一种减缓眼部新生血管生成的药物 本发明涉及一种甾体化合物(I)用于抑制眼部新生血管生成的药物中的应用。本发明涉及该种药物相关制剂的制备。
【发明背景】
已知有多种药物可抑制新血管的形成(血管生成或新生血管形成)。例如，在Crum等人的“一类新的类固醇在肝素或肝素片段的存在下抑制血管生成”(A New Class of steroidsInhibits Angiogenesis in the Presence Of Heparin or a Heparin Fragment，Science，Vol.230：1375-1378，1985年12月20日)一文中，公开了可在肝素或特定肝素片段的存在下抑制血管生成的类固醇。作者将所述类固醇称为“血管抑制(angiostatic)”类固醇。此类被发现具有血管抑制作用的类固醇中所包括的有可的松和去氧可的松的二氢和四氢代谢物。在测试有关所述机理的假说的后续研究中证明：肝素/血管抑制类固醇组合物导致基底膜支架溶解，在所述支架上连接有贴壁依赖性内皮，从而导致毛细管萎缩(involution)；其中所述机制是类固醇通过其来抑制血管生成的机制；参见Ingber等人的“通过血管抑制类固醇来抑制血管生成的可能机理：毛细管基底膜溶解的诱导”(A Possible Mechanism forInhibition of Angiogenesis by Angiostatic Steroids：Induction of Capillary BasementMembrane Dissolution，Endocrinology Vol.119：1768-1775，1986)。
在Aristoff等人的美国专利US 4,975,537中公开了一组可用于抑制血管生成的四氢类固醇.该专利公开所述化合物可用于治疗头部创伤、脊柱创伤、败血症性休克或创伤性休克、中风和出血性休克。此外，该专利还讨论了这些化合物在胚胎植入以及在治疗癌症、关节炎和动脉硬化中的作用。在美国专利us4771,042中公开了Aristoff等人的专利中所公开的某些类固醇与肝素或肝素片段组合来抑制温血动物的血管生成。Li等人，“通过硫酸化环糊精而增强效力的血管抑制类固醇抑制角膜新生血管形成”(Angiostatic SteroidsPotentiated by Sulphated Cyclodextrin Inhibit Corneal Neovascularization)，Investigative ophthalmology and Visual Science，Vol 32(11)：2898-2905，1991年10月。类固醇单独使用可使新生血管形成多少减轻一些，但是仅单独使用不能有效消退新生血管形成。
四氢可的松已经作为血管抑制类固醇，在Folkman等人的“血管抑制类固醇”(Angiostatic steroids，Ann.Surg，Vol.206(3)，1987)一文中公开，其中该文献提出血管抑制类固醇可能可用于治疗由新生血管形成异常所控制的疾病，包括糖尿病性视网膜病、新生血管性青光眼以及晶状体后纤维组织形成。
CN03818826中介绍了乙酸阿奈可他是一种开发用于抑制眼睛新血管生成的血管抑制剂。该发明涉及用于预防AMD相关性视力丧失、维持AMD患者的视力以及抑制AMD相关性损害发展的制剂和方法。该制剂和方法涉及巩膜旁施用3-30mg的乙酸阿奈可他或其相应的醇以提供经巩膜的药物释放。
CN200480004351中介绍了乙酸阿奈可他与糖皮质激素的组合物治疗病理性眼血管生成及任何相关水肿的方法。
发明概述
本发明涉及使用含有式(I)化合物、其生理学上可接受的溶剂合物或其药学上可接受盐在减慢眼部新生血管生成的药物中的应用。
发明详述：
眼部新生血管生成造成的疾病涉及角膜、虹膜、脉络膜及视网膜等，其造成的渗出、出血和增生等病理改变对眼部结构和功能的损害，是引起视力障碍的重要原因。大部分眼疾病均存在炎症、缺血、缺氧等病理过程；因此，眼病与眼部新生血管形成有密切的关系。其中眼部新生血管生成造成的疾病包括：
