说明书用于治疗神经障碍的LH或HCG和EPO的给药方案
相关申请的交叉参考
[0001]本申请要求2006年3月17日提交的美国临时申请No.60/783,500，2006年4月5日提交的美国临时申请No.60/789,132，和2006年10月24日提交的美国临时申请No.60/862,669的优先权和权益，其全文在此引入作为参考。
背景
[0002]分离和体外培养多潜能神经干细胞的技术的发展(例如，见美国专利No.5,750,376；5,980,885；5,851,832)显著改进了神经变性疾病和病症的治疗前景。已经发现胎儿脑可用于分离和体外培养多潜能神经干细胞。而且，与长期以来认为胎儿脑细胞是不能复制或再生的脑细胞的观点相反，已经发现神经干细胞也可从成体哺乳动物脑中分离。这些干细胞，不管是来自胎儿还是成体脑中，是能够自我复制的。子代细胞可增殖或分化为神经细胞系中的任何细胞，包括神经元，星形胶质细胞和少突神经胶质细胞。因此，这些发现不仅提供了可用于移植的神经细胞的来源，还证实了成体脑中多潜能神经干细胞的存在。
[0003]某些试剂，神经干细胞增殖试剂，已被发现在体外或体内增加神经干细胞的数量。所述增加的机理可能包括刺激增殖，抑制分化，和/或防止神经干细胞的死亡。附加试剂，干细胞分化试剂，已被发现在体外或体内选择性增强神经元前体细胞或神经胶质前体细胞的生产。这些增殖和分化试剂可因此用于增加和选择性增强神经元和神经胶质细胞。
概述
[0004]此处提供的是用于神经干细胞增殖试剂和分化试剂的有效给药方案，其试剂盒和用途。所述物质的组合物和方法可短期利用(例如，在神经伤害后或神经病学症状发作之后的数天内)或可长期利用(例如，对于持续的神经伤害或发生中的神经病学症状)。而且，所述组合物和方法可连续地或间歇地利用。
[0005]相应的，提供了治疗或改善哺乳动物中的神经变性疾病或病症的方法。本方法包含给予哺乳动物有效量的hCG或LH和有效量的EPO，其中hCG或LH以至少三个剂量全身给药，任选的通过利用试剂盒。hCG，LH和/或EPO可连续或间歇地给药。而且，hCG或LH可在第一治疗期内给药，EPO可在第二治疗期内给药。例如，hCG或LH可在第一治疗期的第1、3和5天间歇给药，然后EPO可在第二治疗期的第1、2和3天连续给药。
[0006]此处还提供了治疗或改善哺乳动物的神经变性疾病或病症的其它方法。本方法包括在第一治疗期给予哺乳动物有效量的hCG或LH，紧接着在第二治疗期给予有效量的EPO，任选的通过利用试剂盒。hCG或LH可在第一治疗期间歇给药并且EPO可在第二治疗期连续给药。例如，hCG或LH可在第一治疗期的第1、3和5天间歇给药，然后EPO可在第二治疗期的第1、2和3天连续给药。
[0007]在本方法和试剂盒中，治疗期可以是，例如，至少3天。本治疗方法可重复几次或多次，具有第二、第三、第四、第五等治疗期。不管是给药一次、两次、几次、或多次，本治疗方法可采取一个或多个试剂盒的形式。
[0008]本方法和试剂盒的详细内容在附图和下面的说明书中阐述。本方法和试剂盒的其它特征、目标和优点将从说明书和附图和权利要求中明显地表现出来。
附图简述
[0009]图1显示了进行了下述治疗的遭受了大脑中动脉闭塞(MCAo)中风的大鼠功能恢复的效果，用逐渐增加剂量的hCG，在肌肉内(IM)给予hCG剂量之后，每天静脉内(IV)给予1440IU的EPO。
[0010]图2显示了进行了下述治疗的遭受了MCAo中风的大鼠与未治疗对照相比功能恢复的区别效果，每天用440IU的hCG并IV给予1440IU的EPO、单独用hCG、或单独用EPO。
[0011]图3是显示进行了下述治疗的遭受了MCAo中风的大鼠与未治疗对照相比的组织损失％(与非中风半球相比)的图，每天用440IU的hCG并IV给予1140IU的EPO、单独用hCG、或单独用EPO。
[0012]图4显示了进行了下述治疗的遭受了MCAo中风的大鼠与未治疗对照相比的组织损失的示意图，每天用440IU的hCG并IV给予1140IU的EPO、单独用hCG、或单独用EPO。
[0013]图5是显示实施例2中在第三次IM给予hCG之后测量的血清hCG水平的柱形图。
[0014]图6显示了以10、15、和20倍于用于脑室内输注的浓度对雄性大鼠皮下输注催乳素六天的结果。展现了来自每个动物的8个切片的室下区(SVZ)中的溴脱氧尿苷阳性(BrdU+)细胞总数量。SVZ增殖水平的最大增加在15倍剂量时观察到(170μg/天，进行6天)。(10倍＝113μg/天；20倍＝226μg/天；对照＝仅用大鼠血清白蛋白(RSA))。相对于对照的显著性：10x＝*p<0.05；15x＝**p<0.01；20x＝p<0.05；对于所有条件n＝3；用Tukey posthoc测试进行单因素方差分析(ANOVA)。
[0015]图7显示了对雄性大鼠利用每天单次腹膜内注射的催乳素给药的结果。展现了每个给药方案的每个切片的BrdU+细胞总数量。(A)对于高的3天剂量观察到SVZ增殖的小的增加。(B)对于增加SVZ增殖水平的最强给药条件利用低的，每天170μg/天的剂量进行6天。显著性是相对于RSA对照的。n＝3；*p<0.05；**p<0.01；接着用Tukeyposthoc测试进行单因素ANOVA。
[0016]图8显示了在中风后(中风＝第0天)第1、3和5天单次肌肉内注射hCG引起前脑SVZ显著增加的增殖。在1000μg剂量条件(n＝3；*p<0.05；用Tukey posthoc进行单因素ANOVA)下观察到每脑室的磷酸-组蛋白H3阳性(pHH3+)细胞数量的显著增长。图象显示了RSA软膜条对照大鼠对比给药1000μghCG的动物的侧脑室背外侧角中的核标记Hoechst和pHH3的表达。注意对于给药1000μg的动物SVZ中总细胞数量和pHH3的表达增加。
[0017]图9显示了在中风后(中风＝第0天)第1、3和5天每天单次肌肉内注射1000μg的hCG引发了前脑SVZ中神经发生的增加。确定给药的动物中的doublecortin+神经元的数量，在1000μg给药的动物中该数量翻倍。
[0018]图10显示了中风后(中风＝第0天)24小时开始每天单次肌肉内注射hCG进行7天的结果。(A)每天330μg/注射的给药方案相对于所有其它给药条件和对照(n＝3；*p<0.01；用Tukey posthoc进行单因素ANOVA)显著增加了SVZ中增殖的数量(pHH3+细胞)。(B)观察给药的大鼠的运动皮层中的缺血性病变，表明每天接受330μg/注射的给药方案的动物显示出新的组织生长并且用组织填料(tissue plug)填充病变位点。
[0019]图11显示了通过计数BrdU+细胞确认的每天以330μg/注射的hCG给药的动物SVZ中增加的增殖。在330μg/注射的条件下相对于对照和100μg/注射(p<0.01；n＝3；用Tukey posthoc分析的单因素ANOVA)每脑室的BrdU+细胞数量显著增加了。这些结果进一步确认了用pHH3染色观察到的增殖的增加。
[0020]不同图中相同的参考标记表示相同的成分。
详细描述
[0021]目前没有临床上批准用于治疗神经系统疾病或病症的神经干细胞增殖和分化试剂。这些试剂对于治疗神经系统疾病和病症是有用的，因而需要有利用这些试剂的有效给药方案。在此提供了对于神经干细胞增殖和分化试剂的有效给药方案，包含对于神经干细胞增殖试剂的有效给药方案的试剂盒，和它们的用途。所述试剂盒和方法可短期利用(例如，在伤害或神经变性疾病或病症发作之后的数天内)或可长期利用(例如，对于慢性神经变性疾病或病症)。而且，如下面进一步描述的，本组合物和方法可连续或间歇利用。
