发明内容
本发明的目的是提供一种利用FMDV 3D区域的基因序列设计合成的口蹄
疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂。
本发明的另一目的是提供这种检测试剂的制备方法。
本发明选择FMDV基因的3D区为靶目标，通过对GenBank中报道的FMDV DNA
序列(AF536534、AF536535、AF536536、AF536540、AF536537、AF536538、AF536539)
进行同源性分析比较，选定FMDV 3D区内较保守的片段(189bp)，应用primer
Express软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针，引物和探针的合成采
用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成，
探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标
记的荧光淬灭基团为TAMAR。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实
验后，确定扩增效率和特异性最好的二套引物和探针。通过FMDV病毒RNA和标
准阳性对照样品的制备，采用矩阵法进行引物和探针最佳浓度的精确筛选，以
获得最低的CT值和较高的荧光强度增加值(ΔRn)。通过建立标准曲线，然后用
FMDV细胞培养物、乳鼠组织、VSV、BTV17、BVDV、正常BHK21细胞、猪
牛的上皮组织等试验样品进行检测，对FMDV荧光定量RT-PCR的特异性、敏
感性和重复性试验，以及各参加反应组份最佳条件的筛选，最终建立FMDV荧
光定量RT-PCR标准化试剂和检测程序。
由上述确定扩增效率和特异性最好的二套引物和探针分述如下：
本发明所述的口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂包含一对特异性引物和
一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为86bp，引物和探针序列为
引物：FVP2-F：5’-TTA CAA ACC TGT GAT GGC CTC-3’
FVP2-R：5’-CGG AGA TCA ACT TCT CCT GTA TG-3’
探针：(FAM)5’-CCT CTC CTT TGC ACG CCG TGG-3’(TAMRA)。
本发明所述的口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂包含一对特异性引物和
一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为135bp，引物和探针序列为：
引物：FVP3-F：5’-CGT GGG ACC ATA CAG GAG AA-3’
FVP3-R：5’-CGC AGG TAA AGT GAT CTG TAG CTT-3’
探针：(FAM)5’-TGA TCT CCG TGG CAG GAC TCG C-3’(TAMRA)。
本发明所述的口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂的制备方法由以下步骤
组成：
一、选择FMDV基因的3D区为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序为列：
TTACAAACCTGTGATGGCCTCAAAGACCCTTGAGGCTATCCTCTCCTTTGCACGCCGTGG
GACCATACAGGAGAAGTTGATCTCCGTGGCAGGACTCGCCGTCCACTCTGGACCAGAC
GAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCCTTTCCAAGGTCTCTTTGAGATTCCAAGCTACAGATCA
CTTTACCTGCG；
二、应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针；
三、引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA
合成仪进行OligoDNA的合成；
四、探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，
3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR；
五、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，确定并得到
扩增效率和特异性好的引物和探针。
本发明的优点和积极效果为：
1、本申请人首次用FMDV 3D区域的基因序列的最保守片段，设计合成了
引物和探针，建立了荧光定量RT-PCR并制备成检测试剂盒，可对细胞培养物、
水泡液、水泡皮及分泌物、血液、肉品中的FMDV进行快速检测，首次创立FMDV
荧光定量RT-PCR。
2、本试剂与常规的RT-PCR相比较，该方法具有快速、特异、敏感、可定
量，可同时检测大量样品等优点。FMDV荧光定量RT-PCR可对肉食品中低含量
的FMD病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测，是一种FMDV检测的良
好方法。
3、本试剂可对细胞培养物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液、肉品等多种
样品中的FMDV进行快速检测，样品适用范围广，没有生物安全隐患，使用安
全的优点。
4、本荧光定量RT-PCR试剂除了具有特异性高、敏感性强外，可同时进行
大量样品检测，具有高通量性，可减少RNA、cDNA或PCR产物污染的风险。比
常规PCR快速，无需扩增后的电泳分析。克服了常规RT-PCR和免疫捕获RT-PCR
产生的产物须电泳检测、费时、不敏感和不能定量的缺点。
5、与常规PCR相比，荧光PCR作出一个定量的、客观的估计，判定出阳性、
阴性和可疑。CT值为40.00可确定为阳性和阴性的临界值(cut-off)。更重要
的是，荧光PCR具有很高的外、内试验重复性。荧光RT-PCR特别适用于保存
