用于治疗缺血组织的SDF1递送.pdf

治疗对象心肌病的方法包括向对象心肌组织弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域直接给予或在其中局部表达有效引起下列参数中至少一种的功能性改善的SDF-1量：左心室容积、左心室面积、左心室维度、心脏功能、6分钟步行测试或纽约心脏协会(NYHA)功能分级。

权利要求书
1.  治疗对象心肌病的方法，包括：
向所述对象心肌组织弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域直接给予或在其中局部表达有效引起下列参数中至少一种的功能性改善的SDF-1量：左心室容积、左心室面积、左心室维度、心脏功能、6分钟步行测试或纽约心脏协会(NYHA)功能分级。

2.  权利要求1所述的方法，所述给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1量有效引起左心室收缩末期容积、左心室射血分数、室壁运动评分指数、左心室舒张末期长度、左心室收缩末期长度、左心室舒张末期面积、左心室收缩末期面积或左心室舒张末期容积的功能性改善。

3.  权利要求2所述的方法，其中所述给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的
SDF-1量有效改善左心室收缩末期容积。

4.  权利要求2所述的方法，其中所述给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的
SDF-1量有效改善左心室射血分数。

5.  权利要求3所述的方法，其中所述给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的
SDF-1量有效改善左心室收缩末期容积至少约10％。

6.  权利要求4所述的方法，其中所述给予弱化的的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的
SDF-1量有效改善左心室射血分数至少约10％。

7.  权利要求1所述的方法，其中所述给予弱化的的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的
SDF-1量有效改善6分钟步行距离至少约30米或改善NYHA分级至少1级。

8.  权利要求1所述的方法，其中所述给予弱化的的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1量有效改善左心室收缩末期容积至少约10％，改善左心室射血分数至少约10％，改善室壁运动评分指数约5％，改善6分钟步行距离至少约30米或改善NYHA分级至少1级。

9.  权利要求8所述的方法，其中所述给予弱化的的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1量有效改善左心室收缩末期容积至少约10％，改善左心室射血分数至少约10％，改善室壁运动评分指数约5％，改善6分钟步行距离至少约30米和改善NYHA分级至少1级。

10.  权利要求1所述的方法，其中所述给予弱化的的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1量有效明显改善所述弱化的、缺血性和/或梗塞周边的区域的血管生成。

11.  权利要求10所述的方法，其中所述给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1量基于血管密度或通过心肌灌注成像测量有效增加血管生成至少20％，并且改善总静止分数、总应激分数和/或总差异分数至少约10％。

12.  权利要求1所述的方法，其中所述SDF-1通过将包含SDF-1表达质粒DNA的溶液注入所述弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域和由所述弱化的、缺血性和/或梗塞周边的区域表达SDF-1进行给予。

13.  权利要求12所述的方法，其中所述SDF-1以有效改善左心室收缩末期容积的量由所述弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域表达。

14.  权利要求12所述的方法，其中所述SDF-1质粒以所述溶液的多次注射被给予所述弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域，每次注射包含约0.33mg/ml至约5mg/ml的SDF-1质粒/溶液。

15.  权利要求14所述的方法，其中每次注射具有至少约0.2ml的体积。

16.  权利要求15所述的方法，其中所述SDF-1质粒以至少约10次注射被给予所述弱化
的、缺血性的和/或梗塞周边的区域。

17.  权利要求16所述的方法，其中所述给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的
SDF-1质粒量为约4mg以上。

18.  权利要求16所述的方法，其中所述给予弱化的的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1质粒的溶液体积为至少约10ml。

19.  权利要求12所述的方法，其中所述SDF-1质粒以所述溶液的至少10次注射被给予所述弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域，每次注射包含约0.33mg/ml至约5mg/ml的SDF-1质粒/溶液，并且每次注射具有至少约0.2ml的体积。

20.  权利要求19所述的方法，其中SDF-1在所述弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域中以治疗有效量表达约3天以上。

21.  权利要求1所述的方法，其中所述对象是大型哺乳动物。

22.  权利要求21所述的方法，其中所述SDF-1质粒通过导管插入术被给予所述对象。

23.  权利要求21所述的方法，其中在给予所述SDF-1质粒前使所述对象的所述心肌组织成像以限定所述弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的面积，并且将所述SDF-1质粒给予由所述成像限定的所述弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域。

24.  权利要求23所述的方法，其中所述成像包括超声心动描记术、磁共振成像、冠状动脉造影术、电解剖标测或荧光镜透视中的至少一种。

25.  治疗大型哺乳动物心肌梗塞的方法，包括：直接给予哺乳动物的梗塞周边区域或在其中局部表达有效改善左心室收缩末期容积至少约10％的SDF-1量。

26.  权利要求25所述的方法，其中给予所述梗塞周边区域的SDF-1量有效改善左心室射血分数至少约10％。

27.  权利要求25所述的方法，其中给予所述梗塞周边区域的SDF-1量有效改善6分钟步行距离至少约30米或改善NYHA分级至少1级。

28.  权利要求25所述的方法，其中给予所述梗塞周边区域的SDF-1量有效改善左心室射血分数至少约10％，改善室壁运动评分指数约5％，改善6分钟步行距离至少约30米和改善NYHA分级至少1级。

29.  权利要求25所述的方法，其中给予所述梗塞周边区域的SDF-1量基于血管密度或通过心肌灌注成像测量有效增加梗塞心肌组织中的血管生成至少20％，并且改善总静止分数、总应激分数和/或总差异分数至少约10％。

30.  权利要求25所述的方法，其中所述SDF-1通过将包含SDF-1表达质粒DNA的溶液注入梗塞周边的区域和由所述梗塞周边区域表达SDF-1进行给予。

31.  权利要求30所述的方法，其中所述SDF-1质粒以所述溶液的多次注射被给予所述梗塞周边区域，每次注射包含约0.33mg/ml至约5mg/ml的SDF-1质粒/溶液。

32.  权利要求31所述的方法，其中每次注射具有至少约0.2ml的体积。

33.  权利要求32所述的方法，其中所述SDF-1质粒以至少约10次注射被给予所述梗塞周边区域。

34.  权利要求33所述的方法，其中所述给予所述梗塞周边区域的SDF-1质粒量为约
4mg以上。

35.  权利要求33所述的方法，其中给予所述梗塞周边区域的SDF-1质粒溶液体积为至
少约10ml。

36.  权利要求30所述的方法，其中所述SDF-1质粒以所述溶液的至少10次注射被给予所述梗塞周边区域，每次注射包含约0.33mg/ml至约5mg/ml的SDF-1质粒/溶液，并且每次注射具有至少约0.2ml的体积。

37.  权利要求30所述的方法，其中SDF-1在所述弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域中以治疗有效量表达约3天以上。

38.  权利要求30所述的方法，其中所述SDF-1质粒通过导管插入术被给予所述对象。

39.  权利要求38所述的方法，其中在给予所述SDF-1质粒前使所述对象的所述心肌组织成像以限定所述梗塞周边区域，以及所述SDF-1质粒被给予由所述成像限定的所述梗塞周边区域。

40.  权利要求39所述的方法，其中所述成像包括超声心动描记术、磁共振成像、冠状动脉造影术、电解剖标测或荧光镜透视中的至少一种。

41.  治疗大型哺乳动物心肌梗塞的方法，包括：通过导管插入术将SDF-1质粒给予哺乳动物的梗塞周边区域，SDF-1以有效引起下列参数中至少一种的功能性改善的量由所述梗塞周边的区域表达：左心室容积、左心室面积、左心室维度、心脏功能、6分钟步行测试或纽约心脏协会(NYHA)功能分级。

42.  权利要求41所述的方法，所述给予所述弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1量有效引起左心室收缩末期容积、左心室射血分数、室壁运动评分指数、左心室舒张末期长度、左心室收缩末期长度、左心室舒张末期面积、左心室收缩末期面积或左心室舒张末期容积的功能性改善。

43.  权利要求42所述的方法，其中所述给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的
SDF-1量有效改善左心室收缩末期容积。

44.  权利要求42所述的方法，其中所述给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的
SDF-1量有效改善左心室射血分数。

45.  权利要求43所述的方法，其中所述给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的
SDF-1量有效改善左心室收缩末期容积至少约10％。

46.  权利要求44所述的方法，其中所述给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的
SDF-1量有效改善左心室射血分数至少约10％。

47.  权利要求41所述的方法，其中所述给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的
SDF-1量有效改善6分钟步行距离至少约30米或改善NYHA分级至少1级。

48.  权利要求41所述的方法，其中所述给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1量有效改善左心室收缩末期容积至少约10％，改善左心室射血分数至少约10％，改善室壁运动评分指数约5％，改善6分钟步行距离至少约30米，和改善NYHA分级至少1级。

49.  权利要求41所述的方法，其中所述给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的
SDF-1量有效明显改善所述弱化的、缺血性和/或梗塞周边的区域的血管生成。

50.  权利要求49所述的方法，其中所述给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1量基于血管密度或通过心肌灌注成像测量有效增加血管生成至少20％，并且改善总静止分数、总应激分数和/或总差异分数至少约10％。

51.  权利要求41所述的方法，其中所述SDF-1通过将包含SDF-1表达质粒DNA的溶液注入所述弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域和由所述弱化的、缺血性和/或梗塞周边的区域表达SDF-1进行给予。

52.  权利要求51所述的方法，其中所述SDF-1以有效改善左心室收缩末期容积的量由所述弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域表达。

53.  权利要求51所述的方法，其中所述SDF-1质粒以所述溶液的多次注射被给予所述弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域，每次注射包含约0.33mg/ml至约5mg/ml的SDF-1质粒/溶液。

54.  权利要求53所述的方法，其中每次注射具有至少约0.2ml的体积。

55.  权利要求54所述的方法，其中所述SDF-1质粒以至少约10次注射被给予所述弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域。

56.  权利要求55所述的方法，其中所述给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的
SDF-1质粒量为约4mg以上。

57.  权利要求55所述的方法，其中所述给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的
SDF-1质粒的溶液体积为至少约10ml。

58.  权利要求51所述的方法，其中所述SDF-1质粒以所述溶液的至少10次注射被给予所述弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域，每次注射包含约0.33mg/ml至约5mg/ml的SDF-1质粒/溶液，并且每次注射具有至少约0.2ml的体积。

59.  权利要求51所述的方法，其中SDF-1在所述弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域中以治疗有效量表达约3天以上。

60.  权利要求41所述的方法，其中在给予所述SDF-1质粒前使所述对象的所述心肌组织成像以限定所述弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的面积，并且将所述SDF-1质粒给予由所述成像限定的所述弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域。

61.  权利要求60所述的方法，其中所述成像包括超声心动描记术、磁共振成像、冠状动脉造影术、电解剖标测或荧光镜透视中的至少一种。

62.  改善心肌梗塞后大型哺乳动物左心室收缩末期容积的方法，包括：通过导管插入术将包含SDF-1表达质粒DNA的溶液注入所述哺乳动物的梗塞周边区
域，SDF-1以有效引起左心室收缩末期容积的功能性改善的量由所述梗塞周边区域表达。

63.  权利要求62所述的方法，其中所述注入梗塞周边区域的SDF-1量有效改善左心室收缩末期容积至少约10％。

64.  权利要求62所述的方法，其中所述注入梗塞周边区域的SDF-1量有效改善左心室射血分数至少约10％。

65.  权利要求62所述的方法，其中所述注入梗塞周边区域的SDF-1量有效改善6分钟步行距离至少约30米或改善NYHA分级至少1级。

66.  权利要求62所述的方法，其中所述注入梗塞周边区域的SDF-1量有效改善左心室射血分数至少约10％，改善室壁运动评分指数约5％，改善6分钟步行距离至少约30米，和改善NYHA分级至少1级。

67.  权利要求62所述的方法，其中所述SDF-1质粒溶液以所述溶液的多次注射被注入所述梗塞周边的区域，每次注射包含约0.33mg/ml至约5mg/ml的SDF-1质粒/溶液。