[0022]在此描述的方法利用用于治疗或改善神经变性疾病或病症的神经干细胞增殖试剂。在这些方法中，在第一治疗期过程中给予神经干细胞增殖试剂。神经干细胞增殖试剂可在第一治疗期内连续或间歇给予。可在第一治疗期过程中进一步添加神经干细胞分化试剂。实施例和说明书包括神经干细胞增殖试剂(例如，催乳素、hCG、LH、CSF、G-CSF、GM-CSF、VEGF)和分化试剂(例如，EPO、BDNF、BMP、PACAP)的用途；然而，所述试剂的类似物，片段或变体可类似的应用于此处所述的任何方法、装置、或试剂盒中。作为一个特定的实施例，公开了给予哺乳动物有效量的hCG或LH和有效量的EPO的方法，其中hCG或LH以至少三个剂量全身给药。
[0023]利用用于治疗或改善神经变性疾病或病症的神经干细胞增殖试剂的这些方法可进一步包括在第二治疗期内给予神经细胞分化试剂，所述第二治疗期开始于第一治疗期之后。第二治疗期可以是至少三天。可在第二治疗期中连续或间歇给予神经干细胞分化试剂。第二治疗期可于第一治疗期结束后至少一天开始。作为一种特定的实施例，公开了一种方法，在所述方法中，神经干细胞增殖试剂在第一治疗期中至少三次全身连续给药，神经干细胞分化试剂在第二治疗期中给药。作为进一步的实施例，公开了一种方法，其中第一治疗期是五天，神经干细胞增殖试剂间歇给药，第二治疗期开始于第一治疗期结束后一天，并且神经干细胞分化试剂连续给药至少三天。作为另一个实施例，可在第一治疗期中给予有效量的hCG或LH，然后在第二治疗期中给予有效量的EPO。
[0024]如此处所用，连续对受试者递送(deliver)或给予(administer)物质意味着将该物质在连续数天的时期内至少一天一次的递送或给予。例如，可通过注射(例如，IM或皮下)或口服至少每天一次全身给药，或通过以导致每天递送到受试者的组织或血流中的方式输注给药。任选的，该物质通过输注或输注以外的方式递送。如此处所用的，“全身”一词不包括大脑内脑室输注。该物质持续递送或给予的持续期或治疗期可持续三天到几年，甚至在受试者剩余的生命中持续。例如，持续期可以是3-6天，3-14天，3-21天，3-28天，1-4个月，1-6个月，1-9个月，1-12个月，1-2年，1-3年，1-5年，1-10年等。对于进一步的实施例，持续递送的治疗期可以是至少三天，至少四天，至少五天，至少六天，至少七天，或至少十四天。而且，该物质可在给药期第1，2和3天连续递送。
[0025]如此处所用的，间歇的对受试者递送或给予物质意味着以少于每天地递送或给予该物质，例如，在一段时期内每2，3，4，5或7天一次。例如，该物质可在一定治疗期内每隔一天递送或给予，例如，在治疗期第1，3和5天。该物质间歇递送或给予的持续期或治疗期可持续三天到几年，甚至在受试者剩余生命中持续。例如，持续期可以是3-6天，3-14天，3-21天，3-28天，1-4个月，1-6个月，1-9个月，1-12个月，1-2年，1-3年，1-5年，1-10年等。对于进一步的实施例，间歇递送的治疗期可以是至少三天，至少四天，至少五天，至少六天，至少七天，或至少十四天。
[0026]此处提供的方法，例如，可通过给予具有神经变性疾病或病症的受试者有效量的增殖试剂，利用增殖试剂催乳素、hCG、LH、CSF、G-CSF、GM-CSF或VEGF治疗神经变性疾病或病症。作为例子，增殖试剂hCG和LH结合相同的受体，并可互换地在此处提供的特定实施例中以等效剂量利用。作为进一步的实施例，增殖试剂hCG可以大约120-200IU/kg/天的剂量肌肉内给药，然后静脉内给予大约570-950IU/kg/天的EPO。对于进一步的实施例，可以160IU/kg/天的剂量肌肉内给予hCG，然后静脉内给予765IU/kg/天的EPO。用hCG和LH间歇治疗任选地包含数天的hCG或LH给药(例如，在第1，3，5天)。所述神经干细胞试剂的给药可紧接着数天的间歇(例如，第7，9，11天)或连续(例如，第7，8，9天)给予分化试剂例如EPO。等效剂量的其它神经干细胞增殖试剂也可被用于类似的方案中。
[0027]因而，实施例4显示了催乳素(另一种增殖试剂)的给药方案。不同量的催乳素每天给药进行了6天，检查对神经干细胞数量的效果。结果显示大约150-200μg/天(包括例如170μg/天)在该给药方案中是最佳量。这种给药方案，大约170μg/天进行6天，然后通过缩短给药期而改变(170μg/天进行3天)或将更高的每日剂量与缩短的期间结合以获得类似的总剂量(大约396μg/天进行3天)。结果显示在更长时期内持续递送更低剂量是有效的。
[0028]此处提供的包括持续递送或间歇递送的方法可改善神经状况。不意味着限制，这种改进可与哺乳动物中神经干细胞数量的增加有关。有效量的神经干细胞增殖试剂的效力可被最优化以增加哺乳动物中神经干细胞数量或神经状况。本方法包括持续或间歇对哺乳动物给予神经干细胞增殖试剂一段时间，其中给予的神经干细胞增殖试剂总剂量等于有效量，并且其中该试剂在第一治疗期内给予至少三次。
[0029]此处所述的方法可被最优化以增加有效量的神经干细胞增殖试剂对于治疗或改善哺乳动物的神经变性疾病或病症的功效。本方法包括对哺乳动物持续或间歇给予神经干细胞增殖试剂一段时间，其中在所述时期内给予的神经干细胞增殖试剂总剂量等于有效量，并且其中该试剂在第一治疗期内给予至少三次。
[0030]神经干细胞增殖试剂可在大约14天内(例如，0到大约14天)给予中枢神经系统(CNS)损伤、症状发作、或诊断的哺乳动物。如此处所用的，0天指CNS损伤、症状发作、或诊断的时间。任选的，神经干细胞增殖试剂可在CNS损伤、症状发作、或诊断的大约13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2，或1天内(例如，0到大约5天)给予。任选的，神经干细胞增殖试剂可在CNS损伤、症状发作、或诊断的24小时内给予哺乳动物。任选的，神经干细胞增殖试剂可在CNS损伤、症状发作、或诊断的12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1小时内给予哺乳动物。
[0031]对于间歇治疗，可利用更高剂量的试剂，或可利用连续治疗。特别的，神经干细胞增殖试剂可在连续模式中以低剂量给予哺乳动物受试者，与以高剂量间歇给予相反。神经干细胞增殖试剂任选的在神经损伤或神经病学症状发作之后24到72小时之内给药。任选的，神经干细胞增殖试剂的连续给药是进行2-5天。例如，对于给定总有效量的催乳素，或催乳素的类似物、片段或变体，包含每天递送总量的1/6进行6天的给药方案比每天递送总量的1/3进行3天更有效。在类似范例中可利用等效剂量的其它神经干细胞增殖试剂。
[0032]此处描述的方法也可包括监视哺乳动物生物液中神经干细胞增殖试剂或神经干细胞分化试剂的水平。监视的生物液可以例如是脑脊髓液或血液。例如，血清中hCG(或另一种神经干细胞增殖试剂或神经干细胞分化试剂)的水平可在治疗期之内或之后在给药后测量。等效水平的不同神经干细胞增殖试剂或神经干细胞分化试剂都可以在生物液中被测量和监视。
[0033]此处还提供了治疗或改善哺乳动物的神经变性疾病或病症的试剂盒。试剂盒包含至少三个剂量单元的在第一治疗期内给予的神经干细胞增殖试剂。在第一治疗期内给予的神经干细胞增殖试剂总剂量可以等于有效量。治疗期可以是至少三天。试剂盒可包括试剂盒的使用说明书。使用说明书可以是对于神经干细胞增殖试剂的连续给药或间歇给药。