角膜新生血管性眼病：在与角膜新生血管相关的眼部疾病中，最常见的是配戴角膜接触镜所致的角膜新生血管性疾病，其他引起角膜新生血管的眼部疾病有角膜外伤，碱及其他化学物质烧伤，角膜手术，各种感染包括细菌感染、衣原体感染、病毒感染(单疱病毒和带状疱疹病毒等)、原虫感染(利什曼原虫)等。
虹膜新生血管性眼病：常见有新生血管性青光眼，而视网膜脱离、创伤、糖尿病视网膜病变、肿瘤(视网膜母细胞瘤)、视网膜中央静脉栓塞等是其常见的诱因。
视网膜新生血管性眼病：糖尿病、肿瘤、视网膜脱离、视网膜中央静脉阻塞、视网膜静脉周围炎、全身性红斑狼疮、Eales病、Coat病、Takavas病等均可引起。
脉络膜新生血管性眼病：老年性黄斑变性、高度近视、中心性渗出性视网膜脉络膜炎、创伤、肿瘤、眼组织胞浆菌病综合征、匍行性脉络膜病变等均可引起该种眼病。
一般认为，眼部新生血管的形成过程为：血管基底膜上的酶出现降解；内皮细胞趋化、迁移；内皮细胞出现有丝分裂；内皮细胞和周围细胞相互作用，血管管腔形成。而内皮细胞在新生血管的形成过程中起着主导作。所以对于可以减慢某种眼部新生血管生成的某种药物，一般也可以减慢其他类眼部新生血管生成，但是由于眼部结构的特点，对于角膜、脉络膜、虹膜、视网膜的新生血管生成，治疗时药物作用的位置不同，另外近些年来对于脉络膜、虹膜、视网膜的新生血管生成除了采用在不同位置注射外，还可以采取埋植药物的方法。
治疗眼部新生血管生成的方法有：
药物治疗：皮质激素有抗白细胞浸润、抗炎及抗合成代谢作用，能抑制未成熟的血管组织生长，可预防眼部新生血管形成。对与炎症有关的角膜新生血管，糖皮质激素、非激素类抗炎药如消炎痛及抗生素等亦有效。但皮质激素的副作用与并发症甚多，如激素性青光眼、白内障和感染等；非激素类抗炎药如flurbiprofen(氟联苯丙酸)、消炎痛可抑制体内前列腺素(PG)的生物合成，用于角膜新生血管的预防和治疗，其疗效优于皮质激素或与其相当，且副作用与合并症较少，α-干扰素(α-IFN)通过有效地抑制血管内皮细胞的生长与迁移，抑制新生血管的生成，对实验性虹膜新生血管具有一定的治疗作用，目前亦试用于眼部新生血管性疾病的治疗，可减少光凝所致视网膜损害；对屈光介质混浊不能进行激光光凝治疗的病人亦可选择α-干扰素疗法。虽然各种药物均可在不同程度上产生对新生血管的防治作用，但目前临床尚缺乏特异性强、疗效显著、副作用小的药物。
激光治疗：激光光凝是治疗新生血管性青光眼的方法之一，但术中和术后仍有相当比例的患者发生不同类型和不同程度的并发症。目前，激光光凝是治疗视网膜新生血管较为有效的方法，但光凝疗法本身又可引起视网膜新生血管。再者，激光治疗对眼底正常组织能产生破坏作用，常导致中心视力下降，且新生血管的残留率和复发率都较高，亦只能适用于当新生血管位于黄斑中心凹无血管区200μ范围以外的患者，200μ范围以内者不能使用光凝。
光动力学疗法：光动力学疗法(photodynamic therapy，PDT)作为一种有选择性、非热效应的方治疗眼部新生血管，可以减少对正常组织的损伤，特别是对治疗老年性黄斑变性(AMD)的脉络膜新生血管具有临床应用价值，为激光治疗眼部新生血管性疾病开辟了新途径，但目前还在摸索中。
手术治疗：对老年黄斑变性病人采用手术摘除旁中心或中心凹下的脉络膜新生血管(CNV)，术后病人自觉视力改善。但也有研究表明，CNV手术摘除后会出现视网膜色素上皮(RPE)功能障碍，影响了视力的恢复：因此，对手术的危险因素和远期疗效等仍有待探讨。
通过对血管抑制类固醇结构的研究，我们很惊奇的发现式(I)化合物、其生理学上可接受的溶剂合物或其药学上可接受盐，可以作为在制备减慢病理性眼血管生成的药物中的应用。
式(I)化合物、其生理学上可接受的溶剂合物、其药学上可接受酯或酸盐在制备减缓眼部新生血管性疾病的药物中的应用。
式(I)
