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1、10申请公布号CN104152436A43申请公布日20141119CN104152436A21申请号201410377744522申请日20140801C12N15/1020060171申请人杭州新景生物试剂开发有限公司地址310030浙江省杭州市西湖区西园八路2号8幢2单元601室72发明人徐小寅蒋锦琴隋梅花徐万红74专利代理机构北京联瑞联丰知识产权代理事务所普通合伙11411代理人武金花54发明名称DNA分离纯化方法及其试剂盒57摘要本发明提出了一种DNA分离纯化方法及其试剂盒，方法包括下列步骤A将裂解缓冲液加入到含有DNA的生物样本中以得到溶解的生物样本缓冲溶液；然后剧烈摇晃缓冲溶液；。
2、B在剧烈摇晃后的所述缓冲溶液中加入沉淀液，之后剧烈摇晃，离心，形成蛋白质沉淀和上清液；C将所述的上清液加入纯化柱中，洗脱DNA。使用本发明的DNA分离纯化方法样本溶解，血红蛋白沉淀，柱纯化，洗脱DNA，小于15分钟。无需另外添加乙醇，或者调整PH，盐分等条件，DNA就可以吸附到纯化柱上。51INTCL权利要求书1页说明书7页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图1页10申请公布号CN104152436ACN104152436A1/1页21一种DNA分离纯化方法，所述方法包括下列步骤A将裂解缓冲液加入到含有DNA的生物样本中以得到溶解的生物样本缓冲溶。
3、液；然后剧烈摇晃缓冲溶液；B在剧烈摇晃后的所述缓冲溶液中加入沉淀液，之后剧烈摇晃，离心，形成蛋白质沉淀和上清液；C将所述的上清液加入纯化柱中，洗脱DNA。2根据权利要求1所述的一种DNA分离纯化方法，其特征在于，所述裂解缓冲液选自氯化铵、硫氰酸铵、硫氰酸胍、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫氰酸钠、TX114、十二烷基肌氨酸钠中的几种的混合物。3根据权利要求2所述的一种DNA分离纯化方法，其特征在于，所述裂解缓冲液为15G/G磷酸氢二钠011G/G磷酸二氢钠15G/G十二烷基氨酸钠12M氯化铵1525M硫氰酸铵以及355M硫氰酸胍。4根据权利要求1所述的一种DNA分离纯化方法，其特征在于，所述样本为生。
4、物样本。5根据权利要求4所述的一种DNA分离纯化方法，其特征在于，所述生物样本为抗凝全血、唾液、细胞或细菌；所述生物样本选自抗凝全血。6根据权利要求1所述的一种DNA分离纯化方法，其特征在于，所述沉淀液选自氯化锌、硫酸钠、乙酸锌、氯化钠、氯化钾、硫酸锌、硫酸胍、乙酸钾、乙酸钠、乙酸胍、盐酸胍中的几种的混合物。7根据权利要求6所述的一种DNA分离纯化方法，其特征在于，所述沉淀液为510G/G乙酸钠或乙酸钾210G/G乙酸1050G/G硫酸锌12M氯化钾以及12M盐酸胍。8根据权利要求1所述的一种DNA分离纯化方法，其特征在于，所述纯化柱为含有二氧化硅介质的纯化柱。9根据权利要求1所述的一种DNA。
5、分离纯化方法，其特征在于，所述缓冲液、样本、沉淀液的体积比是352413。10一种DNA分离纯化试剂盒，包括上述权利要求19任一权利要求所述裂解缓冲液和沉淀液。权利要求书CN104152436A1/7页3DNA分离纯化方法及其试剂盒技术领域0001本发明涉及分子生物学技术中的核酸纯化领域，特别是指一种DNA分离纯化方法及其试剂盒。背景技术0002传统的DNA纯化方法是用SDS十二烷基磺酸钠、TX100、CTABCETYLTRIMETHYLAMMONIUMBROMIDE,十六烷基三甲基溴化铵等试剂裂解细胞，然后经酚、氯仿有毒性抽提去除蛋白质，使DNA释放到上清中，上清液中的DNA再经乙醇或异丙醇。
6、沉淀回收。但是这样纯化的DNA中仍存留一部分蛋白质、多糖等物质，需采用其它形式的纯化方法进一步纯化DNA。如比格科技私人有限公司的公开号为CN102725407A，公开日为20121010，名称为分离核酸的方法及其试剂盒的发明专利，即公开了如下的技术特征，一种从样本中分离核酸的方法，所述方法包括下列步骤A将裂解缓冲液加入到含有核酸的样本中以得到裂解溶液；或者B将裂解缓冲液连同结合缓冲液一起加入到样本中以得到裂解溶液；C将结合缓冲液加入到步骤A的溶液中以使核酸与基质结合，或者使步骤B的溶液与基质直接结合；和D洗涤和洗脱与基质结合的核酸以分离和纯化核酸。0003采用SDS十二烷基硫酸钠和氢氧化钠的。