[0034]试剂盒可进一步提供至少三个剂量单元的分化试剂。分化试剂可在第一治疗期内利用。在第一治疗期内给予的分化试剂的总剂量可等于有效量。治疗期可以是至少三天。分化试剂的治疗期任选是用神经干细胞增殖试剂的治疗期之后的第二或随后的治疗期。试剂盒可包括分化试剂的使用说明书。该使用说明书可以是对于神经干细胞增殖试剂的连续给药或间歇给药。
[0035]试剂盒中神经干细胞增殖试剂、分化试剂、或其它试剂每种的总剂量可在一个容器、多个容器、或在其任何组合中提供。例如，一种或多种神经干细胞增殖试剂的总剂量可在一个适于提供计量的剂量或适于提取剂量的容器中，所述提取例如是被待治疗的人或被另外的人例如护理者进行。一种或多种神经干细胞增殖试剂可存在于多个容器中而不是单个容器中，所述多个容器提供适于每天、每周、每月等给药的等分量的剂量。用于分化试剂或其它试剂的单个容器或多个容器可类似地在该试剂盒中提供。也可包括组合，其中试剂盒中可包含一个容器的神经干细胞增殖试剂，多个容器的分化试剂，或相反。而且，用于第一治疗期的神经干细胞增殖因子的总剂量可以在一个单独的容器中或多个容器中，第二治疗期的总剂量可以在一个单独容器中或多个容器中，或其组合。
[0036]神经干细胞增殖试剂和分化试剂可任选的包装在试剂盒中，以使试剂盒中包含治疗期中待递送的神经干细胞增殖试剂和分化试剂的总量。试剂盒可任选包含其它成分或其它成分的组合，包括例如血液取样装置或其成分。
[0037]试剂盒可进一步包含监视患者中的血细胞比容水平的装置或设备或从患者中去除一定量的血液的适当的装置或同时包括监视装置和血液采样装置。血液采样和监视是需要的，因为血细胞比容水平可能上升到高于可接受的水平。可接受的血细胞比容水平可以通过任何本领域已建立的标准确定。
[0038]任选的，用于给药的给药装置可包括在试剂盒中，其包含神经干细胞增殖试剂和/或分化试剂。
[0039]试剂盒可适于用于健康护理机构，例如住院患者护理机构或紧急护理机构。健康护理机构包括例如医院。试剂盒还适于在离开住院患者护理机构之后或没进入时使用。以试剂盒形式的包装有利于患者早日离开健康护理机构，通过允许在长期护理机构中或在家中的患者治疗，例如通过自我治疗、门诊患者治疗、或通过护理者或健康护理提供者在家中或长期护理机构中等的治疗而实现。类似的，以试剂盒形式的包装允许患者在紧急情况下的立即治疗，包括在急诊室或通过定点紧急护理提供者(例如，通过紧急医师，运动教练员等)。
[0040]在本方法和试剂盒中，时期可以是例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、21、28天，或在3到28天之间的任何天数。任选的，本方法和试剂盒可包含在第二治疗期中连续给予哺乳动物神经干细胞增殖试剂，其中第二治疗期开始于该时期结束后至少1、2或3天的间隔，并且其中第二治疗期是至少三天。第二治疗期，类似第一治疗期，可以是，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、21或28天。第一治疗期和接下来的治疗期之间的间隔也可以是例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、21或28天。这种治疗日程可重复几次或多次。用于第二或后来的治疗期的神经干细胞增殖试剂可以与用于第一治疗期或其它治疗期中使用的神经干细胞增殖试剂相同或不同。而且，在单个治疗期中可利用一种以上的神经干细胞增殖试剂。因而，本方法中有用的试剂盒可包含用于一种或多种治疗期的一种或多种神经干细胞增殖试剂。
[0041]神经干细胞增殖试剂或其它试剂(例如，分化试剂)可通过本领域已经建立的任何方法给药，例如，通过静脉内、动脉内、结肠内、气管内、腹膜内、鼻内、血管内、鞘内、颅内、髓内、胸膜内、皮内、皮下、肌肉内、口服、局部给药、肺给药、或其任意组合。任选的，用于给药的药物递送装置或其元件可包括在含有神经干细胞增殖试剂的试剂盒中。
[0042]神经干细胞增殖试剂可以是能够在体外或在体内增加哺乳动物神经干细胞数量的任何物质。此处所用的促进试剂与增殖试剂具有相同含义。可增加神经干细胞数量的试剂包括但不限于：
1.促卵泡激素(FSH)，其经常与LH的作用相合作，并且诱导LH受体表达，因而增强LH信号传导的效果。
2.生长激素(GH)，其可刺激神经干细胞增殖。
3.胰岛素生长因子(IGFs)，包括IGF-1，其是从响应于GH的许多组织中释放并且介导GH的许多生长增殖效应的生长调节素(somatomedians)，并且其刺激神经干细胞增殖。
4.生长激素释放激素(GHRH)，其从下丘脑分泌，并且诱导GH从垂体前叶释放，引起循环GH的增加的水平。
5.催乳素(PRL)，其从垂体前叶中分泌并且促进神经干细胞增殖。
6.催乳素释放肽(PRP)，其引发催乳素的释放。
7.成纤维细胞生长因子(FGF)，神经干细胞的促有丝分裂试剂。
8.雌激素，其促进神经干细胞的增殖，包括例如在海马中。
9.血清素，其促进海马中神经干细胞的增殖。
10.表皮生长因子(EGF)，神经干细胞的促有丝分裂试剂。
11.转化生长因子α(TGFα)，神经干细胞的促有丝分裂试剂。
12.促性腺激素释放激素(GnRH)，其引发LH的释放。
13.睫状神经营养因子(CNTF)和白血病抑制因子(LIF)，其通过一种信号传导途径通过gp130亚基传导信号，所述信号传导途径促进神经干细胞自我更新，因而扩增脑神经干细胞群体。
14.集落刺激因子(CSF)。
15.粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
16.粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
17.血管内皮生长因子(VEGF)。
18.促黄体素(LH)。
19.人绒毛膜促性腺激素(hCG)。
[0043]而且，可给予神经细胞分化试剂以选择性增强神经元形成或神经胶质细胞形成。这些分化试剂也可根据给药方案和试剂盒递送。示例性的分化试剂包括但不限于：
1.红细胞生成素(EPO)，其增进神经干细胞定型为神经细胞谱系，并且对于治疗小鼠和大鼠的中风模型是有用的。
2.源自脑的神经营养因子(BDNF)，其是一种已知的促进神经谱系的存活因子和分化试剂。
3.转化生长因子β和骨形态发生蛋白(BMPs)，其是促进神经谱系和特定神经表型(例如，脊髓中的感觉中间神经元)的产生的分化试剂。
4.甲状腺激素(TH，包括T3和T4形式)，一种促进少突神经胶质细胞的成熟和产生的分化试剂，见例如Rodriguez-Pena，1999。
5.甲状腺刺激激素(TSH)和甲状腺释放激素(TRH)，其促进TH从垂体前叶中释放，产生增加水平的循环TH。这种试剂可与LH或hCG组合使用以促进从神经干细胞的少突神经胶质细胞发生。
6.音猬蛋白(sonic hedgehog)(SHH)，一种在发育过程中使发育的CNS成形的形态发生素，并且以不同的浓度促进特定类型的神经元(例如，脊髓中的运动神经元)和少突神经胶质细胞的产生。这种试剂可与LH或hCG组合使用以促进从神经干细胞的神经发生和/或少突神经胶质细胞发生。
7.血小板源生长因子(PDGF)，其促进少突神经胶质细胞从神经干细胞的产生和分化。这种试剂可与LH或hCG组合使用以促进从神经干细胞的少突神经胶质细胞发生。
8.环AMP和增强cAMP途径的试剂，例如垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)和血清素，其选择性促进神经元的产生。