其中，R1＝H、卤素、OH或OCOR7，R7＝H或C1-C6碳链；R2＝H、α-OH或α-OCOR8，R8＝C1-C6碳链；R3＝H、OH或α、βC1-3烷基；R2，R3＝α环氧或双键；R4＝H，α、βC1-3烷基或α、β卤素；R5，R6＝CH；或R2＝OH且R3＝α、β位含有C1-3烷基时，R4为α、βC1-3烷基或α、β卤素。优选R1＝OH、H或OCOR7，R7＝H或C1-C6碳链，R2＝α-OH或α-OCOR8，R3＝H、α或β-CH3，R4＝α-CH3，R5，R6＝CH，R8＝C1-C6碳链。更优选R1＝OH或OCOR7，R7＝H或C1-C6碳链，R2＝α-OH，R3＝H、α或β-CH3，R4＝α-CH3，R5，R6＝CH。特优选R1＝OCOR7，R7＝C1-C3碳链，R2＝OH或α-OCOR8，R3＝H，R4＝H或α-CH3，R5，R6＝CH，R8＝CH3。
上述任一项化合物中碳链为由碳和氢原子组成的直链、支链或环形的烷、烯、炔；优选为由碳和氢原子组成的直链的烷。
上述眼部新生血管生成疾病优选是指角膜新生血管性眼病和脉络膜新生血管性眼病；优选角膜新生血管性眼病；更优选配戴角膜接触镜所致的角膜新生血管性疾病。脉络膜新生血管性眼病优选指老年性黄斑变性。
一种药物组合物，含有上述任一项化合物及可用于眼部的药用辅料。其中眼部的药用辅料含有水、凡士林、羊毛脂的一种或几种。眼部的药用辅料含有载体、pH调节剂、助溶剂、渗透压调节剂、抑菌剂、增粘剂、粘度调节剂、粘度调节剂、表面活性剂中的一种或几种。其中载体是水、凡士林、羊毛脂中的一种或几种。渗透压调节剂是丙二醇、丙三醇中的一种或几种。pH调节剂为可溶于水的盐。
上述任一项的化合物，减缓眼部新生血管性疾病的剂量也可为0.01mg/天-10mg/天，优选单眼剂量为0.01mg/天-2mg/天。
上述的所有组合物，减缓眼部新生血管性疾病的剂量也可为0.01mg/天-10mg/天，优选单眼剂量为0.01mg/天-2mg/天。
上述任一项的化合物，减缓眼部新生血管性疾病的剂量也可为0.1mg-5mg/周，优选单眼剂量为0.1mg-1mg/周。
上述的所有组合物，减缓眼部新生血管性疾病的剂量也可为0.1mg-5mg/周，优选单眼剂量为0.1mg-1mg/周。
上述的所有组合物在制备减缓眼部新生血管性疾病的药物中的应用。其中眼部新生血管性疾病是角膜新生血管性眼病和脉络膜新生血管性眼病，优选角膜新生血管性眼病，更优选配戴角膜接触镜所致的角膜新生血管性疾病，脉络膜新生血管性眼病是老年性黄斑变性。
本发明中的式(I)化合物可以根据CN200510014479中介绍的方法合成，其药学上可接受盐可参见如地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙等糖皮质激素相关盐的合成，其生理学上可接受的溶剂合物也可参见如地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙等糖皮质激素相关溶剂合物的合成。
所述的药物组合物的滴眼剂辅料包括pH调节剂、助溶剂、渗透压调节剂、粘度调节剂、粘度调节剂、表面活性剂。和其他适用于滴眼剂的辅料。
所述滴眼剂辅料pH调节剂可以举出但不仅限于磷酸及其盐、硼酸及其盐、枸橼酸及其盐、醋酸及其盐、酒石酸及其盐、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氨基丁三醇等。
所述渗透压调节剂可以举出但不仅限于甘油、丙二醇、氯化钠、氯化钾、山梨糖醇、甘露醇等。
所述抑菌剂可以举出但不仅限于苯扎氯铵、苄索氯铵、山梨酸、山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯(尼泊金甲酯)、对羟基苯甲酸丙酯(尼泊金丙酯)、氯代丁醇等。
所述增粘剂可以举出但不仅限于羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯基醇、羧乙烯聚合物、聚乙烯基吡咯烷酮等。
