毒的抵抗力，是一种抗神经坏死病毒的重组蛋白疫苗，可用于制备鱼类抗神经坏死病毒的重组蛋白疫苗制品。
本发明的神经坏死病毒重组蛋白疫苗，是含有序列表序列<400>2的氨基酸序列(即重组的神经坏死病毒主衣壳蛋白基因编码的多肽)的重组蛋白。通常是通过原核表达方法获得的含有序列表序列<400>2所示氨基酸序列的融合蛋白；特别是具有序列表序列<400>5所示氨基酸序列的融合蛋白。
本发明还提供编码上述重组蛋白疫苗的多核苷酸。该多核苷酸是含有序列表序列<400>1的核苷酸序列或其互补序列(序列表序列<400>3)；特别是序列表序列<400>4的核苷酸序列或其互补序列(序列表序列<400>6)。
本发明还提供一种重组表达载体，它含有上述编码本发明重组蛋白疫苗的多核苷酸。该表达载体可以是在原核表达载体(例如pET32a(+))的多酶切位点插入序列表序列<400>1的核苷酸序列而构建成的表达质粒。
本发明还提供一种含有上述的重组表达载体的宿主细胞(重组工程菌)。它可以通过将上述的重组表达载体转化宿主细胞(例如大肠杆菌)而得到。
经试验证明，用上述本发明的重组蛋白疫苗免疫鱼类，能有效提高鱼体抵抗神经坏死病毒的能力，预防神经坏死病毒病的爆发。因此，该重组蛋白疫苗可用于制备鱼用抗神经坏死病毒疫苗制品。
本发明的重组蛋白疫苗可通过以下方法之一制备：
1.根据所述神经坏死病毒主衣壳蛋白基因的核苷酸序列(序列表序列<400>1的多核苷酸，GenBank序列号：AF534998)设计一对特异性引物，用反转录-聚合酶链式发应(RT-PCR)扩增出所需的神经坏死病毒主衣壳蛋白基因序列(即序列表序列<400>1的多核苷酸)。然后，将该核苷酸序列重组到表达载体(例如pET32a)，并将重组后的载体转化宿主细胞(例如大肠杆菌)，进行重组表达，提取表达产物。
2.根据所述神经坏死病毒主衣壳蛋白基因的核苷酸序列(序列表序列<400>1的多核苷酸)，用化学方法合成核苷酸序列，并在5’和3’端加上限制性酶切位点；然后，将该核苷酸序列重组到表达载体(例如pET32a)，并将重组后的载体转化宿主细胞(例如大肠杆菌)，进行重组表达，提取表达产物。
3.根据序列表序列<400>5的氨基酸序列，通过化学方法合成得到所需的重组蛋白疫苗。
本发明的重组蛋白疫苗及其核苷酸序列还具有下列用途：
1.在水产养殖中的应用：该重组蛋白疫苗可制备成疫苗制品，通过注射、添加于饲料等方法，用来免疫鱼类，预防神经坏死病毒病的发生。
2.该重组蛋白疫苗可以免疫动物，制备多克隆抗体。该抗体可以中和神经坏死病毒，用于预防和治疗鱼类神经坏死病毒病。也可以通过免疫组织化学的方法检测鱼体组织中病毒感染情况。
3.可以以该重组蛋白疫苗为抗原建立ELISA检测方法，用于检测鱼体血液中抗神经坏死病毒抗体效价，以此判断鱼体受到该病毒感然情况。
4.根据序列表序列<400>1或其互补序列的多核苷酸不同区段设计特异性引物，可直接通过RT-PCR检测其它水产动物受神经坏死病毒的感染情况。也可以将RT-PCR扩增的序列<400>1或其互补序列的多核苷酸的部分片断进行标记，再用Southern blot、Northern blot、基因芯片、微阵列、原位杂交、原位PCR等技术，检测动物受神经坏死病毒感染情况。
【附图说明】
图1是斜带石斑神经坏死病毒主衣壳蛋白基因的PCR扩增结果；其中：1.PCR产物；M.DNA标准分子量。
图2是重组质粒的Sac I+Hind III双酶切鉴定结果；其中：M.DNA标准分子量；1.pET32a(+)表达载体的双酶切；2-3.pET32a-MCP重组表达载体的双酶切。
图3是重组质粒PCR鉴定结果；其中：1.DNA标准分子量；2-4PCR扩增产物。
图4是重组菌BL21/pET32a-MCP诱导表达后总蛋白的SDS-PAGE和Western-blot分析结果；其中：1-3.重组菌总蛋白的Western-blot分析(箭头示表达的重组蛋白带)；4-6.重组菌总蛋白的SDS-PAGE分析：4.重组菌BL21/pET32a-MCP经IPTG诱导表达后的总蛋白；5.阴性对照；6.蛋白质标准分子量。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例一：斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白基因cDNA的获取
本发明人根据已测定的斜带石斑鱼神经坏死病毒基因组序列，设计了一对特异性引物，用于扩增该病毒主衣壳蛋白基因。以斜带石斑鱼神经坏死病毒RNA为模板，，将其反转录成第一链cDNA，用特异性引物扩增出双链cDNA。
1.第一链cDNA的合成
以斜带石斑鱼神经坏死病毒RNA(GenBank序列号：AF534998)为模板。先将RNA模板在95℃水浴中变性5min，取出，迅速放置冰上备用。取0.2ml离心管，依次加入下列试剂：
5×buffer 2μl
DTT 1μl
10mmol/l dNTP 1μl
20pmol/l 6bp随机引物 1μl
Rnase抑制剂 0.2μl
M-MLV反转录酶 0.5μl
RNA模板 1μl
加DEPC处理水至总体积10μl，37℃恒温水浴反应50-60min，95℃水浴5min终止反应，-20℃保存。
所述的斜带石斑鱼神经坏死病毒RNA也可以通过如下方法得到：取患神经坏死病毒病的斜带石斑鱼的脑组织，用Trizol Blue(上海博采生物公司)提取RNA。
2.引物的设计
根据编码病毒主衣壳蛋白基因(序列表序列<400>1的多核苷酸)的起始位点AUG至终止位点UAA设计一对引物，引物序列如下：
上游引物F1：5’-TCGAGCTCATGGTACGCAAAGGT-3’
下游引物R1：5’-GCCCAAGCTTTAGTTTTCCGAGTC-3’
引物间距约1017bp，其中F1和R1的5’端的TC和GCCC均为加入的保护性碱基，并分别加入了Sac I和Hind III酶切识别序列。引物可由上海基康生物技术公司合成。
3.PCR扩增