[0044]任何方法和试剂盒可包含多种神经干细胞增殖试剂和/或神经细胞分化试剂。因而，一种或多种神经干细胞增殖试剂可共同或相继给药，并且可通过分别的组合物或组合在单个组合物中的形式给药。而且，一种或多种神经干细胞增殖试剂和一种或多种神经干细胞分化试剂可共同或相继给药，并且可通过分别的组合物或组合在单个组合物中的形式给药。例如，PRL和LH或hCG可组合使用以使神经干细胞增殖最大化；PRP可与LH或hCG组合使用以使神经干细胞增殖最大化；GnRH可与LH或hCG组合使用或替代其使用以增加LH的循环水平并且增强神经干细胞增殖；并且CNTF和LIF可与LH或hCG组合使用以促进神经干细胞增殖和增加CNS中神经干细胞群的大小。进一步例如，催乳素可与EPO一起使用，LH可与EPO一起使用，hCG可与EPO一起使用。没有明确阐述的所有其它组合也可使用。
[0045]这些因子的适当的剂量可根据本领域已经建立的方法确定。例如，催乳素的剂量范围为可以是从大约0.510IU/kg/天到大约100,000IU/kg/天，例如，大约0.510-100,000；0.510-75,000；0.510-50,000；0.510-25,000；0.510-10,000；100-5,000；100-2,000；500-2,000；1,000-2,000；100-1,000；200-800IU/kg/天。hCG的剂量范围可以是从大约0.5IU/kg/天到大约3,000,000IU/kg/天，例如，大约0.5-2,000,000；0.5-1,000,000；0.5-500,000；0.5-250,000；0.5-100,000；0.5-50,000；10-25,000；10-10,000；240-216,000；1,200-2,000；2,160；或1,600IU/kg/天。hCG也可以10,000IU/天的剂量提供。LH的剂量范围可以是从大约0.5IU/kg/天到大约500,000IU/kg/天，例如，大约0.5-300,000；0.5-200,000；0.5-100,000；0.5-50,000；0.5-25,000；24-21,600；1,000；120-200；216；或160IU/kg/天。LH也可以10,000IU/天的剂量提供。EPO的剂量范围可以是从大约100IU/kg/天到大约2000IU/kg/天，例如，大约100-1500；100-1000；160-1000；570-950；765；或1020IU/kg/天。EPO也可以30,000IU/天的剂量提供。可利用等效剂量的其它试剂。此处的剂量指在整个治疗期中每天或间歇地递送的平均剂量。例如，如果神经干细胞增殖或分化试剂不是每天递送，在整个治疗期中的递送试剂总量可除以包括间隔的治疗期的总天数，以获得每天的剂量。
[0046]对于此处公开的方法中待用的神经干细胞增殖或分化试剂可指定特定的剂量单元(也就是，在治疗期中的系列给药的单次给药量)。这些剂量单元可以是特定的剂量和此处指定的剂量范围。剂量单元可根据必须给予以获得受试者中神经干细胞增殖或分化试剂的期望水平的量来界定。例如，提供血清中0.03IU/L到5,000,000IU/L的神经干细胞增殖或分化试剂水平的神经干细胞增殖试剂的剂量单元。或，作为进一步的例子，提供脑脊髓液中大约0.003IU/L到大约5,000IU/L的增殖试剂水平的神经干细胞增殖或分化试剂的剂量单元。
[0047]当神经干细胞增殖试剂和分化试剂全身给药时，血脑屏障渗透剂可任选地包括在试剂盒中或用于方法中以促进进入脑中。血脑屏障渗透剂是本领域已知的，包括例如缓激肽和描述于美国专利No.5,686,416；5,506,206和5,268,164中的缓激肽激动剂(例如，NH2-精氨酸-脯氨酸-hydroxyproxyproline-甘氨酸-噻吩丙氨酸-丝氨酸-脯氨酸-4-Me-酪氨酸(-CH2NH)-精氨酸-COOH)。
[0048]作为选择地，如美国专利No.6,329,508；6,015,555；5,833,988或5,527,527所述，待递送的神经干细胞增殖试剂或分化试剂可与转铁蛋白受体抗体配合。神经干细胞增殖试剂和分化试剂还可作为融合蛋白给药，所述融合蛋白包含神经干细胞增殖或分化试剂和与脑毛细管内皮细胞受体具有反应性的配体，例如转铁蛋白受体(见例如美国专利No.5,977,307)。
[0049]药物组合物可通过将期望的治疗剂和适于计划的给药途径的适当载体混合而制备，任选用于适当的给药装置中。在制备本发明的药物组合物中，治疗剂通常与赋形剂混合，被赋形剂稀释或包封在所述载体中，所述载体可以是胶囊、囊袋(sachet)、纸或其它容器的形式。当药学上可接受赋形剂作为稀释剂时，它可以是固体、半固体、或液体物质，其作为治疗剂的媒介、载体或介质。因而，组合物可以是下列形式：片剂、丸剂、粉末剂、锭剂、囊剂、扁囊剂(cachets)、酏剂(elixirs)、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、含有例如达10％重量的治疗剂的膏剂、软和硬的明胶胶囊、栓剂、无菌可注射溶液、和无菌包装粉末。
[0050]适当的赋形剂的一些例子包括人工脑脊髓液，乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯树胶，磷酸钙，藻酸盐，黄芪胶，明胶，硅酸钙，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素，无菌水，糖浆，和甲基纤维素。制剂中可另外包括：润滑剂例如滑石，硬脂酸镁，和矿物油；湿润剂；乳化和悬浮剂；防腐剂例如甲基苯甲酸盐和丙羟基苯甲酸盐；甜味剂；和调味剂。本发明的组合物可配制为在利用本领域已知方法给予患者之后提供治疗剂的快速，持续或延迟释放。
[0051]对于制备固体组合物例如片剂，治疗剂与药学赋形剂混合以形成包含本发明的化合物的均质混合物的固态前制剂(preformulation)组合物。当将这些前制剂组合物表示为均质时，意味着治疗剂均匀地分散在组合物中以致组合物可容易的细分为等效的单元剂量形式，例如片剂、丸剂和胶囊剂。本发明的片剂或丸剂可以是包衣的或另外是复合的以产生提供延长作用的优点的剂形。例如，片剂或丸剂可包含内部剂量和外部剂量成分，后者的形式为包裹在前者之外。这两种成分可被肠衣层(enteric layer)隔开，所述肠衣层的作用是抵抗胃中的分解并允许内部成分完整地进入十二指肠中或被延迟释放。对于所述肠衣层或包衣可利用多种物质，所述物质包括多种聚合酸和聚合酸和例如虫胶，十六烷醇和醋酸纤维素的材料的混合物。
[0052]可用于口服或注射给药的本发明新的组合物的液体形式可以包括水溶液、适当调味的糖浆、水性或油性悬浮液、和用食用油调味的乳剂，所述食用油例如是玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油、或花生油，以及酏剂和类似药物媒介。
[0053]用于吸入或吹入的组合物包括药学上可接受的水或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉末。液体或固体组合物可包含此处所述的适当的药学上可接受的赋形剂。组合物通过为局部或全身效果的口服或鼻吸途径给药。处于优选药学上可接受溶剂中的组合物可以利用惰性气体成喷雾状。喷雾状溶液可从喷雾装置中直接吸入，或者喷雾装置可附着于面罩吸入器，或间歇加压呼吸装置。