所述的表面活性剂可以举出但不仅限于吐温-80，聚氧乙烯氢化蓖麻油60，聚乙二醇-硬脂酸酯，聚乙二醇4000，卵磷脂，蔗糖酯，聚氧乙烯烷基醚，聚氧硬脂酸盐，聚氧乙烯-聚氧丙烯二醇及其类似物。
当所述的药物组合物为眼膏剂时，所述辅料中的基质可以但不仅限于由羊毛脂、凡士林、液状石蜡构成。
所述的眼膏剂辅料还可以包括、抑菌剂、稳定剂等所有可以用于眼膏剂的辅料。
本发明所述的药物组合物可以抑制眼部新生血管生成，。
下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案，所述的实施例是为了解释和澄清本发明的技术方案，不能理解为对本发明的限制。
【具体实施方式】
实施例1
主料：孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-6α-甲基-21-醋酸酯 10.0g
(粒径5～20μm)
辅料：
羧甲基纤维素钠 2.0g
吐温-80 0.8g
磷酸二氢钠 4.35g
磷酸氢二钠 6.75g
氯化钠 4.0g
尼泊金乙酯 0.1g
尼泊金丙酯 0.1g
注射用水 1000ml
取处方量的尼泊金乙酯、尼泊金丙酯溶于处方量50％的注射用水中，加热至80～90℃，加入处方量的吐温-80、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠使溶解，用3号垂熔漏斗过滤，作为<1>液待用，羧甲基纤维素钠溶于处方量30％的注射用水中，用垫有200目尼龙布的布氏漏斗过滤，加热至80～90℃，加入处方量的孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-6α-甲基-21-醋酸酯搅匀，保温30min，冷至40～50℃作为<2>液，将<1>液与<2>液和并，加入余量的注射用水。调制好的滴眼剂pH为6.6。
实施例2
主料为孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21-丙酸酯，辅料配方及制备方法同实施例1。
实施例3
主料为孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21-醋酸酯-16α-甲基，辅料配方及制备方法同实施例1。
实施例4
主料为孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17-羟基-16-β-甲基，辅料配方及制备方法同实施例1。
实施例5
主料为孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17-羟基，辅料配方及制备方法同实施例1。
实施例6
主料为孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17-羟基-21-氯，辅料配方及制备方法同实施例1。
实施例7
主料为孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-17，21-双醋酸酯，辅料配方及制备方法同实施例1。
实施例8
主料为孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-16，17-环氧，辅料配方及制备方法同实施例1。
实施例9
主料为孕甾-1，4，9(11)，16(17)-四烯-3，20-双酮，辅料配方及制备方法同实施例1。
实施例10
主料：孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17-羟基-6α-甲基-21-氯-17-醋酸酯 1.0g
(粒径5～20μm)
辅料：
羧甲基纤维素钠 1.5g
吐温-80 1.0g
磷酸二氢钠 8.35g
氯化钠 4.0g
尼泊金乙酯 0.15g
尼泊金丙酯 0.15g
注射用水 1000ml
