从白细胞提取法产物产生用于临床应用的 完全成熟并稳定的树突细胞 本发明提供了一种生产成熟并稳定的树突细胞或未成熟树突细胞的方法，该方法包括在适用于该方法的无菌培养设备中培养造血祖细胞，本发明还提供了一种制备适用于树突细胞培养的外周血液单核细胞的方法。
相关领域论述
树突细胞(DC)构成了抗原呈递细胞体系，该体系通过与淋巴细胞的相互作用控制免疫。大部分DC来自骨髓并具有免疫刺激性(Banchereau，J.，Steinman，R.M.，Nature，392，245(1998))。这些典型DC在体内通过若干途径特化以激发辅助和杀伤性T细胞(“自然佐剂”)。最为重要地是，外周组织中的未成熟DC具有捕获抗原并生产免疫原性MHC-肽复合体的能力(“抗原加工模式”)。在应答成熟诱导刺激物，如炎症细胞因子(“危险物”)的过程中，通过上调粘附和共刺激分子，这些未成熟DC发育为有效的T细胞刺激物(“T细胞刺激模式”)，并同时迁移进次级淋巴器官中，选择并刺激罕见的抗原特异性T细胞。那些从组织或血液中很费力分离的DC，如果使其在体外带上抗原，并作为成熟DC注射回体内，被证实在体内是免疫原性的(Inaba，K.et al.，J.Exp.Med.，178，479(1993)；Inaba，K.et al.，Int.Rev.Immunol.，6，197(1990)；Hsu，F.J.et al.，Nature Med.，2，52(1996))。这些数据说明对于免疫介导的针对肿瘤和感染地抗性而言，DC是有效的佐剂。从造血祖细胞离体大量生产DC方法的发展是更为具体探索这种DC为基础的疫苗接种方法的前提。在发现GM-CSF是从鼠血液生产DC的关键细胞因子后(Inaba，K.et al.，J.Exp.Med.，175，1157(1992))，开发了一种从鼠骨髓生产(主要是成熟的)DC的简单并可靠的技术(Inaba，K.et al.，J.Exp.Med.，176，1693(1992))。之后，一些研究小组一致证实如果使这种DC后代带有肿瘤抗原，将其注射进小鼠体内，将诱导CD8+CTL介导的肿瘤衰退(参见Young，J.W.，Inaba，K.，J.Exp.Med.，183，7(1996)；Schuler，G.，Steinman，R.M.，J.Exp.Med.，186，1183(1997))。生产人DC的方法也已获得，但还不如从小鼠获得DC的方法那样规范。从前体离体生产的DC已被成功地用于接种人类并治疗疾病(Bancherau，J.et al.，Cell，in press，2001)。
在人体中，通过利用GM-CSF+TNFα作为关键性细胞因子从罕见的增殖性CD34+前体(Caux，C.et al.，Nature，360，258(1992)；Siena，S.et al.，Exp.Hematol.，23，1463(1995)；WO 93/20185)，或通过从外周血中更常见的处于GM-CSF+IL-4(WO 97/29182)保护下非增生CD14+前体(单核细胞)(WO 97/29182)均可生产DC。自1994年后一种方法被采用以来(Sallusto，F.，Lanzavecchia，A.，J.Exp.Med.，179，1109(1994)；Romani，N.et al.，J.Exp.Med.，180，83(1994))，该方法便被广泛地用于试验目的，并且有若干理由可说明该方法也可应用在免疫疗法中。首先，CD14+前体是充足的，所以在大多数情况中采用诸如G-CSF的细胞因子(用于增加外周血液中CD34+细胞和更为定型的前体)对患者进行预治疗是不必要的(Romani，N.etal.，J.Immunol.Methods，196，137(1996))。其次，由该方法生产的DC似乎相当同源，并且可以未成熟、完全分化或成熟状态生产。第三，有证据显示可能避免非人类蛋白，如FCS(胎牛血清)，并且可能通过利用自体单核细胞调节的培养基作为成熟刺激物，从而获得完全且不可逆的成熟并稳定DC(Romani，N.et al.，J.Immunol.Methods，196，137(1996)；Bender，A.et al.，J.Immunol.Methods，196，121(1996))。能够避免FCS是理想的，因为它可能有害(由于传染性和免疫原性)且非标准化(DC后代的质量随着所采用特定FCS批次的不同而明显变化)。
此外，下列专利/专利申请公开了树突细胞的制备方法：
EP-A-0 922 758公开了从具有巨噬细胞或树突细胞特性表达可能性的多潜能细胞来源的未成熟树突细胞生产成熟树突细胞的方法，该方法包括使未成熟树突细胞与包括IFNα在内的树突细胞成熟因子接触。
EP-B-0 633930公开了人树突细胞的制备方法，包括步骤如下：
(a)采用(i)GM-CSF、(ii)TNF-α和IL-3、或(iii)GM-CSF和TNF-α培养人CD34+造血细胞，从而诱导CD1a+造血细胞的形成；及
(b)从该培养物中回收CD1a+人树突细胞。
WO 95/28479公开了制备树突细胞的方法，包括分离外周血液细胞，从其中富集表达CD34抗原的血液前体细胞，及利用造血生长因子和细胞因子的组合使该细胞扩增。
有若干理由可说明对免疫疗法而言，成熟DC显得优于未成熟DC。在移除/缺乏M-CSF的情况下，只有成熟DC后代缺乏M-CSF-R并保持稳定(Romani，N.et al.，J.Immunol.Methods，196，137(1996))。成熟DC对诸如IL-10(Steinbrink，K.et al.，J.Immunol.，159，4772(1997)；Steinbrink，K.et al.，(1998))或VEGF(Gabrilovichet al.，Nature Med.，2，1096(1996))的(肿瘤来源的)抑制因子具有抗性，而未成熟DC则无该抗性。成熟DC在体外(Sallusto，F.，Lanzavecchia，A.，J.Exp.Med.，179，1109(1994)；Romani，N.etal.，J.Immunol.Methods，196，137(1996)；Bender，A.et al.，Immunol.Methods，196，121(1996)；Reddy，A.et al.，Blood，90，3640(1997)；I naba et al.，J.Exp.Med.，175，1157(1992)；Inabaet al.，J.Exp.Med.，176，1693(1992)；Larsson，M.et al.，J.Immunol.，165(3)：1182-90(Aug 1，2000)；Jonuleit，H.etal.，J.Exp.Med.，192(9)：1213-22(Nov 6，2000))和体内(Dhodapkar，M.V.et al.，J.Exp.Med.，193(2)：233-8(Jan 15，2001)和Jonuleit，H.et al.，Int.J.Cancer.，93(2)：243-51(Jul15，2001))诱导T细胞应答方面也具有优势。事实上，未成熟DC通过诱导调节性T细胞，甚至可以在体外(Jonuleit，H.et al.，J.Exp.Med.，192(9)：1213-22(Nov 6，2000))和体内(Dhodapkar，M.V.etal.，J.Exp.Med.，193(2)：233-8(Jan 15，2001))诱导耐受性。因此在诱导免疫性方面，成熟DC是优选的，而在诱导耐受性方面，未成熟DC是优选的。
