应用转基因技术提高水稻植株对稻纵卷叶螟抗性的方法.pdf

本发明公开了应用转基因技术提高水稻植株对稻纵卷叶螟抗性的方法，属于植物基因工程育种技术领域。该方法包括：将Rubisco特异表达启动子RubS与抗虫基因Cry1A(b)构建到pPZP201表达质粒载体中；利用根癌土壤杆菌介导的共转化方法使Cry1A(b)基因整合到水稻基因组中；在其自交后代中再剔除潮霉素抗性基因等步骤。该转基因水稻中的Cry1A(b)抗虫目的基因在叶片上呈特异高表达，而在籽粒中呈低表达、在根中不表达，从而显著提高了水稻植株对稻纵卷叶螟的抗性，大幅减少了农药施用，降低生产成本，提高种植效益；同时降低了抗虫蛋白在水稻籽粒、花粉和根中的表达，减少了人们对转基因水稻安全性的担忧。

权利要求书
1、  由根癌土壤杆菌(Agrobacyerium tumefaciens)EHA101与质粒pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos构建的菌种EHA101/pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos，其菌种保藏编号为CGMCC No.2319。

2、  应用转基因技术提高水稻植株对稻纵卷叶螟抗性的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
(1)抗虫基因质粒载体pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos的构建：
1)用添加了SalI内切酶位点的引物BtF：5′-tgtgtcgacatggacaacaacccaaacat-3′和添加了XbaI内切酶位点的引物BtR：5′-ctgtctagagtactcagcctcgaaggtaa-3′，扩增p35S-Cry1A(b)-NosTer质粒载体中的Cry1A(b)基因序列，电泳后回收，连接到pCR4-TOPO克隆载体中，形成pTOPO-Cry1A(b)质粒载体；
2)用Sal I完全酶切、XbaI部分酶切上述pTOPO-Cry1A(b)质粒载体，电泳后回收大小为1.8kb的Cry1A(b)条带，连接到pRN72克隆载体中，形成pRN72-Cry1A(b)-Nos质粒载体；
3)用HindIII和EcoR I双酶切上述pRN72-Cry1A(b)-Nos质粒载体，电泳后回收大小为4.9kb的RbcS-Cry1A(b)-Nos条带，连接到pPZP201克隆载体中，形成pPZP201-RbcS(2.8kb)-Cry1A(b)-Nos质粒载体，其中的RbcS为Rubisco组织特异表达启动子，大小为2.8kb，Cry1A(b)大小为1.8kb，Nos大小为0.3kb；
4)用Hind III和Sal I双酶切质粒载体pSB11，电泳后回收大小为1.3kb的RubS条带；用Hind III和Sal I双酶切质粒pPZP201-RbcS(2.8kb)-Cry1A(b)-Nos，取分离了RbcS(2.8kb)片段后的载体部分与回收的大小为1.3kb的RubS连接，形成pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos质粒载体，其中的RubS也为Rubisco组织特异表达启动子，大小为1.3kb；
(2)根癌土壤杆菌EHA101/pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos和根癌土壤杆菌EHA105/pCambia 1300的建立：
1)根癌土壤杆菌EHA101/pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos的建立：将质粒载体pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos电转化到根癌土壤杆菌EHA101中，形成内含pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos质粒的根癌土壤杆菌EHA101/pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos；
