一种人肥大细胞羧肽酶hMC-CP的制备方法 【技术领域】
本发明涉及基因工程领域，具体地说是一种人肥大细胞羧肽酶hMC-CP的制备方法。
背景技术
变态反应疾病的发生极为广泛，其发病率约占全球人口的25％，其中我国的发病率也在20％以上，而发达国家的发病率更高(约为30％)。无论在国外或国内，变态反应疾病均列为多发病，呈逐年增高之势，增长率约为1％(J Allergy Clin Immunol，2002，110：341-348；Curr Opin Immunol，2001，13：701-708)，其对人民的健康造成极大威胁。
肥大细胞是变态反应发生的始动效应细胞，其炎性介质在变态反应性疾病中起重要作用。肥大细胞炎性介质有多种，蛋白酶是其中的一类重要介质，主要以中性蛋白酶为主，约占肥大细胞蛋白总量的50％，它不仅在变态反应性疾病中起重要的病理生理作用，同时也是肥大细胞活化和脱颗粒的标志，作为一类特异的蛋白酶，是变态反应性疾病的体外诊断指标和治疗靶位。hMC-CP是重要的中性蛋白酶之一，hMC-CP的生物学功能尚不清楚。hMC-CP在肥大细胞内与肝素及蛋白聚糖形成分子量约400-560kDa的大分子复合物(JImmunol，1992，148：2475-2482)，其分离纯化工作极为困难。另外，hMC-CP地分离纯化需用大量的新鲜人体组织作提取材料，但材料难得，来源有限，使得天然hMC-CP难于获取。所以，hMC-CP的获取成为hMC-CP生物学功能研究是否顺利进行下去的一个关键瓶颈。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种采用基因工程方法制备人肥大细胞羧肽酶hMC-CP的方法。
本发明的人肥大细胞羧肽酶hMC-CP的制备方法，是采用基因工程方法制备人肥大细胞羧肽酶hMC-CP，其具体步骤为：
(1)提取人皮肤组织的总RNA；
(2)引物合成：
引物1：5′-GCTGAATTCATCCCAGGCAGGCACAGCTAC-3′，
引物2：5′-TACGCGGCCGC TTAGGAAGTATGCTTGAGGATATAC-3′；
(3)以上述提取的总RNA为模板和合成的引物进行RT-PCR扩增人肥大细胞羧肽酶hMC-CP的cDNA；
(4)将hMC-CP cDNA与pGEM-T载体连接，构建重组克隆质粒pGEM/hMC-CP；
(5)将用EcoRI和NotI酶切重组质粒pGEM/hMC-CP得到的含有hMC-CP cDNA的片断与同样酶切处理的pPIC9K载体连接，构建重组表达载体pPIC9K/hMC-CP；
(6)重组表达质粒pPIC9K/hMC-CP转化宿主菌；
(7)诱导重组宿主菌表达人肥大细胞羧酶hMC-CP。
上述的RT-PCR扩增的反应条件为：94℃变性30s、55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后于72℃延伸10min。
上述步骤(4)为用T4DNA连接酶连接hMC-CP cDNA与pGEM-T载体，构建重组克隆质粒pGEM/hMC-CP。
上述步骤(6)为先用BglII酶切质粒pPIC9K/hMC-CP，再转化宿主菌。
上述的宿主菌为GS115酵母菌。
上述步骤(7)是用甲醇诱导重组宿主菌表达人肥大细胞羧酶hMC-CP。
本发明的有益效果：hMC-CP在肥大细胞内与肝素及蛋白聚糖形成大分子复合物，其分离纯化工作极为困难。另外，hMC-CP的分离纯化需用大量的新鲜人体组织作提取材料，但材料难得，来源有限，使得天然hMC-CP难于获取。本发明采用基因工程的方法来制备人肥大细胞羧肽酶hMC-CP，克服了以上种种问题，具有方法简便，成本低，适于产业化的特点，对hMC-CP的后续生物学研究具有深远的意义。
【附图说明】
图1是以RT-PCR技术从人皮肤组织中扩增hMC-CP的琼脂糖凝胶电泳分析图；
图2为pPIC9K/hMC-CP表达载体的构建图；
图3是重组hMC-CP基因表达产物的SDS-PAGE电泳分析图及western blot检测分析图；
图4是hMC-CP的酶活动力学检测分析图；
其中，图1中，1为Marker，2为PCR产物；图3中，1、2、3、4分别用1％的甲醇分别诱导0h、24h、48h、72h的表达上清的SDS-PAGE电泳分析；图4中，左为重组产物上清，右为阳性对照。
【具体实施方式】
实施例1：
(1)总RNA的提取
用适量的人皮肤组织，按Invitrogen公司试剂盒的说明书进行人皮肤组织总RNA的提取。
(2)引物的合成
用ABI DNA自动合成仪合成如下引物。
引物1：5′-GCTGAATTCATCCCAGGCAGGCACAGCTAC-3′(含EcoRI酶切位点)；
引物2：5′-TACGCGGCCGC TTAGGAAGTATGCTTGAGGATATAC-3′(含NotI酶切位点和终止子)。
(3)hMC-CP cDNA的制备