对上述从CD14+单核细胞前体生产DC的方法进行了进一步改进，使其具有临床实用性，以实现更大规模的DC基础疫苗接种试验(Thurner，B.et al.，J.Immunological Methods 223，1-15(1999))。为提供一种可根据GMP(良好生产操作规范)准则实施，且避免需要通过多次采血生产DC的可再生的DC生产方法(该方法对DC为基础的人体接种疫苗方法而言必不可少)，所引入的改进可以从白细胞提取法产物中可再生地生产完全成熟的DC(而不是重复采集新鲜血液作为起始群体)。尤其是在该方法中，是通过以白细胞提取法产物为起始群体的两步法(在GM-SF+IL-4中激发，继而在单核细胞调节的培养基中成熟)从CD14+单核细胞生产成熟DC。进行一些改动是必要的。已经公开的是经过改善的粘附步骤对从提取法单核细胞可靠地富集CD14+DC前体而言是必要的。在培养开始时，添加GM-CSF+IL-4被证实是不利的，因此将该添加延迟24小时。DC从提取法细胞发育比从新鲜血液或白细胞层发育要快，并且7天后便可完成。当于第6天添加单核细胞调节的培养基时，便可在24小时后生产完全成熟并稳定的DC(隐蔽的，高度迁移的，且T细胞致敏细胞，具有如≥85％CD83+、p55/fascin+、CD115/M-CSF-R-、CD86++的特征表型)。如果在缺乏细胞因子的情况下另外培养1-2天，该成熟DC后代仍然表现得稳定并可存活，而且对IL-10的抑制效应具有抗性。通过设定冷冻条件，从冷冻的PBMC等分试样(外周血液单核细胞)生产DC，或者将成熟DC本身冷冻待用。该方法可以产生大量的标准DC(5-10×108成熟CD83+DC/白细胞提取法)，这些DC适用于进行可彼此对照的可靠以DC为基础的疫苗接种试验。
也已发现如果以提取法细胞为起始群体，TNF-α自体是不充分的成熟刺激物。最近，有结果显示MCM可被由促炎细胞因子TNF-α、IL-1-β、IL-6和前列腺素E2组成的混合物所模拟(Jonuleit，H.et al.，Eur.J.Immunol.，27，3135(1997))。这些物质也是MCM的主要成分。此外，在多数情况中，MCM与这种混合物一样有效，不过TNF-α+前列腺素E2的组合(Rieser，C.et al.，J.Exp.Med.，186，1603(1997))更为可变。最近，补充有1％自体血浆的X-vivo 15或20培养基被推荐用于生产完全成熟的DC(Jonuleit，H.et al.，Eur.J.Immunol.，27，3135(1997))。不过，已发现RPMI培养基更好。有趣的是，采用RPMI培养基可获得表达CD1a分子的完全成熟DC，而在X-vivo培养基中生产的DC却为CD1a阴性或弱阳性。Thurner，B.etal.，J.Immunol.Methods 223，1-15(1999)建立了一种以白细胞提取法产物为原料生产DC，避免反复采血需要的改进方法。仅单次白细胞提取法便足以生产全部系列接种所需的DC(≥5×108成熟CD83+DC/白细胞提取法)。可以从冷冻的PBMC等分试样重复生产连续接种所需的DC，或者一开始便处理全部的提取法产物，以获得大量DC，可利用优化的冷冻方法将等分试样的DC冷冻备用。
不过上述方法的主要缺点是DC的培养通常需要在(大量的)开放容器(孔或瓶)中进行。多种操作步骤，即试剂的重复添加和去除，使得在受控且无菌条件下难以进行全部操作，即还没有一种符合GMP准则的生产方法可应用。不过这种GMP方法是离体扩增或生产DC操作的基本要求(如，在以DC为基础的接种过程中)，其中所生产的DC被重新输回原始供体或另一个受体中。另一方面，仅有少数论文强调在树突细胞的生产中利用封闭容器(如WO98/06826；Kowalski，K.L.et al.，Blood，vol.88(10)，suppl.1，111a页(1996))。不过这些文献中利用的是对该容器中所生产DC量加以某些限制的标准容器。
最后，通常需要简化在实际培养树突细胞之前的步骤，即从患者分离合适的造血祖细胞的步骤。
发明概述
通过采用下文说明的方法及设备可以解决上述难题。尤其是本发明提供了
(1)一种根据GMP(良好生产操作规范)准则生产成熟并稳定的树突细胞或未成熟树突细胞的方法，该方法包括在至少一种树突细胞分化/成熟因子存在的情况下，在无菌培养设备中培养造血祖细胞，该培养设备包括一个封闭容器，该容器具有扩大的内表面，形成一个可供细胞贴附于表面的生长区域；
(2)一种用于生产成熟并稳定的树突细胞的设备，该设备包括一个封闭容器，该容器具有形成生长区域的扩大的内表面；及
(3)一种制备外周血液单核细胞的方法，该方法适用于从白细胞提取法产物培养树突细胞，该方法包括通过添加水或氯化铵水溶液以裂解白细胞提取法产物中的红细胞(和部分粒细胞)。
根据本发明，细胞贴附在容器扩大的内表面上。为扩大该容器的内表面，该容器可含有主室，和/或可充满由聚合材料或类似物制成的颗粒，如珠、球、螺旋、海绵状、毛状或网状结构，三维网状物等。由于这些颗粒的量很大，该容器的内表面得以扩大，从而细胞可贴附在这些颗粒的表面上。
根据本发明，该颗粒可具有任意三维结构。例如可能采用尼龙毛、ratings、螺旋、海绵状结构等。
根据本发明的优选实施方案，该容器包含至少两个流体交换室，从而每个室均可界定一个生长区域。这种容器含有一个或多个分隔壁可将该容器分为若干个室。根据本发明，这些室是流体连通的。因此提供仅具有一个可引入含待培养细胞的流体的主要入口的设备是可能的。优选的，该流体通过流体交换装置均匀地分配在各个室中。
优选的，室之间交换装置设置的方式使该容器保持在连通状态。只有在该状态下，容器中的流体才会平均地分配在这些室中。如果保持该容器在培养状态或位置，且这些室不能彼此流体连通，那么在该状态下流体将不能从一个室流至另一个室。
附图简述
附图显示了根据本发明的设备的优选实施方案，由此
图1显示了根据本发明具有可叠放盆状室的设备的俯视示意图。
图2显示了图1所示设备沿X-X线的横剖面图。
图3显示了图1和2所示设备连同一个填充装置的三维示意图。
图4显示了根据本发明设备的第二种优选实施方案的俯视示意图。
图5显示了图3所示设备沿XII-XII线的横剖面图。
图6显示了根据本发明设备的第三种优选实施方案的横剖面图，及
图7显示了根据本发明设备的第四种优选实施方案的横剖面图。
发明详述