2)根癌土壤杆菌EHA105/pCambia 1300的建立：将质粒pCambia 1300电转化到根癌土壤杆菌EHA105中，形成内含pCambia 1300质粒的根癌土壤杆菌EHA101/pCambia 1300；
(3)水稻愈伤组织Hpt抗性基因和Cry1A(b)抗虫目的基因的遗传转化：
1)以浙粳22粳稻种子的成熟胚或开花后12-15天的未成熟胚为外植体，诱导产生愈伤组织；
2)将根癌土壤杆菌EHA101/pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos培养在含卡那霉素Kan和壮观霉素Spe的液体培养基中激活至OD600值为0.4-0.8；将根癌土壤杆菌EHA105/pCambia 1300培养在含潮霉素Hpt和链霉素Strep的液体培养基中激活至OD600值为0.4-0.8；
3)将将根癌土壤杆菌EHA101/pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos菌液与根癌土壤杆菌EHA105/pCambia 1300菌液按体积4∶1比例混合，并浸染水稻愈伤组织1-5分钟；再将根癌土壤杆菌浸染过的愈伤组织移入含有Hpt的选择培养基中生长，获得抗Hpt的愈伤组织；
4)抗Hpt愈伤组织在分化培养基上培养成绿苗，最终获得含有Cry1A(b)基因和Hpt基因的共转化T0代转基因植株；
(4)T0代转基因植株Hpt和Cry1A(b)基因的分子鉴定和稻纵卷叶螟抗性鉴定：
1)Hpt和Cry1A(b)基因的分子鉴定：
取T0代转基因植株功能叶，提取总DNA；用引物HygF：5′-atcggcgagtacttctacacagcc-3′和HygR：5′-ctcgtgctttcagcttcgatgtag-3′扩增大小为881bp的Hpt基因内部DNA序列，以确认Hpt基因的存在；用引物CryF：5′-caccacagaacaacaatgtgccacc-3′和BtR：5′-ctgtctagagtactcagcctcgaaggtaa-3′扩增大小为604bp的Cry1A(b)基因内部DNA序列，以确认Cry1A(b)基因的存在；选择同时含有Hpt基因和Cry1A(b)基因的T0代转基因植株进行稻纵卷叶螟抗性鉴定；
2)稻纵卷叶螟抗性鉴定：
获得的同时含有Hpt基因和Cry1A(b)基因的T0代转基因植株不喷施任何对稻纵卷叶螟有杀伤力的农药，让稻纵卷叶螟自然发生；根据稻纵卷叶螟的为害程度，确定转基因植株对稻纵卷叶螟的抗性；
(5)收获Hpt和Cry1A(b)分子鉴定均为阳性，且对稻纵卷叶螟有极强抗性的T0代转基因植株的自交种子，产生T1代种子；同样，收取对稻纵卷叶螟有极强抗性的T1代转基因植株的自交种子，产生T2代种子；
(6)T2代转基因植株的稻纵卷叶螟抗性鉴定和Hpt、Cry1A(b)基因的分子鉴定：
1)稻纵卷叶螟抗性鉴定：
播种T2代种子产生的植株为T2代转基因植株，分株系种植；不喷施任何对稻纵卷叶螟有杀伤力的农药并保持稻苗嫩绿，任稻纵卷叶螟自然发生；从中选择出农艺性状稳定，并对稻纵卷叶螟表现极强抗性的株系进行分子鉴定；
2)Hpt抗性基因和Cry1A(b)抗虫目的基因的分子鉴定：
采用步骤(4)1)扩增与检测的同样方法，鉴定T2代转基因植株中的Hpt抗性基因和Cry1A(b)抗虫目的基因；从中选择没有Hpt抗性基因，但有Cry1A(b)抗虫目的基因，而且在田间对稻纵卷叶螟表现极强抗性的株系进行Southern杂交分子验证；
3)Cry1A(b)抗虫目的基因的Southern杂交：
用EcoRI和Hind III两种内切酶分别对上述入选株系进行Southern分子杂交验证，选择Cry1A(b)基因为单烤贝插入的株系；
4)Cry1A(b)抗虫目的基因的表达水平分析：
上述转基因株系进行RT-PCR表达检测，选择Cry1A(b)抗虫目的基因在转基因植株叶片中高表达，在水稻茎秆中中等表达，在水稻籽粒中微量表达，在水稻根中不表达的株系。

说明书应用转基因技术提高水稻植株对稻纵卷叶螟抗性的方法
技术领域
本发明涉及植物抗虫育种技术领域，尤其涉及应用生物转基因技术提高水稻植株对稻纵卷叶螟抗性的方法。
技术背景