68.  权利要求67所述的方法，其中每次注射具有至少约0.2ml的体积。

69.  权利要求68所述的方法，其中所述SDF-1质粒以至少约10次注射被给予所述梗塞周边区域。

70.  权利要求69所述的方法，其中所述给予梗塞周边区域的SDF-1质粒量为约4mg以
上。

71.  权利要求所述的方法70其中所述给予梗塞周边区域的SDF-1质粒溶液体积为至少
约10ml。

72.  权利要求62所述的方法，其中所述SDF-1质粒以所述溶液的至少10次注射被注入所述梗塞周边区域，每次注射包含约0.33mg/ml至约5mg/ml的SDF-1质粒/溶液，并且每次注射具有至少约0.2ml的体积。

73.  权利要求62所述的方法，其中在注射所述SDF-1质粒前使所述对象的所述心肌组织成像以限定所述梗塞周边区域，以及将所述SDF-1质粒注入由所述成像限定的所述梗塞周边的区域。

74.  权利要求73所述的方法，其中所述成像包括超声心动描记术、磁共振成像、冠状动脉造影术、电解剖标测或荧光镜透视中的至少一种。

说明书用于治疗缺血组织的SDF-1递送
[0001]相关申请
[0002]本申请要求享有2009年8月28日提交的美国临时申请号61/237,775和2010年
5月13日提交的美国临时申请号61/334,216的优先权，在此将其主题的全部内容引入作为参考。
发明领域
[0003]本申请涉及用于治疗心肌病的SDF-1递送方法和组合物，并涉及SDF-1递送方法和组合物对于治疗缺血性心肌病的应用。
[0004]发明背景
[0005]缺血是这样的病症：其中血流在身体的局部完全被阻塞或显著减少，导致缺氧、底物供应减少和代谢物积累。虽然缺血的程度取决于血管阻塞的急性程度(acuteness)、其持续时间、组织对其的敏感度和侧副管的发育程度，但功能异常通常发生于缺血的器官或组织中，并且长期缺血导致受影响的组织萎缩、变性、凋亡和坏死。
[0006]在缺血性心肌病——其为影响冠状动脉并引起心肌缺血的疾病——中，缺血性心肌细胞损伤的程度随冠状动脉阻塞时间的增加从可逆的细胞损进展至不可逆的细胞损害。[0007]发明概述
[0008] 本申请涉及治疗对象心肌病的方法。心肌病可包括，例如，与如下相关的心肌病：肺栓塞、静脉血栓形成、心肌梗塞、短暂性缺血发作、外周血管疾病、动脉粥样硬化和/或其他心肌损伤或血管疾病。该方法包括向对象心肌组织弱化的(weakened)、缺血性的和/或梗塞周边的区域直接给予或在其中局部表达有效引起下列参数中至少一个功能性改善的SDF-1量：左心室容积、左心室面积、左心室维度(dimension)、心脏功能、6分钟步行测试(6MWT)或纽约心脏协会(NYHA)功能分级。
[0009] 在本申请的一方面中，给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1量有效引起如下中至少一个的功能性改善：左心室收缩末期容积、左心室射血分数、室壁运动评分指数、左心室舒张末期长度、左心室收缩末期长度、左心室舒张末期面积、左心室收缩末期面积、左心室舒张末期容积、6分钟步行测试(6MWT)或纽约心脏协会(NYHA)功能分级。在本申请的另一方面中，给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1量有效改善左心室收缩末期容积。在本申请的又一方面中，给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1量有效改善左心室射血分数。
[0010]在本申请的一些方面中，给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1量有效改善左心室收缩末期容积至少约10％。在本申请的其他方面中，给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1量有效改善左心室收缩末期容积至少约15％。在本申请再进一步的方面中，给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1量有效改善左心室收缩末期容积至少约10％，改善左心室射血分数至少约10％，改善室壁运动评分指数至少约5％，改善6分钟步行距离至少约30米，和改善NYHA分级至少1级。在本申请的又一方面中，给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1量有效改善左心室射血分数至
少约10％。
[0011]在本申请的另一方面中，给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1量有效明显改善弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的血管生成至少约20％——基于血管密度或通过心肌灌注成像(例如，SPECT或PET)测量，并且总静止分数、总应激分数和/或总差异分数改善至少约10％。可通过如下给予SDF-1：将包含SDF-1表达质粒的溶液注入弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域，并且由弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域表达SDF-1。SDF-1可以有效改善左心室收缩末期容积的量由弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域表达。
[0012] 在本申请的一方面中，SDF-1质粒可以溶液的多次注射被给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域，每次注射包含约0.33mg/ml至约5mg/ml的SDF-1质粒溶液。在一个实例中，SDF-1质粒可以至少约10次注射被给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域。给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的每次注射可具有至少约0.2ml的体积。SDF-1可在弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域中表达约3天以上。
[0013]在示例性应用中，包含SDF-1表达质粒的溶液每次注射的注射体积可以是至少约
0.2ml，每次注射的SDF-1质粒浓度可以是约0.33mg/ml至约5mg/ml。在本申请的另一方面中，至少一个心脏功能参数可通过如下得到改善：将SDF-1质粒注入心脏弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域，每个位点的注射体积为至少约0.2ml，至少约10个注射位点，并且每次注射的SDF-1质粒浓度为约0.33mg/ml至约5mg/ml。
[0014]在进一步的实例中，给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的可改善至少一个心脏功能参数的SDF-1质粒的量为约4mg以上。给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的可改善至少一个心脏功能参数的SDF-1质粒溶液体积为至少约10ml。
[0015] 在本申请的另一方面中，给予SDF-1的对象可以是大型哺乳动物，如人或猪。SDF-1质粒可通过导管插入术如冠状动脉内导管插入术或心室内导管插入术被给予对象。在给予SDF-1质粒前，对象心肌组织可经成像以限定弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的面积，并且可将SDF-1质粒给予通过成像限定的弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域。成像可包括如下中的至少一种：超声心动描记术、磁共振成像、冠状动脉造影术、电解剖标测(electroanatomicalmapping)或荧光镜透视。
[0016]本申请还涉及通过向哺乳动物心肌的梗塞周边区域给予SDF-1质粒治疗大型哺乳动物心肌梗塞的方法，其通过导管插入术如冠状动脉内导管插入术或心室内导管插入术进行。通过导管插入术给予的SDF-1可由梗塞周边的区域表达，其表达量有效引起下列参数中至少一个的功能性改善：左心室容积、左心室面积、左心室维度、心脏功能、6分钟步行测试(6MWT)或纽约心脏协会(NYHA)功能分级。
[0017] 在本申请的一方面中，给予梗塞周边的区域的SDF-1量有效引起以下中至少一个的功能性改善：左心室收缩末期容积、左心室射血分数、室壁运动评分指数、左心室舒张末期长度、左心室收缩末期长度、左心室舒张末期面积、左心室收缩末期面积、左心室舒张末期容积、6分钟步行测试(6MWT)或纽约心脏协会(NYHA)功能分级。在本申请的另一方面中，给予梗塞周边的区域的SDF-1量有效改善左心室收缩末期容积。在本申请的又一方面中，给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1量有效改善左心室射血分数。[0018] 在本申请的一些方面中，给予梗塞周边的区域的SDF-1量有效改善左心室收缩末
期容积至少约10％。在本申请的其他方面中，给予梗塞周边的区域的SDF-1量有效改善左心室收缩末期容积至少约15％。在本申请再进一步的方面中，给予梗塞周边的区域的SDF-1量有效改善左心室收缩末期容积至少约10％，改善左心室射血分数至少约10％，改善室壁运动评分指数约5％，改善6分钟步行距离至少约30米或改善NYHA分级至少1级。在本申请的又一方面中，给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1量有效改善左心室射血分数至少约10％。
[0019]在本申请的另一方面中，给予梗塞周边的区域的SDF-1量有效明显改善梗塞周边区域的血管生成至少约20％——基于血管密度。
[0020]在本申请的一方面中，SDF-1质粒可以溶液的多次注射被给予弱化的、缺血性的和
/或梗塞周边的区域，每次注射包含约0.33mg/ml至约5mg/ml的SDF-1质粒/溶液。在一个实例中，SDF-1质粒可以至少约10次注射被给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的。给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的每次注射可具有至少约0.2ml的体积。SDF-1可在弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域中表达约3天以上。
[0021] 在示例性应用中，包含SDF-1表达质粒的溶液的每次注射的注射体积可以是至少约0.2ml，每次注射的SDF-1质粒浓度可以是约0.33mg/ml至约5mg/ml。在本申请的另一方面中，至少一个心脏功能参数可通过如下得到改善：将SDF-1质粒注入心脏弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域，每个位点的注射体积为至少约0.2ml，至少约10个注射位点，并且每次注射的SDF-1质粒浓度为约0.33mg/ml至约5mg/ml。
[0022]在进一步的实例中，给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的可改善至少一个心脏功能参数的SDF-1质粒量为约4mg以上。给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的可改善至少一个心脏功能参数的SDF-1质粒溶液体积为至少约10ml。
[0023] 本申请进一步涉及改善大型哺乳动物在心肌梗塞后左心室收缩末期容积的方法。该方法包括通过心室内导管插入术向哺乳动物的梗塞周边区域给予SDF-1质粒。SDF-1可由梗塞周边的区域表达，其表达量有效引起左心室收缩末期容积的功能性改善。
[0024]在本申请的一些方面中，给予梗塞周边的区域的SDF-1量有效改善左心室收缩末期容积至少约10％。在本申请的其他方面中，给予梗塞周边区域的SDF-1量有效改善左心室收缩末期容积至少约15％。在本申请再进一步的方面中，给予梗塞周边的区域的SDF-1量有效改善左心室收缩末期容积至少约10％，改善左心室射血分数至少约10％，改善室壁运动评分指数约5％，改善6分钟步行距离至少约30米或改善NYHA分级至少1级。
[0025]在本申请的一方面中，SDF-1质粒可以溶液的多次注射被给予弱化的、缺血性的和
/或梗塞周边的区域的，每次注射包含约0.33mg/ml至约5mg/ml的SDF-1质粒/溶液。在一个实例中，SDF-1质粒可以至少约10次注射被给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域。给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的每次注射可具有至少约0.2ml的体积。SDF-1可在弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域中表达约3天以上。
[0026]在示例性应用中，包含SDF-1表达质粒的溶液的每次注射的注射体积可以是至少约0.2ml，每次注射的SDF-1质粒浓度可以是约0.33mg/ml至约5mg/ml。在本申请的另一方面中，心脏的左心室收缩末期容积可通过如下改善约10％：将SDF-1质粒注入心脏弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域，每个位点的注射体积为至少约0.2ml，至少约10个注射位点，并且每次注射的SDF-1质粒浓度为约0.33mg/ml至约5mg/ml。