扩增反应总体积为50μl，其中模板第一链cDNA(GenBank序列号：AF534998)1μl，100mmol/LdNTPs 1μl，20pmol/L的F1、R1引物各1μl，10×PCR buffer(含Mg2+)5μl，pfu酶0.5μl。循环参数为：95℃ 5min，94℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 120s，35个循环后72℃延伸10min。扩增产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)，从图1中可见，PCR产物与预计的目的cDNA分子量大小相符，表明扩增出了目的cDNA。该cDNA即为斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白的基因cDNA，其核苷酸序列如序列表序列<400>1所示。
实施例二：斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白基因重组表达质粒pET32a-MCP的构建
1.cDNA与表达载体的连接
用Sac I和Hind III将实施例一得到的cDNA和原核表达质粒pET32a(+)分别进行双酶切，再用琼脂糖胶分别进行回收。回收的产物进行连接反应，得到含有神经坏死病毒主衣壳蛋白编码序列(序列表序列<400>1的核苷酸序列)的重组表达载体，命名为pET32a-MCP。该质粒pET32a-MCP实际上含有序列表序列<400>4的核苷酸序列。
连接反应体系如下：
cDNA 2μl
pET32a 6μl
10×连接缓冲液 1μl
T4DNA连接酶 1μl
将以上试剂依次加入0.5ml离心管，混合均匀，4℃反应过夜。
2.重组表达载体的扩增
(1).CaCl2法制备感受态细胞 液体或者平板保存的TG1细胞(大肠杆菌)于LA液体培养基中37℃活化过夜，次日按1％的比例再次接种于LA液体培养基中培养至对数生长期(OD值约为0.6左右)；冰浴30分钟，4℃、6000rpm离心3分钟，弃上清，每1.5ml菌液加入200μl预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬，4℃、6000rpm离心3分钟，弃上清，第二次加入200μl预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬，4℃、6000rpm离心3分钟，弃上清，再次加入100μl的CaCl2溶液轻轻吹打悬浮，置4℃，30分钟后至24小时内使用或加甘油至终浓度为10％后冻存于-80℃，两个月内使用。
(2).转化 取连接产物(重组表达载体pET32a-MCP)5μl与感受态细胞100μl混合，冰浴30分钟后42℃热击90秒，迅速冰浴5分钟。加入SOC液体培养基800μl，37℃ 120-180rpm缓慢振摇培养1小时或37℃水浴培养1小时。取100μl均匀涂布LA平板，待液体被平板完全吸收后，于37℃倒置培养12-16小时。
3.重组表达载体pET32a-MCP的鉴定
双酶切鉴定 用碱裂解法提取质粒DNA，用Sac I+Hind III限制性内切酶进行双酶切，取适量酶切反应液和DNA Marker共同进行琼脂糖凝胶电泳(图2)，pET32a(+)载体长5.9kb，重组质粒pET32a-MCP经Sac I和Hind III双酶切后，得到大小约为1kb和6kb的两个片断与预期结果一致，表明目的cDNA序列(如序列表序列<400>1所示)重组到pET32a(+)表达载体上。
PCR鉴定 用碱裂解法提取质粒DNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增的条件和反应体系按照实施例一中3的方法进行。反应结束后，取适量进行琼脂糖凝胶电泳(图3)，从图中可见，PCR产物与预计的目的cDNA分子量大小相符，表明重组质粒pET32a-MCP含有目的cDNA序列(如序列表序列<400>1所示)。
4.重组表达载体pET32a-MCP的序列测定与分析
用质粒提取试剂盒(上海基康生物工程公司)提取经酶切鉴定和PCR鉴定的质粒DNA，利用pET32a(+)载体两端的T7通用引物进行正反向测序(测序反应由上海基康生物工程公司完成)。测序结果用DNAstar、BLAST等生物软件进行分析。经分析确认斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白基因的cDNA序列(如序列表序列<400>1所示)重组到pET32a(+)表达载体上。
实施例三：重组表达载体pET32a-MCP在大肠杆菌中的表达
将重组表达载体pET32a-MCP的质粒DNA，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，次日挑取转化平板上长出的单菌落，即为含pET32a-MCP质粒DNA的原核重组菌，命名为BL21/pET32a-MCP。挑取转化平板上长出的单菌落于LA液体培养基中37℃活化过夜，次日按照1％的比例转接于新鲜的LA液体培养基中，培养至OD600约为0.8左右时，加入100mmol/L IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养2-3小时。收集菌体，经SDS-PAGE分析(图4)，重组菌比空载体菌多出一条分子量约为55.3kD的带，而且含量较多。进一步经Western-blot鉴定(图4)，该条带能特异性的与抗狼鲈神经坏死病毒单克隆抗体发生反应，证实了分子量约为55.3kD带的蛋白即为含有神经坏死病毒主衣壳蛋白基因编码的多肽的重组蛋白。其氨基酸序列如序列表序列<400>5所示。
实施例四：斜带石斑鱼神经坏死病毒重组蛋白疫苗的制备及其作为疫苗的应用
