一种蟾酥提取物及其制备方法.pdf

本发明公开了一种蟾酥提取物及其制备方法，该制备方法包括：①将蟾酥药材用无水乙醇回流提取；②将上述提取液浓缩，经硅胶柱分离，用体积比为3～10∶1的石油醚和丙酮等度洗脱，收集洗脱液，过滤，蒸干即得含有三种蟾毒配基混合物的蟾酥提取物。本发明的制备方法简便、易于操作并适于工业化生产，制得的本发明蟾酥提取物中三种蟾毒配基混合物的含量均≥90％。

权利要求书
1、  一种蟾酥提取物，其含有重量百分比≥90％的脂蟾毒配基、华蟾毒精和蟾毒灵三种蟾毒配基混合物。

2、  如权利要求1所述的蟾酥提取物，其特征在于该三种蟾毒配基混合物在蟾酥提取物中的含量为91～99％。

3、  如权利要求1所述的蟾酥提取物的制备方法，其包括下列步骤：
①将蟾酥药材用无水乙醇回流提取；
②将上述提取液浓缩浓缩后经硅胶柱分离，用体积比为3～10∶1的石油醚和丙酮等度洗脱，收集洗脱液，过滤，蒸干即得含有三种蟾毒配基混合物的蟾酥提取物。

4、  如权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤①中所述的蟾酥药材为蟾酥粉，每次提取时药材与无水乙醇的比例为1g∶5～20ml，提取时间为20～60分钟，共提取1～3次。

5、  如权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤②中将浓缩的提取液加入硅胶拌样，蒸干得拌样硅胶，所得拌样硅胶干法上样。

6、  如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的加入硅胶的重量为蟾酥药材重量的0.5～3倍。

7、  如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的加入硅胶的重量为蟾酥药材重量的0.6～1倍。

8、  如权利要求5所述的制备方法，其特征在于在所得拌样硅胶干法上样前先将硅胶湿法装柱，预先用所述洗脱剂石油醚和丙酮浸泡洗脱。

9、  如权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤②中洗脱剂石油醚和丙酮的体积比为4～6∶1。