利用上述总RNA和引物RT-PCR扩增hMC-CP cDNA。反转录体系20μL，加入2μL 10×RT Buffer，4μL dNTPs(2.5mM)，0.5μLrRNasin(40u/μL)，2μL AMV反转录酶(25u/μL)，2μL引物oligo(dT)。42℃温浴60min，95℃加热10min，灭活反转录酶。在PCR扩增的50μL体系中，加入2μL cDNA，引物(10μmol/L)各1μL、5μL的10×Buffer、4μL dNTP(2.5mM)及0.5μL Taq酶(5U/μL)，混匀后进行PCR扩增。PCR条件设定：94℃变性30s、55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后于72℃延伸10min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析。如图1所示，1为DNA Marker，2为PCR产物。
(4)PCR产物与pGEM-T载体连接
按DNA快速纯化回收试剂盒回收PCR产物，与pGEM-T载体连接，20μL连接体系中，加入50ng载体，50ngPCR产物，2μL 10×Buffer，1U T4DNA连接酶，4℃过夜，以构建重组克隆质粒pGEM/hMC-CP。
(5)连接产物转化DH5α感受态菌
连接产物转化DH5α感受态菌按照《分子克隆》实验手册(科学出版社，1999)进行操作，37℃培养过夜后挑取白色菌落进行培养，提取重组质粒进行酶切初步鉴定，用美国ABI DNA自动测序仪测序，结果与文献报道一致。
(6)表达质粒的构建
EcoRI和NotI酶切重组质粒重得到的所需片断与同样酶切处理的pPIC9K载体连接，构建表达载体pPIC9K/hMC-CP，如图2所示。转化DH5α感受态菌，培养后，挑选连接成功的阳性克隆，提取pPIC9K/hMC-CP质粒。
(7)表达质粒转化GS115感受态酵母菌
纯化的质粒pPIC9K/hMC-CP用BglII进行酶切处理，使其线性化，回收，转化GS115感受态酵母菌。用Bio-Rad Gene Pulser电转仪于1500V、25μF和200Ω条件下进行电转化。转完毕立即加入1mL预冷1M山梨醇。将菌液铺500μl至MD/-His(1.34％YNB、4×10-5％生物素、1％甲醇、2％葡萄糖及1.5％琼脂)选择平板上。将平板置30℃培养箱孵育3d，观察转化子的生长。
(8)多拷贝整合转化子的筛选
将His+选转化子分别对应地点在逐步增高G418(0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0及4.0g/L)的YPD平板上，于30℃孵育3d，筛选具有高G418抗性、且生长良好的菌株作为表达株。
(9)重组酵母克隆的鉴定PCR检测
重组酵母克隆的鉴定用PCR检测法进行鉴定。取菌落少计悬浮于50μl无菌水中，将菌液置于液氮中1min，然后沸水煮10min，离心后取上清，加入0.5倍体积的7.5M NH4Ac(pH7.5)和2倍体积的无水乙醇，混匀后在-20℃放置30min。4℃，12000r/min离心5min，吹干沉淀，并溶于10μL无菌水中，取5μL作模板DNA进行PCR检测，取前述的引物1和引物2各2μL，加入4μL 2.5mM dNTP，0.5μL Taq酶，加水补齐反应体积至50μL。扩增条件为：94℃变性30s、57℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后于72℃延伸10min。经证实的高拷贝转化子用于下一步的诱导表达。
(10)诱导表达
接种经筛选的阳性转化子于100mlBMGY培养基中，于30℃振荡培养至培养物OD到4左右，3000g×5min离心，去上清收集细胞，加20mlBMMY培养基，置于30℃振荡培养。每24h加入100％甲醇至终浓度为1％，维持诱导，连续培养4d。12000g×15min离心收集上清。
(11)SDS-PAGE与表达产物的免疫学测定(Western blot)
用SDS-PAGE凝胶分离蛋白质，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为15％。转膜采用电转装置，电压40V，转移4h。电转缓冲液：48mmol/LTris碱，29mmol/L甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇。转移后的硝酸纤维膜用3％BSA封闭4h，再与适当稀释的抗hMC-CP单克隆抗体37℃作用2h，洗涤后用DAB显色，PBS终止反应。如图3所示，左为SDS-PAGE电泳分析图，右为Western blot，lane1、2、3、4分别用1％的甲醇分别诱导0h、24h、48h、72h的表达上清。Westernblot显示诱导48h时的表达量较高。
(12)表达产物的酶活性测定
hMC-CP的酶活鉴定采用分光光度计法。方法是用分光光度计测定hMC-CP水解合成肽底物hippurl-L-phenlalanine时在波长为254nm时每分钟所增加的吸光度的速率。反应时底物浓度为1mM，缓冲液为50mM Tris-HCl(含500mM NaCl，Ph＝7.5)。单位定义：在25℃和pH＝7.5的条件下，1分钟水解1μg底物hippurl-L-phenlalanine定义为1U。反应时在90μL底溶液中加入10μL的待测表达上清液，反应时底物浓度为1mM，以牛胰腺羧肽酶(51U/mg)作为阳性参照，以未带有pPIC9K/hMC-CP表达载体酵母菌培养物上清为阴性对照。结果显示：阴性对照未见有酶活性，重组产物上清和阳性对照表现出明显的酶活性。