时间长而无法进行分离病毒的大批量样品的检测。
6、本试剂可在收到样品后4小时之内作出定性、定量检测结果。与FMDV
ELISA检测结果的阳性检出率低、细胞培养分离病毒需要4天时间相比。该荧
光RT-PCR试剂是一种检测临床样品中FMDV的敏感和可靠的方法。
具体实施方式
1、设计引物和探针
本发明选择FMDV基因的3D区为靶目标，通过对GenBank中报道的FMDV DNA
序列(AF536534、AF536535、AF536536、AF536540、AF536537、AF536538、AF536539)
进行同源性分析比较，选定FMDV 3D区内较保守的片段(189bp)，应用primer
Express软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针，引物和探针的合成采
用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成
探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标
记的荧光淬灭基团为TAMAR。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实
验后，确定扩增效率和特异性最好的二套引物和探针。第一套引物和探针
(FMDVP2-F/FMDVP2-R)扩增目标片段长度为86bp，第二套引物和探针(FMDVP3-F
/FMDVP3-R)扩增目标片段长度为135bp。
2、RNA提取
FMDV病毒RNA和标准品同时制备。参照黄祯祥主编《医学病毒学基础及实
验技术》，科学出版社(1990年)第143-146页，先测定毒价，以Reed和Muench
氏法计算TCID50。取100μL病毒原液，参照卢圣栋主编《分子生物学实验室常
用技术》，科学出版社(1999年)第61-62页，酚/氯仿核酸抽提法提取RNA。
用无RNA酶的超纯水溶解总RNA，稀释成相当于10000、1000、100、10、1、0.1TCID50
的每个反应管。水泡皮、水泡液、血液(抗凝血)、血清和细胞组织等材料直
接提取RNA。荧光RT-PCR和常规RT-PCR试验用同批次提取的RNA。
3、FMDV荧光定量RT-PCR
FMDV荧光定量RT-PCR采用25μL体积反应液，在7000型荧光定量PCR
仪中，按下列反应参数进行：42℃30min反转录；92℃变性3min；92℃变性10min，
45℃30sec，72℃1min，预扩增5个循环；然后以92℃10sec，60℃30sec扩增
40个循环。
引物和探针的浓度进行精确筛选，以获得最低的CT值和较高的荧光强度增加
值(ΔRn)。每次检测时，设立用水代替病毒RNA样品的4个阴性对照(或正常
组织、细胞阴性对照)；设立相当于1000、100、10、1TCID50/每反应管的FMDV
标准各4个对照；每个样品检测做3管平行试验。在4个阴性对照为阴性、阳
性对照为阳性时，整个试验有效，可进一步判定结果。每个样品须作多个备份，
以进行稳定性、重复性试验。
4、常规RT-PCR
常规RT-PCR的上游引物用FVP2-F：5’-TTA CAA ACC TGT GAT GGC
CTC-3’，下游引物用FVP3-R：5’-CGC AGG TAA AGT GAT CTG TAG CTT-3’，
扩增目标片段长度为189bp，按常规方法进行扩增。检测用2％琼脂糖电泳分析，
阳性扩增结果出现一条189bp特异性条带。
5、FMDV荧光定量RT-PCR的特异性、敏感性
用VSV、BVD、BTV、EHD、AKAV以及正常BHK21细胞、野外采集猪、牛的组
织样品和血清进行特异性比较检测。对FMDV细胞培养物、人工感染乳鼠组织样
品进行10倍系列稀释，用常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测，比较它们的敏
感性。
6、荧光定量RT-PCR稳定性和重复性试验
在评估FMDV荧光定量RT-PCR检测FMDV方法中的组内和组间试验的
重现性、稳定性时，用相当于1000TCID50的样品RNA，在同样反应条件下，反
复进行荧光定量RT-PCR检测，每次试验的每个样品做6个平行的反应管，重
复12次。
7、标准阳性对照样品的制备、标准曲线的建立及核酸拷贝数的计算
所用的标准阳性对照样品为含有目的扩增片段的质粒pBAD-3D，由本实验室
用pBAD/Thio TOPO载体构建。质粒转化大肠杆菌TOP10，LB培养基(含Amp100
μg/mL)增殖，碱裂解法提取，经试剂盒纯化，质粒浓度用分光光度计测OD260
定量。模板浓度的计算：在作绝对定量时，首先制备标准曲线。对标准品进行
10-1、10-2、10-3、10-4～10-7稀释，通过测OD知道质粒原液(标准品)
的浓度后，可计算出每个PCR管中模板的数量。例如，已知pBAD/Thio TOPO载
体长4436bp，插入的FMDV 3D目的片断长189bp，每个碱基的平均分子量是
330，(每对碱基/bp是660，)质粒原液约250μg/mL，阿弗加德罗常数(每
mol的微粒数)是6.02×1023/mol。那么每2μL的绝对模板数量是：(250
μg/mL×2μL×6.02×1023/mol)/[(4436+189)bp×660g/(mol×bp)]＝98.6
×1018。据此，10-4～10-7质粒的模板分子数是98.6×1014～1011。做荧
光定量RT-PCR检测，以拷贝数或TCID50的对数为X轴，CT值为Y轴作回归
曲线，获得标准曲线。
8、引物和探针及其浓度的筛选
选择引物、探针、模板的最佳浓度配比，获得荧光定量RT-PCR反应的最
低CT值和最高ΔRn，提高扩增效率和敏感性。应用含有目的片段的质粒标准品
和FMDV细胞毒，经系列稀释，制备DNA和RNA不同含量的检测样品。对设
计的二对引物和各自的探针，选用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和
500nM的引物和探针终浓度，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度。
9、对FMDV样品的检测
用荧光定量RT-PCR对FMDV细胞培养物、乳鼠组织、VSV、BTV17、
