一种基于基因芯片的微量样品线性放大方法 本发明属于基因芯片技术，涉及一种微量核酸样品的体外扩增技术领域，特别是涉及到应用于基因芯片研究用的微量RNA样品的线性放大技术方法。
基因芯片技术的发展可以追溯到90年代初，由美国Affymetrix公司的Fodor首先博士提出，至今，基因芯片技术在各个领域中的应用均已取得巨大突破。基因芯片(Gene chip)又称DNA芯片，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦检测系统等对芯片进行扫描，测定微阵列上各点的荧光强度，推算出待测样品中各种基因的表达水平，从而实现对基因功能的研究。
随着人类基因组计划的结束，以及小鼠、线虫、果蝇等一批模式生物全基因组序列的测定，基因组学的研究将转入后基因组学时代，展开对基因的功能研究将成为重点。与传统的检测基因表达水平地技术相比较，基因芯片具备高通量的优势，它越来越被研究人员应用于基因表达检测，通过定量监测大量基因表达水平以阐述基因功能、探索疾病原因及机理、发现可能的诊断及治疗靶等。
但在常规的基因芯片应用研究中，对RNA样品的需求量比较大，一般制备用于每张芯片杂交用的探针需要消耗总RNA大约50-100μg或mRNA 1-2μg，这对诸如临床上取病理标本和古生物标本以及神经元细胞等难以获得的样品，无疑增加了取样的难度，限制了基因芯片技术在相关领域的应用和发展。而PCR技术发明，使得微量样品的体外扩增放大成为了可能，最早由Eberwine(1992)提出了RNA-PCR技术(图1)。其主要原理是首先通过在T7启动子的逆转录系统内生成cDNA第一链(ssDNA)，进而通过RNase H的作用下以部分RNA链片段为引物通过PCR过程获得双链cDNA(dsDNA)，同时获得一定量的扩增，最后在体外经T7RNA聚合酶的作用下获得反义RNA(aRNA)，而著名的美国Affymetrix所使用的基因芯片探针标记系统就是基于此原理工作的，该系统一般需要起始总RNA 10μg或mRNA 200ng左右即可以满足芯片使用。但对于更微量的模板RNA，则需要采用Eberwine(1992)的RNA-PCR技术进行第二轮或更多轮次的循环才能得到足够的aRNA用于标记探针和芯片杂交。目前市场上基于此原理生产的试剂盒扩增效率一般在200-1000倍之间，但关于扩增后线性关系的报道很少或难以保证一定的线性，这为应用于高通量基因芯片研究带来了巨大困难和一定程度的数据偏差。
本发明的目的在于提供一种经济、简便、易行的方法，一方面提高扩增的效率，使得更微量的RNA样品也能应用于基因芯片研究；另一方面从实验的保真性即在PCR循环中既要简单又要充分维持线性关系，如实反映原RNA样品中不同丰度RNA拷贝数的分布情况。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为(图2)：
一、cDNA第一链合成
1、模板变性、引物退火
Total RNA 1-100ng
Primer A* 1μg
RNase Free H2O Xμ
总体积共10μl，70℃变性5-10分钟，4℃放置5分钟。
Primer A*：5’AAA CGA CGG CCA GTG AAT TGT AAT ACGACT CAC TAT AGG CGC TTT TTT TTT TTT TTT 3’
2、反转录反应
在冰上配制下述母液：
RNA模板 10μl
Primer B* 1μg
5×第一链缓冲液* 4μl
0.1M DTT 2μl
10mM dNTP mix 1μl
RNasin 40U
Superscript II 200U
总体积共20μl混合后离心，42℃温育5分钟，然后按10个循环进行下述反应：
60℃ 2分钟
55℃ 2分钟
循环结束后在65℃反应5-10分钟，最后4℃放置。
5×第一链缓冲液*：(Invitrogen)
Primer B*：5’AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GTA CGC GGG 3’
二、cDNA的第二链合成
1、在冰上将下述成分加入第一链合成产物中
cDNA第一链产物 20μl