取处方量的尼泊金乙酯、尼泊金乙酯溶于处方量50％的注射用水中，加入处方量的磷酸二氢钠、氯化钠使溶解，用1N的氢氧化钠溶液将pH调至6.5，作为<1>液待用，甲基纤维素钠溶于处方量30％的注射用水中，用垫有200目尼龙布的布氏漏斗过滤，加热至80～90℃，加入处方量的孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17-羟基-6α-甲基-21-氯-17-醋酸酯搅匀，保温30min，冷至40～50℃作为<2>液，将<1>液与<2>液和并，加入余量的注射用水。
实施例11
主料：孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-6α-甲基-21-醋酸酯 0.5g
(粒径5～20μm)
辅料：
羟丙基甲基纤维素(非离子型) 2.0g
磷酸二氢钠 6.5g
磷酸氢二钠 5.2g
氯化钠 3.0g
1N氢氧化钠溶液
苯扎氯铵 0.25g
取处方量的苯扎氯铵溶于处方量50％的注射用水中，加入处方量的磷酸二氢钠、氯化钠使溶解，用1N的氢氧化钠溶液将pH调至6.5，作为<1>液待用，羟丙基甲基纤维素溶于处方量30％的注射用水中，用垫有200目尼龙布的布氏漏斗过滤，加热至80～90℃，加入处方量的孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-6α-甲基-21-醋酸酯搅匀，保温30min，冷至40～50℃作为<2>液，<1>和<2>合并，加入余量的注射用水。
实施例12
主料：孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-6α-甲基-21-醋酸酯 0.1g
(粒径5～20μm)
辅料：
羟丙基甲基纤维素(非离子型) 2.0g
磷酸二氢钠 6.5g
磷酸氢二钠 5.2g
氯化钠 3.0g
1N氢氧化钠溶液
苯扎氯铵 0.25g
取处方量的苯扎氯铵溶于处方量50％的注射用水中，加入处方量的磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠使溶解，用3号垂熔漏斗过滤，作为<1>液待用，甲基纤维素钠溶于处方量30％的注射用水中，用垫有200目尼龙布的布氏漏斗过滤，加热至80～90℃，加入处方量的孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-6α-甲基-21-醋酸酯搅匀，保温30min，冷至40～50℃作为<2>液，将<1>液与<2>液和并，加入余量的注射用水。
实施例13
主料：
孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-6α-氟-17-丁酸酯-21-醋酸酯50mg(粒径5~20μm)
辅料：
磷酸二氢钠 8.5g
氯化钠 1.0g
尼泊金乙酯 0.1g
尼泊金丙酯 0.1g
丙三醇 15g
注射用水 1000ml
取处方量50％的注射用水，加入处方量的磷酸二氢钠、、氯化钠使溶解、丙二醇、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯，用1N的氢氧化钠溶液将pH调至7.0，再加入处方量的孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-6α-氟-17-丁酸酯-21-醋酸酯加热至80～90℃至溶解，冷却至室温，用3号垂熔漏斗过滤，加入余量的注射用水。
实施例14
主料：孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-6α-甲基-21-磷酸钠 0.1g
(粒径5～20μm)
辅料：
磷酸二氢钠 7.8g
氯化钠 1.0g
尼泊金乙酯 0.1g
尼泊金丙酯 0.1g
丙二醇 10g
注射用水 1000ml