[0027]在进一步的实例中，给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的可改善左心室收缩末期容积的SDF-1质粒量为约4mg以上。给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的可改善心脏左心室收缩末期容积的SDF-1质粒溶液体积为至少约10ml。
[0028]附图简述
[0029]在参考附图阅读下列描述后，本申请的前述和其他特征对于本申请所涉及领域的技术人员将变得明显。
[0030]图1是示例猪模型中不同量和体积的DNA的荧光素酶表达的图；
[0031]图2是示例利用充血性心脏衰竭猪模型得到的SDF-1注射后30天不同SDF-1质粒量的左心室收缩末期容积变化百分比的图；
[0032]图3是示例利用充血性心脏衰竭猪模型得到的SDF-1注射后30天不同SDF-1质粒量的左心室射血分数变化百分比的图；
[0033]图4是示例利用充血性心脏衰竭猪模型得到的SDF-1注射后30天不同SDF-1质粒量的室壁运动评分指数变化百分比的图；
[0034]图5是示例利用充血性心脏衰竭猪模型得到的SDF-1注射后90天不同SDF-1质粒量的左心室收缩末期容积变化百分比的图；和
[0035]图6是示例利用充血性心脏衰竭猪模型得到的SDF-1注射后30天不同SDF-1质粒量的血管密度变化百分比的图。
[0036]图7是根据本申请一个方面所述的质粒载体的示意图。
[0037]图8是显示猪心脏相当一部分中质粒表达的图像。
[0038]图9是示例基线和初次注射后30天的左心室收缩末期容积的图。所有组在第30天显示相近的左心室收缩末期容积增加。对于全部数据点，N＝3。数据以平均值±SEM表示。
[0039]图10是示例基线和初次注射后30天的左心室射血分数的图。所有组显示左心室射血分数未改善。对于全部数据点，N＝3。数据以平均值±SEM表示。
[0040]详细描述
[0041]除非另外限定，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本申请所属领域技术人员通常理解的相同的含义。在本文全部公开内容中所涉及的所有专利、专利申请、公布的申请和出版物、Genbank序列、网站以及其他公开材料除非另外注明其整体均被引入作为参考。在本文术语具有多个定义的情况下，本部分的定义占据主导。除非另外限定，本文所用的所有技术术语均具有与本申请所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。分子生物学术语的通常理解的定义可在，例如，Rieger等，GlossaryofGenetics：ClassicalandMolecular，5thedition，Springer-Verlag：NewYork，1991；和Lewin，GenesV，OxfordUniversityPress：NewYork，1994中找到。
[0042] 本文描述了涉及常规分子生物学技术的方法。这些技术在本领域是周知的，并在如下方法论专著中被详细描述，如MelecularCloning：ALaboratoryManual，2nded.，vol.1-3，ed.Sambrook等，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1989；和CurrentProtocolsinMelecularBiology，ed.Ausubel等，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork，1992(定期更新)。核酸的化学合成法在例如，BeaucageandCarruthers，Tetra.Letts.22：1859-1862，1981和Matteucci等，
J.Am.Chem.Soc.103：3185，1981中被论述。核酸的化学合成可在例如商用自动化寡核苷酸合成仪中进行。免疫学方法(例如，抗原特异性抗体的制备、免疫沉淀和免疫印迹)在例如，CurrentProtocolsinImmunology，ed.Coligan等，JohnWiley&Sons，NewYork，
1991；和MethodsofImmunologicalAnalysis，ed.Masseyeff等，JohnWiley&Sons，NewYork，1992中被述及。基因转移和基因治疗的常规方法也可适用于本申请。参见，例如GeneTherapy：PrinciplesandApplications，ed.T.Blackenstein，SpringerVerlag，1999；GeneTherapyProtocols(MethodsinMolecularMedicine)，ed.P.D.Robbins，HumanaPress，1997；和Retro-vectorsforHumanGeneTherapy，ed.C.P.Hodgson，SpringerVerlag，1996。
[0043]在参考URL或其他这样的标识符或地址时，要理解的是，这样的标识符可发生改变，并且因特网上的具体信息是易变的，但通过搜索因特网可找到等同的信息。其引用证明了这种信息的可用性和公众传播性。
[0044] 如本文所用，“核酸”指包含至少两个共价连接的核苷酸或核苷酸类似物亚单元的多核苷酸。核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或DNA或RNA的类似物。核苷酸类似物可商业获得，并且制备包含这种核苷酸类似物的多核苷酸的方法是已知的(Lin等(1994)Nucl.AcidsRes.22：5220-5234；Jellinek等(1995)Biochemistry34：
11363-11372；Pagratis等(1997)NatureBiotechnol.15：68-73)。核酸可以是单链的、双链的或其混合物。对于本文的目的，除非另外说明，核酸是双链的或其从上下文看是明显的。
[0045]如本文所用，“DNA”意为包括所有类型和大小的DNA分子，包括cDNA、质粒和包括修饰核苷酸和核苷酸类似物的DNA。
[0046] 如本文所用“，核苷酸”包括核苷一磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸。核苷酸还包括修饰核苷酸，如但不限于，硫代磷酸核苷酸和脱氮杂嘌呤核苷酸以及其他核苷酸类似物。[0047] 如本文所用，术语“对象”或“患者”指大DNA分子可导入的动物。包括高等生物，如哺乳动物和鸟类，包括人类、灵长类、啮齿类、牛、猪、兔、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠、猫、狗、马、鸡等。
[0048]如本文所用“，大型哺乳动物”指具有至少10kg的一般成年体重的哺乳动物。这种大型哺乳动物可包括，例如，人类、灵长类、狗、猪、牛，并且意为不包括小型哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠和其他啮齿类。
[0049]如本文所用，“给予对象”是这样的程序：将一种或多种递送剂和/或大核酸分子一起或分别导入或施用于对象，使得对象中存在的目标细胞最终接触该剂和/或大核酸分子。
[0050]如本文所用，“递送(delivery)”，其与“转导(transduction)”交替使用，指将外源核酸分子转移至细胞中从而其位于细胞内的过程。核酸递送是与核酸表达不同的过程。[0051]如本文所用，“多克隆位点(MCS)”是质粒中包含多个限制酶位点的核酸区域，该限制酶位点中的任一个均可联合标准重组技术用于消化载体。“限制酶消化”指用仅作用于核酸分子特定位置的酶催化切割核酸分子。这些限制酶中许多可商业获得。这种酶的应用为本领域技术人员所周知。载体常利用在MCS中进行切割的限制酶被线性化或片段化(fragmented)，从而使外源序列能被连接至载体。
[0052]如本文所用，“复制起点”(常被称为“ori”)，是开始复制的特定核酸序列。可选地，如果宿主细胞是酵母，可应用自主复制序列(ARS)。
[0053]如本文所用，“可选择标记或可筛选标记”赋予细胞可识别的变化，能够容易识别包含表达载体的细胞。一般而言，可选择标记是赋予能够进行选择的性质的标记。阳性可选择标记是标记的存在能够进行其选择的标记，而阴性可选择标记是其的存在阻止其选择的标记。阳性可选择标记的实例是药物抗性标记。
[0054] 通常，包含药物选择标记有助于转化体的克隆和识别，例如，赋予新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇抗性的基因是有用的可选择标记。除赋予能够基于条件的实施区分转化体的表型的标记外，还考虑其他类型的标记，包括可筛选标记，如GFP，其基础是比色分析。可选地，可以利用可筛选酶，如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还将直到如何利用可能联合FACS分析的免疫学标记。所用的标记不被认为是重要的，只要其能同时用编码基因产物的核酸表达。可选择和可筛选标记的进一步实例对于本领域技术人员是周知的。
[0055] 术语“转染”用于指细胞摄取外源DNA。当外源DNA已被导入细胞膜内时，细胞已被“转染”。许多转染技术在本领域是周知的。参见，例如，Graham等，Virology52：456(1973)；Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual(1989)；Davis等，BasicMethods
inMolecularBiology(1986)；Chu等，Gene13：197(1981)。这些技术可用于将一个或多个外源DNA部分如核苷酸整合载体和其他核酸分子导入适当的宿主细胞中。该术语涉及化学转染程序、电转染程序和病毒介导的转染程序。
[0056] 如本文所用，“表达”指将核酸翻译成肽或转录成RNA——该RNA例如可翻译成肽、多肽或蛋白质——的过程。如果核酸源自基因组DNA，表达可以——如选择适当的真核宿主细胞或生物——包括mRNA的剪接。对于宿主细胞中要表达的异源核酸，其必须首先被递送到细胞中，然后只要进入细胞就最终位于核中。
[0057]如本文所用，″基因治疗″包括将异源DNA转移至患有治疗或诊断所针对的疾病或病症的哺乳动物——特别是人类——的细胞。DNA以这样的方式被导入所选择的目标细胞：所述方式使得异源DNA被表达，从而生成被编码的治疗产物。可选地，异源DNA可以某种方式介导编码治疗产物的DNA的表达；其可编码以某种方式直接或间接介导治疗产物表达的产物，如肽或RNA。基因治疗也可用于递送编码基因产物的核酸以替代缺陷基因或补充其所导入的哺乳动物或细胞生成的基因产物。导入的核酸可编码治疗化合物，如其生长因子抑制剂、或肿瘤坏死因子或其抑制剂，因此如哺乳动物宿主中通常不产生或不以治疗有效量或在治疗有用时间产生的受体。编码治疗产物的异源DNA可在导入患病宿主的细胞前被修饰，以便增强或另外改变产物或其表达。
[0058]如本文所用“，异源核酸序列”一般是这样的DNA：所述DNA编码其表达所在的细胞在体内通常不产生的RNA和蛋白质，或介导或编码通过影响转录、翻译或其他可调控生物化学过程改变内源DNA表达的介导物。异源核酸序列也可被称为外源DNA。任何本领域技术人员认为或考虑对其表达所在的细胞是异源或外源的DNA在此均包括在异源DNA内。异源DNA的实例包括但不限于，编码可追踪标记蛋白如赋予药物抗性的蛋白质的DNA、编码治疗有效物质如抗癌剂、酶和激素的DNA和编码其他种类蛋白质如抗体的DNA。异源DNA编码的抗体可被分泌或表达在异源DNA所导入的细胞的表面上。
[0059] 如本文所用，术语“心肌病”指任何原因引起的心肌(即，实际的心脏肌肉)功能退化。心肌病对象常处于心律失常、突发心源性死亡或心脏衰竭引发的入院或死亡的危险。[0060] 如本文所用，术语“缺血性心肌病”是由于氧输送至心肌不足引起的心肌虚弱，冠状动脉疾病是最常见的病因。
[0061]如本文所用术语“缺血性心脏病”指任何这样的病症：其中由于其血液供应缺乏或相对不足造成心肌损伤或工作低效；最常由动脉粥样硬化引起，其包括心绞痛、急性心肌梗塞、慢性缺血性心脏病和猝死。
[0062]如本文所用，术语“心肌梗塞”指心脏肌肉(心肌)的区域损伤或死亡，其由向该区域的血液供应阻塞引起。
[0063]如本文所用，术语“6分钟步行测试”或“6MWT”指测量患者6分钟时间内在平坦、坚硬的表面上可快速步行的距离(6MWD)的测试。其评价了运动(exercise)过程中涉及的所有系统的整体和综合反应，包括肺和心血管系统、全身循环、外周循环、血液、神经肌肉单元和肌肉代谢。其未提供关于运动涉及的各个不同器官和系统的功能或运动限制(exerciselimitation)机制的具体信息，这对于极量心肺运动测试是可能的。自定步速(self-paced)的6MWT评估了功能性能力的亚极量水平。(参见，例如，AMJRespirCritCareMed，Vol.166.Pp111-117(2002))
[0064]如本文所用“，纽约心脏协会(NYHA)功能分级”指对心脏衰竭程度的分级。其基于患者在身体活动过程中受限的程度将患者置于四个等级其中一个；限制/症状针对正常呼吸和呼吸短促或心绞痛的不同程度：
[0065]
[0066]
[0067]本申请涉及治疗对象心肌病的组合物和方法，该心肌病导致心肌功能降低和/或减弱。本文所述组合物和方法治疗的心肌病可包括与如下相关的心肌病：肺栓塞、静脉血栓形成、心肌梗塞、短暂性缺血发作、外周血管疾病、动脉粥样硬化、缺血性心脏病和/或其他心肌损伤或血管疾病。治疗心肌病的方法可包括向弱化心肌组织、缺血性心肌组织和/或凋亡心肌组织——如心肌梗塞后向心脏梗塞周边的区域——局部给予(或局部递送)有效引起下列参数中至少一个的功能性改善的量的间质细胞衍生因子-1(SDF-1)：左心室容积、左心室面积、左心室维度、心脏功能、6分钟步行测试(6MWT)或纽约心脏协会(NYHA)功能分级。
[0068]利用模拟人类心脏衰竭的猪心脏衰竭模型发现，缺血性心肌组织的功能性改善取决于给予缺血性心肌组织的SDF-1的量(amount)、剂量(dose)和/或递送，并且给予缺血性心肌组织的SDF-1的量、剂量和/或递送可被优化以使心肌功能参数如左心室容积、左