[0054]溶液、悬浮液、或粉末组合物可从以适当方式递送制剂的药物递送装置优选口服或经鼻给药，用于本发明的方法的另一种制剂利用透皮药物递送装置(“贴片”)。所述透皮贴片可用于提供以控制量的本发明治疗剂的连续或不连续的输注。用于给药的透皮贴片的结构和用途是本领域公知的。见例如，美国专利No.5,023,252，此处全文引入作为参考。所述贴片可以为连续的，脉动的，或根据给药需要而构造。其它适于用于本发明的制剂可在Remington′s Science and Practice ofPharmacy，21st Edition，ed.University of the Sciences in Philadelphia，Lippincott，Williams & Wilkins，Philadelphia Pa.，2005中找到。
[0055]利用此处描述的方法和试剂盒治疗的哺乳动物可以是任何年龄的，包括儿童，青少年，和成体。
[0056]本申请中使用的词语如下定义，除非有相反的提示。
[0057]神经干细胞是神经细胞系中的干细胞。干细胞是能够自我复制的细胞。换句话说，产生于干细胞分裂的子细胞包括干细胞。神经干细胞能够最终分化为神经细胞系的所有细胞类型，包括神经元、星形胶质细胞和少突神经胶质细胞，星形胶质细胞和少突神经胶质细胞统称为神经胶质或神经胶质细胞。因而，此处表示的神经干细胞是多潜能神经干细胞。
[0058]神经干细胞增殖试剂是能够增加神经干细胞数量的物质，例如，通过刺激增殖、抑制分化、和/或防止神经干细胞死亡。
[0059]神经变性疾病或病症是与神经元丧失或功能障碍相关的疾病或医疗状况。神经变性疾病或病症的例子包括神经变性疾病，中枢神经系统损伤或功能障碍。神经变性疾病包括，例如，阿尔茨海默氏病或其它痴呆、多发性硬化症(MS)、精神分裂症、黄斑变性、青光眼、糖尿病性视网膜病、外周神经病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化、和帕金森氏症。CNS损伤包括，例如，脑血管事件，如中风(例如，出血性中风、局部缺血性中风或全脑缺血性中风)、眼缺血、和硬脑膜窦血栓；创伤性脑或脊髓损伤(例如，由脑或脊髓外科手术或人身事故导致的损伤)；震荡；由药物导致的损伤(例如，化疗、消闲性药物(recreationaldrugs)、和精神抑制药)；冠状动脉旁路移植术(CABG)；和分娩中的缺血症。CNS功能障碍包括，例如，抑郁症、癫痫症、神经机能病和精神病。神经变性病症的实例包括衰老。室下区的神经干细胞数量在年老小鼠中显著降低。相应的，与衰老问题有关问题的改善通过根据本方法和试剂盒给予神经干细胞增殖试剂和任选的神经干细胞分化试剂而获得。
[0060]治疗和改善表示减少或完全去除疾病或医疗状况的一种或多种症状(包括神经症状或行为表现)。所述治疗或改善可包括当对有疾病或医疗状况风险的患者给药时延迟或消除一种或多种症状的发作。治疗或改善的成功的实验是本领域公知的。
[0061]与天然因子具有基本序列相似性的多肽与天然因子在氨基酸水平上具有至少大约30％同一性。多肽与天然因子在氨基酸水平上同一性优选至少大约40％，更优选至少大约60％，仍然更优选至少大约70％，并且最优选至少大约80％。因而，基本相似性可在大约30-99％同一性之间。
[0062]类似物或变体与天然因子的同一性百分比或同一性％的表述指当比对时也在类似物或变体中发现的天然因子中的氨基酸序列百分比。同一性百分比可通过本领域已经建立的任何方法或算法确定，例如，LALIGN或BLAST。
[0063]如果多肽能够结合天然因子的受体或被针对天然因子的多克隆抗体识别，则该多肽具有天然因子的生物活性。优选地，多肽能够在受体结合测试中特异性结合天然因子的受体。
[0064]天然因子的功能激动剂是结合并活化天然因子的受体的化合物，尽管它不必要具有与天然因子的基本序列相似性。
[0065]促黄体素或LH是包含天然哺乳动物(例如，人)LH的蛋白或与天然哺乳动物LH相当(comparable)的多肽序列的蛋白。如此处所用，LH类似物、变体或片段(1)包含与天然哺乳动物LH具有基本序列类似性的多肽，优选天然人LH；和(2)具有天然哺乳动物LH生物学活性。天然哺乳动物LH是由垂体前叶分泌的促性腺激素。LH是由非共价结合的α和β亚基组成的异源二聚体。α亚基在LH，FSH和HCG中是共同的，β亚基对于每种激素是特异的。在本方法和试剂盒中有用的LH可以具有天然α亚基，和与天然哺乳动物LH具有基本序列类似性的β亚基。可选的，LH可具有天然β亚基，和与天然哺乳动物LH具有基本序列类似性的α亚基。LH类似物、变体或片段也可同时具有与天然相应的亚基具有基本序列类似性的α亚基和β亚基。因而，术语LH类似物或变体包含天然LH亚基的缺失、插入、或取代突变体。而且，术语LH包括来自其它物种的LH和其天然存在的变体。另外，LH类似物也可以是天然哺乳动物LH受体的功能性激动剂。
[0066]人绒毛膜促性腺激素或hCG是包含天然哺乳动物hCG(例如，人的)或与天哺乳动物hCG类似的多肽序列的蛋白。如此处所用，hCG类似物，变体、或片段(1)包含与天然hCG具有基本序列类似性的多肽；和(2)具有天然hCG的生物学活性。天然hCG是由非共价结合的α和β亚基组成的异源二聚体。α亚基在LH，FSH和HCG中是共同的，β亚基对于每种激素是特异的。然而，hCG和LH的β亚基之间具有85％的序列类似性。本发明和试剂盒中有用的hCG可具有天然α亚基，和与天然hCG具有基本序列类似性的β亚基。可选的，hCG可具有天然β亚基，和与天然hCG具有基本序列类似性的α亚基。hCG类似物、变体或片段也可同时具有与天然相应的亚基具有基本序列类似性的α亚基和β亚基。因而，术语hCG类似物、变体、或片段包含了天然hCG亚基的缺失、插入、或取代突变体。而且，术语hCG包括了来自其它物种的hCG相似物和其天然存在的变体。另外，hCG类似物也可以是天然哺乳动物hCG/LH受体的功能性激动剂。
[0067]催乳素是包含天然哺乳动物催乳素(例如，人的)或与天然哺乳动物催乳素类似的多肽序列的多肽。如此处所用，催乳素类似物、变体或片段(1)与天然哺乳动物催乳素具有基本序列类似性，优选天然人催乳素；和(2)具有天然哺乳动物催乳素的生物学活性。天然人催乳素是主要在垂体腺中合成的199个氨基酸的多肽。因而，术语催乳素包括了催乳素类似物、变体或片段，其是天然催乳素的缺失、插入、或取代的突变体。而且，术语催乳素包括了来自其它物种的催乳素和其天然存在的变体。
[0068]另外，催乳素类似物、变体或片段也可能是天然哺乳动物催乳素受体的功能性激动剂。例如，功能性激动剂可以是美国专利No.6,333,031中公开的催乳素受体的活化氨基酸序列；具有催乳素受体激动剂活性的金属复合受体配体(美国专利No.6,413,952)；G120RhGH，其是人生长激素类似物但作为催乳素激动剂(Mode et al.，1996)；或美国专利No.5,506,107和5,837,460中描述的催乳素受体的配体。
[0069]表皮生长因子或EGF是包含天然哺乳动物EGF或类似于哺乳动物EGF的多肽序列的蛋白。如此处所用，EGF类似物、变体、或片段与天然EGF具有基本氨基酸序列类似性，并具有天然EGF的至少一种生物学活性，例如与EGF受体的结合。特别包括的作为EGF的是任何物种的天然EGF、TGFα、或重组修饰的EGF。特定的例子包括但不限于，具有两个C末端氨基酸的缺失和位点51的中性氨基酸取代的重组修饰的EGF(特别是EGF51 gln51；美国专利申请公开No.20020098178A1)，位点16的His残基被中性或酸性氨基酸取代的EGF突变蛋白(EGF-X16)(美国专利No.6,191,106)，缺乏天然EGF的氨基末端残基的EGF的52-氨基酸缺失突变体(EGF-D)，N-末端残基以及两个C-末端残基(Arg--Leu)被删去的EGF缺失突变体(EGF-B)，位点21的Met残基被氧化的EGF-D(EGF-C)，位点21的Met残基被氧化的EGF-B(EGF-A)，肝素结合性EGF样生长因子(HB-EGF)，β-细胞素，双调蛋白，神经调节蛋白，或包括上述任何蛋白的融合蛋白。其它有用的EGF类似物，变体和片段描述于美国专利申请公开No.20020098178A1，和美国专利No.6,191,106和5,547,935。