5x Second Strand Buffer* 30μl
10mM dNTPs 3μl
DNA polymerase I 40U
RNase H(10U/μl) 2U
RNase Free H2O xμl
体积共150μl，按如下反应进行
37℃ 5分钟
94℃ 2分钟
65℃ 1分钟
75℃ 30分钟
3、加入1.0μl 2.5N NaOH，37℃10分钟。
4、加入0.2μl浓HCl调节pH至7.2左右。
5x Second Strand Buffer*(Invitrogen)
三、双链cDNA纯化(PCR purification Kit)
1、在上述反应产物中加入5倍体积的PB缓冲液，混匀后把探针转移到纯化柱，13000rpm离心1分钟。
2、弃下层滤液，加0.75ml PE缓冲液，13000rpm离心1分钟。
3、弃下层滤液，13000rpm再离心1min。
4、在纯化柱上套入新的1.5ml离心管，在纯化柱中心加入80μl无RNase的水，放置1分钟后13000rpm离心1分钟，收集流过液。
四、体外转录(IVT)
1、在0.5ml PCR管中依次加入下列成分：
双链cDNA溶液 ≤20μl
10×T7 reaction buffer 4μl
0.1M DTT 4μl
100mM NTP Mix 1μl
RNasin 1μl
T7 RNA Polymerase 80U
RNase Free H2O Xμl
2、总体积共40μl，37℃ 3-6小时。
3、采用10U DNase I处理，37℃30分钟。
五、aRNA纯化(采用QIA RNeasy mini kit)
1、在42μl转录产物中加入58μl水，将体积调至100μl，加入350μl RLT并充分吹吸混匀。
2、加入250μl无水乙醇并吹吸混匀；将上述混合物加入Rneasy柱中，13000rpm离心15秒。
3、弃去洗脱液后，13000rpm重新离心15sec。
4、弃下层洗脱液，将柱子移入一个新的收集管，加入500μ1 RPE缓冲液，13000rpm离心15秒。
5、丢弃洗脱液，加入500μl RPE缓冲液，13000rpm离心2分钟。
6、丢弃下层洗脱液，13000rpm离心1分钟。
7、将柱子转移入新的1.5ml收集管，在柱中加入30μl无RNA酶的水，13000rpm离心1分钟。
8、在柱中加入30-60μl无RNA酶的水13000rpm离心1分钟。
六、aRNA的扩增
l、模板变性、引物退火
aRNA Xμg
Hexamers 1μg
总体积共10μl，70℃变性10分钟，冰上放置
2、逆转录
aRNA溶液 10μl
5×First strand buffer 4μl
0.1M DTT 2μl
10mM dNTP mix 1μl
RNasin 40U
Superscript II 200U
总体积共20μl，混合后离心，37℃温育2小时，70℃反应10分钟，加入2U RNase H，37℃温育30分钟。
3、模板变性
95℃变性2分钟。加1μg引物A，70℃反应10分钟。42℃温育10分钟，冰上放置。
4、cDNA第二链合成
cDNA第一链产物 20μl
5x Second Strand Buffer 30μl
10mM dNTPs 3μl
DNA polymerase I 20U
RNase H 2U
RNase Free H2O Xμl
总体积共150μl，按如下反应进行
37℃ 5分钟
94℃ 2分钟
65℃ 1分钟
75℃ 30分钟
反应结束后加入1.0μl 2.5N NaOH，37℃温育10分钟；然后加入0.2μl浓HCl调节pH至7.2左右。双链cDNA纯化(采用PCR purification Kit，同上)
5、体外转录(IVT)
aRNA合成及纯化同(四)。
本发明一种基于基因芯片的微量样品线性放大技术区别于以往微量RNA样品体外扩增方法，其优点在于在传统的非循环相cDNA第一链合成反应中，通过PrimerB的引入，不仅可以保证反应温度的均一性，同时也与RNase H作用下得到的短片段一起作为PCR的引物，引入了循环相，增加了cDNA第一链的模板量，为提高aRNA的得率创造了条件；此外本发明在cDNA第二链合成的反应体系中不在使用DNA连接酶，但又保证了反应的成功进行，降低了成本，同时通过设置温度梯度的变化，增加了PCR产物的量，进一步为提高aRNA的产量提供了基础。综合而言，本发明不仅是转录依赖的扩增系统，同时也是自主维持序列扩增系统，它可以保证RNA产物以10的指数方式增加，所以低至1ng的总RNA样品也能得以体外扩增而最终应用于基因芯片研究。