7、溶解液溶解细胞，再用含有乙酸钾和乙酸的混合液中和溶解液，使大部分蛋白质沉淀下来，DNA溶解在上清液中。但是这种方法主要用于质粒DNA的分离纯化，如果用于抗凝全血中DNA的分离纯化，则根本不能使血红蛋白沉淀下来。0004市场上其他公司已经商品化的血液DNA提取试剂盒，细菌DNA提取试剂盒均需要蛋白酶K消化步骤，价格昂贵，时间比较长。发明内容0005本发明提出一种DNA分离纯化方法及其试剂盒，解决了现有技术中无法快速分离纯化DNA的问题。0006本发明的技术方案是这样实现的0007一种DNA分离纯化方法，所述方法包括下列步骤0008A将裂解缓冲液加入到含有DNA的生物样本中以得到溶解的生物样本缓冲。
8、溶液；然后剧烈摇晃缓冲溶液；0009B在剧烈摇晃后的所述缓冲溶液中加入沉淀液，之后剧烈摇晃，离心，形成蛋白质沉淀和上清液；0010C将所述的上清液加入纯化柱中，洗脱DNA。0011作为优选的技术方案，所述裂解缓冲液选自氯化铵、硫氰酸铵、硫氰酸胍、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫氰酸钠、TX114、十二烷基肌氨酸钠中的几种的混合物。其中氯化铵、硫氰酸铵、硫氰酸胍、硫氰酸钠溶解用作溶解生物样本中的蛋白质组分。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠维持裂解缓冲液稳定的PH值。TX114、十二烷基肌氨酸钠用作溶解生物样本中的脂说明书CN104152436A2/7页4质组分。0012作为优选的技术方案，所述裂解缓冲液为001。
9、315G/G磷酸氢二钠0014011G/G磷酸二氢钠001515G/G十二烷基氨酸钠001612M氯化铵00171525M硫氰酸铵以及0018355M硫氰酸胍。0019作为优选的技术方案，所述裂解缓冲液为002015G/G磷酸氢二钠002105G/G磷酸二氢钠002216G/G十二烷基肌氨酸钠002315M氯化铵00242M硫氰酸铵以及00254M硫氰酸胍。0026作为优选的技术方案，所述样本为生物样本。0027作为优选的技术方案，所述生物样本为抗凝全血、唾液、细胞或细菌。0028作为优选的技术方案，所述生物样本选自抗凝全血。0029作为优选的技术方案，所述沉淀液选自氯化锌、硫酸钠、乙酸锌、氯。
10、化钠、氯化钾、硫酸锌、硫酸胍、乙酸钾、乙酸钠、乙酸胍、盐酸胍中的几种的混合物。其中氯化锌、乙酸锌、硫酸锌等物质提供锌离子作为蛋白组分的沉淀内核。硫酸钠、氯化钠、氯化钾等物质可促成蛋白组分盐析沉淀。乙酸钾、乙酸钠等物质维持沉淀液稳定的PH值。硫酸胍、乙酸胍、盐酸胍等物质维持沉淀液中含有高浓度的盐分。0030作为优选的技术方案，所述沉淀液为0031510G/G乙酸钠或乙酸钾0032210G/G乙酸00331050G/G硫酸锌003412M氯化钾以及003512M盐酸胍。0036作为优选的技术方案，所述沉淀液为00378G/G乙酸钠或乙酸钾00385G/G乙酸003915G/G硫酸锌00401M氯化。
11、钾以及004115M盐酸胍。0042作为优选的技术方案，所述纯化柱为含有二氧化硅介质的纯化柱。0043作为优选的技术方案，所述缓冲液、样本、沉淀液的体积比是352413。0044作为优选的技术方案，所述缓冲液、样本、沉淀液的体积比是343。0045一种DNA分离纯化试剂盒，包括上述裂解缓冲液和沉淀液。说明书CN104152436A3/7页50046有益效果00471简便、快速0048传统全血DNA分离纯化方法红细胞去除，白细胞蛋白酶K消化，酚氯仿抽提，异丙醇沉淀，乙醇洗涤，DNA溶解，约12小时；0049QIAGEN全血试剂盒样本溶解，蛋白酶K消化，补加乙醇，柱纯化，洗脱DNA，约3045分钟。
12、；0050使用本发明的DNA分离纯化方法样本溶解，血红蛋白沉淀，柱纯化，洗脱DNA，小于15分钟。无需另外添加乙醇，或者调整PH，盐分等条件，DNA就可以吸附到纯化柱上。00512廉价，蛋白酶K是昂贵的试剂，本发明不使用蛋白酶K。00523环保，与传统DNA分离纯化方法相比，无需酚、氯仿等有害化学品的使用。附图说明0053为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。0054图1。
13、从11个不同的人抗凝全血样本中分离纯化DNA的效果图实施例1。0055图2从6个相同的金黄色葡萄球菌样本中分离纯化DNA的效果图实施例2。具体实施方式0056下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。0057本发明涉及一种DNA分离纯化方法，它能将生物大分子中的蛋白质分子沉淀去除，DNA分子溶解在溶液中，特别适合蛋白含量很高的生物学样本比如抗凝全血中DNA的分离纯化，溶解在溶液中的DNA的还可以直接吸附到。