水稻是我国最重要的粮食作物之一，每年的种植面积约占农作物种植面积的三分之一，稻谷产量占粮食总产量的40％左右，因此水稻的高产稳产对于保证粮食安全有着重要的意义。据全国农技中心统计，2007年稻纵卷叶螟来势猛、发生重，在我国长江流域、江淮、西南、华南等稻区大发生，发生程度为近10年最严重年份，对水稻生产构成严重威胁；另据农业部统计，2007年全国防治稻纵卷叶螟面积达5.8亿亩次，比2006年增加了1.5亿亩次。当前面临的问题主要有：(1)稻纵卷叶螟发生呈加重趋势：发生范围广、面积大，迁入早、峰次多，蛾量大、田间虫口密度高，且危害历期长，发生程度超过了大发生的2003年，田间自然为害卷叶率在50％左右，最高达90％，全国损失稻谷达85万吨；(2)农民难以掌握防治方法：由于稻纵卷叶螟防治适期为卵孵化至低龄幼虫阶段，稻农难以掌握田间调查和防治关键技术，往往错过最佳防治时期，影响了防治效果；(3)过分依赖化学农药，导致稻田生物多样性遭到严重破坏。
Cry1A(b)为克隆自苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)，属于革兰氏阳性孢子细菌并经过人工修饰而成的抗虫基因。苏云金杆菌在芽胞形成过程中，可产生伴孢晶体蛋白，具有高度特异杀虫活性，这种蛋白被称作δ-内毒素(ICP)。ICP通常以原毒素形式存在，当昆虫取食ICP后，原毒素在昆虫的消化道内被活化，转型为毒性多肽分子。活化的ICP与昆虫肠道上皮细胞上的特异性蛋白结合，全部或部分嵌合于细胞膜中，使细胞膜产生一些孔道，从而导致细胞由于渗透不平衡而破裂。伴随着上述过程，昆虫幼虫停止进食，最终死亡。
目前已有的研究主要是利用Ubiquitin等组成型启动子驱动的Cry1A(b)抗虫质粒载体导入水稻的转基因研究，并育成了对水稻螟虫具有较强抗性的“克螟稻”等第一代转基因水稻。经鉴定这种转基因水稻虽然对水稻螟虫有较强的抗性，但由Ubiquitin组成型启动子驱动的Cry1A(b)抗虫基因，在水稻植株的根、茎、叶、花粉和种子等植株的所有组织都有较强的表达。因而这种转基因水稻植株所产生的花粉会随桑叶对家蚕产生毒副作用；植株的根会对土壤微生物的生存环境产生一定的影响；生产的大米也能检测到Bt毒蛋白；同时，这类转基因植株在基因转化过程中所利用的Hpt等抗生素抗性基因很难在植株中分离，从而更增加了人们对转基因食品安全性的担忧，存在着一定的潜在风险。
1，5二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)存在于所有高等植物和自养细菌中，是所有光合生物进行光合碳同化的关键酶，也是光合植物叶片中含量最丰富的蛋白质，约占可溶性总蛋白的50％。利用它所编码的基因高效表达特性，来启动外源目的基因在转基因水稻绿色组织中的高效表达非常有效。Rubisco由大亚基rbcL和小亚基rbcS组成，前者由叶绿体基因组编码，而后者由核基因编码，Rubisco启动子已经被克隆(In-Cheol Jang，Won-Bin Choi，Kyung-Hee Lee，Sang Ik Song，Baek Hie Nahm，and Ju-Kon Kim.Plant Physiology，2002，129，1473-1481)，并根据其引导的gus报告基因在转基因水稻中的活性表明，gus基因在转基因水稻的叶片、叶鞘等组织的叶肉细胞内特异高效表达，而茎、根和种子等器官中不表达或者极弱表达，表现出明显的组织特异性。根据PLAC(http://www.dna.afrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)分析，Rubisco启动子在光诱导转录表达或与光合作用相关的转录表达中起着非常重要的作用，使Rubisco启动子调控的外源基因在植物绿色组织中能够特异高效表达。