诱导重组菌BL21/pET32a-MCP表达，离心收集菌体，加入细菌裂解缓冲液(50mmol/lTris.Cl，pH8.0；2mmol/l EDTA)重悬。加入50mg/ml溶菌酶贮存液至终浓度为100μg/ml，室温下搅拌15-20分钟后，冰浴上超声破碎至溶液不再粘稠。12000g，4℃离心15分钟，收集沉淀。加入含0.1％Triton X-100洗涤缓冲液(50mmol/l Tri.Cl，pH8.0；2mmol/l EDTA)使沉淀完全溶解，12000g，4℃，离心15分钟，弃上清。在沉淀中加入1×PBS使完全溶解，12000g，4℃，离心15分钟，弃上清，再用1×PBS按上述方法洗涤沉淀一次，离心收集沉淀，沉淀中60％以上为重组蛋白(其氨基酸序列如序列表序列<400>5所示)。在所得沉淀中加入1×PBS使之完全溶解，即为重组蛋白疫苗溶液，取10μl进行SDS-PAGE分析，其余-20℃冻存备用。
可将重组蛋白疫苗溶液直接腹腔注射或肌肉注射免疫鱼体，或者在重组蛋白疫苗溶液中加入植物油制备成油包水乳剂注射免疫鱼体，剂量按每公斤鱼体重注射1-10mg重组蛋白疫苗，隔7-15天注射一次，共注射2-3次。免疫后相对存活率可达40％或以上，相对保护率达55.6％或以上。
实施例五：神经坏死病毒重组蛋白疫苗的免疫保护作用
取健康斜带石斑_鱼36尾(平均体重11.25±0.37g/尾)，分成2组(A1、A2)，A1腹腔注射0.1ml(约含50-100μg重组蛋白疫苗)的重组蛋白疫苗溶液，A2腹腔注射同样剂量的阴性菌液。首次免疫15天后，进行第二次免疫，方法和剂量同第一次。第二次免疫7天后进行第三次免疫，方法和剂量同第一次。第三次免疫7天后攻毒，按300μl/尾的量将制备好的病毒液从鱼的靠近尾部的背鳍两侧肌肉注入鱼体内，每侧注射150μl。结果如表1所示。
表1用重组蛋白疫苗免疫斜带石斑鱼试验结果
组名 个体 死亡数 累积死 相对存活率％ 发病非 发病率％ 相对保护率％
总数 亡率％ 死亡个体
A1 18 3 16.7 40 1 22.2 55.6
A2 18 5 27.8 - 4 50 -
【序列表】
<110>中山大学
<120>一种神经坏死病毒重组蛋白疫苗及其编码序列和用途
<160>6
<210>1
<211>1017
<212>cDNA
<213>斜带石斑鱼神经坏死病毒(Epinephelus coioids nervous necrosis virus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1017)
<400>1
atg gta cgc aaa ggt gag aag aaa ttg gca aaa ccc gcg acc acc aag 48
Met Val Arg Lys Gly Glu Lys Lys Leu Ala Arg Pro Ala Thr Thr Arg
1 5 10 15
gcc gcg aat ccg caa ccc cgc cga cgt gct aac aat cgt cgg cgt agt 96
Ala Ala Asn Pro Gln Pro Arg Arg Arg Ala Asn Asn Arg Arg Arg Ser
20 25 30
aat cgc act gac gca cct gtg tct aag gcc tcg act gtg act gga ttt 144
Asn Arg Thr Asp Ala Pro Val Ser Lys Ala Ser Thr Val Thr Gly Phe
35 40 45
gga cgt ggg acc aat gac gtc cat ctc tca ggt atg tcg aga atc tcc 192
Gly Arg Gly Thr Asn Asp Val His Leu Ser Gly Met Ser Arg Ile Ser
50 55 60
cag gcc gtc ctc cca gcc ggg aca gga act gac gga tac gtt gtc gtt 240
Gln Ala Val Leu Pro Ala Gly Thr Gly Thr Asp Gly Tyr Val Val Val
65 70 75 80
gac gca acc atc gtc ccc gac ctc ctg cca cga ctg gga cac gct gct 288
Asp Ala Thr Ile Val Pro Asp Leu Leu Pro Arg Leu Gly His Ala Ala
85 90 95
aga atc ttc cag cga tac gct gtt gaa aca ctg gag ttt gaa att cag 336
Arg Ile Phe Gln Arg Tyr Ala Val Glu Thr Leu Glu Phe Glu Ile Gln
100 105 110
cca atg tgc ccc gca aac acg ggc ggt ggt tac gtt gct ggc ttc ctg 384
Pro Met Cys Pro Ala Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Val Ala Gly Phe Leu
115 120 125
cct gat cca act gac aac gac cac acc ttc gac gcg ctt caa gca act 422
Pro Asp Pro Thr Asp Asn Asn His Thr Phe Asp Ala Leu Gln Ala Thr
130 135 140
cgt ggt gca gtc gtt gcc aaa tgg tgg gaa agc aga aca gtc cga cct 480
Arg Gly Ala Val Val Ala Lys Trp Trp Glu Ser Arg Thr Val Arg Pro
145 150 155 160