本发明实施方案(2)的培养设备也适用于本发明实施方案(1)的方法，下文通过参考附图1-7对其进行了描述。图1和2显示了该设备的第一种优选实施方案，该方案可被用于生产成熟并稳定的树突细胞或未成熟树突细胞。图示设备包括可叠放盆状装置10，如图2所示叠放。每一个盆状装置10具有一个底部12及包围底部12的侧壁14。通过将一个盆状装置10叠放至另一个盆状装置10的顶部，底部12又另外充当了顶部，所以通过两个盆状装置10叠放一起便形成了室16，如图2所示。最顶部盆状装置10形成了室16的盖子，该室在最顶部盆状装置10的底部12之下。
每一个盆状装置10具有至少一个用于连接相邻室16的装置18。在所示优选实施方案中，每一个盆状装置10具有两个用于与相邻室16流体连通的装置18。用于流体连通的装置18优选地形成圆柱形中空凸出物。换言之，用于流体连通的该装置18形成导管或管子。这些管子中的每一根都具有一个开口20，该开口与底部12的底面22有一定距离。与该开口20相对，每一根管子具有第二开口24，该开口24在底部12的平面上。这一第二开口24对相邻室16开放。
图2显示了处于培养状态或位置的设备。在该水平位置上，流体分布在底面22上，从而细胞可以贴附在该底面22上。因此，整个盆状装置10和至少底部12由塑料材料制成，该材料包括但不仅限于聚碳酸酯、聚苯乙烯和聚烯烃。可选地，对底部12而言，该材料可包被有合适的贴附介导剂，如Ig(免疫球蛋白)包被(包括IgG包被)或者以单核细胞上细胞表面分子的抗体(包括CD14、CD16)包被，以使这些细胞可以贴附在底面22上。
所示培养状态中，可将每一个室16充满，直到液面高于管子18的开口20。通过利用适用于所描述方法的图示设备，液面可以非常低。流体厚度约为3mm。
对图示室16的流体连通而言，图2所示设备可旋转90℃，以使管子18位于底部(图1)。从而流体26可通过管子18均匀地分配在各个室16中。
最底部盆状装置10的管子18的开口24由盖子28封闭。最顶部不用于培养的盆状装置10具有插入在管子18中的管状部分30。管状部分30中的一个由盖子32通过无菌封闭其开口而得以封闭。盖子32与连杆34相连，该连杆34可拉开管子30。如图2所示，另一个管状部分30已被打开，即移除了盖子32。流体从而可通过形成主入口36的管状部分30的开口36充入室16中。通过主开口36，流体可充入任何一个室中。一旦流体充入，该设备便可保持在培养状态中。每一个管状部分30均可作为流体的入口和/或出口。在培养状态下，由气体充满每一个室16中流体以上的区域。该气体可交换，例如，通过泵入含有5％CO2的空气通过室16。
如图3所示，连接所用装置18连接一个或优选两个滤器128是可能的。利用该滤器128以供给空气，因此该滤器是防漏的。采用另一个连接所用装置18或两个连接所用装置18之一(图1和2)连接填充/排空装置130。该装置130提供了一个优选的由PVC制成的管状接头或三通龙头132。通过该接头132，便可通过导管140与贮存袋134、136、138之一相连。该导管140配有夹钳142或其它种类的关闭/开启装置，以关闭/开启任何一条导管140，即，使贮存袋134、136、138中的任何一个与如图1和2所示设备相连或相隔。可采用其它种类适用于贮存或收集培养基的室样装置取代贮存袋134、136、138。
上述贮存袋134、136、138可含有例如PBMC、培养基或不贴附成分(NAF/废物)。在加载设置中，通过热封使含有PBMC的贮存袋134与装置130的PVC管相连。继而通过打开相应夹钳142，可将细胞(如240ml完全培养基中约含120×106个细胞)转移进双盘细胞工厂中。经过小心平衡后，将该细胞工厂置于37℃、5％CO2培养箱中。1小时后，通过装置130的PVC管将不贴附成分(NAF)转移进NAF/废物贮存袋138中。洗涤该细胞工厂(如采用纯培养基1640)。随后添加培养基(如240ml完全培养基)，并使其均匀地分布在两个盘上。贮存袋136总是在没有打开体系的情况下通过热封与体系连接和断开。
在细胞工厂补料设置中，通过热封使含有培养基的贮存袋136与PVC管130相连，内容物便转移进细胞工厂中。在细胞工厂的成熟设置中，通过热封使含有成熟刺激物的贮存袋136与PVC管130相连，内容物便转移进细胞工厂中。在细胞工厂的收获设置中，通过热封使相应的贮存袋138与PVC管130相连。轻柔地重悬浮后，不贴附细胞便在没有打开体系的情况下被转移至DC袋138中。继而以培养基充满该细胞工厂，以使松散贴附的细胞松动，这些细胞也将被收集在第二个DC袋中。继而使两个DC袋与体系断开。
图4和5所示第二种实施方案是具有分隔壁40、42、44和46的瓶状容器，所示实施方案中，这些分隔壁40、42、44、46形成了三个室49、50和52(图5)。室的数目也可更多。最上层室49由具有图5所示水平底部42和侧壁40和44的盆状装置形成。底部42具有表面48，根据本发明方法，细胞可贴附其上。所以如图5所示在培养状态或位置下，流体被保持在室49中，底部42与在容器总高度上延伸的侧壁54和56紧密相连。侧壁40和44也与壁54和56紧密相连。与顶壁48邻接的分别是具有开口60和62的侧壁40、44。
中室60也具有与侧壁54、56和侧壁40紧密相连的底部42。在侧壁40的对侧，中室50具有不带开口的侧壁46。因此，侧壁46与底部42、上室49的侧壁44以及侧壁54和56紧密相连。另外，中室50具有一个与底部42紧密相连，并且带有对中室50开放的开口66的管状凸出物64。与开口66相对，管64具有第二个开口68，该开口位在底部42的平面上，且开口指向下室52。
下室52的边界由侧壁70、底壁72和与侧壁70相对的侧壁74构成。该侧壁70从底板72延伸至顶板58。
在侧壁74中，形成有一个开口76。该开口76具有一个由盖子80封闭的管状凸出物78(图5)。在盖子80中，装有一个疏水滤器82以使空气可以进入该容器内。
为将相同量的流体26充满室49、50和52，如图4所示保持该瓶状设备，以使流体可沿箭头80所指方向通过管状凸出物78和开口76进入室中。如果保持该设备在此交换状态，如图5所示流体沿虚线箭头方向流入室内。首先，流体沿箭头84所指方向流入下室52中。继而流体沿箭头86所指方向从下室52流进通路89，该通路通过侧壁44上的开口62使下室52与上室48相连。该通路89由侧壁70及其相对侧壁46和44构成。另外，流体沿箭头88所指方向流经管64和开口66，进入中室50。如果室49、50、52平均地充有等量流体，在图5所示位置上旋转该瓶状设备，以使流体均匀地分布在平底部42和72上。根据本发明图1-5，合适的无菌培养设备为Nunc细胞工厂和NuncTriple烧瓶。
在本发明进一步的实施方案中，容器扩大的内表面(22、48)由一个或多个规则或不规则形状的结构或颗粒形成，从而细胞可以贴附在该容器内表面和/或颗粒表面上。合适的结构和颗粒为上述的珠、球、螺旋、卷起的箔或膜、海绵状、毛状或网状结构、三维网等。
上述本发明的两种优选实施方案也可应用在生产成熟并稳定的树突细胞所用的连续或非连续流体灌注方法中。为此，可将管状部分30(图2)和管状凸出物28(图5)连接到软管或类似物上。使该软管与蠕动泵或其它用于输送流体的装置相连，便可将流体分别泵入室16和49、50、52中。