为了对基因转化的细胞进行有效地选择，在进行基因转化时都要利用Hpt等选择标记基因和/或Gus等报告基因对转化细胞进行选择和鉴定，但在获得转基因植株后，这些标记基因和/或报告基因又成了多余。因此，在获得转基因植株后，如何将标记基因和/或报告基因与目的基因彻底分离，或者说将标记基因和/或报告基因在转基因植株中剔除是获得安全转基因植株所必须考虑的问题。为此，利用“共转化”转基因技术是一个很好的选择。“共转化”转基因技术，是指目的基因与标记基因和/或报告基因分别构建在二个不同的质粒载体中；在基因转化时，将含有目的基因的根癌土壤杆菌液与含有标记基因和/或报告基因的根癌土壤杆菌液按一定的比例混合，然后用这二种根癌土壤杆菌的混合菌液浸染水稻愈伤组织，选择标记或抗性愈伤，继而培养成绿苗。由于目的基因与标记基因和/或报告基因是分别构建在二个不同的质粒载体中，因而它们在整合到水稻染色体中时是二个独立事件，独立遗传。按孟德尔遗传分离规律，这种转基因植株通过自交，目的基因与标记基因和/或报告基因发生分离，可选择出只含有目的基因的转基因植株。
发明内容
本发明目的在于，针对近年来稻纵卷叶螟猖獗给水稻生产带来的巨大损失；和以往水稻抗虫转基因育种中所存在的，抗虫目的基因在转基因水稻植株的各部位均有表达及抗生素抗性基因很难在转基因水稻植株中分离的缺陷，提供一种应用生物转基因育种技术，以提高水稻植株尤其是其绿叶部分对外源抗虫目的基因高表达，而种子部分极弱表达、根部不表达，达到水稻植株高抗稻纵卷叶螟、降低转基因水稻风险的方法。
本发明目的通过以下技术方案来实现。
由根癌土壤杆菌(Agrobacyerium tumefaciens)EHA101与质粒pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos构建的菌种EHA101/pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos，已于2008年1月2日在北京市朝阳区大屯路，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏编号为CGMCC No.2319。
应用转基因技术提高水稻植株对稻纵卷叶螟抗性的方法，该方法按以下步骤进行：
(1)抗虫基因质粒载体pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos的构建：
1)用添加了SalI内切酶位点的引物BtF：5′-tgtgtcgacatggacaacaacccaaacat-3′和添加了XbaI内切酶位点的引物BtR：5′-ctgtctagagtactcagcctcgaaggtaa-3′，扩增p35S-Cry1A(b)-NosTer质粒载体中的Cry1A(b)基因序列，电泳后回收，连接到pCR4-TOPO克隆载体中，形成pTOPO-Cry1A(b)质粒载体；
2)用Sal I完全酶切、XbaI部分酶切上述pTOPO-Cry1A(b)质粒载体，电泳后回收大小为1.8kb的Cry1A(b)条带，连接到pRN72克隆载体中，形成pRN72-Cry1A(b)-Nos质粒载体；
3)用HindIII和EcoR I双酶切上述pRN72-Cry1A(b)-Nos质粒载体，电泳后回收大小为4.9kb的RbcS-Cry1A(b)-Nos条带，连接到pPZP201克隆载体中，形成pPZP201-RbcS(2.8kb)-Cry1A(b)-Nos质粒载体，其中的RbcS为Rubisco组织特异表达启动子，大小为2.8kb，Cry1A(b)大小为1.8kb，Nos大小为0.3kb；
4)用Hind III和Sal I双酶切质粒载体pSB11，电泳后回收大小为1.3kb的RubS条带；用Hind III和Sal I双酶切质粒pPZP201-RbcS(2.8kb)-Cry1A(b)-Nos，取分离了RbcS(2.8kb)片段后的载体部分与回收的大小为1.3kb的RubS连接，形成pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos质粒载体，其中的RubS也为Rubisco组织特异表达启动子，大小为1.3kb；
(2)根癌土壤杆菌EHA101/pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos和根癌土壤杆菌EHA105/pCambia 1300的建立：