cag tac acc cgc acg ctc ctc tgg acc tcg tcg gga aag gag cag cgt 528
Gln Tyr Thr Arg Thr Leu Leu Trp Thr Ser Ser Gly Lys Glu Gln Arg
165 170 175
ctc acg tca cct ggt cgg ctg ata ctc ctg tgt gtc ggc aac aac act 576
Leu Thr Ser Pro Gly Arg Leu Ile Leu Leu Cys Val Gly Asn Asn Thr
180 185 190
gat gtg gtc aac gtg tca gtg ctg tgt cgc tgg agt gtt cga ctg agc 624
Asp Val Val Asn Val Ser Val Leu Cys Arg Trp Ser Val Arg Leu Ser
195 200 205
gtt cca tct ctt gag aca cct gaa gag acc acc gct ccc atc atg aca 672
Val Pro Ser Leu Glu Thr Pro Glu Glu Thr Thr Ala Pro Ile Met The
210 215 220
caa ggt tcc ctg tac aac gat tcc ctt tcc aca aat gac ttc aag tcc 720
Gln Gly Ser Leu Tyr Asn Asp Ser Leu Ser Thr Asn Asp Phe Lys Ser
225 230 235 240
atc ctc cta gga tcc aca cca ctg gat att gcc cct gat gga gca gtc 768
Ile Leu Leu Gly Ser Thr Pro Leu Asp Ile Ala Pro Asp Gly Ala Val
245 250 255
ttc cag ctg gac cgt ccg ctg tcc att gac tac agc ctt gga act gga 816
Phe Gln Leu Asp Arg Pro Leu Ser Ile Asp Tyr Ser Leu Gly Thr Gly
260 265 270
gat gtt gac cgt gct gtt tat tgg cac ctc aag aag ttt gct gga aat 864
Asp Val Asp Arg Ala Val Tyr Trp His Leu Lys Lys Phe Ala Gly Ash
275 280 285
gct ggc aca cct gca ggc tgg ttt cgc tgg ggc atc tgg gac aac ttc 912
Ala Gly Thr Pro Ala Gly Trp Phe Arg Trp Gly Ile Trp Asp Asn Phe
290 295 300
aac aag acg ttc aca gat ggc gtt gcc tac tac tct gat gag cag ccc 960
Asn Lys Thr Phe Thr Asp Gly Val Ala Tyr Tyr Ser Asp Glu Gln Pro
305 310 315 320
cgt caa atc ctg ctg cct gtt ggc act gtc tgc acc agg gtt gac tcg 1008
Arg Gln Ile Leu Leu Pro Val Gly Thr Val Cys Thr Arg Val Asp Ser
325 330 335
gaa aac taa 1017
Glu Asn ***
<210>2
<211>338
<212>PRT
<213>斜带石斑鱼神经坏死病毒(Epinephelus coioids nervous necrosis virus)
<400>2
Met Val Arg Lys Gly Glu Lys Lys Leu Ala Arg Pro Ala Thr Thr Arg
1 5 10 15
Ala Ala Asn Pro Gln Pro Arg Arg Arg Ala Asn Asn Arg Arg Arg Ser
20 25 30
Asn Arg Thr Asp Ala Pro Val Ser Lys Ala Ser Thr Val Thr Gly Phe
35 40 45
Gly Arg Gly Thr Asn Asp Val His Leu Ser Gly Met Ser Arg Ile Ser
50 55 60
Gln Ala Val Leu Pro Ala Gly Thr Gly Thr Asp Gly Tyr Val Val Val
65 70 75 80
Asp Ala Thr Ile Val Pro Asp Leu Leu Pro Arg Leu Gly His Ala Ala
85 90 95
Arg Ile Phe Gln Arg Tyr Ala Val Glu Thr Leu Glu Phe Glu Ile Gln
100 105 110
Pro Met Cys Pro Ala Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Val Ala Gly Phe Leu
115 120 125
Pro Asp Pro Thr Asp Asn Asn His Thr Phe Asp Ala Leu Gln Ala Thr
130 135 140
Arg Gly Ala Val Val Ala Lys Trp Trp Glu Ser Arg Thr Val Arg Pro
145 150 155 160
Gln Tyr Thr Arg Thr Leu Leu Trp Thr Ser Ser Gly Lys Glu Gln Arg
165 170 175