心室面积、左心室维度或心脏功能明显改善。如下文所述，在一些方面中，给予缺血性心肌组织的SDF-l的量、浓度和体积可被控制和/或优化，从而明显改善功能参数(例如，左心室容积、左心室面积、左心室维度、心脏功能、6分钟步行测试(6MWT)和/或纽约心脏协会(NYHA)功能分级)，同时减轻有害副作用。
[0069] 在一个实例中，SDF-1可被直接或局部给予大型哺乳动物(例如，猪或人类)心肌组织的弱化区域、缺血区域和/或梗塞周边区域，所述大型哺乳动物的心脏功能参数，如左心室容积、左心室面积、左心室维度或心脏功能，由于缺血性心肌病如心肌梗塞而退化或恶化。功能参数的退化或恶化可包括，例如，左心室收缩末期容积增加、左心室射血分数减少、室壁运动评分指数增加、左心室舒张末期长度增加、左心室收缩末期长度增加、左心室舒张末期面积(例如，二尖瓣水平和乳头肌插入水平)增加、左心室收缩末期面积(例如，二尖瓣水平和乳头肌插入水平)增加或左心室舒张末期容积增加，如利用例如超声心动描记术所测。
[0070]在本申请的一方面中，给予大型哺乳动物心肌组织弱化区域、缺血区域和/或梗塞周边区域的SDF-1量可以是有效改善至少一个心肌功能参数的量，如左心室收缩末期容积减少、左心室射血分数增加、室壁运动评分指数减少、左心室舒张末期长度减少、左心室收缩末期长度减少、左心室舒张末期面积(例如，二尖瓣水平和乳头肌插入水平)减少、左心室收缩末期面积(例如，二尖瓣水平和乳头肌插入水平)减少或左心室舒张末期容积减少，如利用例如超声心动描记术所测；也可以是有效改善对象6分钟步行测试(6MWT)或纽约心脏协会(NYHA)功能分级的量。
[0071]在本申请的另一方面中，给予患有心肌病的大型哺乳动物心肌组织弱化区域、缺血区域和/或梗塞周边区域的SDF-1量在给予后30天后有效改善哺乳动物的左心室收缩末期容积至少约10％，更具体而言至少约15％，如通过超声心动描记术所测。改善百分比相对于各治疗对象，并且基于在治疗性干预或治疗前或者治疗性干预或治疗时测量的各个参数。
[0072]在本申请的又一方面中，给予患有心肌病的大型哺乳动物心肌组织弱化区域、缺血区域和/或梗塞周边区域的SDF-1量在给予后30天后有效改善左心室收缩末期容积至少约10％，改善左心室射血分数至少约10％，和改善室壁运动评分指数约5％，如通过超声心动描记术所测。
[0073]在本申请更进一步的方面中，给予患有心肌病的大型哺乳动物心肌组织弱化区域、缺血区域和/或梗塞周边区域的SDF-1量有效改善弱化区域、缺血区域和/或梗塞周边区域的血管生成至少20％——基于血管密度或SPECT成像所测的心脏灌注增加。血管生成
20％的改善已显示出临床意义(LosordoCirculation2002；105：2012)。
[0074]在本申请更进一步的方面中，给予患有心肌病的大型哺乳动物心肌组织弱化区域、缺血区域和/或梗塞周边区域的SDF-1量有效改善6分钟步行距离至少约30米或改善NYHA分级至少1级。
[0075]本文所述的SDF-1可在组织损伤(例如，心肌梗塞)后被给予心肌组织的弱化区域、缺血区域和/或梗塞周边区域直至SDF-1下调发生后约数小时、数天、数周或数月。向细胞给予SDF-1的时期可包括从心肌病(例如，心肌梗塞)发作后大约即刻至缺血性疾病或组织损伤发生后大约数天、数周或数月。
[0076]根据本申请所述的给予心肌组织弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1可具有基本类似于天然哺乳动物SDF-1氨基酸序列的氨基酸序列。多种不同哺乳动物SDF-1蛋白的氨基酸序列是已知的，包括人类、小鼠和大鼠。人类与大鼠的SDF-1氨基酸序列具有至少约92％同一性(例如，约97％同一性)。SDF-1可包括两种同种型，SDF-1α和SDF-1β，除非另外确定，二者均在本文中被称为SDF-1。
[0077]SDF-1可具有与SEQIDNO：1基本相同的氨基酸序列。过表达的SDF-1也可具有基本类似于前述哺乳动物SDF-1蛋白之一的氨基酸序列。例如，过表达的SDF-1可具有基本类似于SEQIDNO：2的氨基酸序列。SEQIDNO：2，其基本上包含SEQIDNO：1，是人类SDF-1的氨基酸序列，并且由GenBank登录号NP954637确定。过表达的SDF-1也可具有与SEQIDNO：3基本相同的氨基酸序列。SEQIDNO：3包含大鼠SDF的氨基酸序列，并由GenBank登录号AAF01066确定。
[0078]根据本申请所述的SDF-1也可以是哺乳动物SDF-1的变体，如哺乳动物SDF-1的片段、类似物和衍生物。这些变体包括，例如，天然SDF-1基因(即，天然存在的编码天然存在的哺乳动物SDF-1多肽的核酸)的天然存在的等位变体编码的多肽、天然SDF-1基因的可选剪接形式编码的多肽、天然SDF-1基因的同系物(homolog)或同源物(ortholog)编码的多肽以及天然SDF-1基因的非天然存在的变体编码的多肽。
[0079]SDF-1变体具有一个或多个氨基酸不同于天然SDF-1多肽的肽序列。这些变体的肽序列的特征可以是SDF-1变体一个或多个氨基酸的缺失、添加或置换。氨基酸插入优选为约1至4个连续的氨基酸，缺失优选为约1至10个连续的氨基酸。变体SDF-1多肽基本保持了天然SDF-1的功能活性。SDF-1多肽变体的实例可通过表达特征在于沉默或保守变化的核酸分子而制得。SDF-1变体的一个实例被列举在美国专利号7,405,195中，在此将其全部引入作为参考。
[0080]相应于一个或多个具体基序和/或结构域或相应于任意大小的SDF-1多肽片段均在本申请的范围内。SDF-1分离的肽基部分可通过筛选由编码这些肽的核酸的相应片段重组产生的肽得到。例如，SDF-1多肽可被任意地分成期望长度的片段，并且无片段重叠；或优选地分成期望长度的重叠片段。可将该片段重组产生并测试，从而确定那些可用作天然CXCR-4多肽激动剂的肽片段。
[0081] SDF-1多肽的变体也可包括SDF-1多肽的重组形式。一些实施方式中的重组多肽，除SDF-1多肽外，由可与编码哺乳动物SDF-1的基因的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸编码。
[0082]SDF-1变体可包括组成性表达天然SDF-1的功能活性蛋白质的对抗形式(agonisticform)。其他SDF-1变体可包括例如由于改变蛋白酶目标序列的突变而对蛋白酶剪切具有抗性的SDF-1变体。肽的氨基酸序列改变是否导致具有天然SDF-1的一种或多种功能活性的变体通过测试变体的天然SDF-1功能活性可容易地确定。
[0083] 编码SDF-1蛋白的SDF-1核酸可以是天然或非天然核酸，并且可以是RNA的形式或DNA的形式(例如，cDNA、基因组DNA和合成DNA)。DNA可以是双链或单链的，并且如果是单链的，则可以是编码(有义)链或非编码(反义)链。编码SDF-1的核酸编码序列可基本类似于SDF-1基因的核苷酸序列，如SEQIDNO：4和SEQIDNO：5所示的核苷酸序列。SEQIDNO：4和SEQIDNO：5分别包含人类SDF-1和大鼠SDF-1的核酸序列，并基本类似于
GenBank登录号NM199168和GenBank登录号AF189724的核酸序列。SDF-1的核酸编码序列也可以是不同的编码序列，其由于遗传密码的冗余或简并而编码相同的多肽，如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3。
[0084]编码SDF-1的其他核酸分子是天然SDF-1的变体，如编码天然SDF-1的片段、类似物和衍生物的那些。这些变体可以是，例如，天然SDF-1基因的天然存在的等位变体、天然SDF-1基因的同系物或同源物、或天然SDF-1基因的非天然存在的变体。这些变体具有一个或多个碱基不同于天然SDF-1基因的核苷酸序列。例如，这些变体的核苷酸序列的特征可以是天然SDF-1基因一个或多个核苷酸的缺失、添加或置换。核酸插入优选为约1至10个连续的核苷酸，缺失优选地为约1至10个连续的核苷酸。
[0085] 在其他申请中，显示结构显著改变的变体SDF-1可通过进行核苷酸置换生成，所述核苷酸置换在被编码的多肽中引起不保守的变化。这些核苷酸置换的实例是引起如下变化的那些：(a)多肽骨架结构；(b)多肽的电荷或疏水性；或(c)氨基酸侧链的大小(bulk)。一般预期产生蛋白质性质最大变化的核苷酸置换是引起密码子非保守变化的核苷酸置换。可能引起蛋白质结构主要变化的密码子变化的实例是引起如下残基置换的密码子变化：(a)亲水性残基(例如，丝氨酸或苏氨酸)置换疏水性残基(例如，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，缬氨酸或丙氨酸)(或反之)；(b)半胱氨酸或脯氨酸置换任意其他残基(或反之)；(c)具有正电性侧链的残基(例如，赖氨酸，精氨酸或组氨酸)置换负电性残基(例如，谷氨酸或天冬氨酸)(或反之)；或(d)具有巨大侧链的残基(例如，苯丙氨酸)置换不具有侧链的残基(例如，甘氨酸)(或反之)。
[0086]天然SDF-1基因的天然存在的等位变体是这样的核酸：其从哺乳动物组织分离得到，与天然SDF-1基因具有至少70％序列同一性，并且编码与天然SDF-1多肽具有结构相似性的多肽。天然SDF-1基因的同系物是这样的核酸：其从其他物种分离得到，与天然基因具有至少70％序列同一性，并且编码与天然SDF-1多肽具有结构相似性的多肽。可搜索公用和/或专用的核酸数据库以确定与天然SDF-1基因具有高序列同一性百分比(例如，70％或更高)的其他核酸分子。
[0087] 非天然存在的SDF-1基因变体是这样的核酸：其在不存在自然界中(例如，由人工制成)，与天然SDF-1基因具有至少70％序列同一性，并且编码与天然SDF-1多肽具有结构相似性的多肽。非天然存在的SDF-1基因变体的实例是编码天然SDF-1蛋白片段的那些、在严格条件下与天然SDF-1基因杂交的那些或与天然SDF-1基因的互补的那些，以及与天然SDF-1基因或天然SDF-1基因的互补基因享有至少65％序列同一性的基因。
[0088]一些实施方式中编码天然SDF-1基因片段的核酸是编码天然SDF-1氨基酸残基的核酸。编码或杂交编码天然SDF-1片段的核酸的较短寡核苷酸可被用作探针、引物或反义分子。编码或杂交编码天然SDF-1片段的核酸的较长多核苷酸也可用于本申请的多个方面中。编码天然SDF-1片段的核酸可通过酶消化(例如，利用限制酶)或化学降解全长天然SDF-1基因或其变体进行制备。
[0089]在严格条件下与前述核酸之一杂交的核酸也用于本文中。例如，这些核酸可以是在低严格条件、中等严格条件或高严格条件下与前述核酸之一杂交的核酸。
[0090]编码SDF-1融合蛋白的核酸分子也可用于一些实施方式中。这些核酸可通过制备在被导入适当的目标细胞时表达SDF-1融合蛋白的构建物(例如，表达载体)而制成。例
如，这些构建物可通过如下制成：连接编码融合在框架中的SDF-1蛋白的第一多核苷酸与编码另一蛋白质的第二多核苷酸，使得构建物在适当表达系统中的表达产生融合蛋白。[0091] 编码SDF-1的核酸可在碱基部分、糖部分或磷酸骨架被修饰，例如，以改善分子稳定性、杂交等。本文所述的核酸可另外包含其他附加的基团，如肽(例如，用于体内靶向目标细胞受体)或促进跨细胞膜运输的剂，引发杂交的切割。因此，核酸可被连接到另一分子，(例如，肽)、引发杂交的交联剂、运输剂、引发杂交的切割剂等。
[0092] SDF-1可通过如下被递送至心肌组织弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域：向弱化的，缺血性，和/或梗塞周边的区域给予SDF-1蛋白，或将引起、增加和/或上调SDF-1表达的剂(即，SDF-1剂)导入心肌组织弱化区域、缺血区域和/或梗塞周边区域的细胞中。由细胞表达的SDF-1蛋白可以是基因修饰细胞的表达产物。
[0093]引起、增加和/或上调SDF-1表达的剂可包含本文所述的被并入重组核酸构建物的天然或合成核酸，该重组核酸构建物一般为DNA构建物，能被导入心肌组织细胞中并在其中复制。这种构建物可包含复制系统和能在给定细胞中转录和翻译编码多肽的序列的序列。
[0094]将剂导入目标细胞的一种方法包括利用基因治疗。本申请的一些实施方式中基因治疗可用于由心肌组织弱化区域、缺血区域和/或梗塞周边区域的细胞体内表达SDF-1蛋白。
[0095]在本申请的一方面中，基因治疗可利用载体，该载体包含编码SDF-1蛋白的核苷酸。“载体(vector)”(有时被称为基因递送或基因转移“运载体(vehicle)”)指包含将被体外或体内递送至目标细胞的多核苷酸的大分子或分子复合物。将被递送的多核苷酸可包含基因治疗中感兴趣的编码序列。载体包括，例如，病毒载体(如腺病毒(Ad)、腺相关病毒(AAV)和逆转录病毒)、非病毒载体、脂质体和其他包含脂质的复合物以及能介导多核苷酸至目标细胞递送的其他大分子复合物。
[0096]载体也可包含进一步调控基因递送和/或基因表达或者另外向目标细胞提供有益性质的其他组分或功能。这些其他组分包括，例如，影响结合或靶向细胞的组分(包括介导细胞类型或组织特异性结合的组分)；影响细胞摄取载体核酸的组分；影响摄取后多核苷酸在细胞中定位的组分(如介导核定位的剂)；和影响多核苷酸表达的组分。这些组分也可包括标记，如可检测和/或可选择标记，其可用于检测或选择已摄入并且正在表达通过载体递送的核酸的细胞。这些组分可作为载体的天然特征(如利用具有介导结合和摄取的组分或功能的某些病毒载体)被提供，或载体可被修饰以提供这种功能。
[0097]可选择标记可以是阳性、阴性或双功能性的。阳性可选择标记对携带标记的细胞进行选择，而阴性可选择标记允许选择性去除携带标记的细胞。多种这样的标记基因已被描述，包括双功能性(即，阳性/阴性)标记(参见，例如，Lupton，S.，WO92/08796，1992年5月29日公开；和Lupton，S.，WO94/28143，1994年12月8日公开)。这些标记基因可提供可在基因治疗背景下有利的对照的附加测量。多种这样的载体在本领域已知，并且一般可用。
