从人间质干细胞制备造血干细胞的方法 【所属技术领域】
本发明涉及一种能够将骨髓间质干细胞诱导分化为造血干/祖细胞的方法。
【背景技术】
造血干细胞移植对白血病、肿瘤及许多遗传病已被证实是非常有效的治疗方法。目前供体来源困难是造血干细胞移植广泛开展的“瓶颈”之一。骨髓间质干细胞容易获得，分离、培养和扩增技术比较简易，实验证实骨髓间质干细胞的组织相容性抗原(包括I类和II类抗原)以及辅助刺激系统抗原(CD80和CD86)表达很低，甚至不表达，不同品系大鼠之间间质干细胞移植存活三个月，也未发现排斥现象，表明在治疗应用时，不仅可用自身间质干细胞，也可以使用不同个体的间质干细胞。如果能找出方法诱导间质干细胞分化为造血干细胞，可以应用于临床以部分或全部代替骨髓移植或脐血移植过程中的造血干细胞数量不足，但目前为止国内外还没有报告能够证实间质干细胞能够分化为造血干/祖细胞。其原因可能是骨髓间质干细胞与骨髓造血干细胞相比，是更早期更原始的干细胞，故必须找到合适的方法，通过信号转递和基因调控启动向造血干/祖细胞分化。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种能够将骨髓间质干细胞诱导分化为造血干/祖细胞的方法。
本发明的目的是这样实现的：该从人间质干细胞制备造血干细胞的方法包括以下步骤：
(1)提供没有造血干/祖细胞污染地人间质干细胞；
(2)提供胎肝条件培养液；
(3)将人间质干细胞培养于胎肝条件培养液7～14天，人间质干细胞诱导分化为造血干/祖细胞。
本发明用胎肝条件培养液诱导间质干细胞分化为造血干/祖细胞，将会部分或全部代替现行的骨髓移植或脐血移植的造血干细胞数量不足，加上间质干细胞免疫原性低，导致的移植后免疫反应弱甚至没有，将会给为造血干细胞移植治疗带来巨大的改观。另外间质干细胞配合骨髓或脐血移植时具有降低移植物抗宿主反应，促进干细胞定居骨髓，促进细胞免疫功能和血小板恢复的作用。间质干细胞的临床应用将部分或全部代替现在的骨髓或脐血移植，同时提高造血干细胞移植的成功率，降低合并症，将给病人和社会带来巨大效益。
【附图说明】
图1至图12是人骨髓间质干细胞表面标志鉴定；
图13和图14是FLSC～CM诱导7天后悬浮细胞瑞氏染色；
图15是小鼠胚胎成纤维细胞饲养单层诱导组；
图16是IL～6和SCF联合诱导组；
图17是空白对照组；
图18是FLSC～C诱导组；
图19是hMSCs(P5)经甲基纤维素半固体培养24小时后的“葵花样”集落；
图20是hMSCs经FLSC～CM诱导7天后，取悬浮细胞进行甲基纤维素半固体培养14天的集落形态(200×)；
图21是PE～人CD34阳性细胞(200×)及其放大图(400×)；
图22 FITC～人CD45阳性细胞(200×)及其放大图(400×)；
图23是CTX处理组小鼠移植后第4、6、8W骨髓、外周血和脾的FCM；
图24是脾石蜡组织切片H&E(40×)的对照组(CTX)，其中脾组织结构紊乱，缺乏脾小体；
图25是脾石蜡组织切片H&E(40×)的移植组(CTX+hMSCT)；
图26是人CD34阳性细胞的移植组6W(CTX+hMSCT)；
图27是人CD45阳性细胞的移植组6W(CTX+hMSCT)；
图28是脾石蜡组织切片H&E(100×)的对照组(TBI)，其中脾小体结构可见；
图29是脾石蜡组织切片H&E(100×)的移植组6～8W(TBI+/hMSCT)，其中脾组织结构紊乱，缺乏脾小体；
图30是骨髓组织切片H&E(200×)的对照组(TBI)；
图31是骨髓组织切片H&E(200×)的移植组(TBI+/hMSCT)，其中骨髓增生活跃，造血组织占40～60％，可见各期幼稚造血细胞；
图32是移植组8周肝组织可见一群骨髓样细胞(200×)；
图33是移植组8周肝组织可见一群骨髓样细胞(400×)；
图34是移植组8周小鼠骨髓细胞涂片。显示早期幼稚细胞，核大而圆形，有的可见核仁，胞浆少并显嗜碱性。
【具体实施方式】
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明的从人间质干细胞制备造血干细胞的方法包括以下步骤：
1、没有造血干/祖细胞污染的人间质干细胞的准备。取手术切除的病人骨髓，经密度梯度分离出单个核细胞，用10％胎牛血清DMEM～LG培养液于5％CO2环境中培养、传代，取传代5～10代细胞作实验用，细胞表型分析，膜抗原CD11a，CD14，CD34，CD38，CD45，CD80，CD86为阴性，而CD29，CD44，CD90，CD105，CD166阳性，证实是间质干细胞，而没有造血干/祖细胞污染，核型分析为正二倍体核型，成瘤性证实无瘤生长(参阅图1-18)。
2、胎肝条件培养液的制备。胎肝条件培养液的制备方法如下：取受孕12.5～14.5天的胎鼠肝脏，用胰酶消化，离心冲洗，按0.5～1×106/ml，培养液为10％胎牛血清的DMEM～LG，培养24小时，收集上清即为胎肝条件培养液。
3、将骨髓间质干细胞诱导分化为造血干/祖细胞。人间质干细胞以1×106/ml密度培养于胎肝条件培养液7～14天后，取出细胞进行各种鉴定检测及体内重建造血实验。
请参阅图19-22，检测结果细胞形态从长梭形变为圆形或类圆形单个核细胞，类似于单核细胞或小淋巴细胞，双色荧光标记检测抗人CD34和CD45阳性，表明已出现人造血干细胞和白细胞，CFU～GM检测每培养孔出现3～5个集落，表明已诱导分化为造血干/祖细胞。对照组使用造血因子组合或间质细胞作饲养层(后二者对骨髓造血干细胞起作用)则未见任何造血干/祖细胞出现。
重建小鼠造血功能的体内实验：NOD/SCID小鼠用亚致死量照射(60Cor3.5～4Gy全身照射)，建立造血衰竭模型，90％小鼠在20天内死于造血衰竭，而输入人间质干细胞(6～8×105细胞/只)小鼠全部存活超过60天，移植后60天检测在小鼠外周血、骨髓和脾均出现人源性CD34+和CD45+细胞尤以脾脏更为明显(髓外造血为主)，说明间质干细胞在体内微环境诱导下同样能够出现人的造血干/祖细胞，表明间质干细胞确实能向造血干/祖细胞分化的潜能(参阅图23-34)。
上述结果表明人间质干细胞确实能够分化为造血干/祖细胞而胎肝条件培养液是诱导间质干细胞分化为造血干/祖细胞的好方法。本发明的关键创新点是根据①造血个体发育经历卵黄囊造血，胎肝造血，在妊娠晚期为骨髓造血，②间质干细胞比骨髓造血干细胞更原始，可能相当于胎肝造血时期的干细胞，故选用胎肝细胞条件培养液启动间质干细胞向造血干细胞分化，结果获得成功。
尽管本发明是参照具体实施例来描述，但这种描述并不意味着对本发明构成限制。参照本发明的描述，所公开的实施例的其他变形，对于本领域技术人员都是可以预料的。因此，这样的变形不会脱离所属权利要求限定的范围及精神。