Leu Thr Ser Pro Gly Arg Leu Ile Leu Leu Cys Val Gly Asn Asn Thr
180 185 190
Asp Val Val Asn Val Ser Val Leu Cys Arg Trp Ser Val Arg Leu Ser
195 200 205
Val Pro Ser Leu Glu Thr Pro Glu Glu Thr Thr Ala Pro Ile Met The
210 215 220
Gln Gly Ser Leu Tyr Asn Asp Ser Leu Ser Thr Asn Asp Phe Lys Ser
225 230 235 240
Ile Leu Leu Gly Ser Thr Pro Leu Asp Ile Ala Pro Asp Gly Ala Val
245 250 255
Phe Gln Leu Asp Arg Pro Leu Ser Ile Asp Tyr Ser Leu Gly Thr Gly
260 265 270
Asp Val Asp Arg Ala Val Tyr Trp His Leu Lys Lys Phe Ala Gly Asn
275 280 285
Ala Gly Thr Pro Ala Gly Trp Phe Arg Trp Gly Ile Trp Asp Asn Phe
290 295 300
Asn Lys Thr Phe Thr Asp Gly Val Ala Tyr Tyr Ser Asp Glu Gln Pro
305 310 315 320
Arg Gln Ile Leu Leu Pro Val Gly Thr Val Cys Thr Arg Val Asp Ser
325 330 335
Glu Asn ***
<210>3
<211>1017
<212>cDNA
<213>斜带石斑鱼神经坏死病毒(Epinephelus coioids nervous necrosis virus)
<400>3
ttagttttcc gagtcaaccc tggtgcagac agtgccaaca ggcagcagga tttgacgggg 60
ctgctcatca gagtagtagg caacgccatc tgtgaacgtc ttgttgaagt tgtcccagat 120
gccccagcga aaccagcctg caggtgtgcc agcatttcca gcaaacttct tgaggtgcca 180
ataaacagca cggtcaacat ctccagttcc aaggctgtag tcaatggaca gcggacggtc 240
cagctggaag actgctccat caggggcaat atccagtggt gtggatccta ggaggatgga 300
cttgaagtca tttgtggaaa gggaatcgtt gtacagggaa ccttgtgtca tgatgggagc 360
ggtggtctct tcaggtgtct caagagatgg aacgctcagt cgaacactcc agcgacacag 420
cactgacacg ttgaccacat cagtgttgtt gccgacacac aggagtatca gccgaccagg 480
tgacgtgaga cgctgctcct ttcccgacga ggtccagagg agcgtgcggg tgtactgagg 540
tcggactgtt ctgctttccc accatttggc aacgactgca ccacgagttg cttgaagcgc 600
gtcgaaggtg tggtcgttgt cagttggatc aggcaggaag ccagcaacgt aaccaccgcc 660
cgtgtttgcg gggcacattg gctgaatttc aaactccagt gtttcaacag cgtatcgctg 720
gaagattcta gcagcgtgtc ccagtcgtgg caggaggtcg gggacgatgg ttgcgtcaac 780
gacaacgtat ccgtcagttc ctgtcccggc tgggaggacg gcctgggaga ttctcgacat 840
acctgagaga tggacgtcat tggtcccacg tccaaatcca gtcacagtcg aggccttaga 900
cacaggtgcg tcagtgcgat tactacgccg acgattgtta gcacgtcggc ggggttgcgg 960
attcgcggcc ttggtggtcg cgggttttgc caatttcttc tcacctttgc gtaccat 1017
<210>4
<211>1524
<212>cDNA
<213>斜带石斑鱼神经坏死病毒(Epinephelus coioids nervous necrosis virus)和pET32a(+)表达载体
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1524)
<400>4
atg agc gat aaa att att cac ctg act gac gac agt ttt gac acg gat 48
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp The Asp
-170 -165 -160
gta ctc aaa gcg gac ggg gcg atc ctc gtc gat ttc tgg gca gag tgg 96
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
-155 -150 -145
tgc ggt ccg tgc aaa atg atc gcc ccg att ctg gat gaa atc gct gac 144