14、含有二氧化硅介质的纯化柱上，洗脱后即获得高纯度的DNA。我公司利用该技术开发成的产品有全血DNA小量试剂盒、细菌DNA试剂盒。本发明的一种DNA分离纯化方法，所述方法包括下列步骤0058A将裂解缓冲液加入到含有DNA的样本中以得到缓冲溶液；然后剧烈摇晃缓冲溶液；0059B在剧烈摇晃后的所述缓冲溶液中加入沉淀液，之后剧烈摇晃，离心，形成蛋白质沉淀和上清液；0060C将所述的上清液加入纯化柱中，洗涤、洗脱DNA。0061详见实施例。0062实施例10063全血DNA小量试剂盒操作步骤0064其中BUFFERL1为裂解缓冲溶液为006515磷酸氢二钠说明书CN104152436A4/7页600660。
15、5磷酸二氢钠006716十二烷基肌氨酸钠006815M氯化铵00692M硫氰酸铵以及00704M硫氰酸胍。0071BUFFERL2为沉淀液00728乙酸钾00735乙酸007415硫酸锌00751M氯化钾以及007615M盐酸胍。0077本操作步骤是为从400L全血中提取DNA而设计，如果血液体积小于400L但大于200L，可按比例减少BUFFERL1和BUFFERL2的用量，其他试剂用量不变；但如果血液体积小于200L，建议在血液中补充生理盐水至血液体积至少至200L。00781加300LBUFFERL1到15ML离心管中。00792加入400L全血，盖上管盖，旋涡振荡30秒。00803加入。
16、300LBUFFERL2，剧烈摇晃离心管35次，再旋涡振荡30秒混匀。0081413000RPM离心2分钟。00825将步骤4中的上清液倒入到核酸纯化柱中核酸纯化柱置于2ML离心管中，盖上管盖，12000RPM离心30秒。00836弃2ML离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ML离心管中，在核酸纯化柱中加入500LBUFFERWA,盖上管盖，12000RPM离心30秒。00847弃2ML离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ML离心管中，在核酸纯化柱中加入600LBUFFERWB,盖上管盖，12000RPM离心30秒。00858弃2ML离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ML离心管中，14000。
17、RPM离心1分钟。00869弃2ML离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的15ML离心管中，在纯化柱中央加100200L56温育的BUFFERTE，盖上管盖，室温静置1分钟，12000RPM离心30秒。008710弃纯化柱，洗脱的DNA可立即用于各种分子生物学实验；或者将DNA储存于20备用。0088参见图1从左至右11个血样DNA的紫外吸收值数据如下0089样品编号ABS260ABS280260/280样品浓度样品类型110080578175504193NG/ULDDNA2363220051811815965NG/ULDDNA314650849172732436NG/ULDDNA说明书CN104。
18、152436A5/7页7408640491176432097NG/ULDDNA509670548176483490NG/ULDDNA604890275178244487NG/ULDDNA707960447178397854NG/ULDDNA804380257171219022NG/ULDDNA908910501178445579NG/ULDDNA1003230188172161646NG/ULDDNA1106290354174314288NG/ULDDNA0090实施例20091细菌DNA试剂盒操作步骤0092其中BUFFERL1为裂解缓冲溶液00935磷酸氢二钠00941磷酸二氢钠00955。
19、十二烷基肌氨酸钠00962M氯化铵009725M硫氰酸铵以及009835M硫氰酸胍。0099BUFFERL2为沉淀液010010乙酸钾010110乙酸010250硫酸锌01032M氯化钾以及01041M盐酸胍。0105具体步骤如下01061用15ML离心管收集20109细菌培养物，加入200LBUFFERTE，旋涡震荡充分悬浮细菌。01072加入100L溶菌酶溶液，旋涡振荡约15秒混匀，37水浴30分钟。01083加入225LBUFFERL1，旋涡振荡30秒。01094加入225LBUFFERL2，剧烈摇晃离心管35次，再旋涡振荡30秒混匀。0110513000RPM离心2分钟。01116将步。