[0098]本文所用的载体包括病毒载体、基于脂质的载体和能将核苷酸递送至心肌组织弱化区域、缺血区域和/或梗塞周边区域的细胞的其他非病毒载体。载体可以是靶向载体，特别是优先结合心肌组织弱化区域、缺血区域和/或梗塞周边区域的细胞的靶向载体。本文
方法所用的病毒载体可包括对心肌组织弱化区域、缺血区域和/或梗塞周边区域的细胞呈低毒性并以组织特异性方式诱导治疗有用量的SDF-1蛋白生成的病毒载体。
[0099]病毒载体的实例是源自腺病毒(Ad)或腺相关病毒(AAV)的病毒载体。人类和非人类病毒载体均可用，并且重组病毒载体可在人类中具有复制缺陷。在载体是腺病毒的情况下，载体可包含具有可操作地连接于编码SDF-1蛋白的基因的启动子的多核苷酸，并在人类中具有复制缺陷。
[0100]根据本申请方法可用的其他病毒载体包括基于单纯疱疹病毒(HSV)的载体。缺失一个或多个即时早期基因(IE)的HSV载体是有利的，因为其一般无细胞毒性，在目标细胞中保持在类似于潜伏期的状态，并提供有效的目标细胞转导。重组HSV载体可并入约30kb的异源核酸。
[0101] 逆转录病毒，如C型逆转录病毒和慢病毒，也可用于本申请的一些实施方式中。例如，逆转录病毒载体可基于鼠白血病病毒(MLV)。参见，例如，Hu和Pathak，Pharmacol.Rev.52：493-511，2000以及Fong等，Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.17：1-60，2000。基于MLV的载体可包含多达8kb的异源(治疗性)DNA以取代病毒基因。异源DNA可包含组织特异性启动子和SDF-1核酸。在递送至创伤附近细胞的方法中，其也可编码组织特异性受体的配体。
[0102]其他可用的逆转录病毒载体是复制缺陷型、基于慢病毒的载体，包括基于人类免疫缺陷(HIV)的载体。参见，例如，Vigna和Naldini，J.GeneMed.5：308-316，2000以及Miyoshi等，J.Virol.72：8150-8157，1998。慢病毒载体是有利的，因为其能感染活跃分裂和非分裂的细胞。其也高效地转导人类上皮细胞。
[0103] 本文方法所用的慢病毒载体可源自人类和非人类(包括SIV)慢病毒。慢病毒载体实例包括载体增殖需要的核酸序列和可操作地连接于SDF-1基因的组织特异性启动子。这些前者(former)可包含病毒LTR、引物结合位点、多嘌呤区段(polypurinetract)、att位点和壳体化(encapsidation)位点。
[0104]慢病毒载体可被封装到任何适当的慢病毒衣壳中。一种颗粒蛋白质被来自不同病毒的另一种颗粒蛋白质的取代称为“假型化“。载体衣壳可包含来自其他病毒的病毒包膜蛋白，包括鼠白血病病毒(MLV)或小气性口炎病毒(VSV)。VSVG-蛋白的应用产生高载体滴度，并造成载体病毒粒子较高的稳定性。
[0105] 基于α病毒的载体，如由西蒙尼克(semliki)森林病毒(SFV)和辛德毕斯(sindbis)病毒(SIN)制成的载体也可用于本文中。α病毒的应用被描述于Lundstrom，K.，Intervirology43：247-257，2000以及Perri等，JournalofVirology74：9802-9807，
2000中。
[0106]重组的复制缺陷型α病毒载体是有利的，因为其能进行高水平的异源(治疗性)基因表达，并可感染许多目标细胞。α病毒复制子可通过如下靶向特定的细胞类型：在其病毒体表面上显示功能性异源配体或结合结构域，所述功能性异源配体或结合结构域将允许选择性地结合至表达同源结合伙伴的目标细胞。α病毒复制子可建立潜伏期，因此在目标细胞中建立长期的异源核酸表达。复制子也可在目标细胞中呈现短暂的异源核酸表达。[0107]在与本申请的方法相容的多种病毒载体中，多于一种启动子可被包括在载体内，从而允许多于一种异源基因被载体表达。进一步，载体可包含编码信号肽或促进SDF-1基
因产物由目标细胞表达的其他部分的序列。
[0108] 为组合两种病毒载体系统的有利性质，混合病毒载体可用于将SDF-1核酸递送至目标组织。混合载体构建的标准技术对于本领域技术人员是周知的。这些技术可以，例如，在Sambrook等，InMolecularCloning：Alaboratorymanual.ColdSpringHarbor，N.Y.或多种论述重组DNA技术的实验手册中找到。包含AAV和腺病毒ITR组合的腺病毒衣壳中双链AAV基因组可用于转导细胞。在另一种变型中，AAV载体可置于“无内容(gutless)”、“依赖辅助病毒(helper-dependent)”或“高性能(highcapacity)”的腺病毒载体中。腺病毒/AAV混合载体被述及于Lieber等，J.Virol.73：9314-9324，1999。逆转录病毒/腺病毒混合载体被述及于Zheng等，NatureBiotechnol.18：176-186，2000。腺病毒内包含的逆转录病毒基因组可整合在目标细胞基因组中，并且实现稳定的SDF-1基因表达。
[0109] 进一步考虑促进SDF-1基因表达和载体克隆的其他核苷酸序列元件。例如，启动子上游的增强子、或编码区下游的终止子的存在，例如，可以促进表达。
[0110] 根据本申请的另一方面，组织特异性启动子，可以与SDF-1基因融合。通过在腺病毒构建物中融合这种组织特异性启动子，转基因表达被限定于特定的组织。组织特异性启动子提供的基因表达效力和特异性程度可利用本文所述的重组腺病毒系统进行测定。[0111] 除基于病毒载体的方法外，非病毒方法也可用于将SDF-1核酸导入目标细胞。对非病毒基因递送方法的评述被提供于Nishikawa和Huang，HumanGeneTher.12：861-870，
2001。根据本发明的非病毒基因递送方法的实例利用质粒DNA将SDF-1核酸导入细胞。基于质粒的基因递送方法在本领域是周知的。在一个实例中，质粒载体可具有图7示意性显示的结构。图7的质粒载体在SDF-lαcDNA(RNA)序列上游包含CMV增强子和CMV启动子。[0112] 任选地，合成基因转移分子可被设计为与质粒SDF-1DNA形成多分子聚集体。这些聚集体可被设计为结合心肌组织弱化区域、缺血区域和/或梗塞周边区域的细胞。阳离子亲水脂分子(amphiphile)，包括脂多胺和阳离子脂质，可用于提供向目标细胞(例如，心肌细胞)的非受体依赖性SDF-1核酸转移。此外，预先形成的阳离子脂质体或阳离子脂质可与质粒DNA混合，生成细胞转染复合物。涉及阳离子脂质制备的方法被评述在Feigner等，Ann.N.Y.Acad.Sci.772：126-139，1995以及Lasic和Templeton，Adv.DrugDeliveryRev.20：221-266，1996中。对于基因递送，DNA也可偶联到两亲阳离子肽(Fominaya等，J.GeneMed.2：455-464，2000)。
[0113] 涉及基于病毒和非病毒的组分的方法可用于本文中。例如，用于治疗性基因递送的基于EpsteinBarr病毒(EBV)的质粒在Cui等，GeneTherapy8：1508-1513，2001中被描述。此外，涉及偶联到腺病毒的DNA/配体/多阳离子助剂(adjunct)的方法在Curiel，D.T.，Nat.Immun.13：141-164，1994中被描述。
[0114] 此外，SDF-1核酸可利用电穿孔技术通过转染目标细胞而导入目标细胞中。电穿孔技术是周知的，并可用于促进利用质粒DNA的细胞转染。
[0115]根据需要，编码SDF-1表达的载体可以包含药学上可接受载体的可注射制剂如盐水的形式被递送到目标细胞。其他药物载体、制剂和剂型(dosage)也可根据本发明使用。[0116]在本发明的一方面中，载体可包含SDF-1质粒，如例如图7所示。SDF-1质粒可通过如下被递送至心肌组织弱化区域、缺血区域和/或梗塞周边区域的细胞：将SDF-1质粒载
体直接注入心肌组织的弱化区域、缺血区域和/或梗塞周边区域，其用量有效改善至少一种心肌功能参数，如左心室容积、左心室面积、左心室维度、心脏功能，和有效改善对象的6分钟步行测试(6MWT)或纽约心脏协会(NYHA)功能分级。通过将载体直接注入心肌组织的弱化区域、缺血区域和/或梗塞周边区域或其周边附近，有可能非常有效地靶向载体转染，和最小化重组载体的损失。这种注射能够进行期望数量的细胞的局部转染，特别是在心肌组织的弱化区域、缺血区域和/或梗塞周边区域附近，从而最大化基因转移的治疗效力，和最小化对病毒蛋白炎性反应的可能性。
[0117]在本申请的一方面中，SDF-1质粒可以表达SDF-1的质粒DNA溶液的多次注射被给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域，每次注射包含约0.33mg/ml至约5mg/ml的SDF-1质粒/溶液。在一个实例中，SDF-1质粒可以至少约10次注射、至少约15次注射或至少约20次注射被给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域。SDF-1质粒向弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的多次注射使弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域中较大区域和/或数量的细胞得到治疗。
[0118]给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的每次注射可具有至少约0.2ml的体积。包含给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的可改善至少一个心脏功能参数的SDF-1质粒量的溶液总体积为至少约10ml。
[0119]在一个实例中，SDF-1质粒可以至少约10次注射被给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域。给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的每次注射可具有至少约
0.2ml的体积。SDF-1可在弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域中表达约3天以上。[0120] 例如，包含SDF-1表达质粒的溶液的每次注射的注射体积可以是至少约0.2ml，每次注射的SDF-1质粒浓度可以是约0.33mg/ml至约5mg/ml。在本申请的另一方面中，至少一个心脏功能参数可通过如下得到改善：将SDF-1质粒注入心脏弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域，每个位点的注射体积为至少约0.2ml，至少约10个注射位点，并且每次注射的SDF-1质粒浓度为约0.33mg/ml至约5mg/ml。
[0121]在充血性心脏衰竭猪模型中发现，浓度低于约0.33mg/ml或高于约5mg/ml和每个注射位点注射体积低于约0.2ml的SDF-1质粒溶液注射至心脏衰竭的猪模型中导致被治疗心脏的左心室容积、左心室面积、左心室维度或心脏功能中任何功能性改善都很小。
[0122]在本申请的另一方面中，给予弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的可改善至少一个心脏功能参数的SDF-1质粒的量每次治疗干预均高于约4mg并低于约100mg。本文中通过治疗干预给予的SDF-1质粒的量指在被设计以影响或产生治疗效果的治疗程序中给予对象的总SDF-1质粒。这可包括以单次注射用于特定治疗干预而给予的总SDF-1质粒或通过多次注射用于治疗干预而给予的总SDF-1质粒。在充血性心脏衰竭猪模型中发现，通过将SDF-1质粒直接注入心脏给予约4mgSDF-1质粒DNA不导致被治疗心脏左心室容积、左心室面积、左心室维度或心脏功能的功能性改善。此外，通过将SDF-1质粒直接注入心脏给予约100mgSDF-1质粒DNA不导致被治疗心脏左心室容积、左心室面积、左心室维度或心脏功能的功能性改善。
[0123]在本申请的一些方面中，SDF-1可在用SDF-1质粒载体转染约3天以上之后在弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域以治疗有效量或剂量表达。SDF-1以治疗有效剂量或量表达三天以上可给弱化的，缺血性，和/或梗塞周边的区域提供治疗效果。有利地，SDF-1
可在用SDF-1质粒载体转染后在弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域中以治疗有效量表达约90天以下，以减轻潜在的慢性和/或细胞毒性效应，所述效应可抑制给予SDF-1至对象的治疗效力。
[0124]要理解的是，给予任何一种动物或人类的SDF-1质粒的量、体积、浓度和/或剂量取决于多种因素，包括对象大小、身体表面积、年龄、所给予的具体组合物、性别、时间和给予途径、一般健康状况以及同时给予的其他药物。利用下文所述的实验方法，SDF-1质粒的上述量、体积、浓度和/或剂量的具体变化可由本领域技术人员容易地确定。
[0125]在本申请的另一方面中，SDF-1质粒可利用导管插入术如心室内导管插入术或心肌内导管插入术通过直接注射被给予。在一个实例中，可偏转导管引导装置可穿过主动脉瓣逆行推进到左心室。一旦该装置被定位在左心室中，就可将SDF-1质粒注入左心室的梗塞周边区域(间隔和侧面)。一般，可在约60秒的时间内注射1.0mlSDF-1质粒溶液。被治疗的对象可接受至少约10次注射(例如，共计约15至约20次注射)。