为使流体在室内分配均匀，尤其是使流体在可贴附细胞的底面22、48上分配均匀，可移动或倾斜该设备。
根据第三种优选实施方案(图6)，通过软管90泵入培养基。管90被分进两个室92内。在室92内，细胞贴附在这些室的表面或分布于室92内的颗粒上。沿箭头94所指方向连续或非连续地输入流体。在流体经过室92之后，再次将两个室与管92相连。为输送流体经过室92，采用的是泵96，尤其是蠕动泵。
每一个室92均具有一个底面98。与底面98相对，形成透气表面100。这些表面100可透气，但不可透过流体。经过表面100，气体可穿过室92进入中间气体室102中，反之亦然。每一个气体室102分别与通用入口和出口104和106相连，以便供应气体和将其从气体室102中散逸出去。图5所示实施方案可特定地应用在非连续流体供应中。
将流体连续供应到两个或多个室124中采用的是另一个优选实施方案(图7)。每一个室124具有一个底面107，该底面具有，例如，通过采用波浪状结构形成的扩大表面。这两个室124与通用软管126相连。为将培养基沿箭头108所指方向供应到室124中，采用了泵110，尤其是蠕动泵。流出室124，并沿箭头112所指方向流入软管126的培养基将被输送进气体交换装置114中。在该气体交换装置中，管子具有一个透气但不透过流体的表面116。通过该表面116，气体可在软管126和气体交换装置114之间进行交换。因此，该气体交换装置具有一个入口118和一个出口120。
为防止细胞被泵入管126和气体交换装置114中，可使室124倾斜，以使细胞因其重量而停留在室104中。
容器(设备)内的室和/或室内规则或不规则形状的颗粒和结构优选地提供了一个有效表面，即该容器内表面的生长区域为25-10000cm2，优选为500-5000cm2。根据本发明，由塑料制成，优选的是聚碳酸酯、聚苯乙烯或聚烯烃。本发明的一个优选实施方案中，容器的内表面，优选地，包括盆状装置10的内表面的生长区域和规则或不规则形状的结构或颗粒的表面包被有贴附介导剂(包括使单核细胞贴附的介导剂)。合适的贴附介导剂为Ig包被(包括但不仅限于IgG包被)、细胞表面蛋白抗体包被(包括但不仅限于抗-CD14或抗-CD16抗体包被)、粘附分子包被(包括但不仅限于选择蛋白，如E-选择蛋白和P-选择蛋白，和/或免疫球蛋白超家族成员，如VCAM-1)等。
实现实施方案(1)中成熟和未成熟树突细胞(DC)的生产，即祖细胞的培养方法与本领域已知方法相似。合适的祖细胞是多能干细胞、树突细胞前体或未成熟树突细胞，优选的该造血祖细胞是树突细胞前体，该前体
(i)获得自CD14+单核细胞、CD34+细胞或直接获得自血液，和/或
(ii)来源自白细胞提取法产物、淘洗法、外周所采血液或骨髓。
例如，根据全部在此引入的Thurner，B.et al.，J.Immunol.Methods 223，1-15(1999)所公开的方法，从白细胞提取法产物可获得祖细胞(和DC)。可选地，通过本发明实施方案(3)的方法可从白细胞提取法产物中分离祖细胞，下文进一步说明了该方法。培养优选地通过下列步骤进行：
(i)将外周血液单核细胞送入培养室中，使其贴附在该室的内表面上，
(ii)洗涤该室以除去未贴附细胞，
(iii)在至少一种树突细胞分化/成熟因子存在下，于培养基中培养贴附细胞，并任选地
(iv)向培养基中添加其它分化/成熟因子，和/或
(v)除去培养基，洗涤贴附细胞，在含有与步骤(iii)所用相同或不同树突细胞成熟因子的培养基中培养贴附细胞。
在本发明实施方案(1)的一种优选模式中，培养包括
(i)每cm2(有效)生长区域加载3×105-4×106个祖细胞，和/或
(ii)每cm2生长区域添加0.01-3ml，优选的0.1-0.5ml培养基，以使生长区域被培养基充分覆盖，优选1-5mm。尤其是在Nunc Triple烧瓶(具有的生长区域为500cm2)中，20-200ml培养基中加载150-2000×106个细胞，在Nunc细胞工厂中(2层；具有的生长区域为1200cm2)，100-400ml培养基加载360-4800×106个细胞。
合适的分化因子是GM-CSF和IL-4、IL-13、IL-15或IFN-α的混合物。本发明方法所用合适的树突细胞成熟因子包括但不仅限于，MCM、IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、IFN-α、脂多糖和其它细菌细胞产物(如MPL(单磷酰脂质A)和脂磷壁酸质)、磷酰胆碱、钙离子载体、佛波醇酯(如PMA)、热激蛋白、核苷酸(如ATP)、脂肽、Toll-样受体的人工配体、双链RNA(poly I：C)、免疫刺激性DNA序列、CD40配体等。最为优选的成熟因子为IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的混合物。
在本发明实施方案(3)的方法中，如果采用水进行裂解，优选的是
(a)在20-30℃进行裂解5-30秒；和/或
(b)白细胞提取法产物与水的体积比为20∶1-2∶1。
另一方面，如果采用氯化铵水溶液进行裂解，优选的是
(a)所添加溶液中氯化铵浓度为0.5-5％(w/w)，优选为1-3％(w/w)；和/或
(b)在25-50℃进行裂解5-20分钟；和/或
(c)白细胞提取法产物与氯化铵的体积比为20∶1-2∶1。
上述方法可进一步包括淬灭和/或洗涤裂解产物，和/或使其悬浮在合适的培养基(无血浆或蛋白质)或盐溶液(如略低渗的盐溶液)中的步骤。尤其是在采用水进行的裂解中，将白细胞提取法产物充入50ml试管(每支试管10ml)中，离心(1100rpm，4℃ 12min)。弃去上清液，向沉淀部分添加20ml Aqua dest.(5-30ml)，使其重新悬浮，涡旋，20秒(5-30s)后，以30ml完全培养基充满，优选地补充800U/ml GM-CSF。继而如Thurner，B.et al.，J.Immunol.Methods223，1-15(1999)中所描述方法对悬浮液进行洗涤。也可在更大的容器中进行裂解，例如，将白细胞提取法产物置于白细胞提取法用袋中，离心(1100rpm，4℃，12min)。弃去上清液，添加50ml Aquadest.，重新悬浮沉淀，20秒(5-30s)后，以150ml完全培养基充满，并如上述进行洗涤步骤。
在采用氯化铵进行的裂解中，将白细胞提取法产物充入50ml试管(每支试管10ml)中，离心(1100rpm，4℃ 12min)。弃去上清液，采用补充有800U/ml GM-CSF的10ml完全培养基重新悬浮沉淀，并添加10ml(5-20ml)1.6％NH4Cl。充分震荡该悬浮液，将其放入水浴(37℃)10(5-15)分钟，并如上述进行洗涤。该裂解操作与上述采用水进行裂解的操作一样也适于在更大容器中进行。
通过下文的非限制实施例进一步说明本发明。
实施例
材料和方法：