取处方量的苯扎氯铵溶于500ml注射用水中，加入处方量的磷酸二氢钠、氯化钠使溶解、用1N的氢氧化钠溶液调pH至7.0，加入丙二醇，再加入处方量的孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-6α-甲基-21-磷酸钠加热至50～60℃至溶解，冷却至室温，用3号垂熔漏斗过滤，加入余量的注射用水。
实施例15
主料：孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-6α-甲基-21-醋酸酯 0.5g
(粒径5～20μm)
辅料：
凡士林 800g
液状石蜡 100g
羊毛脂 100g
苯扎氯铵 0.15g
将处方量的苯扎氯铵、孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-6α-甲基-21-醋酸酯，加注射用水20ml调成混悬液<1>，将处方量的凡士林、液状石蜡、羊毛脂混匀制成眼膏剂基质，将适量基质逐渐加入到混悬液<1>中，搅匀直至水吸尽后加入余量的基质混匀。
实施例16
主料为孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21-丙酸酯，辅料配方及制备方法同实施例15。
实施例17
主料为孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-21-醋酸酯-16α-甲基，辅料配方及制备方法同实施例15。
实施例18
主料为孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17-羟基-16-β-甲基，辅料配方及制备方法同实施例15。
实施例19
主料为孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17-羟基，辅料配方及制备方法同实施例15。
实施例20
主料为孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17-羟基-21-氯，辅料配方及制备方法同实施例15。
实施例21
主料为孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-17，21-双醋酸酯，辅料配方及制备方法同实施例15。
实施例22
主料为孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17-羟基-6α-氟，辅料配方及制备方法同实施例15。
实施例23
主料为孕甾-1，4，9(11)-三烯-3，20-双酮-17，21-双羟基-6α-甲基-21-醋酸酯，辅料配方及制备方法同实施例15。
试验
实施例1每天给药药效对比实验
实验动物：健康日本大耳白兔140只，体质量2.0-3.0kg，雌雄兼有。术前经裂隙灯检查均无明显眼前段病变。
d：天 h：小时 min：分钟 s：秒
模型建立方法
实验兔角膜碱烧伤动物的模型建立与观察：
①兔角膜碱烧伤模型的建立：将全部实验兔予以氯胺酮(25mg/kg)和氯丙嗪(25mg/kg)肌肉注射诱导全身麻醉，然后用盐酸奥布卡因进行双眼表面麻醉；将直径为7mm的单层圆形滤纸片，浸入1mol/L的氢氧化钠溶液中约30s后，置于兔双眼角膜中央区2min，除去滤纸，立即用复方氯化钠冲洗烧伤区及结膜囊2min；双眼结膜囊内涂5g/L红霉素眼膏和10g/L阿托品眼膏。
②角膜新生血管的观察：角膜碱烧伤模型兔均于碱烧伤后24h开始每日用裂隙灯观察角膜新生血管的发生情况，至各组均出现角膜新生血管后改为隔日观察。
③角膜新生血管面积的测量：分别于伤后6，12，15，21，28d按Robert电脑数学模型公式A＝C/12×3.1416[r2-(r-l)2]算，A为角膜新生血管生长面积，c为角膜新生血管累及角膜的圆周点数，l为角膜新生血管从角膜缘深入角膜的长度，r为兔角膜半径7mm。
试验设计
