一种微藻藻红蛋白分离纯化技术.pdf

本发明涉及一种采用蒸馏水浸提、硫酸铵分级沉淀和离子交换柱层析分离纯化微藻藻红蛋白的技术。冻干藻粉及藻泥加蒸馏水于4℃过夜浸提、高速冷冻离心，加入固体硫酸铵至一定的饱和度时进行分级沉淀，磷酸钠缓冲液平衡透析，离心20min后，采用离子交换柱层析将上清液一步纯化，得到藻红蛋白。本发明通过硫酸铵分级沉淀、DEAE－Sepharose FF离子交换柱层析一步纯化得到藻红蛋白，具有纯化效果好、上样量大、样品得率较高且可用于放大生产等特点，所分离得藻红蛋白纯度达到4.85，总收率52％，聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示一条带。

1、  一种采用硫酸铵分级沉淀和离子交换柱层析微藻藻红蛋白的分离纯化技术，其特征是：
I、藻粉加蒸馏水于冰箱中过夜浸提，离心分离上清液，沉淀的藻泥加蒸馏水于冰箱中2次过夜浸提，合并所得上清液即为藻红蛋白粗提液；
II、藻红蛋白粗提液加入固体硫酸铵，过夜、离心，取沉淀溶于蒸馏水并装入透析袋中蒸馏水透析，磷酸钠缓冲液平衡透析，将透析后的样品离心，取上清液即为上样样品；
III、将样品上样于平衡好的DEAE-Sepharose FF离子交换柱柱顶，用缓冲液洗柱直至280nm处吸收峰回到基线，用0.5～1.0mol/L NaCl进行梯度洗脱。

2、  根据权利要求1所述的分离纯化技术，其特征是藻粉和藻泥分别按1∶10～15和1∶8.0～12.5加蒸馏水浸提后，于高速冷冻离心机4℃、6000r/min离心20min。

3、  根据权利要求1所述的分离纯化技术，其特征是藻红蛋白粗提液分组后加入固体硫酸铵，饱和度分别为20％、40％、60％和80％进行分级沉淀。

4、  根据权利要求1所述的分离纯化技术，其特征是经固体硫酸铵分级沉淀后的沉淀溶于少量蒸馏水装入透析袋中，4℃蒸馏水透析24h，再用pH为7.0的0.01mol/L磷酸钠缓冲液平衡透析24h，于4℃、6000r/min离心20min，取上清液。

5、  根据权利要求1所述的分离纯化技术，其特征是将样品上样于平衡好的DEAE-Sepharose FF离子交换柱柱顶，用0.01～0.02mol/L磷酸钠上样缓冲液洗柱直至280nm处吸收峰回到基线，然后用0.5～1.0mol/L NaCl进行梯度洗脱，流速1.5mL/min。