下面将就本发明予以详细阐述实施例：
实施例一：采用GIBICO的TRIzol提取人胎盘标本，并分别采用1％琼脂糖凝胶电泳和Agilent的2100 Bilanalyze进行RNA完整性分析(图3A和图3B)，取1μg总RNA或分离mRNA后取10-50ng，按如下步骤进行：
1、模板变性、引物退火
Total RNA 1μg
Primer A 1μg
RNase Free H2O Xμl
总体积共10μl，70℃变性5-10分钟，4℃放置5分钟。
2、反转录反应
冰上配制下述母液：
RNA模板 10μl
Primer B 1μg
5×第一链缓冲液 4μl
0.1M DTT 2μl
10mM dNTP mix 1μl
RNasin 40U
Superscript II 200U
总体积共20μl混合后离心，42℃温育5分钟，然后按10个循环进行下述反应
60℃ 2分钟
55℃ 2分钟
循环结束后在65℃反应5-10分钟，最后4℃放置。
3、在冰上将下述成分加入第一链合成产物中
cDNA第一链产物 20μl
5x Second Strand Buffer 30μl
10mM dNTPs 3μl
DNA polymerase I 40U
RNase H 2U
RNase Free H2O xμl
体积总共150μl，按如下反应进行
37℃ 5分钟
94℃ 2分钟
65℃ 1分钟
75℃ 30分钟反应结束后加入1.0μl 2.5N NaOH，37℃温育10分钟。然后加入0.2μl浓HCl调节pH至7.2左右。
4、双链cDNA纯化(同前，采用PCR purification Kit)
5、体外转录(IVT)
1)、在0.5ml PCR管中依次加入下列成分：
双链cDNA溶液 ≤20μl
10×T7 reaction buffer 4μl
0.1M DTT 4μl
100mM NTP Mix 1μl
RNasin 1μl
T7 RNA Polymerase 80U
RNase Free H2O Xμl
2)、总体积共40μl，37℃ 3-6小时。
3)、采用10U DNase I处理，37℃ 30分钟。
6、aRNA纯化(同前，采用QIA RNeasy mini kit)
实施例二：同实施例一，提取RNA，取10ng总RNA，按如下步骤进行
前6步反应同实施例一，余下实验如下
1)、模板变性、引物退火
aRNA 5-20μg
Hexamers 1μg
总体积共10μl，70℃变性10分钟，冰上放置
2)、逆转录
aRNA溶液 10μl
5×First strand buffer 4μl
0.1M DTT 2μl
10mM dNTP mix 1μl
RNasin 40U
Superscript II 200U
总体积共20μl，混合后离心，37温育2小时，70℃反应10分钟，加入2U RNase H，37℃温育30分钟。
3)、模板变性
95℃变性2分钟。加入1μg引物A，70℃反应10分钟。42℃温育10分钟，冰上放置。
4)、cDNA第二链合成
cDNA第一链产物 20μl
5x Second Strand Buffer 30μl
10mM dNTPs 3μl
DNA polymerase I 20U
RNase H 2U
RNase Free H2O Xμl
总体积共150μl，按如下反应进行
37℃ 5分钟
94℃ 2分钟
65℃ 1分钟
75℃ 30分钟
反应结束后加入1.0μl 2.5N NaOH，37℃温育10分钟；然后加入0.2μl浓HCl调节pH至7.2左右。双链cDNA纯化(采用PCR purification Kit，同上)
5)、体外转录(IVT)
aRNA合成及纯化同实施例一
实施例三：分别取实施例一和实施例二得到的aRNA予以标记荧光，制备cDNA探针。
Hexamers 5-10μg
aRNA 1-40μg
总体积共10μl，70℃变性10分钟，4℃放置。