20、骤5中的上清液倒入到核酸纯化柱中核酸纯化柱置于2ML离心管中，盖上管盖，12000RPM离心30秒。01127弃2ML离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ML离心管中，在核酸纯化柱中加入500LBUFFERWA,盖上管盖，12000RPM离心30秒。说明书CN104152436A6/7页801138弃2ML离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ML离心管中，在核酸纯化柱中加入600LBUFFERWB,盖上管盖，12000RPM离心30秒。01149弃2ML离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ML离心管中，14000RPM离心1分钟。011510弃2ML离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的15ML离。
21、心管中，在纯化柱中央加100200L37温育的BUFFERTE，盖上管盖，室温静置1分钟，12000RPM离心30秒。011611弃纯化柱，洗脱的DNA可立即用于各种分子生物学实验；或者将DNA储存于20备用。0117参见图2从左至右6个金黄色葡萄球菌样本DNA的紫外吸收值数据如下0118样品编号ABS260ABS280260/280样品浓度样品类型10517029117801293NG/ULDDNA20526029817631314NG/ULDDNA30568032017721419NG/ULDDNA40562031717751405NG/ULDDNA50568032417501419NG/。
22、ULDDNA60573032417701432NG/ULDDNA0119实施例30120从培养细胞、唾液中分离纯化DNA的操作步骤0121其中BUFFERL1为裂解缓冲溶液01221磷酸氢二钠012301磷酸二氢钠01241十二烷基肌氨酸钠01251M氯化铵012615M硫氰酸铵以及01275M硫氰酸胍。0128BUFFERL2为沉淀液01295乙酸钠01302乙酸013110硫酸锌01321M氯化钾以及01332M盐酸胍。01341A从细胞中分离纯化DNA0135A悬浮培养的细胞0136用15ML离心管300G离心5分钟，收集510106细胞，弃培养基，加入300L说明书CN10415243。
23、6A7/7页9PBS溶液悬浮沉淀。0137B贴壁培养的细胞0138用胰酶消化或者细胞刮刀刮取的方法收集50106细胞到15ML离心管，300G离心5分钟，弃培养基，加入300LPBS溶液悬浮沉淀。01391B从唾液中分离纯化DNA0140用15ML离心管收集300L唾液。01412加入225LBUFFERL1，盖上管盖，旋涡振荡30秒。01423加入225LBUFFERL2，剧烈摇晃离心管35次，再旋涡振荡30秒混匀。0143413000RPM离心2分钟。01445将步骤4中的上清液倒入到核酸纯化柱中核酸纯化柱置于2ML离心管中，盖上管盖，12000RPM离心30秒。01456弃2ML离心管中。
24、的滤液，将核酸纯化柱置回到2ML离心管中，在核酸纯化柱中加入500LBUFFERWA,盖上管盖，12000RPM离心30秒。01467弃2ML离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ML离心管中，在核酸纯化柱中加入600LBUFFERWB,盖上管盖，12000RPM离心30秒。01478弃2ML离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ML离心管中，14000RPM离心1分钟。01489弃2ML离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的15ML离心管中，在纯化柱中加入100200L56温育的BUFFERTE，盖上管盖，室温静置1分钟，12000RPM离心30秒。014910弃纯化柱，洗脱的DNA可立即用于各种分子生物学实验，或者将DNA储存于20备用。0150以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。说明书CN104152436A1/1页10图1图2说明书附图CN104152436A10。