一种微藻藻红蛋白分离纯化技术
本发明涉及一种采用蒸馏水浸提、硫酸铵分级沉淀和离子交换柱层析分离纯化微藻藻红蛋白的技术。
藻胆蛋白是一种水溶性色素蛋白，存在于红藻、蓝藻、隐藻和某些甲藻体内，是这些藻类特有的光合系统捕光色素，在光合作用中起捕集光能和传递能量的作用。根据结构和光谱特性，藻胆蛋白分为：藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)和别构藻蓝蛋白(A-PC)。藻红蛋白将捕获的光能传递给藻蓝蛋白，再传递给别藻蓝蛋白，最后传递给中心色素，实现光合作用。因而藻红蛋白在光合作用的原初理论方面具有重要的研究价值。另一方面，藻红蛋白用途广泛，既可以作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、染料等工业，又可制成荧光试剂，用于临床医学诊断、免疫化学及生物工程等领域，作为光敏剂用于光动力治疗肿瘤。
紫球藻细胞内有一个大而呈星形的色素体，内含丰富的藻红蛋白及藻蓝蛋白，藻红蛋白占藻胆蛋白84％，其中以B-藻红蛋白含量最多。Kost-Reyes(EurJBiochem.1979，102(1)：83-91)利用无载体电泳从过柱的蛋白中分离出B-藻红蛋白、b-藻红蛋白和R藻蓝蛋白，最后获得的B-藻红蛋白OD₅₄₅/OD₂₈₀比率≥5。Stadnichuk(J Photochemistry Photobiology B.1997，39：19-23)通过ToypearlDEAE-650M离子交换、羟基磷灰石和Sephadex G-200凝胶分离得到紫球藻B-藻红蛋白，最终得到的B-藻红蛋白OD₅₄₂/OD₅₀₀＝2.00，OD₅₄₂/OD₂₈₀＞6.0。Bermejo(JChromatogr A.2001，917(1-2)：135-145，J Botech.2002，93：73-85；JChromatogr B.2003，709：317-325)等利用两步层析的方法分离纯化紫球藻B-藻红蛋白，采用反向高性能液体色谱梯度半制备方法，用C4大孔径柱和含有0.05％三氟乙酸(TFA)的水溶液和0.05％TFA的乙氰溶液分离藻红蛋白的α、β和γ亚基，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳产生三条接近的条带，这三条带和它的三个亚基相对应。他们还制备自然态的B-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白。建立一种新的且可放大的分离纯化紫球藻B-藻红蛋白的方法，该实验结合膨化床和DEAE-纤维素填充床两种层析方法。Ma(Plant Sci.2003，164：253-257)等利用SephadexG-200凝胶层析分离紫球藻B-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白，并利用这两种蛋白氨基基团之间的相互反应形成人工B-藻红蛋白-R-藻蓝蛋白共价联合体，实验结果表明这种人工共价联合体的稳定性高于B-藻红蛋白，有望用于藻胆蛋白探针的制备。温少红(海洋通报.2000，19(3)：90-93；中国海洋药物.2001，3：33-35)等将紫球藻的水溶性粗提物经过硫酸铵沉淀和羟基磷灰石柱层析，分离纯化得到B-藻红蛋白(B-PE)，B-PE在545nm和563nm各有一个吸收峰，在498nm有一吸收肩峰。他们还将藻胆蛋白粗提物经硫酸铵沉淀、透析、羟基磷灰石和SephadexG-100柱层析，分离纯化得到B-藻红蛋白，纯度(OD₅₄₅/OD₂₈₀)分别为4.92和3.78，聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳得到一条带。
本发明的目的就是提供一种将藻粉反复浸提，硫酸铵分部沉淀得到粗藻胆蛋白，经离子交换柱层析纯化得到高纯度的藻红蛋白的技术。
为实现本发明的目的而采用的技术方案是：首先将微藻藻粉按1∶10～15加蒸馏水于冰箱中过夜浸提，浸提后高速冷冻离心机4℃、6000r/min离心20min，取上清液。沉淀的藻泥按1∶8.0～12.5加蒸馏水于冰箱中继续2次过夜浸提，于4℃、6000r/min离心20min，各取上清液，合并3次浸提所得上清液(即为藻红蛋白粗提液)，分组，分别加入固体硫酸铵20、40、60、80％饱和度，混匀后静置过夜，4℃、6000r/min离心20min，取沉淀，将沉淀溶于少量蒸馏水装入透析袋中，4℃蒸馏水透析24h，再用pH7.0的0.01mol/L磷酸钠缓冲液平衡透析24h。将透析后的样品于4℃、6000r/min离心20min，取上清液，即为上样样品。将装好的DEAE-Sepharose FF柱用0.01mol/L磷酸钠缓冲液平衡，直至流出液pH值为7.0。将样品上样于平衡好的柱顶，用0.01～0.02mol/L磷酸钠缓冲液洗柱直至280nm处吸收峰回到基线，然后用0.5～1.0mol/LNaCl作梯度洗脱，流速1.5mL/min。将收集到的各管测其280nm和545nm处的光吸收值，并作出280nm层析曲线。根据吸收峰和OD₅₄₅/OD₂₈₀比值，收集样品，透析、浓缩、离心、冻干得样品。本发明具体的技术方案包括以下具体的步骤：