①试验方法：随机将140只兔分为对照组和实验组，对照组10只，对照组双眼结膜下注射0.3mL生理盐水；实验组130只，分成13组，每组10只模型兔，组号为X-S，X为液体来源，S为注射剂量代码，例如1-1组代表使用实施例1的液体使用剂量是0.001ml/天，3-4组代表使用实施例3的液体使用剂量是0.5ml/天。将实施例1的液体在双眼结膜下分别注射0.001ml/天(注射剂量代码为1)、0.01ml/天(注射剂量代码为2)、0.1ml/天(注射剂量代码为3)、0.5ml/天(注射剂量代码为4)、1ml/天(注射剂量代码为5)连续注射28天；将实施例2至8的液体在双眼结膜下分别注射0.1ml(注射剂量代码为3)连续注射28天。其中每种实施例液体的每个剂量使用10只模型兔。
②主要观察指标：兔角膜碱烧伤后的大体情况；兔角膜碱烧伤后角膜新血管面积；统计学分析：实验数据的计量资料采用x±s表示；应用SAS 9.0统计软件进行处理，采用t检验并进行两两比较；以P＜0.05作为差异有显著意义标准。
2结果
2.1角膜碱烧伤后的大体情况
对照组：7天水肿，角膜新生血管多，未烧灼区混浊；14天明显水肿，中央有大片溃疡灶，角膜新生血管密集、粗大、迂曲，未烧灼区混浊；28天水肿.溃疡灶减小，角膜新血管细密迂曲，未烧灼区混浊。
1-1组：7天轻度水肿，角膜新生血管较多，未烧灼区中度混浊；14天水肿，中央有片状溃疡灶角膜新生血管细密、迂曲.未烧灼区中度混浊；28d水肿减轻，溃疡灶减少，角膜新生血管较14d稀疏.未烧灼区轻度混浊。
1-2组：7d轻微水肿.角膜新生血管较少，未烧灼区轻度混浊；14d轻度水肿，无溃疡灶.角膜新生血管细密，未烧灼区轻度混浊；28d无水肿，无溃疡灶，角膜新生血管较14d稀疏，未烧灼区无混浊。
1-3组：7d无水肿.角膜新生血管少.未烧灼区无混浊；14d无水肿，无溃疡灶，角膜新生血管少，未烧灼区无混浊；28d角膜新生血管较14天稀疏，未烧灼区无混浊。
1-4组：7d无水肿.角膜新生血管少.未烧灼区无混浊；14d无水肿，无溃疡灶，角膜新生血管少，未烧灼区无混浊；28d角膜新生血管较14天稀疏，未烧灼区无混浊。
1-5组：7d无水肿.角膜新生血管少.未烧灼区无混浊；14d无水肿，无溃疡灶，角膜新生血管少，未烧灼区无混浊；28d角膜新生血管较14天稀疏，未烧灼区无混浊。
2-3组：7d无水肿.角膜新生血管少.未烧灼区无混浊；14d无水肿，无溃疡灶，角膜新生血管少，未烧灼区无混浊；28d角膜新生血管较14天稀疏，未烧灼区无混浊。3-3组：7d轻微水肿.角膜新生血管较少，未烧灼区轻度混浊；14d轻度水肿，无溃疡灶.角膜新生血管细密，未烧灼区轻度混浊；28d无水肿，无溃疡灶，角膜新生血管较14d稀疏，未烧灼区无混浊。
4-3组：7d轻微水肿.角膜新生血管较少，未烧灼区轻度混浊；14d轻度水肿，无溃疡灶.角膜新生血管细密，未烧灼区轻度混浊；28d无水肿，无溃疡灶，角膜新生血管较14d稀疏，未烧灼区无混浊。
5-3组：7天轻度水肿，角膜新生血管较多，未烧灼区中度混浊；14天水肿，中央有片状溃疡灶角膜新生血管细密、迂曲.未烧灼区中度混浊；28d水肿减轻，溃疡灶减少，角膜新生血管较14d稀疏.未烧灼区轻度混浊。
6-3组：7d轻微水肿.角膜新生血管较少，未烧灼区轻度混浊；14d轻度水肿，无溃疡灶.角膜新生血管细密，未烧灼区轻度混浊；28d无水肿，无溃疡灶，角膜新生血管较14d稀疏，未烧灼区无混浊。
7-3组：7d无水肿.角膜新生血管少.未烧灼区无混浊；14d无水肿，无溃疡灶，角膜新生血管少，未烧灼区无混浊；28d角膜新生血管较14天稀疏，未烧灼区无混浊。
8-3组：7天轻度水肿，角膜新生血管较多，未烧灼区中度混浊；14天水肿，中央有片状溃疡灶角膜新生血管细密、迂曲.未烧灼区中度混浊；28d水肿减轻，溃疡灶减少，角膜新生血管较14d稀疏.未烧灼区轻度混浊。
9-3组：7天轻度水肿，角膜新生血管较多，未烧灼区中度混浊；14天水肿，中央有片状溃疡灶角膜新生血管细密、迂曲.未烧灼区中度混浊；28d水肿减轻，溃疡灶减少，角膜新生血管较14d稀疏.未烧灼区轻度混浊。
2.2免角膜碱烧伤后角膜新生血管面积见表1.