[0070]另外，EGF类似物、变体、或片段也可以是天然哺乳动物EGF受体的功能性激动剂。例如，功能性激动剂可以是公开于美国专利No.6,333,031中的EGF受体的活化氨基酸序列，或具有EGF受体激动剂活性的抗体(Fernandez-Pol，1985和美国专利No.5,723,115)。
[0071]垂体腺苷酸环化酶活化多肽或PACAP是包含天然哺乳动物PACAP(例如，人)或与天然哺乳动物PACAP类似的多肽序列的多肽。如此处所用，PACAP类似物、变体、或片段是天然PACAP或任何PACAP类似物、变体、或片段，所述PACAP类似物、变体、或片段与天然PACAP具有基本氨基酸序列类似性并具有天然PACAP的至少一种生物学活性，例如与PACAP受体的结合。有用的PACAP类似物、变体、和片段包括但不限于，PACAP的38氨基酸和27氨基酸变体(分别为PACAP38和PACAP27)，以及公开于例如美国专利No.5,128,242；5,198,542；5,208,320；5,326,860；5,623,050；5,801,147和6,242,563中的类似物和变体。
[0072]另外，PACAP类似物、变体、和片段也可以是天然哺乳动物PACAP受体的功能性激动剂。例如，功能性激动剂可以是maxadilan，一种作为PACAP 1型受体的特异性激动剂的多肽(Moro et al.，1997)。
[0073]红细胞生成素或EPO是包含天然哺乳动物EPO(例如，人)或类似于天然哺乳动物EPO的多肽序列的蛋白。如此处所用，EPO类似物、片段或变体与天然EPO具有基本氨基酸序列相似性，并具有天然EPO的至少一种生物学活性，例如与EPO受体的结合。EPO类似物、变体、和片段的例子公开于，例如，美国专利NO.6048971和5614184。
[0074]另外，EPO类似物、变体、或片段也可以是天然哺乳动物EPO受体的功能性激动剂。例如，功能性激动剂可以是EPO模拟肽1(EMP1；Johnson et al.，2000)；描述于Wrighton et al.，1996和美国专利No.5,773,569中的一种EPO的短肽模拟物；公开于Kaushansky，2001中的任何小分子EPO模拟物；描述于美国专利No.5,885,574、WO 96/40231、WO 97/48729，Fernandez-Pol，1985或美国专利No.5,723,115中的活化EPO受体的抗体；公开于美国专利No.6,333,031中的EPO受体的活化氨基酸序列；具有EPO受体的激动剂活性的金属复合受体配体(美国专利No.6,413,952)，或描述于美国专利No.5,506,107和5,837,460中的EPO受体配体。
[0075]LH/hCG-诱导试剂是当给予动物时能够增加动物中的LH或hCG量的物质。例如，LH-释放激素(LHRH)刺激LH的分泌。
[0076]哺乳动物信息素可以是包含天然哺乳动物信息素(例如，人)或类似于天然哺乳动物信息素的多肽序列的蛋白或小分子。如此处所用，信息素类似物、变体、或片段是作为对相同物种的另一动物的信号的物质，所述动物通常为相反性别。优选地，信息素选自2-仲-丁基-4，5-二氢噻唑(SBT)、2，3-脱氢-外-brevicomin(DHB)、α和β法呢烯、6-羟基-6-甲基-3-庚酮、2-庚酮、反式-5-庚烯-2-酮、反式-4-庚烯-2-酮、n-戊基乙酸酯、顺式-2-戊烯-1-基-乙酸酯、2，5-二甲基吡嗪、十二烷基丙酸酯、和(Z)-7-十二烯-1-基乙酸酯(见，例如，Dulac et al.，2003)。
[0077]有效量是足以获得期望目的的治疗剂的量。例如，增加神经干细胞数量的LH或hCG的有效量是如该情况可能成为的足以在体内或体外导致神经干细胞数量增加的量。LH或hCG治疗或改善神经变性疾病或病症的有效量是足以降低或去除神经变性疾病或病症的一种或多种症状的LH/hCG的量。给定的治疗剂的有效量将随着例如试剂性质，给药途径，接受治疗剂的动物大小和物种，以及给药目的的因素而改变。本领域熟练技术人员可根据本领域已经建立的方法根据经验确定每个个体病例中的有效量。
[0078]神经干细胞增殖试剂的等效量是获得与另一种神经干细胞增殖试剂相同或等效的效果所需要的神经干细胞增殖试剂的量。等效量可以通过等效量的相对水平或结果而详细说明。因而，等效量或等效剂量可以是获得与另一种特定神经干细胞增殖试剂相同的血清或脑脊髓液水平所需要的神经干细胞增殖试剂的量或剂量。
[0079]药物递送装置是适于给予有效量的神经干细胞增殖试剂或分化试剂的物品。药物递送装置可影响通过本领域已经建立的任何方法给予神经干细胞增殖试剂或分化试剂的效果，所述方法包括例如，肠胃外、静脉内、动脉内、结肠内(intracolonical)、气管内、腹膜内、鼻内、血管内、鞘内、颅内、骨髓内、胸膜内、皮内、透皮、皮下、肌肉内、腹膜内、口服、直肠、阴道、局部给药、肺部给药、或其任何组合。全身递送可通过一些技术完成，所述技术包括例如，肠胃外、静脉内、动脉内、结肠内(intracolonical)、气管内、腹膜内、鼻内、血管内、鞘内、颅内、骨髓内、胸膜内、皮内、透皮、皮下、肌肉内、腹膜内、口服、直肠、阴道、局部给药、肺部给药、或其任何组合。药物递送装置可以是，例如，可植入装置或泵(例如，渗透泵)、制剂的贮库(缓释)递送、或注射笔(用或不用针)。任选地，药物递送装置是输注装置或其元件；或可选的，为输注之外的装置。
[0080]下面的实施例意图进一步阐述本发明的特定实施方式，而不意图限制权利要求的范围。
实施例
[0081]在下面的实施例中，下述缩写具有下述意思。没有定义的缩写具有一般所接受的含义。
℃ ＝ 摄氏度
hr ＝ 小时
min ＝ 分钟
μM ＝ 微摩尔
mM ＝ 毫摩尔
M ＝ 摩尔每毫升(molar ml milliliter)
μl ＝ 微升
mg ＝ 毫克
μg ＝ 微克
FBS ＝ 胎牛血清
PBS ＝ 磷酸盐缓冲盐水
DMEM ＝ Dulbecco’s改良Eagle’s medium
MEM ＝ 改良的Eagle’s medium
EGF ＝ 表皮生长因子
NSC ＝ 神经干细胞
SVZ ＝ 室下区
PACAP ＝ 垂体腺苷酸环化酶活化多肽
BMP ＝ 骨形态发生蛋白
RSA ＝ 大鼠血清白蛋白
实施例1
利用rhCG+EPO的中风后功能改进
[0082]通过临时闭塞右侧大脑中动脉(MCA)而损伤雄性大鼠，然后给予逐步增加剂量的重组人绒毛膜促性腺激素(rhCG)，紧接着给予3天的红细胞生成素(EPO，Epogen 1440IU/天)。
[0083]将雄性Long Evans大鼠(280-330g)禁食过夜，但允许自由获取水。硫酸阿托品(0.5mg/kg，i.p.)在麻醉之前10分钟注射。用70％一氧化二氮和30％氧的混合物中的3.5％异氟烷诱导麻醉。所有的大鼠都口部插管并机械通气。通气过程中，动物用泮库溴铵(pancuroniumbromide)(0.6mg/kg，i.p)麻醉。