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
-140 -135 -130
gaa tat cag ggc aaa ctg acc gtt gca aaa ctg aac atc gat caa aac 192
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
-125 -120 -115 -110
cct ggc act gcg ccg aaa tat ggc atc cgt ggt atc ccg act ctg ctg 240
Pro Gly Thr Ala Pro Asp Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
-105 -100 -95 -90
ctg ttc aaa aac ggt gaa gtg gcg gca acc aaa gtg ggt gca ctg tct 288
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
-85 -80 -75
aaa ggt cag ttg aaa gag ttc ctc gac gct aac ctg gcc ggt tct ggt 336
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
-70 -65 -60
tct ggc cat atg cac cat cat cat cat cat tct tct ggt ctg gtg cca 384
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
-55 -50 -45
cgc ggt tct ggt atg aaa gaa acc gct gct gct aaa ttc gaa cgc cag 432
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
-40 -35 -30
cac atg gac agc cca gat ctg ggt acc gac gac gac gac aag gcc atg 480
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met
-25 -20 -15 -10
gct gat atc gga tcc gaa ttc gag ctc atg gta cgc aaa ggt gag aag 528
Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Glu Leu Met Val Arg Lys Gly Glu Lys
-5 -1 1 5
aaa ttg gca aaa ccc gcg acc acc aag gcc gcg aat ccg caa ccc cgc 576
Lys Leu Ala Arg Pro Ala Thr Thr Arg Ala Ala Asn Pro Gln Pro Arg
10 15 20
cga cgt gct aac aat cgt cgg cgt agt aat cgc act gac gca cct gtg 624
Arg Arg Ala Asn Asn Arg Arg Arg Ser Asn Arg Thr Asp Ala Pro Val
25 30 35
tct aag gcc tcg act gtg act gga ttt gga cgt ggg acc aat gac gtc 672
Ser Lys Ala Ser Thr Val Thr Gly Phe Gly Arg Gly Thr Asn Asp Val
40 45 50 55
cat ctc tca ggt atg tcg aga atc tcc cag gcc gtc ctc cca gcc ggg 720
His Leu Ser Gly Met Ser Arg Ile Ser Gln Ala Val Leu Pro Ala Gly
60 65 70
aca gga act gac gga tac gtt gtc gtt gac gca acc atc gtc ccc gac 768
Thr Gly Thr Asp Gly Tyr Val Val Val Asp Ala Thr Ile Val Pro Asp
75 80 85
ctc ctg cca cga ctg gga cac gct gct aga atc ttc cag cga tac gct 816
Leu Leu Pro Arg Leu Gly His Ala Ala Arg Ile Phe Gln Arg Tyr Ala
90 95 100
gtt gaa aca ctg gag ttt gaa att cag cca atg tgc ccc gca aac acg 864
Val Glu Thr Leu Glu Phe Glu Ile Gln Pro Met Cys Pro Ala Asn Thr
105 110 115
ggc ggt ggt tac gtt gct ggc ttc ctg cct gat cca act gac aac gac 912
Gly Gly Gly Tyr Val Ala Gly Phe Leu Pro Asp Pro Thr Asp Asn Asn
120 125 130 135
cac acc ttc gac gcg ctt caa gca act cgt ggt gca gtc gtt gcc aaa 960
His Thr Phe Asp Ala Leu Gln Ala Thr Arg Gly Ala Val Val Ala Lys
140 145 150