在冰上配制标记反应：
5×First strand Buffer 4μl
0.1M DTT 2μl
dNTP mix* 1μl
Cy3/Cy5-dCTP 1μl
RNasin 40U
SuperscriptII 200U
总体积20μl，37℃温育2小时，70℃反应10分钟。加入10URNase H和0.1U RNase A(或加入1μl 2.5N NaOH水解未反转录的cRNA链)，37℃反应10分钟。
dNTP mix*(2mM dATP、dGTP和dTTP，1mM dCTP)
荧光探针的纯化使用PCR purification Kit，同实施例一。
实施例四：芯片探针标记实验按以下步骤进行
同上取50μg总RNA，进行如下实验
1、荧光探针的制备
(1)从-70冰箱中取出RNA，在室温下解冻，然后在0.2ml PCR管中配制反应溶液。
总RNA 50μg
Oligo-dT(15)(μg/μl) 1-2μl
无核酸酶的水 Xμl
(2)70℃预变性5-10min，变性反应结束后在PCR管中配制cDNA第一链合成反应体系
5X first-strand burfer* 4.0μl
0.1M DTT 2.0μl
dNTP mix 1.0μl
Cy3/Cy5dCTP(1mM) 1.0μl
RNA抑制剂 1.0μl
Superscript II(200U/μl) 1.0μl
(3)42℃保温2小时，70℃变性5分钟。在PCR管中加入2μl2.5N的NaOH水解RNA终止反应，37℃保温15分钟，加入10μl 2N HEPES中和。
2.荧光探针的纯化(QIAquick PCR purification Kit或者QIAquick Nucleotide Removal Kit)
同上操作
3.荧光探针的定量
(1)将纯化好的探针转入酶标板，分别测定A260、A550、A650。
(2)定量 Cy3 probe(pmol)＝A550×洗脱体积/0.15
Cy5 probe(pmol)＝A650×洗脱体积/0.25
(3)定量完后的探针吸回PCR管，真空加热抽干，避光保存于-20℃，待杂交。
实施例五：芯片杂交及线性分析实验
设置三个实验，将实施例一和实施例二获得的aRNA按实施例三获得探针，一并与实施例四获得的探针按下述方案进行芯片实验和线性分析。
(1)取出经定量的Cy3和Cy5标记的探针，各取出约30pmol，共用9μl水充分溶解混合于0.2ml PCR管内。
(2)将溶解的探针置于PCR仪中94℃变性3分钟左右，取出加入Human Cot-1 DNA 1-2μg，放回PCR仪中，70℃保温45分钟。
(3)反应结束后，加入10μl 4×杂交缓冲液和20μl甲酰胺，总体积达到40μl，充分混匀。
(4)取杂交液滴加于芯片上，盖上盖玻片。将杂交芯片水平放入加有PBS的杂交盒或者湿盒，置42℃杂交箱中避光杂交16-18小时。
(5)杂交结束后，用镊子取出片子，浸入经过55℃预热的洗液I(1×SSC/0.2％SDS)中，上下抽动，使盖玻片从芯片上自然脱离，然后在55℃洗液I中洗涤10分钟。
(6)从洗液I中取出片子，浸入经过55℃预热的洗液II(0.1×SSC/0.2％SDS)中，洗涤10分钟，然后再转入新的55℃洗液II中，洗涤10分钟。
(7)从洗液II中取出片子，于室温下浸入洗液III(0.1×SSC)中，洗涤3-5分钟，然后转入新的洗液III中，再洗涤3-5分钟。用镊子小心将片子取出，浸入装有ddH2O的50ml离心管中，洗涤1-2分钟，迅速转入50ml空离心管中，1500rpm，离心5分钟，干片。
(8)最后将芯片取出立即扫描，获得图4A(50μg总RNA)、图4B(1μg总RNA)和4C(10ng总RNA)
(9)线性分析：通过图象转化成数据，用R2代表线性关系，结果显示体外扩增的一轮与原始信息的重复性在0.98(图5A)，而两轮扩增的与原始信息的重复性也在0.98(图5B)，综合显示重复性在见图5C。
本发明既显示了较高的扩增效率，使的10ng的总RNA也可以应用于基因芯片研究，同时有保证了线性的关系，能真确反映原始样品中的遗传信息，进一步促进了基因芯片的使用和发展，尤其是在样品数量少的珍贵RNA领域的应用。