[0084]如Zea Longa et al.(Stroke 20：84(1989))所述和(Belayev et al.，Stroke 27：1616(1996))的修改将MCA临时闭塞90分钟。缝合处置之后，封闭颈部切口，允许动物从麻醉中苏醒。MCAo之后60分钟，在标准神经行为成套测试中测试，以确认神经缺陷的存在(Belayev et al，1996)。没有表现出左上肢轻瘫的大鼠(总神经得分小于9；见行为测试，下面和图1)排除在进一步研究之外。MCAo 90分钟之后，大鼠被重新麻醉，重新插入温度探针，并且小心的去除腔内缝线。
[0085]MCAo之前和闭塞过程中(在60分钟时)在所有大鼠中进行行为测试以确认MCAo的成功。成套测试由先前利用的2个测试组成以评价神经功能的不同方面：(1)姿势反射测试，为Bederson et al.(Stroke17：472(1986))所研发，以检查当动物通过尾巴被悬挂时的上身姿势；和(2)前肢放置测试(forelimb placing test)，为De Ryck et al.(Stroke20：1383(1989))所研发，以检查对视觉、触觉和本体感受刺激的前肢放置反应中的感觉运动综合。神经功能被分级为0-12等级(正常得分＝0，最大得分＝12)。
[0086]治疗和实验组如下：
组1：n＝8，在第1，3和5天IM给予盐溶液(与IM给予的hCG等体积)，然后从外科手术后第7，8，9天开始通过泵(AlzetOsmotic Pumps；Cupertino，CA)IV给予盐。首次注射是在中风外科手术之后24小时给予。
组2：n＝8；MCA闭塞之后第1，3和5天IM给予盐溶液(与IM给予的hCG等体积)，然后从第7，8，9天开始通过泵IV给予EPO(1440IU/天)。首次注射在中风外科手术之后24小时给予。
组3：n＝8；在MCA闭塞之后第1，3和5日IM递送hCG(33IU/天)，然后从第7，8，9天开始通过泵IV给予EPO(1440IU/天)。首次注射在中风外科手术之后24小时给予。
组4：n＝8；在MCA闭塞之后第1，3和5天IM递送hCG(100IU/天)，然后从第7，8，9天开始通过泵IV给予EPO(1440IU/天)。首次注射在中风外科手术之后24小时给予。
组5：n＝8；在MCA闭塞之后第1，3和5天IM递送hCG(300IU/天)，然后从第7，8，9天开始通过泵IV给予EPO(1440IU/天)。首次注射在中风外科手术之后24小时给予。
组6：n＝8；在MCA闭塞之后第1，3和5天IM递送hCG(1000IU/天)，然后从第7，8，9天开始通过泵IV给予EPO(1440IU/天)。首次注射在中风外科手术之后24小时给予。
组7：n＝8；在MCA闭塞之后第1，3和5天IM递送hCG(3000IU/天)，然后从第7，8，9天开始通过泵IV给予EPO(1440IU/天)。首次注射在中风外科手术之后24小时给予。
组8：n＝8；在MCA闭塞之后第1，3和5天IM递送hCG(10000IU/天)，然后从第7，8，9天开始通过泵IV给予EPO(1440IU/天)。首次注射在中风外科手术之后24小时给予。
组9：n＝8；在MCA闭塞之后第1，3和5天IM递送hCG(30000IU/天)，然后从第7，8，9天开始通过泵IV给予EPO(1440IU/天)。首次注射在中风外科手术之后24小时给予。
[0087]如从图1中所见，这些接受了hCG然后接受了EPO的动物的功能性恢复好于仅接受了EPO的动物。
[0088]转化为人给药遵循从大鼠给药的mg/kg转化为人给药的mg/m2的异速生长比例因子8。根据该转化已经建立的指南(Guidance forIndustry：Estimating the Maximum Safe Starting Does in Initial ClinicalTrials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers，U.S.Department ofHealth and Human Services，FDA Center for Drug Evaluation and Research，July 2005)，对于观察到的300IU/天的大鼠最佳剂量转化为
HD＝[AD*AKm]/HKm
其中，
HD＝人剂量，
AD＝动物剂量
AKm＝动物km因子
HKm＝人km因子
[0089]因此，对于体重为305g的普通大鼠300IU/天(在本研究中其相当于每天30μg hCG，也就是：1μg hCG＝10IU hCG)相当于动物中的98.4μg/kg剂量。大鼠km因子为8，人km因子为37，对于人给药的hCG最佳剂量因而计算为：
HD＝98.4μg/kg*8/37＝21.28μg/kg或212.8IU/kg/天
[0090]EPO的人剂量可被计算，根据本实施例中体重为305g的普通大鼠的1440IU/天的EPO剂量的活性相当于动物的4721.3IU/kg的剂量。用大鼠km因子为8，人km因子为37，对于人给药的EPO最佳剂量因而计算为：
HD＝4,721.3IU/kg*8/37＝1020.82IU/kg
实施例2
利用hCG+EPO的中风后的功能改进
[0091]第二组雄性大鼠通过如实施例1所述临时闭塞右侧大脑中动脉(MCA)而被损伤，然后给予人源的人绒毛膜促性腺激素(hCG)，紧接着如实施例1所述给予3天的红细胞生成素(EPO，Epogen 1440IU/天)。
[0092]将雄性Long Evans大鼠(280-330g)禁食过夜，但允许自由获取水。硫酸阿托品(0.5mg/kg，i.p.)在麻醉之前10分钟注射。用70％一氧化二氮和30％氧的混合物中的3.5％异氟烷诱导麻醉。所有的大鼠都口部插管并机械通气。通气过程中，动物用泮库溴铵(pancuroniumbromide)(0.6mg/kg，i.p)麻醉。
[0093]如实施例1所述在MCAo之前和闭塞过程中(在60分钟)对所有大鼠进行行为测试，以确认MCAo的成功。
[0094]治疗和实验组如下：
组1：n＝10；在第1，3和5天IM给予盐溶液(与IM给予hCG相等体积)，然后从外科手术后第7，8，9天开始通过泵IV给予盐。
组2：n＝10；在MCA闭塞之后第1，3和5天IM递送hCG(440IU/天)，然后从第7，8，9天开始通过泵IV给予EPO(1440IU/天)。
组3：n＝10；在MCA闭塞之后第1，3和5天IM递送hCG(440IU/天)，然后从第7，8，9天开始通过泵IV给予相同体积比例的盐。
组4：n＝10；在MCA闭塞之后第1，3和5天IM递送盐，然后从第7，8，9天开始通过泵IV给予EPO(1440IU/天)。
组5：n＝5，无MCAo，无治疗，在第-1，1，2，3，4和6周以四种行为任务培训并测试动物。
[0095]图2显示了中风后同一时间点上测试组之间神经功能上的差异，分为0-12级。如所见的，以在此处所述的方案给予hCG然后给予EPO产生显著的功能改进。而且，图3显示了这些测试组的组织损失％(与非中风大脑半球相比)的图表，图4显示了每个组的组织损失的代表图。
[0096]另外，在第三次IM给予hCG之后测量血清hCG水平。如图5所示，循环的hCG水平在给药动物中是显著的。
实施例3
在人急性中风的治疗中利用hCG+EPO
[0097]对于人中风患者开始了一项研究，涉及到在研究参与的第1，3和5天提供给患者3个每日一次的hCG(10000IU/天)IM剂量，接着一天的洗出期(第6天)，然后再研究参与的第7，8和9天三个一天一次的红细胞生成素(30000IU/天)IV剂量。首次IM hCG剂量在中重度的中风事件之后24到48小时之间递送。治疗过程中在几个点以及在中风发作之后6周和3个月检查患者。基线评价包括临床/安全、神经学、血液学、和血管状态，以及脑MRI。临床/安全、神经学、血液学、和血管状态的评价将在完成治疗后第1天，15天和80天重复。为对比目的，脑MRI将在完成治疗(中风发作之后大约90天)之后80天重复。