tgg tgg gaa agc aga aca gtc cga cct cag tac acc cgc acg ctc ctc 1008
Trp Trp Glu Ser Arg Thr Val Arg Pro Gln Tyr Thr Arg Thr Leu Leu
155 160 165
tgg acc tcg tcg gga aag gag cag cgt ctc acg tca cct ggt cgg ctg 1056
Trp Thr Ser Ser Gly Lys Glu Gln Arg Leu Thr Ser Pro Gly Arg Leu
170 175 180
ata ctc ctg tgt gtc ggc aac aac act gat gtg gtc aac gtg tca gtg 1104
Ile Leu Leu Cys Val Gly Asn Asn Thr Asp Val Val Asn Val Ser Val
185 190 195
ctg tgt cgc tgg agt gtt cga ctg agc gtt cca tct ctt gag aca cct 1152
Leu Cys Arg Trp Ser Val Arg Leu Ser Val Pro Ser Leu Glu Thr Pro
200 205 210 215
gaa gag acc acc gct ccc atc atg aca caa ggt tcc ctg tac aac gat 1200
Glu Glu Thr Thr Ala Pro Ile Met The Gln Gly Ser Leu Tyr Asn Asp
220 225 230
tcc ctt tcc aca aat gac ttc aag tcc atc ctc cta gga tcc aca cca 1248
Ser Leu Ser Thr Asn Asp Phe Lys Ser Ile Leu Leu Gly Ser Thr Pro
235 240 245
ctg gat att gcc cct gat gga gca gtc ttc cag ctg gac cgt ccg ctg 1296
Leu Asp Ile Ala Pro Asp Gly Ala Val Phe Gln Leu Asp Arg Pro Leu
250 255 260
tcc att gac tac agc ctt gga act gga gat gtt gac cgt gct gtt tat 1344
Ser Ile Asp Tyr Ser Leu Gly Thr Gly Asp Val Asp Arg Ala Val Tyr
265 270 275
tgg cac ctc aag aag ttt gct gga aat gct ggc aca cct gca ggc tgg 1392
Trp His Leu Lys Lys Phe Ala Gly Asn Ala Gly Thr Pro Ala Gly Trp
280 285 290 295
ttt cgc tgg ggc atc tgg gac aac ttc aac aag acg ttc aca gat ggc 1440
Phe Arg Trp Gly Ile Trp Asp Asn Phe Asn Lys Thr Phe Thr Asp Gly
300 305 310
gtt gcc tac tac tct gat gag cag ccc cgt caa atc ctg ctg cct gtt 1488
Val Ala Tyr Tyr Ser Asp Glu Gln Pro Arg Gln Ile Leu Leu Pro Val
315 320 325
ggc act gtc tgc acc agg gtt gac tcg gaa aac taa 1524
Gly Thr Val Cys Thr Arg Val Asp Ser Glu Asn ***
330 335
<210>5
<211>512
<212>PRT
<213>斜带石斑鱼神经坏死病毒(Epinephelus coioids nervous necrosis virus)和pET32a(+)表达载体
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Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp The Asp
-170 -165 -160
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
-155 -150 -145
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
-140 -135 -130
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
-125 -120 -115 -110
Pro Gly Thr Ala Pro Asp Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
-105 -100 -95 -90
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
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Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
-70 -65 -60
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
-55 -50 -45
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
-40 -35 -30