1、藻红蛋白的提取：称取一定量冻干藻粉，如Rhodella reticulate、紫球藻(Porphydidium cruentum)按1∶10～15加蒸馏水于冰箱中过夜浸提，浸提后于高速冷冻离心机4℃、6000r/min离心20min，取上清液。沉淀的藻泥按1∶8.0～12.5加蒸馏水继续2次过夜浸提，于高速冷冻离心机4℃、6000r/min离心20min，取上清液。合并上述3次浸提所得上清液即为藻红蛋白粗提液。
2、硫酸铵分级沉淀：粗提液分组，分别加入固体硫酸铵，饱和度为20％、40％、60％和80％，进行杂蛋白质和目的蛋白质的分级沉淀，静置过夜后，高速冷冻离心机，4℃、6000r/min离心20min，取沉淀，将沉淀溶于少量蒸馏水装入透析袋中，4℃蒸馏水透析15～24h，然后用pH7.0缓冲液平衡透析15～24h。将透析后的样品于高速冷冻离心机，4℃6000r/min离心20min，取上清液，即为上样样品。分别测定经硫酸铵分级沉淀的藻红蛋白样品纯度，以确定硫酸铵分级沉淀所采用的饱和度。
3、DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析：将装好的DEAE-Sepharose FF柱，用pH7.0缓冲液平衡，直至流出液为pH7.0。将样品上样于平衡好的柱顶，用上样缓冲液洗柱直至280nm处吸收峰回到基线，然后用0.5～1.0mol/L NaCl溶液作梯度洗脱，将收集到的各管测其280nm和545nm处的光吸收值，并作出280nm层析曲线。根据吸收峰和OD₅₄₅/OD₂₈₀比值，收集较纯的样品，透析、浓缩、离心、冻干得藻红蛋白样品。
本发明具有的优点在于藻红蛋白经过DEAE-Sepharose FF离子交换柱层析一步纯化，纯度达到OD₅₄₅/OD₂₈₀＝4.85，所得样品在聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示一条带，说明已达到电泳纯，总收率52％。采用DEAE-Sepharose FF离子交换柱层析具有纯化效果好、上样量大、样品得率较高且可用于放大生产等特点。与已报道的藻红蛋白分离纯化方法相比，采用DEAE-Sepharose FF离子交换柱层析优于采用羟基磷灰石柱层析、Sephadex G-100凝胶柱层析。
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
1、藻红蛋白的提取：称取5g紫球藻冻干粉按1∶10的比例加50mL蒸馏水于冰箱中过夜浸提，充分浸提后于高速冷冻离心机4℃6000r/min离心20min，取上清液。沉淀的藻泥加50mL蒸馏水继续过夜浸提2次。合并3次浸提所得上清液即为藻红蛋白粗提液。
2、硫酸铵分级沉淀：粗提液分组，分别加入固体硫酸铵，饱和度为20％、40％、60％和80％，混匀后进行杂蛋白质和目的蛋白质的分级沉淀，静置过夜，高速冷冻离心机，4℃、6000r/min离心20min，取沉淀，将沉淀溶于少量蒸馏水装入透析袋中，4℃蒸馏水透析24h，然后用0.01mol/L磷酸钠缓冲液(PBS)pH7.0缓冲液平衡透析24h。将透析后的样品于高速冷冻离心机，4℃6000r/min离心20min，取上清液，即为上样样品。分别测定经硫酸铵分级沉淀的藻红蛋白样品纯度，以确定硫酸铵分级沉淀所采用的饱和度。
3、藻红蛋白DEAE-Sepharose FF柱层析纯化：将装好的DEAE-SepharoseFF柱，用0.01mol/L磷酸钠缓冲液平衡，直至流出液为pH7.0。将样品上样于平衡好的柱顶，用上样缓冲液洗柱直至280nm处吸收峰回到基线，然后用0.5mol/L NaCl作梯度洗脱，洗脱液总体积为300mL，流速1.5mL/min，每管收集约5mL。将收集到的各管测其280nm和545nm处的光吸收值，并作出280nm层析曲线。根据吸收峰和OD₅₄₅/OD₂₈₀比值，收集较纯的样品，透析、浓缩、冻干得紫球藻藻红蛋白样品。
实施例2
1、藻红蛋白地提取：称取5gRhodella reticulate冻干粉按1∶15的比例加75mL蒸馏水于冰箱中过夜浸提，充分浸提后于高速冷冻离心机4℃6000r/min离心20min，取上清液。沉淀的藻泥按1∶12.5加60mL蒸馏水继续2次过夜浸提。合并3次浸提所得上清液即为藻红蛋白粗提液。
2、硫酸铵分级沉淀，粗提液分组，分别加入固体硫酸铵，饱和度为20％、40％、60％和80％，混匀后进行杂蛋白质和目的蛋白质的分级沉淀，静置过夜，高速冷冻离心机，4℃、6000r/min离心20min，取沉淀，将沉淀溶于少量蒸馏水装入透析袋中，4℃蒸馏水透析24h，然后用0.02mol/L磷酸钠缓冲液(PBS)pH7.0缓冲液平衡透析24h。将透析后的样品于高速冷冻离心机，4℃6000r/min离心20min，取上清液，即为上样样品。分别测定经硫酸铵分级沉淀的藻红蛋白样品纯度，以确定硫酸铵分级沉淀所采用的饱和度。
3、藻红蛋白DEAE-Sepharose FF柱层析纯化，将装好的DEAE-SepharoseFF柱，用0.02mol/L磷酸钠(pH7.0)缓冲液平衡，直至流出液pH7.0。将样品上样于平衡好的柱顶，用上样缓冲液洗柱直至280nm处吸收峰回到基线，然后用1.0mol/L NaCl作梯度洗脱，洗脱液总体积为500mL，流速2.0mL/min，每管收集约5mL。将收集到的各管测其280nm和545nm处的光吸收值，并作出280nm层析曲线。根据吸收峰和OD₅₄₅/OD₂₈₀比值，收集较纯的样品，透析、浓缩、冻干得蔷薇藻藻红蛋白。