[0126] 可在给予SDF-1质粒前将对象的心肌组织成像，从而在给予SDF-1质粒前限定弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域面积。通过成像限定弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域允许SDF-1质粒对弱化的，缺血性，和/或梗塞周边的区域更准确的干预和靶向。用于限定心肌组织弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的成像技术可包括任何已知的心脏成像技术。这些成像技术可包括，例如，超声心动描记术、磁共振成像、冠状动脉造影术、电解剖标测或荧光镜透视中至少一种。要理解的是，可限定弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的其他成像技术也可被应用。
[0127]任选地，除SDF-1核酸(例如，SDF-1质粒)外的其他剂也可被导入心肌组织弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域，从而促进SDF-1由弱化的，缺血性，和/或梗塞周边的区域的细胞表达。例如，增加编码SDF-1的基因转录、增加编码SDF-1的mRNA翻译的剂，和
/或减少编码SDF-1的mRNA降解的那些剂可用于提高SDF-1蛋白水平。增加由细胞中基因转录的速度可通过在编码SDF-1的基因上游导入外源启动子而实现。促进异源基因表达的增强子元件也可以采用。
[0128] 其他剂可包括其他蛋白质、趋化因子和细胞因子，它们在被给予目标细胞时可上调来自心肌组织弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域的SDF-1表达。这些剂可包括，例如：胰岛素样生长因子(IGF)-1，其显示在被给予间质干细胞(MSCs)时上调SDF-1的表达(Circ.Res.2008，Nov21；103(11)：1300-98)；音猬因子(sonichedgehog)(Shh)，其显示在被给予成年成纤维细胞时上调SDF-1的表达(NatureMedicine，Volume11，Number11，Nov.23)；转化生长因子β(TGF-β)，其显示在被给予人类腹膜间皮细胞(HPMCs)时上调SDF-1表达；IL-lβ、PDGF、VEGF、TNF-α和PTH，其显示在被给予原代人类成骨细胞(HOBs)混合的骨髓间质细胞(BMSCs)和人类成骨细胞样细胞系时上调SDF-1的表达(Bone，2006，Apr；38(4)：497-508)；胸腺素β4，其显示在被给予骨髓细胞(BMCs)时上调表达(Curr.Pharm.Des.2007；13(31)：3245-51)；以及缺氧诱导因子lα(HIF-1)，其显示在被给予骨髓衍生的祖细胞时上调SDF-1的表达(Cardiovasc.Res.2008，E.Pub.)。这些剂可用于治疗特定的心肌病，其中存在或给予这些与特定细胞因子有关能上调SDF-1表达的细胞。
[0129]SDF-1蛋白或剂——其引起、增加和/或上调SDF-1表达——可单独(neat)或以药物组合物被给予心肌组织弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域。药物组合物可
提供SDF-1或剂向被治疗的弱化、缺血和/或梗塞周边区域细胞的局部释放。根据本申请所述的药物组合物一般包含一定量混合有可接受药物稀释剂或赋形剂如无菌水溶液的SDF-1或剂，从而给出最终浓度范围，这取决于预期用途。制剂技术在本领域是周知的，如Remington′sPharmaceuticalSciences，16thEd.MackPublishingCompany，1980所例示的，在此引入作为参考。此外，对于人类的给予，制剂应符合无菌性、致热原性、一般安全性和FDA生物标准部门规定的纯度标准。
[0130] 药物组合物可以是单位剂量可注射形式(例如，溶液、悬浮液、和/或乳液)。可用于注射的药物制剂的实例包括无菌水溶液或分散液和用于重构到无菌可注射溶液或分散液中的无菌粉末。载体可以是溶剂或分散介质，包括，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、葡萄糖、盐水或磷酸盐缓冲盐水、其适当的混合物和植物油。[0131] 适当的流动性可例如通过利用包衣(coating)如卵磷脂、在分散液的情况下通过保持所需的粒径和通过利用表面活性剂来进行保持。非水运载体如棉籽油、芝麻油、橄榄油、大豆油、玉米油、葵花籽油或花生油和酯如肉豆蔻酸异丙酯，也可被用作化合物组合物的溶剂系统。
[0132] 此外，可添加增强组合物稳定性、无菌性和等渗性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等可确保防止微生物的作用。在很多情况下，期望包含等渗剂，例如，糖、氯化钠等。可注射药物形式的延长吸收可通过利用延迟吸收剂，例如，单硬脂酸铝和明胶来实现。但是，根据本文所述的方法，所用的任何载体、稀释剂或添加剂必须与化合物相容。[0133] 无菌可注射溶液可通过如下制备：按照期望将实践本文所述方法所用的化合物与不同量的其他成分合并到所需量的适当溶剂中。
[0134]药物的“缓慢释放(slowrelease)”胶囊或“持续释放(sustainedrelease)”组合物或制剂可被应用，并且一般是适用的。缓慢释放制剂一般被设计成长期提供恒定的药物水平，并可用于递送SDF-1或剂。缓慢释放制剂一般被植入心肌组织弱化的、缺血性的和
/或梗塞周边的区域附近。
[0135] 持续释放制剂的实例包括包含SDF-1或剂的固态疏水性聚合物的半透性基质，该基质是成形物品(shapedarticle)的形式，例如，膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯；水凝胶，例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)；聚乳酸，例如，美国专利号3,773,919；L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物；不可降解的乙烯-醋酸乙烯；可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)；和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
[0136] 虽然聚合物如乙烯-醋酸乙烯和乳酸-乙醇酸能释放分子达100天以上，但某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当被包封时，SDF-1或剂可长期保持在身体内，并且可由于在37℃下暴露于水气而变性或聚集，从而降低生物活性和/或改变免疫原性。取决于所涉及的机制，合理的策略可用于稳定化。例如，如果聚集机制涉及分子内S-S键通过硫-二硫化合物交换形成，则稳定化通过如下实现：修饰巯基残基，由酸性溶液冻干，控制水分含量，利用适当的添加剂，产生特定的聚合物基质组合物等。
[0137] 在某些实施方式中，脂质体和/或纳米粒子也可与SDF-1或剂一起应用。脂质体的形成和应用对于本领域技术人员是周知的，如下文所概括的。
[0138]脂质体由分散在水介质中的磷脂形成，并自发地形成多层同心双层小泡(也被称为多层小泡(MLV)。MLV的直径一般是25nm至4μm。超声处理MLV导致单层小泡(SUVs)形成，其直径在200至500A的范围内，核心含有水溶液。
[0139]当分散在水中时，磷脂可形成除脂质体外的多种结构，其取决于脂质与水的摩尔比率。在低比率下，脂质体是优选的结构。脂质体的物理特征取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。脂质体可显示对离子和极性物质的低渗透性，但在升高的温度下经历相变，该相变显著改变其渗透性。相变包括从被称为凝胶状态的紧密聚集的有序结构变为被称为流体状态的松散聚集的无序结构。这发生在特征性相变温度，并导致对离子、糖和药物的渗透性增加。
[0140]脂质体与细胞通过如下四种不同的机制相互作用：网状内皮系统的吞噬细胞如巨噬细胞和中性粒细胞的内吞作用；通过非特异性弱疏水力或静电力或通过与细胞表面组分特异性相互作用而吸附至细胞表面；通过将脂质体的脂质双层插入质膜中与质膜融合，同时将脂质体内含物释放到细胞质中；和将脂质体的脂质转移至细胞膜或亚细胞膜或反之亦然，而与脂质体内含物没有任何关联。改变脂质体制剂可改变运行的机制，尽管一种以上机制可同时运行。
[0141] 纳米胶囊一般可以稳定和可再生的方式包埋化合物。为避免由于胞内聚合过载引起的副作用，应当利用能够体内降解的聚合物设计这些超微粒子(大小在约0.1μm左右)。[0142] 考虑符合这些要求的生物可降解聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米粒子用于本方法，并且这些粒子可容易制得。
[0143]对于由本申请所述的化合物制备药物组合物，药学上可接受的载体可以是任何形式(例如，固体、液体、凝胶等)。固态载体可以是一种或多种物质，所述物质也可用作稀释剂、调味剂、粘合剂、防腐剂和/或封装材料。下列实例仅用于说明目的，并不意欲限制本文所附权利要求的范围。
实施例
[0144]实施例1
[0145]间质细胞衍生因子-1或SDF-1是天然存在的趋化因子，其表达响应于于组织损伤被迅速上调。SDF-1诱导刺激多种保护性抗炎途径，导致促炎性介导物(如MMP-9和IL-8)下调，并可防止细胞凋亡。
[0146] 此外，SDF-1是器官特异性和骨髓衍生的干细胞以及祖细胞到达组织损伤位点的强化学引诱物，其促进组织保护(preservation)和血管发育。基于缺血性动物模型中SDF-1表达增加导致心脏功能性改善的观察，我们致力于开发缺血性心血管疾病治疗用的非病毒的、裸-DNASDF-1编码质粒。在开发的过程中，基于下文所述的细胞培养和小动物研究结果优化了质粒。质粒ACL-01110Sk基于其在心脏组织中表达转基因和在缺血性心肌病的临床前动物模型中持续改善心脏功能的能力而被选择。ACL-01110Sk中的SDF-1转基因表达由CMV增强子/启动子、CMV-内含子A和RU5翻译增强子进行驱动。药物产物，JVS-100(原先为ACRX-100)，由5％葡萄糖中的质粒ACL-01110Sk组成。
[0147]心脏衰竭大鼠模型的初步研究证明，ACL-01110S(将前体表达为ACL-01110Sk的
SDF-1)在MI后四周将质粒直接注入大鼠心脏梗塞边缘区后改善心脏功能。益处在达注射
后持续了至少8-10周，并且与ACL-01110S治疗的动物中血管生成增加相关。ACL-01110S
被修饰以优化其表达模式(profile)。
[0148]MI大鼠模型的质粒剂量依赖性表达
[0149]为确定在大鼠心脏组织中提供最大量表达的每次注射的质粒剂量，逐渐提高的ACL-00011L荧光素酶质粒剂量(10、50、100、500μg)被注入梗塞的大鼠心脏。对Lewis大鼠进行正中胸骨切开术(mediansternotomy)，并且左前降动脉(LAD)始终被结扎，并且在MI周围的一个位点注射PBS中的100μlACL-00011L质粒。在基线以及注射后1、2、3、
4和5天通过非侵入性生物发光成像(Xenogen，Hopkinton，MA)在各个剂量组(n＝3)中测量整个身体荧光素酶的表达。峰值表达增加直至100μg的剂量，在更高剂量下达到饱和。基于此剂量响应曲线，100μg的剂量被确定为在大鼠心脏中足以达到最大量质粒表达。ACL-00011L由载体骨架表达荧光素酶基因，所述载体骨架等同于构建表达SDF-1的ACL-00011S所用的载体骨架。
[0150]缺血性心脏衰竭大鼠模型心脏载体表达的比较
[0151]测试几种SDF-1候选质粒的荧光素酶表达等同物在心肌梗塞(MI)大鼠模型的心脏组织中的表达。候选质粒的差异在于驱动表达的启动子和增强子元件的存在。对Lewis大鼠进行正中胸骨切开术，并且左前降动脉(LAD)始终被结扎和关闭胸腔。四周后，再次打开胸腔，将荧光素酶表达质粒直接注入(每次注射100μg，在100μl中)4个心肌梗塞周围位点。在注射后1、2、4、6、8和10天(和之后每3-4天)，将大鼠麻醉，注射荧光素并用全身Xenogen荧光素酶成像系统成像。
[0152]测试的两种CMV驱动的质粒，ACL-00011L和ACL-01110L，在注射的24小时内产生可检测的荧光素酶表达，并且表达的初峰在注射后2天。
[0153]ACL-01110L峰值表达比ACL-00011L高7倍，并且表达比其长10天(持续至注射后16天)。相反，ACL-00021L(αMHC驱动的质粒)不显示初峰，但低水平的表达直至注射后第25天。这些结果支持以前的研究，证明CMV驱动的质粒可用于心脏中局部、短暂的蛋白质表达以及治疗性蛋白质表达的时间框架可通过包含增强子元件进行调控。
[0154]MI大鼠模型中SDF-1质粒的效力
[0155]在MI大鼠模型中测试SDF-1编码质粒以确定否可实现功能性心脏益处。对Lewis大鼠进行正中胸骨切开术，并且立即将LAD第一分支远端始终结扎。四周后，重新打开胸腔，并将三个SDF-1表达质粒中的一个(ACL-01110S、ACL-00011S或ACL-00021S)或盐水注入(每次100μl注射100μg)4个MI周围位点：
[0156]在基线(注射前)和注射后2、4和8周，将大鼠麻醉并用M-模式超声心动描记术成像。LVEF、分数缩短和LV维度由盲化随机的经过培训的超声医师测量。
[0157] 观察到，CMV驱动的质粒，ACL-01110S和ACL-00011S，相对于盐水对照均有心脏功能性改善的强烈倾向。ACL-01110S在第四周引起分数缩短在统计学上显著增加，并在注射后持续8周。相反，没有观察到αMHC驱动的质粒ACL-00021S和盐水之间的功能差异。此外，与对照相比，ACL-01110S和ACL-00011S治疗的动物的大血管密度显著增加(ACL-01110S：21±1.8血管/mm2；ACL-00011S：17±1.5血管/mm2；盐水：6±0.7血管/mm2，相对于盐水，二者均p＜0.001)，并且梗塞尺寸减小(ACL-01110S：16.9±2.8％；ACL-00011S：17.8±2.6％；盐水：23.8±4.5％)。重要地是，ACL-01110S治疗证明了心脏