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met
-25 -20 -15 -10
Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Glu Leu Met Val Arg Lys Gly Glu Lys
-5 -1 1 5
Lys Leu Ala Arg Pro Ala Thr Thr Arg Ala Ala Asn Pro Gln Pro Arg
10 15 20
Arg Arg Ala Asn Asn Arg Arg Arg Ser Asn Arg Thr Asp Ala Pro Val
25 30 35
Ser Lys Ala Ser Thr Val Thr Gly Phe Gly Arg Gly Thr Asn Asp Val
40 45 50 55
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Ser Leu Ser Thr Asn Asp Phe Lys Ser Ile Leu Leu Gly Ser Thr Pro
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300 305 310
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<213>斜带石斑鱼神经坏死病毒(Epinephelus coioids nervous necrosis virus)和pET32a(+)表达载体
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ttagttttcc gagtcaaccc tggtgcagac agtgccaaca ggcagcagga tttgacgggg 60
ctgctcatca gagtagtagg caacgccatc tgtgaacgtc ttgttgaagt tgtcccagat 120
gccccagcga aaccagcctg caggtgtgcc agcatttcca gcaaacttct tgaggtgcca 180
ataaacagca cggtcaacat ctccagttcc aaggctgtag tcaatggaca gcggacggtc 240
cagctggaag actgctccat caggggcaat atccagtggt gtggatccta ggaggatgga 300
cttgaagtca tttgtggaaa gggaatcgtt gtacagggaa ccttgtgtca tgatgggagc 360
ggtggtctct tcaggtgtct caagagatgg aacgctcagt cgaacactcc agcgacacag 420
cactgacacg ttgaccacat cagtgttgtt gccgacacac aggagtatca gccgaccagg 480
tgacgtgaga cgctgctcct ttcccgacga ggtccagagg agcgtgcggg tgtactgagg 540
tcggactgtt ctgctttccc accatttggc aacgactgca ccacgagttg cttgaagcgc 600
gtcgaaggtg tggtcgttgt cagttggatc aggcaggaag ccagcaacgt aaccaccgcc 660
cgtgtttgcg gggcacattg gctgaatttc aaactccagt gtttcaacag cgtatcgctg 720
gaagattcta gcagcgtgtc ccagtcgtgg caggaggtcg gggacgatgg ttgcgtcaac 780
gacaacgtat ccgtcagttc ctgtcccggc tgggaggacg gcctgggaga ttctcgacat 840
acctgagaga tggacgtcat tggtcccacg tccaaatcca gtcacagtcg aggccttaga 900
cacaggtgcg tcagtgcgat tactacgccg acgattgtta gcacgtcggc ggggttgcgg 960
attcgcggcc ttggtggtcg cgggttttgc caatttcttc tcacctttgc gtaccatgag 1020
ctcgaattcg gatccgatat cagccatggc cttgtcgtcg tcgtcggtac ccagatctgg 1080
gctgtccatg tgctggcgtt cgaatttagc agcagcggtt tctttcatac cagaaccgcg 1140
tggcaccaga ccagaagaat gatgatgatg atggtgcata tggccagaac cagaaccggc 1200
caggttagcg tcgaggaact ctttcaactg acctttagac agtgcaccca ctttggttgc 1260
cgccacttca ccgtttttga acagcagcag agtcgggata ccacggatgc catatttcgg 1320
cgcagtgcca gggttttgat cgatgttcag ttttgcaacg gtcagtttgc cctgatattc 1380
gtcagcgatt tcatccagaa tcggggcgat cattttgcac ggaccgcacc actctgccca 1440
gaaatcgacg aggatcgccc cgtccgcttt gagtacatcc gtgtcaaaac tgtcgtcagt 1500
caggtgaata attttatcgc tcat 1524