BVDV、正常BHK21细胞、猪牛的上皮组织等试验样品进行检测。提取的RNA
稀释后检测，阳性样品的CT值均小于或等于38.50，阴性对照样品的CT值均大
于40，试验特异性强。CT值40.00可作为是阳性和阴性的临界值。CT值大于40
可判为阴性，CT值小于或等于38.50可判为阳性，在38.50-40之间为可疑，须
重新试验。用第一套引物和探针进行检测FMDV的荧光定量RT-PCR特异性高，
强阳性样品的CT值小于28.00，试验的敏感性高，稳定性、可靠性、重复性很
好。
10、FMDV荧光定量RT-PCR标准化试剂和检测程序
10.1试剂盒组成
组成成份(48tests/盒)
体积
样本处理试剂
裂解液
核酸扩增试剂
DEPC水
FMDV RT-PCR反应液
RT-PCR酶(带盖PCR反应管装)
Taq酶(5U/ul)
对照品
阴性对照
阳性对照(非感染性体外转录RNA)
5ml×6瓶
1ml×1管
750ul×1管
1颗/管×12管
12ul×1管
1ml×1管
1ml×1管
定量用标准对照品(重组质粒)
0.5ml×1管
10.2操作方法
10.2.1样本处理(样本处理区)
取n个1.5ml灭菌离心管(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，
作好标记。
首先加入600ul裂解液(裂解液有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否
则立即用大量清水冲洗并擦干)，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性
对照各200ul(一份样本换用一个吸头)；再加入200ul氯仿，混匀器上振荡
混匀5sec(不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀)。
于12,000g离心15min(如有条件，于4℃进行离心)。
取与步骤1.1.中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400ul异丙醇(-20
℃预冷)，作好标记。吸取步骤1.3.各管中的上清液相转移至相应的管中(上
清液应至少吸取500ul，注意不要吸出中间层，该层富含DNA和蛋白质)，颠
倒混匀。
●12,000g离心15min，(注意固定离心管方向，即将离心管开口朝离心机转轴
方向放置)。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在吸
水纸不同地方沾干)；加入600ul 75％乙醇，颠倒洗涤。
●12,000g离心10min，(注意固定离心管方向，即将离心管开口朝离心机转轴
方向放置)。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体(不同样品应
在吸水纸不同地方沾干)。
●4,000g离心10sec(注意固定离心管方向，即将离心管开口朝离心机转轴方
向放置)将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干(一
份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面)，室温干燥3min(不
宜过于干燥，以免RNA不溶)。
●加入11ul DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000g离心5sec，冰上
保存备用(注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩
增)。
10.2.2扩增试剂准备(PCR前准备区)
●从试剂盒中取出FMDV RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2,000rpm离心
5sec。设所管数为n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试
反应体系配制如下表：
试剂
FMDV RT-PCR反应液
Taq酶
用量
15ul
0.25ul
●计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入n/4颗RT-PCR酶颗
粒，充分混合均匀，向每个反应管中各分装15ul，转移至样本处理区。
10.2.3加样(样本处理区)
●在各设定的反应管中分别加入上述样本处理步骤1.8.中制备的RNA溶液各10ul，
盖紧管盖，放入离心机中，于2,000rpm离心5sec。将反应管排好放入PCR
荧光检测仪内，记录样本摆放顺序。
10.2.4 RT-PCR反应(检测区)
●循环条件设置
Program
cycles
Temperature
(℃)
Incubation
Time(min∶sec)
Temperature Transition
Rate(℃/sec)
Acquisiton
Mode
Analysis
Mode
1
1
42
30∶0
20
None
None
2
1
92
3∶00
20
None
None
3
5
92
10
20
None
None
45
30
20
None
72
1∶00
20
None
4
40
92
10
20
None
Quantification
60
30
20
Single
5
1
40
0
20
None
None
10.2.5结果分析条件设定
读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线
的最高点，结果显示阴性为准。
10.2.6质控标准
●阴性对照的检测结果为阴性。
●阳性对照的Ct值应小于等于28.0。
10.2.7结果判断
●Ct值无数值的样本为阴性样本。
●Ct值≤38.5的样本为阳性。
●Ct值大于38.5的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。
10.2.8定量检测
在作绝对定量检测时，首先制备标准曲线。对试剂盒中提供的定量用标准对照
品(重组质粒)，按说明书要求进行序列稀释，与被检样品同时进行荧光定量RT-PCR
检测。以标准品的拷贝数的对数为X轴，CT值为Y轴作回归曲线，获得标准曲
线，即可对被样品进行定量。