在用以生产临床应用中适用的DC的方法中，所采用的所有试剂和材料均无内毒素，并且尽可能大部分为GMP(良好生产操作规范)质量。
设备：微生物安全工作台(Heraeus，HERA safe HS 12/2)；离心机(Heraeus，Megafuge 2，ORS)；培养箱(Heraeus，Cytoperm2)；-80℃制冷机(National Lab，Profimaster EPF)；-20℃制冷机(Liebherr，GS 1382)；冰箱Liebherr KB 1001(Liebherr，Berlin)；透射光显微镜(Leica，DMLS)；反射光显微镜(Leica，DMIL)；移液辅助器Pipet-aid XP(Drummond)；移液器，EppendorfReference(Eppendorf)；Neubauer细胞计数室(SuperiorMarienfeld)
塑料材料：50ml试管，锥形聚丙烯试管、经γ照射灭菌(CorningCostar，产品号430829)；15ml试管，锥形聚丙烯试管、经γ照射灭菌、25个试管/袋(Corning Costar，产品号5315-15)；一次性移液管，无热原、独立包装、经γ照射灭菌(Corning Costar，产品号4485/1ml，4486/2ml，4487/5ml，4488/10ml，4489/25ml)；移液器头，无菌且独立包装(Biozym，Safeseal-Tips，产品号790011/10μl，790101/100μl，791001/1000μl)；一次性无菌滤器，0.22mm、无菌、无内毒素、独立包装(Millipore，Millex-GS，产品号SBGS025SB)；具有细胞培养表面的培养皿，NUNCLON表面产品[Nunc细胞工厂、两个叠放、独立包装、原包装、经γ照射灭菌、无内毒素(Nunc，产品号167695)；细胞培养罐Nunc Triple烧瓶，经γ照射灭菌、无内毒素(Nunc，产品号1328867或132913)]；6孔细胞培养板，独立包装、Optilux表面、经γ照射灭菌、无内毒素(Falcon/Becton Dickinson，产品号3046)；空气滤器Midisart 2000(Sartorius，产品号17805-G)；冷冻管，无菌、无内毒素(Nunc，Nunc Cryo Tube vials，产品号375418/1.8ml，337516/4.5ml)；套管：Stericam 0.9×70mm20G×2 4/5Luer薄壁一次性套管(Braun，产品号04665791)；Microlance 3 0.4×19mm 27G 1 3/4 REF 302200(BectonDickinson)；无菌乳胶外科手套Peha-taft(Hartmann，产品号942353/8(7号)或9423 54/7(71/2号))；无菌外科手套Peha-taftSyntex，无乳胶(Hartmann，产品号942633/8(7号))。
化学药品：Molgramostim(GM-CSF)(Leukomax400)，54.38mg干燥物质和1ml无菌H2O，医学药物批准号25756.03.00)(Sandoz，产品号PZN-4608744)；NaCl 0.9％，10ml小瓶(Braun，产品号02246228)；注射用水，10ml小瓶(Braun，产品号02240246)；PBS，无菌且无内毒素，GMP质量(Bio Whittaker/Serva，产品号17-512F)；重组人IL-4，无菌且无内毒素，GMP质量(Cell Genix)；白细胞介素1b(Amedak)；白细胞介素6(Novartis)；肿瘤坏死因子α(Bhringer Ingelheim)；前列腺素E2 Minprostin(Pharmacia)；70％酒精(Laborcenter，Nürnberg)；Barrycidal36，消毒剂(Helmut Schrder)
-Incidin Plus(Henkel)；无菌海绵Gazin，无菌且独立包装(Lohmann，产品号0197)；台盼蓝0.4％无菌(Sigma产品号T-8154)。
培养基、细胞因子、单克隆抗体(mAbs)：采用下文所描述的培养基：作为补充有终浓度为20μg/ml的庆大霉素(Refobacin 10，Merck，Darmstadt，Germany)、终浓度为2mM的谷氨酰胺(Prod.Nr.17-605，Bio Whittaker)和1％热灭活(56℃持续30min)人血浆的标准培养基RPMI 1640(Prod.Nr.12-167，Bio Whittaker，Walkersville，USA)[＝进一步称为完全培养基]。人血浆是自体肝素化(500I.U./20ml血液，Liquemin N 2500，Hoffmann La Roche，Basel，Switzerland)血浆(获得自新鲜采血)，或10％ACD-A(酸性柠檬酸盐葡萄糖配方A，Fresenius AG，Bad Homburg，Germany)血浆(通过白细胞提取法操作获得)，或者对选定的试验而言，是获得自输血医学科的单供体异源AB阳性ACD-血浆。可选的，我们测试了X-VIVO15和X-VIVO20(BioWhittaker)，这两种培养基的补充物质与上述标准培养基所补充的物质相同。
采用GMP质量的重组人GM-CSF(800U/ml)(LeukomaxSandoz，Basel，Switzerland)和重组人IL-4(500U/ml)(由E.Liehl博士友好提供，Novartis Research Institute，Vienna，Austria)进行标准培养操作。也采用获得自Genzyme Corporation(Cambridge，Massachusetts，USA)，根据GLP(良好实验室操作规范)生产并根据GMP准则检验的人IL-4。
在比较MCM与成熟诱导细胞因子的试验中，采用了重组人10ng/mlTNF-α(由Adolf博士友好提供，Bender & Co.Vienna，Austria)、1000U/ml IL-6(由Novartis友好提供，Basel，Switzerland)、10ng/ml IL-1β(Sigma，St.Louis，MO USA)和1μg/ml前列腺素E2(Cayman Chemical，Ann Arbor，MI，USA)。对IL-10抗性试验而言，采用剂量为10ng/ml的rh IL-10(Genzyme Corporation，Cambridge，Massachusetts，USA)。
对流式细胞术而言，采用抗下列抗原的单克隆抗体：CD1a(OrthoDiagnostic System，Germany)、CD2、CD4、CD8、CD14、CD19、CD25、CD56、HLA-DR(均获得自Becton Dickinson，Brussels，Belgium)、CD3、CD40、CD86(Cymbus，Dianova，Hamburg，Germany)、CD83(Immunotech，Marseilles，France)、CD95(Pharmingen，San Diego，USA)、CD115(Calbiochem，Massachusetts，USA)。平行进行同种型对照。