10、  如权利要求3～9任一项所述的制备方法，其特征在于所述的硅胶为100～160目的粗孔硅胶。

说明书一种蟾酥提取物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种蟾酥提取物及其制备方法，该蟾酥提取物的主要成分为脂蟾毒配基、华蟾毒精和蟾毒灵这三种蟾毒配基混合物。
背景技术
药用蟾蜍为两栖纲蟾蜍科动物中华大蟾蜍(Bufo bufogargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)。蟾酥为中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液，经加工干燥制成。古今验方广泛应用蟾蜍、蟾酥拔毒消肿、定痛杀虫、强心利尿。经现代科学研究，发现蟾酥中的脂蟾毒配基、华蟾毒精、蟾毒灵三种脂溶性成分的混合物不但具有明显的抗肿瘤作用，而且还能将肿瘤细胞转化为正常细胞(诱导肿瘤细胞分化)、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞新生血管形成、降低肿瘤转移等作用。
中国专利申请“蟾蜍或蟾酥中三种抗癌化合物的制剂及其制备方法”(申请号：200610045893.7，公开号为1810827A)使用乙醇、丙酮等有机溶剂提取，提取物经硅胶、氧化铝等色谱柱分离，并以不同比例石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇等溶剂梯度洗脱的方法分别得到脂蟾毒配基、华蟾毒精、蟾毒灵三种脂溶性成分，合并取得此三种蟾毒配基混合物，其总含量高于80％。但其中许多条件如溶剂的浓度、样品上样方法及洗脱剂的具体比例等都尚未公开，且梯度洗脱操作复杂、费时。此外，从安全性和疗效的角度考虑，三种脂溶性成分的总含量有待进一步提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题即是提供一种脂蟾毒配基、华蟾毒精、蟾毒灵三种蟾毒配基混合物含量超过90％的蟾酥提取物及其制备方法。
本发明人经过试验惊奇地发现，采用无水乙醇为提取溶剂；并且采用一定比例的石油醚和丙酮等度洗脱，不仅提取效率高，简化了步骤，还进一步提高了上述三种蟾毒配基混合物含量，可以达到90％水平以上。
本发明提供的一种蟾酥提取物的制备方法，其包括下列步骤：
①将蟾酥药材用无水乙醇回流提取；
②将上述提取液浓缩后经硅胶柱分离，用体积比为3～10∶1的石油醚和丙酮等度洗脱，收集洗脱液，过滤，蒸干即得含有三种蟾毒配基混合物的蟾酥提取物。
较佳地，为增加提取效率及节约提取溶剂，步骤①中所述的蟾酥药材通常先研磨粉碎成粉(过60目筛)；而综合考虑提取效果及所需的成本、时间，每次提取时药材与无水乙醇的比例优选1g∶5～20ml，更优选1g∶10～12.5ml；每次提取时间优选20～60分钟，一般在40分钟左右；共提取1～3次。
较佳地，为增大上样量，易于工业化生产，步骤②中将浓缩的提取液加入硅胶拌样，蒸干得拌样硅胶，所得拌样硅胶干法上样。其中，加入硅胶的量以能完全吸附蟾酥提取物浓缩液为宜，优选为最初称取的蟾酥药材重量的0.5～3倍左右，更优选0.6～1倍。
更佳地，为达到更好的纯化效果，在所得拌样硅胶干法上样前先将硅胶湿法装柱，预先用所述洗脱剂石油醚和丙酮浸泡洗脱。
本发明步骤②中洗脱剂石油醚和丙酮的更佳体积比为4～6∶1。
本发明优选的硅胶为100～160目的粗孔硅胶。
采用本发明上述制备方法制得的蟾酥提取物中脂蟾毒配基、华蟾毒精、蟾毒灵这三种蟾毒配基混合物的重量百分比含量均在90％以上，通常在91～99％范围。
本发明与现有技术相比，其优点在于采用绿色安全的乙醇溶剂提取，采用上样量较大的干法上样，使用等度洗脱，简化了纯化方法，进一步提高了三种脂溶性成分的总含量，达到高于90％水平。并且，本发明提取纯化方法及所用设备简单，成本较低，操作简便，耗时较短，易于工业化生产，三种脂溶性成分可以得到较好的纯化，纯化效率高，纯化纯度大幅提高，减小了药物的毒副作用，可以提高药物的安全有效性。
附图说明
图1为本发明蟾酥提取物经纯化后的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
实施例1
取蟾酥药材1克，加无水乙醇10ml，加热回流40min，上述条件下提2次。将提取液趁热过滤，旋蒸浓缩后加入0.9克硅胶拌样，得拌样硅胶。取20克硅胶以石油醚∶丙酮(体积比5∶1)浸泡后湿法装柱，加入拌样硅胶，用石油醚∶丙酮(体积比5∶1)洗脱剂进行等度洗脱。通过HPLC鉴别(如图1所示，保留时间为7.184min的为蟾毒灵，8.886min的为华蟾毒精，9.549min的为脂蟾毒配基)，收集含有这三种脂溶性成分的洗脱液，蒸干，即得本发明蟾酥提取物，其中三种蟾毒配基混合物占整个提取物的重量百分比为98.01％。
实施例2
取蟾酥药材2克，加无水乙醇25ml，加热回流40min，上述条件下提2次。将提取液趁热过滤，旋蒸浓缩后加入1.8克硅胶拌样，得拌样硅胶。取22克硅胶以石油醚∶丙酮(体积比5∶1)浸泡后湿法装柱，加入拌样硅胶，用石油醚∶丙酮(体积比5∶1)洗脱剂进行等度洗脱。通过HPLC鉴别，收集含有脂蟾毒配基、华蟾毒精、蟾毒灵这三种脂溶性成分的洗脱液，蒸干，即得本发明蟾酥提取物，其中三种蟾毒配基混合物含量为97.94％。
实施例3
取蟾酥药材3克，加无水乙醇35ml，加热回流40min，上述条件下提2次。将提取液趁热过滤，旋蒸浓缩后加入3克硅胶拌样，得拌样硅胶。取22克硅胶以石油醚∶丙酮(体积比5∶1)浸泡后湿法装柱，加入拌样硅胶，用石油醚∶丙酮(体积比5∶1)洗脱剂进行等度洗脱。通过HPLC鉴别，收集含有脂蟾毒配基、华蟾毒精、蟾毒灵这三种脂溶性成分的洗脱液，蒸干，即得本发明蟾酥提取物，其中三种蟾毒配基混合物含量为99.08％。
实施例4
取蟾酥药材2克，加无水乙醇15ml，加热回流40min，上述条件下提3次。将提取液趁热过滤，旋蒸浓缩后加入1.8克硅胶拌样，得拌样硅胶。取22克硅胶以石油醚∶丙酮(体积比6∶1)浸泡后湿法装柱，加入拌样硅胶，用石油醚∶丙酮(体积比6∶1)洗脱剂进行等度洗脱。通过HPLC鉴别，收集含有脂蟾毒配基、华蟾毒精、蟾毒灵这三种脂溶性成分的洗脱液，蒸干，即得本发明蟾酥提取物，其中三种蟾毒配基混合物含量为96.37％。
实施例5
取蟾酥药材2克，加无水乙醇10ml，加热回流20min，上述条件下提3次。将提取液趁热过滤，旋蒸浓缩后加入1克硅胶拌样，得拌样硅胶。取22克硅胶以石油醚∶丙酮(体积比4∶1)浸泡后湿法装柱，加入拌样硅胶，用石油醚∶丙酮(体积比4∶1)洗脱剂进行等度洗脱。通过HPLC鉴别，收集含有脂蟾毒配基、华蟾毒精、蟾毒灵这三种脂溶性成分的洗脱液，蒸干，即得本发明蟾酥提取物，其中三种蟾毒配基混合物含量为91.06％。
实施例6
取蟾酥药材2克，加无水乙醇40ml，加热回流60min，上述条件下提1次。将提取液趁热过滤，旋蒸浓缩后加入2克硅胶拌样，得拌样硅胶。取22克硅胶以石油醚∶丙酮(体积比3∶1)浸泡后湿法装柱，加入拌样硅胶，用石油醚∶丙酮(体积比3∶1)洗脱剂进行等度洗脱。通过HPLC鉴别，收集含有脂蟾毒配基、华蟾毒精、蟾毒灵这三种脂溶性成分的洗脱液，蒸干，即得本发明蟾酥提取物，其中三种蟾毒配基混合物含量为90.33％。
实施例7
取蟾酥药材1克，加无水乙醇15ml，加热回流40min，上述条件下提2次。将提取液趁热过滤，旋蒸浓缩后加入3克硅胶拌样，得拌样硅胶。取21克硅胶以石油醚∶丙酮(体积比10∶1)浸泡后湿法装柱，加入拌样硅胶，用石油醚∶丙酮(体积比10∶1)洗脱剂进行等度洗脱。通过HPLC鉴别，收集含有脂蟾毒配基、华蟾毒精、蟾毒灵这三种脂溶性成分的洗脱液，蒸干，即得本发明蟾酥提取物，其中三种蟾毒配基混合物含量为95.38％。
上述实施例中所述的蟾酥药材购自江苏宝应兴平蟾蜍养殖基地，粉碎研磨至60目左右；硅胶为青岛美高集团产品，粗孔，100～160目，柱直径2厘米，柱高20厘米。