功能和血管生成的最大改善，并导致梗塞尺寸减小最大。
[0158] 总之，在缺血性心脏衰竭大鼠模型中，CMV启动子驱动的SDF-1编码质粒与盐水治疗相比提供功能性心脏益处，血管生成增加，以及梗塞尺寸减小。在所有测试的参数中，ACL-01110S提供最显著的益处。
[0159]ACL-01110Sk和ACl-01010Sk在H9C2细胞中的转染效力
[0160]无转染试剂下的H9C2心肌细胞体外转染(即，裸质粒DNA被添加至培养的细胞中)被用于评估GFP形式的Juventas主要质粒载体，ACL-01110Sk和ACL-01010Sk的体内转染效力。体外培养H9C2细胞，并将不同量的pDNA(0.5μg、2.0μg、4.0μg、5.0μg)加入5％葡萄糖中。由ACL-01110Sk(ACL-01110G)或ACL-01010Sk(ACL-01010G)骨架构建GFP载体。在转染后第3天，通过FACS评估GFP荧光性，从而评价转染效力。5％葡萄糖中ACL-01110G和ACL-01010G载体的转染效力在1.08-3.01％的范围内。在测试的pDNA的各个量下，两种载体均具有类似的体外转染效力。我们得出结论，此研究中观察到的1-3％转染效力符合之前的研究发现，证明体内转染效力水平相似。特别是，JVS-100将转染有限但足量的心脏细胞以产生治疗量的SDF-1。
[0161]实施例2
[0162]猪心肌中质粒的表达
[0163]将左前降动脉(LAD)的闭塞/再灌注MI猪模型选作适当的大型动物模型以测试ACRX-100的效力和安全性。在该模型中，在MI与治疗之间给予4周的恢复期，从而能有时间进行额外的心脏重建和模拟慢性缺血性心脏衰竭。
[0164]外科程序
[0165] 将Yorkshire猪麻醉和肝素化至活化凝血时间(ACT)≥300秒，并且以背卧放置。为确定LV的轮廓，以前-后视和侧视进行左心室造影术。
[0166]将荧光素酶质粒递送至猪心肌中
[0167]将可偏转的导管引导装置穿过主动脉瓣逆行推进至左心室，去除导丝，并使LV心内针注射导管经引导导管进入LV腔。以给定体积在4个位点注射荧光素酶质粒，并使浓度进入心脏的间隔或侧壁。测试质粒浓度(0.5、2或4mg/ml)和位点注射体积(0.2、0.5、
1.0ml)的五种组合。0.5mg/ml的质粒在USP葡萄糖中缓冲，其他全部在USP磷酸盐缓冲盐水中缓冲。对于每次注射，将针插入心内，并以0.8-1.5ml/分钟的速度注射基因溶液。注射后，将针保持在适当的位置15秒，然后撤出。注射完成后，去除所有装置，闭合切口，并使动物恢复。
[0168]心肌组织的收获
[0169]在注射后第3天，对动物进行尸体解剖。在安乐死后，将心脏摘除，称重，并灌注乳酸林格(LactateRingers)溶液直到清除血液。打开LV，并确定注射位点。在每个注射位点周围取1em正立方体的组织。从远离任意注射位点的后壁获取的四(4)个立方体充当阴性对照。将组织样品在液氮中冷冻，并储存在-20至-70℃下。
[0170]荧光素酶表达的评估
[0171]将组织样品解冻并置于5ml玻璃管中。添加裂解缓冲液(0.5-1.0ml)，并用Polytron匀浆机(PT1200型)在冰上将组织破碎。将组织匀浆离心，并利用Bio-Rad去垢剂兼容(Detergent-Compatible)(DC)蛋白质分析和已知量的牛血清白蛋白(BSA)的标准
曲线确定各组织样品上清液中的蛋白质浓度。利用荧光素酶分析试剂盒(Promega)分析组织样品匀浆(1-10μl)。
[0172] 实验结果显示在图1中。数据显示，载体的表达随注射体积的增加和DNA浓度的增加而增加。
[0173]实施例3
[0174]SDF-1质粒治疗对缺血性心肌病猪模型心脏功能的改善
[0175]心肌梗塞的诱导
[0176] 将Yorkshire猪麻醉和肝素化至活化凝血时间(ACT)≥250秒，并且以背卧放置。通过将气囊式导管经过引导导管向LAD推进至LAD的第一主要分支下来导入气囊式导管。然后将气囊膨胀至足以确保动脉完全闭塞的压力，并在动脉中保持膨胀90-120分钟。用荧光镜透视检验完全气囊膨胀和紧缩。然后移除气囊，闭合切口，并使动物恢复。
[0177]入选标准
[0178] 在MI后一个月，通过超声心动描记术评估各猪的心脏功能。如果LVEF低于40％和LVESV高于56.7ml，则该猪入选该研究中。
[0179]外科程序
[0180] 将各个入选猪麻醉和肝素化至活化凝血时间(ACT)≥300秒，并且以背卧放置。为确定LV的轮廓，以前-后视和侧视进行左心室造影术。
[0181]SDF-1质粒(ACL-01110Sk)向心肌的递送
[0182]将各猪随机分至3个处死点之一：治疗后3天、30天或90天；以及四个治疗组之一：对照(20次注射，仅缓冲液)、低(15次注射，0.5mg/ml)、中(15次注射，2.0mg/ml)或高(20次注射，5.0mg/ml)。全部质粒均在USP葡萄糖中缓冲。下文描述注射程序。
[0183]将可偏转的导管引导装置穿过主动脉瓣逆行推进至左心室，移除导丝，并使LV心内针注射导管经引导导管进入LV腔。将随机剂量的SDF-1质粒或缓冲液载入1ml注射器中，将该注射器与导管连接。每次注射体积为1.0ml。对于每次注射，将针插入心内，并经
60秒注射溶液。注射后，将针保持在适当的位置15秒，然后撤出。注射完成后，移除所有装置，闭合切口，并使动物恢复。
[0184] 在处死时，切除并快速冷冻心脏和其他主要器官的组织样品，用于PCR和组织病理学分析。
[0185]心脏功能的评估
[0186]通过标准二维超声心动描记术在注射后第0、30、60和90天(或直到处死)评估各动物的心脏功能。由独立的核心实验室对左心室容积、面积和室壁运动评分进行测量。所测的效力参数显示在下表1中。
[0187]表1：超声心动描记参数
[0188]
[0189]SDF-1质粒对功能性改善的影响显示在图2-5中。图2-4显示，低剂量和中剂量的SDF-1质粒相对于对照在注射后30天改善LVESV、LVEF和室壁运动评分指数；但是高剂量没有显示益处。图5证明，低剂量和中剂量的心脏益处持续到90天，因为均显示显著病理重建显著降低，即，与对照相比，LVESV增加较少。
[0190]血管生成的评估
[0191]用7至9个从各福尔马林固定的心脏获得的组织样品评估在30天处死的动物的左心室血管密度。利用小型柱纯化程序(Qiagen)将基因组DNA从福尔马林固定的组织样品中提取并有效纯化。通过定量PCR测试来自SDF-1治疗的动物样品和对照动物样品质粒DNA的存在。将各动物的3-5个组织样本——其被发现包含质粒DNA拷贝，至少在背景4倍以上(除对照动物)——用于制备切片，并用异凝集素免疫染色。确定横截面，并计数每个组织20-40个随机区域的血管。将每个区域的血管转化为血管/mm2，并对各个动物求平均值。各个剂量的数据被报告为所有接受该剂量的动物的平均血管/mm2。
[0192]图6显示，提供功能益处的两个剂量与对照相比在30天也显著增加血管密度。相反，不改善功能的高剂量基本不增加血管密度。该数据提供了，SDF-1质粒改善缺血性心肌病心脏功能的假设生物学机制。
[0193]生物分布数据
[0194]在MI猪模型的关键效力和毒理学研究中，测量注射后3、30和90天JVS-100在心脏和非心脏组织中的分布。在心脏组织中，在每个时间点，平均JVS-100质粒浓度随剂量而增加。在每个剂量下，在注射后3、30和90天观察到JVS-100的清除，并且第90天约
99.999999％从心脏组织清除。JVS-100被分布至具有相对高血流的非心脏器官(例如心脏、肾、肝和肺)，并且在注射后3天注意到最高浓度。JVS-100主要存在于肾中，与质粒的肾清除一致。在30天时存在持续的低水平，并且在90天时在非心脏组织中基本不可检测到JVS-100。
[0195]结论
[0196] JVS-100治疗在单次心肌内注射7.5和30mg后造成缺血性心脏衰竭猪的血管形成显著增加和心脏功能显著改善。测试的最高剂量JVS-100(100mg)显示，血管形成增加的倾向，但不显示心脏功能性改善。JVS-100剂量均不关联毒性迹象、对临床病理学参数或组织病理学的副作用。JVS-100主要被分布至心脏，并且在治疗后90天约99.999999％从心脏组织清除。JVS-100被分布至具有相对高血流的非心脏器官(例如，心脏、肾、肝和肺)，并且在注射后3天在肾中观察到最高浓度。注射后第90天在身体内基本不可检测到JVS-100，仅可忽略量的给予剂量被发现在非心脏组织中。基于这些发现，MI猪模型中JVS-100的未观察到副作用水平(NOAEL)为通过心肌内注射给予100mg。
[0197]实施例4
[0198]猪的探索性研究：在慢性MI猪中经动脉注射的LUC注射
[0199]方法
[0200]用经动脉导管对一只已有LAD闭塞/再灌注MI和EF＞40％的猪注射
ACL-01110Sk。进行2次LAD注射和2次LCX注射，注射体积为2.5ml以及总注射时间为
125-130sec。用混合有质粒的对照再进行一次LCX注射，注射体积为3.0ml，总注射时间为
150sec。
[0201]处死和组织收集
[0202]注射后3天，对动物实施安乐死。安乐死后，将心脏移除，排出血液，置于冰冷的切割板上，并且进一步由尸体解剖技术人员或病理学者进行解剖。通过打开右心室得到来自间隔的未经注射的心肌。将右心室从心脏剪下，并置于冷心脏停跳液中。对各部分使用新的解剖刀片。
[0203] 接下来，打开左心室，并通过从顶至底切割切成6个部分对整个左心室进行切除。将LV平均分成3片。切除后，各部分能够放平。将各部分(3个LV部分，1个RV部分，和1块胸肌)置于单独的标记容器中，所述容器具有在湿冰上的冷心脏停跳液，并将其运送，用于荧光素酶分析。
[0204]荧光素酶成像
[0205] 将全部收集的组织均浸泡于荧光素中，并用Xenogen成像系统成像，以确定质粒表达。
[0206]结果
[0207]心脏的代表性图像显示在图8中。着色点表示荧光素酶表达的区域。这些点表示相对光单位(RLU)高于106个单位，超过背景2个数量级。该数据证明，导管递送了足以在心脏大部分中产生显著质粒表达的质粒。
[0208]实施例5
[0209]临床研究实例
[0210] 给予增加剂量的JVS-100以治疗缺血性心肌病对象的HF。通过记录所有不良事件(AE)追踪各剂量下的安全性，主要安全性终点是在30天时主要心脏AE的数量。在各组中，对象将接受单一剂量的JVS-100。在各组中，通过如下来评价治疗效力：利用标准超声心动描记测量法测量对心脏功能的影响、利用单光子发射计算断层(SPECT)成像测量对心脏灌注的影响、纽约心脏协会(NYHA)分级、6分钟步行距离和生活质量。
[0211]所有对象均具有已知的收缩功能障碍病史、以往的MI，并且通过最新的适龄癌症筛选没有检查出已存在的癌症。所有对象均通过医师诊查和心脏超声心动描记术进行筛选。进行进一步的基线测试，如SPECT灌注成像。各对象均接受十五(15)次1mlJVS-100注射，其通过心内针导管被递送至梗塞边缘区中的位点。将对三组(A、B、C)进行研究。如表2所示，剂量将通过增加每个注射位点的DNA量同时保持注射位点数恒定在15个和注射体积为1ml而逐渐提高。注射后监测对象约18小时，并在注射后3和7天安排诊查，以确保无安全性担忧。患者在注射后保持入院18小时以确保实施全部所需的血液收集(即，心脏酶、血浆SDF-1蛋白水平)。所有对象均在30天(1个月)、120天(4个月)和360天(12个月)时进行了随访，以评估安全性和心脏功能。主要的安全性终点是治疗性递送后1个月内的主要不良心脏事件(MACE)。整个研究中将追踪各对象的AE。下列安全性和效力终点将被测量：
[0212]安全性：
[0213]·注射后30天时主要不良心脏事件(MACE)数
[0214]·12个月随访期中的不良事件
[0215]·血液实验室分析(心脏酶、CBC、ANA)
[0216]·SDF-1血浆水平
[0217] ·身体评估
[0218] ·超声心动描记术
[0219] ·AICD监测
[0220] ·ECG
[0221] 效力：
[0222] ·LVESV、LVEDV、LVEF和室壁运动评分指数自基线的变化
[0223] ·NYHA分级和生活质量自基线的变化
[0224] ·通过SPECT成像测定的灌注自基线的变化
[0225] ·6分钟步行测试距离自基线的变化
[0226] 表2：临床剂量给药表
[0227]
[0228] 基于临床前数据，预期JVS-100的递送在4个月时引起心脏功能和症状改善，其持续至12个月。在JVS-100注射后4个月，预期与基线值相比，6分钟步行距离改善约30米以上，生活质量分数改善约10％，和/或NYHA分级改善约1级。类似地，我们预期LVESV、LVEF和/或WMSI与基线值相比相对改善约10％。
[0229] 比较实施例1
[0230] 在用ACL-01110Sk或ACL-01010Sk治疗后通过超声心动描记术评价慢性心脏衰竭猪的心脏功能
[0231] 目的
[0232] 本研究的目的是比较缺血性心脏衰竭猪模型在心肌内导管递送后对SDF-1质粒
ACL-01110Sk或ACL-01010Sk的功能性心脏反应。
[0233]本研究比较了ACL-01110Sk和ACL-01010Sk改善缺血性心脏衰竭猪模型功能的效力。在本研究中，质粒通过心室内针注射导管进行递送。效力通过如下评估：利用超声心动描记术测量治疗对心脏重建(即，左心室容积)和功能(即，左心室射血分数(LVEF))的影响。
[0234] 方法
[0235] 简而言之，通过90分钟气囊血管成形术，利用LAD闭塞得到雄性Yorkshire猪的心肌梗塞。如M-型超声心动描记术所测在梗塞后30天射血分数＜40％的猪入选。将猪随机分到3个组中的一组：利用心室内针注射导管递送系统注射磷酸盐缓冲液(PBS，对照)、PBS中的ACL-01110或PBS中的ACL-01010Sk(表3)。
[0236] 表3.初步研究设计：猪慢性心脏衰竭的SDF-l治疗
[0237]