对细胞内FACS染色而言，根据生产商的说明书采用Fix&Perm(Biozol，Eching，Germany)固定并渗透细胞，继而采用p55/抗-fascin上清液(Mosialos，G.et al.，Am.J.Pathol.，148，593(1996))(K-2克隆，由E.Langhoff博士友好提供，Boston)染色。二级抗体采用的是Fcγ片段特异性的荧光素偶联的AffiniPureF(ab’)2山羊抗小鼠IgG(Jackson Immuno Research，Dianova，Hamburg，Germany)。
白细胞提取法和PBMC的分离：提取法产物的初加工：白细胞提取法产物获得自输血医学科，是作为单核细胞分离产物从知情同意的健康供体或黑素瘤患者获得的(该健康志愿者为常规单采血细胞术供体，黑素瘤患者处于I期DC疫苗接种临床试验期间，该试验经过Erlangen-Nuerenberg大学的伦理委员会，以及Ludwig Institutefor Cancer Research，New York，USA的国际审查委员会批准)。就细胞分离器而言，采用的是Cobe Spectra(Cobe BCT，Inc.，Lakewood，CO，USA)或Fresenius ASTEC204(Fresenius AG，BadHomburg，Germany)。采用的Cobe spectra带有白细胞装置和MNC程序，采用的Fresenius ASTEC 204带有P1Y-Set和MNC程序。白细胞提取法期间，根据生产商的说明书采用酸-柠檬酸盐-葡萄糖配方A(ACD-A，Fresenius)作为抗凝物质。采用PBS(Prod，Nr.17-512，Bio-Whittaker，Walkersville，USA)/10％ACD-A(Fresenius AG)稀释(利用灌注器)将白细胞提取法产物充入600ml培养摇瓶中，继而添加含10％ACD-A的PBS至终体积480ml)后，通过室温下460g离心30分钟，以分离Lymphoprep(1.077g/ml；Nycomed Pharma，Oslo，Norway)中的PBMC(15ml lymphoprep被30ml稀释的白细胞提取法产物所覆盖)。在不含钙或镁但含有1mM EDTA(Bio Whittaker)的PBS中洗涤细胞三次，以第一次250g离心开始，第二次175g离心，第三次110g离心，每次12分钟，均于4℃进行。
自体单核细胞调节的培养基(MCM)的产生：使用前立即制备Ig包被的细菌培养板(85mm，Falcon 1005)。免疫球蛋白采用的是SandoglobinTM(Novartis，Basel，Switzerland)。室温下采用10ml稀释(采用不含钙或镁的PBS，Bio Whittaker)的免疫球蛋白(10μg/ml)进行包被10分钟。包被完成后，采用不含钙或镁的PBS(BioWhittaker)漂洗培养皿两次。将含有50×106个PBMC的无细胞因子完全培养基接种在这些培养皿上，并于37℃，5％CO2条件下温育20小时。继而收获单核细胞调节的培养基，1360g离心10分钟(22℃)，无菌过滤(0.22μm滤器，Millipore，Molsheim，France)并等分地冷冻于-20℃。在单核细胞调节的培养基的情况中，每孔(有3ml体积)添加750μl MCM，即20v/v％。可选地，添加细胞因子混合物(IL-1β+IL-6+TNF-α，浓度均为10ng/ml)或单独添加TNF-α(10-20-40ng/ml)。结合或不结合前列腺素E2(1μg/ml)对每种成熟诱导刺激物进行测试。也见培养基，细胞因子。
通过磁性细胞分选技术(MACS)对CD14+单核细胞的分离：采用CD14微磁珠(Miltenyi，Bergisch-Gladbach，Germany)并根据生产商的说明书进行阳性选择，以分离CD14+细胞(Miltenyi，S.et al.，cytometry，11，231(1990))。
单核细胞分离所用的可选方法
A)采用Aqua dest的裂解：将白细胞提取法产物充入50ml试管(每支试管10ml)中，离心(1100rpm，4℃ 12min)。弃去上清液，向沉淀部分添加20ml Aqua dest.，通过20秒的混匀，使其重新悬浮后，添加30ml补充有800U/ml GM-CSF的完全培养基。继而4℃下1100rpm离心该悬浮液12分钟，弃去上清液，向剩余物中添加50mlPBS/EDTA(1mM)。4℃下900rpm离心所获悬浮液12分钟，弃去上清液，并向剩余物中添加50ml PBS/EDTA。取出10μl细胞悬液以计数细胞。4℃下800rpm离心该悬浮液12分钟，弃去上清液，向剩余物中添加完全培养基(完全培养基：500ml RPMI 1640，5ml自体热灭活血浆，5ml谷氨酰胺和200μl庆大霉素)，并以常用方式将其接种进/充入培养皿中。
B)采用氯化铵的裂解：将白细胞提取法产物充入50ml试管(每支试管10ml)中，离心(1100rpm，4℃ 12min)。弃去上清液，采用10ml完全培养基(补充有800U/ml GM-CSF)重新悬浮沉淀，并添加10ml 1.6％NH4Cl。充分震荡得到悬浮液，将其放入水浴(37℃)温育5-15分钟。继而4℃下1100rpm离心该悬浮液12分钟，弃去上清液，向剩余物中添加50ml PBS/EDTA(1mM)。4℃下900rpm离心该悬浮液12分钟，弃去上清液，并向剩余物中添加50ml PBS/EDTA。取出10μl细胞悬液以计数细胞。4℃下800rpm离心该悬浮液12分钟，弃去上清液，向剩余物中添加完全培养基，并以常用方式将其接种进/倒入培养皿中。
流式细胞仪：由上文所列的mAbs组分析细胞群的表型，并如Romani et al.，J.Immuno.Methods，196，137(1996)中所描述方法在FACScan(Becton-Dickinson)上对细胞群进行分析。基于光散射特性剔除死细胞。
T细胞刺激/功能性测定；初级同种异体MLR：为检验T细胞的刺激功能，将分级剂量的DC添加到同种异体T细胞中，并在补充有庆大霉素、谷氨酰胺和5％同种异体热灭活人血浆(单一供体)的RPMI 1640中共同温育4-5天。在2×105个T细胞/孔的96孔平底板中进行检验。利用分离柱(TEBU，Frankfurt，Germany)并根据生产商的说明书分离T细胞。在三份的孔中通过添加50μl 3H胸腺嘧啶核苷(终浓度为4μCi/ml)测定增殖12-16小时。