实施例4
催乳素的给药
[0098]在两个催乳素给药实验中利用雄性大鼠(250-300g)。催乳素通过皮下微-渗透泵输注(微泵)每天一次的给予。储存的催乳素在碳酸氢盐缓冲液中稀释，并且进一步在用于注射的1mg/ml的盐水中的大鼠血清白蛋白(RSA)中进行稀释。大鼠没有受到缺血性损伤。在第6天动物在10小时内接受6 BrdU注射(Sigma-Aldrich)(60mg/kg，i.p.)，并在最后的BrdU注射30分钟后处死。冷冻切割大脑并且利用每个动物8个切片在SVZ中量化BrdU+细胞。如图示符号所示，结果表示为SVZ中的BrdU+细胞总数量或表示为每切片的平均值。
实验#1：
[0099]大鼠给药6天，并且接受皮下输注以下剂量的RSA(对照)或大鼠催乳素(National Hormone and Peptide Program，Torrance，CA)(每组三只大鼠)：
*10x＝99ul/泵(2mg/0.25ml PRL)-113μg/天
**15x＝148.5ul/泵(2mg/0.25ml PRL)-170μg/天
***20x＝198ul/泵(2mg/0.25ml PRL)-226μg/天
其中
*10x＝10倍于脑室内输注给予的剂量(大约11μg/天)
**15x＝15倍于脑室内输注给予的剂量
***20x＝20倍于脑室内输注给予的剂量
结果：
[00100]如图6所示，170μg/天导致了在前脑SVZ之内的增殖(BrdU+细胞数量)的最大增加。
实验#2：
[00101]大鼠给药3或6天，并且接受每天单次腹膜内注射以下剂量的RSA或大鼠催乳素(每组3只大鼠)：
170μg/天3天
396μg/天3天
170μg/天6大
结果：
[00102]如图7所示，170μg/天递送6天导致了在前脑SVZ之中增殖(BrdU+细胞数量)的最大增加。
实施例5
hCG的给药
[00103]本研究的目的是为了确定使成体雄性大鼠的前脑胚带的细胞增殖和组织再生最大化的hCG剂量，所述大鼠已经受到运动皮层的软膜条(pial strip)血行阻断缺血性损伤。
方法
动物和外科手术
[00104]250-350g雄性大鼠如前所述受到运动皮层的软膜条血行阻断缺血性损伤(Gonzalez and Kolb.A comparison of different models ofstroke on behaviour and brain morphology.Eur J Neurosci.2003.18(7)：1950-1962)。对于戊巴比妥钠麻醉(60mg/kg)的动物，从前卤点向前/向后+4到-2mm和从中线横向1.5到4.5mm钻一个矩形洞。去除硬脑膜并且利用无菌盐水浸泡的棉签从皮层表面擦拭软脑膜和附着的血管。
给药
[00105]中风后一天开始(24小时后)，动物接受单独肌肉内(i.m.)注射hCG(National Peptide and Hormone Program，Torrance，CA))，剂量如表1所述给出，并且以5天三次注射(在第1，3和5天给药)或一周内每天注射，注射在每天9:00am给予。对照大鼠接受盐水中的大鼠血清白蛋白(RSA；Sigma，1mg/ml)注射。在最后给药的当天，hCG注射之后30分钟开始，动物10小时内接受6次BrdU注射。BrdU(Sigma-Aldrich)以60mg/kg剂量，i.p.给予。动物用4％多聚甲醛透心输注。切割大脑，在蔗糖中冷冻保藏并冷冻切割。大脑以14微米冷冻切割为两系列的8个切条，每个切条具有8个切片。利用兔抗-磷酸组蛋白H3(phosphohistone H3)(抗pHH3；1:100；Upstate Biotechnologies)、大鼠抗-BrdU(1:100；Seralab)、山羊抗-doublecortin(DCX；1:100；Santa CruzBiotechnologies)进行免疫染色。每个动物的侧脑室周围的前脑室下区(SVZ)中的磷酸组蛋白H3(phosphohistone H3)(pHH3-一种有丝分裂-活性细胞标记物)、BrdU、和doublecortin(DCX-不成熟神经元的标记物)阳性细胞的数量在8个切片中量化，并且表示为每个侧脑室的阳性细胞平均数量。
统计
[00106]数值是平均值+平均值标准误差(SEM)。显著性使用单因素方差分析然后进行Tukey HSD posthoc测试(*p<0.05；**p<0.01)而确定。每组中包括三只动物。
结果
[00107]本研究检查了肌肉内注射hCG促进中风后成体前脑室下区中的神经干细胞和祖细胞的增殖的能力。动物进行了软膜条血行阻断外科手术以诱导运动皮层的局部缺血性损伤，治疗在24小时后开始。在弹丸浓注的高剂量策略中，如表1中概括的，动物在5天内的第1(中风后24小时)、3和5天接受3剂hCG。动物在第5天被处死分析前脑SVZ的增殖水平。如表2和图8所示，本方案与接受RSA对照注射的中风动物相比在增加增殖上是有效的。在1000μg的剂量时，增殖增加了几乎2.5倍，并且，如图9所示，这些动物的SVZ中新产生的doublecortin阳性(DCX+)神经元的数量类似地显著增加。
[00108]在另一研究中，动物如表1所概括的每天接受hCG给药7天，开始于中风后24小时，在第7天给予动物BrdU10小时，然后处死。如图10A所示，通过pHH3免疫反应性显示的SVZ中分裂细胞数量在330μg/注射的组中相对于所有其它组显著增加了。这种增加通过相对于RSA对照量化这些动物的SVZ中的BrdU+细胞数量而确认(图11)。相对于软膜条RSA对照在100μg治疗组中有增加的趋势(图10A和11)。注意图10中的未治疗动物没有接受注射和没有软膜条中风。作为内部对照，一个组接受与330μg/注射的组相同的总剂量(见表1)，但在第1，3和5天以770μg/注射3次注射给予hCG，并且动物在第5天处死。基于此研究，以每天330μg/注射给予的低的，常规剂量的hCG对于大脑缺血性损伤之后的前脑SVZ中的增殖的增加是最有效的。
[00109]为确定是否任何给药方案都可能导致新的皮层组织的生长，我们分析了hCG治疗动物的皮层的损害位点。在以330μg/注射的低的常规剂量的给药方案给药的动物组中组织再生长是特别明显的(图10B)。
[00110]任何在说明书中提到的专利或公开文献都表示了本发明涉及领域的熟练技术人员的水平。这些专利和公开文献在此全文引入作为参考，如同每篇单独文献特别并单独的引入作为参考一样。
[00111]本发明不限于实施例中公开的实施方式的范围，实施例只是意图作为本发明的某些方面的例证，任何功能等同的实施方式在本发明的范围内。在此展示和描述之外的本方法和试剂盒的多种修饰对于本领域熟练技术人员来说是明显的，并且落在所附权利要求的范围内。而且，尽管只有在此公开的组合物的某些代表性组合在上述实施方式中进行了特别讨论，组合物的其它组合对于本领域熟练技术人员来说是明显的，并且也落在所附权利要求的范围内。因而步骤或组合物的组合可在此明确提及；然而，步骤或组合物的其它组合尽管没有明确阐述也包括在内。
表1.hCG给药策略。大鼠在中风后24小时开始接受5天内或7天内三次肌肉内(I.M.)注射hCG。对照大鼠仅仅接受RSA注射。
表2.对于软膜条血行阻断中风后24小时用hCG给药的动物相对于对照的pHH3+，BrdU+和DCX+细胞的定量，将每侧脑室阳性细胞的平均数量表示为实际值±SEM。