[0238] 在注射前和注射后30和60天记录超声心动描记术。下表8限定本报告所涉及的变量。
[0239] 表4.变量的定义
[0240]
变量名称
定义

LVESV
胸骨旁长轴视角测量的收缩末期容积

LVEDV
胸骨旁长轴视角测量的舒张末期容积

LVEF
(LVEDV-LVESV)/LVEDV*100％

[0241] 结果
[0242] 下表5提供了本报告所有入选动物(n＝9)初次注射时(MI后30天)的基线超声心动描记特征，其由超声心动描记术核心实验室报告。
[0243] 表5.基线特征
[0244]
参数
第1组基线值
第2组基线值
第3组基线值

LVESV
78±18ml
67±2ml
86±31ml

LVEDV
132±30ml
114±11ml
130±36ml

LVEF
41±1％
41±5％
34±10％

[0245]表5显示了初次注射后0和30天的LVESV、LVEF和LVEDV。对照PBS动物证明，
LVESV和LVEDV增加以及LVEF无改善，与所述心脏衰竭模型一致。治疗组与对照相比没有减少心脏体积或增加LVEF。在初次注射后60天得到类似的结果。
[0246]比较实施例2
[0247]研究了在心肌梗塞猪模型中通过基于导管的SDF-1跨心内膜递送来增加梗塞周围区域的干细胞归巢的策略，以确定其是否将改善左心室灌注和功能。基于导管的方法已被成功用于人类细胞移植和血管生成生长因子递送。
[0248]应用雌性德国长白猪(30kg)。禁食过夜后，将动物麻醉和插管。
[0249]将7French的鞘管(sheath)置于股动脉中，并且动物处于仰卧位。将导丝上的气囊推进至远端LAD。用2atm膨胀气囊，并通过气囊式导管将琼脂糖珠在1min内缓慢注入远端LAD。1分钟后，使气囊紧缩，并且通过血管造影术记录远端LAD的闭塞。在诱导心肌梗塞后，监测动物3-4h直至心律和血压稳定。移除动脉鞘管，肌内给予卡洛芬(4mg/kg)，并使
动物断离呼吸机。心肌梗塞2周后，麻醉动物。通过8F股动脉鞘管进行左心室机电作图，并且动物处于仰卧位。在得到左心室的全图后，利用注射导管通过18次注射(100μml盐水中5μg)将人类SDF-1(Peprotec，Rocky-Hill，NJ)递送到梗塞和梗塞周围区域中。每次注射使用5μg，以针对报告的导管注射效力进行调节。经20s缓慢实施注射，并且仅当导管端部垂直于左心室壁时、环(loop)稳定性＜2mm时，和针突出至心肌中时，引起异位心室额外跳动。对照动物以假注射进行相同的程序。超声心动描记术排除干预后的心包渗出液。[0250] 二十(20)只动物完成了研究方案：8只对照动物和12只经SDF-1治疗的动物。对于心肌灌注成像，由于技术问题仅可评价6只对照动物。所有动物的梗塞位置在前间隔。[0251] 通过四氮唑染色确定的以左心室百分比表示的梗塞大小在对照组中为
8.9±2.6％，在SDF-1组中为8.9±1.2％。两组的左心室肌肉体积相似(83±14ml比
95±10ml，p＝ns)。
[0252] 免疫荧光染色揭示，经SDF-1治疗的动物的梗塞周围区域vWF-阳性血管明显比对照动物多(349±17/mm2比276±2I/mm，p＜0.05)。观察到经SDF-1治疗的动物梗塞周围区域的胶原蛋白相对于对照动物大量损失(32±5％比61±6％，p＜0.005)。两组梗塞周围区域内的炎性细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)数相似(332±51/mm2比303±55/mm2，p＝ns)。全心肌灌注从基线至随访SPECT无变化，并且组之间没有差异。两组中的最终梗塞大小相似，并且与四氮唑染色结果充分比较。心肌灌注的分段分析揭示，心尖和前间隔节段追踪剂(tracer)摄取减少，并且心肌节段之间具有显著差异。但是，对照和经SDF-1治疗的动物基线和随访的追踪剂摄取几乎相同。组之间舒张末期容积和收缩末期容积没有差异。但是，对照动物的每搏输出量增加，而经SDF-1治疗的动物的每搏输出量略微减少。两组之间的差异明显。
[0253] 类似地，对照动物的射血分数增加，而经SDF-1治疗的动物的射血分数减少。组之间的差异显示强的倾向(p＝0.05)。对照动物的局段缩短率(localshortening)——心室机械功能的另一参数——没有变化。但是，经SDF-1治疗的动物的局段缩短率显著减小，造成组间的显著差异。组内和组间的单极性电压没有显著差异。注意到，基线射血分数和每搏输出量与基线局段缩短率之间的显著关联(EF与LS：r＝0.71，SV与LS：r＝0.59)。随访值得到相似的结果(EF与LS：r＝0.49，SV与LS：r＝0.46)。局段缩短率变化与射血分数(r＝0.52)和每搏输出量(r＝0.46)的变化明显相关。局段缩短率与舒张末期容积之间无关联(基线r＝-0.03，随访r＝0.12)并且射血分数与舒张末期容积之间也无关联
(基线r＝-0.04，随访r＝0.05)。EEM数据的分段分析显示，前间隔节段的单极性电压和局段缩短率降低，并且基线的心肌节段之间具有显著差异。两组基线和随访的心肌节段单极性电压值的分布相似。对照组的节段局段缩短率没有变化。但是，SDF-1组的节段局段缩短率减小，主要是因为左心室的侧节段和后节段减少。SDF-1分配(assignment)与随访和基线之间具有显著的相互作用。
[0254] 上述研究证明，单独应用SDF-1蛋白质不足以产生功能性心脏益处。
[0255]从本申请的上述描述看，本领域技术人员将知道改进、变化和修正。本领域技术人员的这种改进、变化和修正意欲被所附权利要求涵盖。本文引用的所有专利、专利申请和出版物其全部内容均被引入作为参考。
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[0002]

[0003]