T细胞刺激性/功能性测定；次级同种异体MLR：采用CD4/CD45RA-multisort试剂盒(Miltenyi，Bergisch-Gladbach，Germany)并根据生产商的说明书分离幼稚CD4T细胞。CD4+/CD45RA+细胞的纯度≥95％。将幼稚T细胞(3×106/孔)接种至大孔(24孔培养板，Falcon)中的RPMI1640，该RPMI1640补充有庆大霉素、谷氨酰胺和5％热灭活的同种异体人血浆(单一供体)，由成熟DC(3×105/孔)对该T细胞进行刺激。大约三天后，采用IL-2(Proleukin，Chiron，Emeryville，USA)(50U/ml)扩增T细胞。采用供体生产的成熟DC进行初级刺激后，再采用相同供体生产的成熟DC，并在相同条件下再次刺激T细胞两周。对再次刺激而言，是将3×106T细胞+3×105DC接种至24孔中。48小时后，收获上清液，于-20℃冷冻，之后如下文所述通过ELISA分析检测细胞因子。
流感病毒特异CTL的诱导；T细胞的制备：如(Bender et al.，1996)所描述，采用经过神经氨酸酶处理的绵羊红细胞进行玫瑰花环试验，以富集T淋巴细胞。
流感病毒特异CTL的诱导：洗涤从HLA-A2.1阳性供体制备的成熟DC，将其重新悬浮于RPMI1640中，浓度为0.5-1×107细胞/ml。添加活流感病毒，终浓度为1000HAU/ml，或者于37℃使DC加载50μg/ml流感基质肽(IMP)GILGFVFTL1小时。洗涤细胞3次，将3×104个细胞添加到24孔板(Falcon)中的1×106个纯化T细胞中。培养7天后，收获该T细胞，并采用铕释放分析检测其溶细胞活性。
测定溶细胞活性：洗涤3×106个靶细胞(HLA A2.1+，MHC II类阴性T2细胞)，并于37℃采用或不采用50μg/ml流感基质肽温育该靶细胞。洗涤后，采用含有3μl荧光增强配体(BATDA，Wallac，Turku，Finland)并补充有10％FCS的1ml培养基于37℃温育1×106个T2细胞15分钟。在PBS中至少洗涤细胞5次，并将其小心地重新悬浮在10％FCS培养基中。在平底96孔板中，37℃下，以效应细胞温育5×103个靶细胞2小时。效应物：靶比例为45∶1、20∶1和5∶1。2小时后，离心96孔板，将每孔内的上清液转移进新的96孔板中，并采用1420-002Victor TM多重标记计数器(Wallac，Turku，Finland)进行分析。
内吞活性的测定与TT的加工/呈递：在少数试验中，是如(Sallusto et al.1995)所描述方法精确测定FITC葡聚糖吸收。如(Romani et al.1996)所描述方法，采用破伤风类毒素-肽特异T细胞克隆AS11.15(由Lanzavecchia博士友好赠送，Basel Instituteof Immunology，Basel)检验破伤风类毒素的抗原加工/呈递活性。
细胞因子和PG E2 ELISA：就ELISA而言，采用特异于IL-6(PharMingen)和IL-1β、IL4、干扰素-γ、TNF-α(均获得自Endogen，Woburn，USA)的抗体包被微量滴定板(Nunc Maxisorb II圆底)4℃过夜。洗涤该板，并以1％人血清封闭。重复测定分析样品与标准三次，并采用抗生物素蛋白-过氧化物酶体系进行测定。就前列腺素E2ELISA而言，采用随时可用的试剂盒(Amersham Pharmacia，Buckinhamshire，UK)。在ELISA读板仪(Wallac，Turku，Finland)中，于405nm波长处检测板。
PBMC或DC的冷冻保存：采用全自动冷冻设备(Nicool Plus，AirLiquid，Bussy-Paris，France)(起点+6℃，终点-120℃，Tx-40℃)冷冻包含在冷冻介质中浓度为10-35×106PBMC/ml冷冻介质的PBMC，该冷冻介质由20％GMP质量的人血清白蛋白(Centeon，Marburg，Germany)+10％(v/v终浓度)DMSO(Sigma，St.Louis，USA；Cat.No.2650)组成。冷冻体积不超过4.5ml/瓶。在56℃加热水浴中解冻冷冻细胞，继而将其放入5ml冷的Hanks平衡盐(Bio Whittaker，Walkersville，USA)中，并4℃下125g离心一次10分钟。之后，如上述将PBMC制板。就冷冻DC而言，在培养的第5或7天，减少细胞密度到5-15×106DC/ml，但冷冻介质及冷冻操作仍然保持不变。
实施例1(比较实施例)：开放容器内DC的生产
从PBMC生产DC：根据Thurner，B.et al.，J.Immunol.Methods223，1-15(1999)公开的方法，将10ml完全培养基中的PBMC铺于85mm培养皿(细菌学Primaria或Tissue培养皿，Falcon，Cat.No.1005、3038或3003；Becton Dickinson，Hershey，USA)中，密度为每个培养皿50×106个细胞，在37℃、5％CO2条件下温育1小时。通过显微镜下控制贴附情况后，将不贴附成分移除，并添加10ml新鲜、温暖的完全培养基(第0天)。离心不贴附成分，再次将其铺于新的85mm组织培养皿中，使其重新贴附。贴附1小时后，将这些“重新铺板”的培养皿上的不贴附成分弃去。培养所有贴附成分1天，继而将培养基小心地取出，而不移除松散贴附的细胞，添加含有GM-CSF(终浓度为800U/ml)和IL-4(终浓度为1000U/ml)的新培养基。第3天，每个培养皿再次添加含有细胞因子的3ml新鲜培养基(含有8000U GM-CSF和10000U IL-4)。第5天，收获所有不贴附细胞。计数并加入新鲜完全培养基(含有如上所述相同剂量的细胞因子)后，置入6孔培养板中，每孔含3ml培养基，细胞密度为5×105个细胞/孔。第6天，添加不同的刺激物，以诱导DC成熟，并于第7或8天(在先导试验中，也为第9和10天)，收获细胞。
通过该方法获得的成熟DC具有如下特性(见Thurner，B.et al.，J.Immunol.Methods 223，1-15(1999))：
(a)在除去细胞因子并进一步培养36小时后仍保持形态稳定的非贴附隐蔽细胞；
(b)由细胞荧光分析测定，表现出成熟DC的特有表型；
(c)在初级同种异体MLR中，DC∶T比例为1∶≥300时表现出强的共刺激能力，并且对IL-10的抑制效应具有抗性(但未成熟DC(于GM-CSF+IL-4中生产，但未暴露于成熟诱导MCM)缺乏这些特性)；
(d)诱导强的溶细胞性T细胞应答；并
(e)显示CD1a表面表达(但在X-vivo15或X-vivo 20培养基中生产的大部分DC缺乏表面CD1a分子，虽然另外显示出可比较的表型)。
实施例2：在Nunc细胞工厂中树突细胞的制备
A.：在Nunc细胞工厂中从新鲜PBMC制备人树突细胞的方法
1.第0天PBMC的铺板：根据所获PBMC的数量，使用相应数目的组织培养容器。就每个细胞工厂组织培养皿而言，在每个含有200ml完全培养基的培养皿中铺1200×106个PBMC(例如，如果有3800×106个PBMC：1200×106×3＝3600×106；铺于3个细胞工厂中，其余作为PBMC冷冻保存)。将待铺板的细胞转移到50ml试管中，并再次离心(4℃，10分钟，700rpm/110×g)。