在各时间点上.对照组角膜新生血管的面积明显高于实验组，各实验组分别与对照组比较.均有统计学差异P＜0.05，实验组中实施例1的液体当剂量＜0.1ml/天时组角膜新生血管面积随药物剂量的增加而减小，当剂量＞0.1ml/天时角膜新生血管与剂量为0.1ml/天的1-3试验组类似，兔角膜新生血管的面积在碱烧伤后15日内呈增高趋势.达到高峰后逐渐降低。
表2免角膜碱烧伤后每天给药角膜新生血管面积(x±s，mm2)
通过以上试验的观察，说明这些实施例液体对减慢角膜新生血管生成有效，其中实施例1、2、7的液体效果较好。
实施例2每周给药药效对比实验
实验动物：健康日本大耳白兔50只，体质量2.0-3.0kg，雌雄兼有。术前经裂隙灯检查均无明显眼前段病变。
d：天 h：小时 min：分钟 s：秒
模型建立方法
实验兔角膜碱烧伤动物的模型建立与观察：
①兔角膜碱烧伤模型的建立：将全部实验兔予以氯胺酮(25mg/kg)和氯丙嗪(25mg/kg)肌肉注射诱导全身麻醉，然后用盐酸奥布卡因进行双眼表面麻醉；将直径为7mm的单层圆形滤纸片，浸入1mol/L的氢氧化钠溶液中约30s后，置于兔双眼角膜中央区2min，除去滤纸，立即用复方氯化钠冲洗烧伤区及结膜囊2min；双眼结膜囊内涂5g/L红霉素眼膏和10g/L阿托品眼膏。
②角膜新生血管面积的测量：分别于伤后7，14，21，28d按Robert电脑数学模型公式A＝C/12×3.1416[r2-(r-l)2]算，A为角膜新生血管生长面积，c为角膜新生血管累及角膜的圆周点数，l为角膜新生血管从角膜缘深入角膜的长度，r为兔角膜半径7mm。
试验设计
①试验方法：随机将50只兔分为对照组和实验组，对照组10只，对照组双眼滴加0.3mL生理盐水；实验组40只，分成4组，每组10只模型兔，双眼滴加实施例1中配制的液体，将实施例1的液体在双眼分别滴加0.01ml/周(滴加剂量代码为1)、0.05ml/周(滴加剂量代码为2)、0.1ml/周(滴加剂量代码为3)、0.5ml/周(滴加剂量代码为4)，每周滴加两次，组号为S，S为滴加剂量代码，例如1组代表使用剂量是0.01ml/周，4组代表使用剂量是0.5ml/周。
②主要观察指标：兔角膜碱烧伤后角膜新血管面积；统计学分析：实验数据的计量资料采用x±s表示；应用SAS 9.0统计软件进行处理，采用t分析并进行两两比较；以P＜0.05作为差异有显著意义标准。
2结果
2.1免角膜碱烧伤后角膜新生血管面积见表2
在各时间点上.对照组角膜新生血管的面积明显高于实验组，各实验组分别与对照组比较.均有统计学差异P＜0.05，实验组中实施例1的液体当剂量＜0.1ml/周时组角膜新生血管面积随药物剂量的增加而减小，当剂量＞0.1ml/周时角膜新生血管与剂量为0.1ml/天的试验3组类似，兔角膜新生血管的面积在碱烧伤后15日内呈增高趋势.达到高峰后逐渐降低。
表2免角膜碱烧伤后每周给药角膜新生血管面积(x±s，mm2)