利用真空泵除去上清液后，将每个待铺板的细胞工厂所需的10ml培养基添加进去，以带起沉淀，并重新悬浮(＝细胞悬液)。标记每个细胞工厂(“患者姓名”)，加入190ml培养基后，每个细胞工厂添加10ml细胞悬液。小心地晃动培养皿，可使细胞均匀地水平分布在培养皿上，之后放入培养箱中温育1小时。
2.1小时后不贴附成分的移除，培养基的更换：60分钟后，用反射光显微镜检查是否实现细胞充分贴附(大约70％的培养皿表面应当被牢固贴附的稍长的细胞覆盖)在培养皿上。
当贴附充分时，通过小心搅拌细胞培养容器，以除去不贴附成分，并倒出不贴附细胞的培养基并加入无菌细胞培养罐中。再以140ml纯RPMI充入细胞培养容器中，再次搅拌，并再次倒出。再次重复该操作，添加200ml完全培养基，使其平衡后，加以新的密封圈和空气滤器。利用10ml注射器从流出的培养基中取出10ml，并将其注射进血液培养罐中。标记该罐，并立即置入培养箱中，继而进行细菌学检查。
在工作台下每次仅处理一个培养皿。然后，将该培养皿再次置入培养箱中温育24小时。
贴附不充分时，在将不贴附成分移除之前，将培养皿保留在培养箱中继续温育15-30分钟。
将不贴附成分收集在50ml试管中，并再次离心(900rpm/175×g，10min，18℃)。如上述(重新贴附)，将从每个细胞工厂收集的不贴附成分再次铺于1个装有100ml完全培养基的Nunc Triple烧瓶中，37℃再次温育60分钟。如上述再次移除不贴附部分(可将不贴附细胞丢弃到GMP部门之外或将其冷冻以供免疫监视)。
3.第1天细胞因子的添加：GM-CSF制备：在预热的原始穿刺罐Leukomax400中将所装的NaCl(1ml)溶解，并采用110ml PBS/2％人血清白蛋白(99ml PBS+11ml 20％HSA，由Behring提供)进行稀释。接着将等分试样分装入100个无菌1.5ml冷冻管中，并于-80℃保存。
IL-4制备：将原瓶中的干粉(Genzyme IL-4，4mg)放到室温，用100μl注射用水将其溶解，采用500μl PBS 2％HSA对其进行稀释。将每份50μl的等分试样分装入无菌1ml冷冻管中，并于-80℃保存。
每管用450μl RPMI稀释每份IL-4等分试样，待用。
从培养箱中小心地取出培养皿，并利用反射光显微镜进行检查。就每个细胞工厂而言，制备20ml培养基外加每份4800μl GM-CSF和每份180μl IL-4(共计240ml)，就每个Triple烧瓶而言，制备10ml培养基外加每份2000μl GM-CSF和每份75μl IL-4(共计100ml)(相当于800U/ml GM-CSF和500U/ml IL-4)。添加新培养基，并使其平衡。随后，将细胞再次转移到培养箱中温育48h。
4.第3天细胞因子的添加：将需要量的GM-CSF和IL-4解冻。将培养基保存在温暖的地方。就每个细胞工厂而言，制备40ml培养基外加每份6000μl GM-CSF和每份225μl IL-4(共计300ml)，就每个Triple烧瓶而言，制备20ml培养基外加每份2600μl GM-CSF和每份97.5μl IL-4(共计130ml)(相当于800U/ml GM-CSF和500U/mlIL-4)。
从培养箱中小心地取出培养皿，并利用反射光显微镜进行检查。添加新培养基，并使其平衡。随后，将细胞再次转移到培养箱中温育48h。
5.第5天细胞因子的添加：将需要量的GM-CSF和IL-4解冻。将培养基保存在温暖的地方。就每个细胞工厂而言，制备40ml培养基外加每份6000μl GM-CSF和每份225μl IL-4(共计300ml)，就每个Triple烧瓶而言，制备20ml培养基外加每份2600μl GM-CSF和每份97.5μl IL-4(共计130ml)(相当于800U/ml GM-CSF和500U/mlIL-4)。
从培养箱中小心地取出培养皿，并利用反射光显微镜进行检查。添加新培养基，并使其平衡。为使细胞均匀分布，小心地晃动培养皿，并将其再次转移进培养箱中。
6.第6天成熟混合物的添加：
在运转的工作台下，于室温将需要量的细胞因子(每ml培养基10μl成熟混合物)解冻。将成熟细胞因子溶解并浓缩，使得每毫升完全培养基添加10μl成熟混合物后，符合下述浓度。
各个细胞因子的终浓度/ml相当于：
2ng IL-1β(白细胞介素1β)
1000U IL-6(白细胞介素6)
10ng TNF-α(肿瘤坏死因子α)
1μg PG E2(前列腺素E2)
Cell工厂含有：每个细胞工厂355ml即3.55ml成熟混合物
Triple烧瓶：每个Triple烧瓶156ml即1.56ml成熟混合物
从培养箱中取出容器，并于反射光显微镜下进行评估。将上述量的成熟混合物转移进培养皿中，使其平衡后重新放入培养箱中。
7.第7天成熟树突细胞的收获：
如果第0天和第5天培养基的细菌学检查令人满意，即发现样品无菌后，便可如下进行DC的光学检查：
从培养箱中取出容器，在反射光显微镜下评估带有树突细胞的表面。利用反射光显微镜制备偏光照片。
如果细胞具有正常外观(几乎没有任何死细胞，几乎没有任何贴附，培养基为红色且清澈，无可见微生物，无污染迹象，请参见SOPDC12，第1项)，从细胞工厂中取出4ml细胞悬液，用于进行FACS分析。
如果FACS染色产生了足够的CD83表达(＞75％CD83阳性)，可收获细胞。如果CDE83表达还不足(＜75％)，进行新的FACS分析前有必要再等待3小时。
为收获细胞，将细胞工厂和Triple烧瓶中的内容物转移进50ml试管中。每次采用100ml RPMI漂洗细胞培养容器两次。4℃700rpm/110×g离心12分钟。
为冷冻细胞，制备含有20％DMSO的自体血清(可选的是含有20％DMSO和5％葡萄糖的20％人血清白蛋白)(例如添加有4ml DMSO的36ml血清)。于冰上冷却冷冻介质。
在参照管(3.6ml)中加有一半体积(1.8ml)的冷冻介质，另一半体积加有纯血清(可选的20％HSA)，使得DMSO终浓度为10％。启动冷冻设备。
为重复细菌学检查，将10ml上清液转移进血液培养罐中。向细胞中加入40ml培养基，继而取出40μl以供细胞计数。将10μl细胞悬液(添加有10μl台盼蓝)转移进Neubauer细胞计数室中，并根据生产商的说明书计数细胞。
需要1×106个DC以进行进一步的质量控制检验，在另一个1ml小瓶中再冷冻1×106个DC作为批对照。
在纯自体血清(可选的20％HSA)中浓度细胞，浓度约为20×106个/ml，并于冰上冷却。在冰上冷却事先标记的冷冻管，并在每只管中加入一半体积的冷却细胞悬液(如在每只3.6ml管中，加入1.8ml细胞悬液)。一旦冷冻设备已可以插入冷冻管，便将冷冻介质添加进冷却的细胞悬液中，以螺纹盖密封管子，震荡后置入冷冻设备中，启动冷冻过程。
冷冻过程完成后(达到-130℃)，将冷冻管转移进液氮中。
B：结论
采用上述操作，可实现9.26％的DC产率(19个患者白细胞提取法产物所获平均值)。CD83表达为89.53％。获得的DC表现出与实施例1中DC一致的特性。