1)根癌土壤杆菌EHA101/pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos的建立：将质粒载体pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos电转化到根癌土壤杆菌EHA101中，形成内含pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos质粒的根癌土壤杆菌EHA101/pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos；
2)根癌土壤杆菌EHA105/pCambia 1300的建立：将质粒pCambia 1300电转化到根癌土壤杆菌EHA105中，形成内含pCambia 1300质粒的根癌土壤杆菌EHA101/pCambia 1300；
(3)水稻愈伤组织Hpt抗性基因和Cry1A(b)抗虫目的基因的遗传转化：
1)以浙粳22粳稻种子的成熟胚或开花后12-15天的未成熟胚为外植体，诱导产生愈伤组织；
2)将根癌土壤杆菌EHA101/pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos培养在含卡那霉素Kan和壮观霉素Spe的液体培养基中激活至OD600值为0.4-0.8；将根癌土壤杆菌EHA105/pCambia 1300培养在含潮霉素Hpt和链霉素Strep的液体培养基中激活至OD600值为0.4-0.8；
3)将根癌土壤杆菌EHA101/pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos菌液与根癌土壤杆菌EHA105/pCambia 1300菌液按体积4∶1比例混合，并浸染水稻愈伤组织1-5分钟；再将根癌土壤杆菌浸染过的愈伤组织移入含有Hpt的选择培养基中生长，获得抗Hpt的愈伤组织；
4)抗Hpt愈伤组织在分化培养基上培养成绿苗，最终获得含有Cry1A(b)基因和Hpt基因的共转化T0代转基因植株；
(4)T0代转基因植株Hpt基因和Cry1A(b)基因的分子鉴定和稻纵卷叶螟抗性鉴定：
1)Hpt基因和Cry1A(b)基因的分子鉴定：
取T0代转基因植株功能叶，提取总DNA；用引物HygF：5′-atcggcgagtacttctacacagcc-3′和HygR：5′-ctcgtgctttcagcttcgatgtag-3′扩增大小为881bp的Hpt基因内部DNA序列，以确认Hpt基因的存在；用引物CryF：5′-caccacagaacaacaatgtgccacc-3′和BtR：5′-ctgtctagagtactcagcctcgaaggtaa-3′扩增大小为604bp的Cry1A(b)基因内部DNA序列，以确认Cry1A(b)基因的存在；选择同时含有Hpt基因和Cry1A(b)基因的T0代转基因植株进行稻纵卷叶螟抗性鉴定；
2)稻纵卷叶螟抗性鉴定：
获得同时含有Hpt基因和Cry1A(b)基因的T0代转基因植株，不喷施任何对稻纵卷叶螟有杀伤力的农药，让稻纵卷叶螟自然发生；根据稻纵卷叶螟的为害程度，确定转基因植株对稻纵卷叶螟的抗性；
(5)收获Hpt和Cry1A(b)分子鉴定均为阳性，且对稻纵卷叶螟有极强抗性的T0代转基因植株的自交种子，产生T1代种子；同样，收取对稻纵卷叶螟有极强抗性的T1代转基因植株的自交种子，产生T2代种子；
(6)T2代转基因植株的稻纵卷叶螟抗性鉴定和分子鉴定：
1)稻纵卷叶螟抗性鉴定：
播种T2代种子产生的植株为T2代转基因植株，分株系种植；通过步骤(5)二次自交加代，使Hpt抗性基因与Cry1A(b)抗虫目的基因分离；不喷施任何对稻纵卷叶螟有杀伤力的农药并保持稻苗嫩绿，任稻纵卷叶螟自然发生；根据转基因植株在大田的农艺性状表现和稻纵卷叶螟的为害情况，从中选择出农艺性状稳定，并对稻纵卷叶螟表现极强抗性的株系进行分子鉴定；
2)Hpt抗性基因和Cry1A(b)抗虫目的基因的分子鉴定：
采用步骤(4)1)扩增与检测的同样方法，鉴定T2代转基因植株中的Hpt抗性基因和Cry1A(b)抗虫目的基因；从中选择没有Hpt抗性基因，但有Cry1A(b)抗虫目的基因，而且在田间对稻纵卷叶螟表现极强抗性的株系进行Southern杂交分子验证；
3)Cry1A(b)抗虫目的基因的Southern杂交：
用EcoRI和Hind III两种内切酶分别对上述入选株系进行Southern分子杂交验证，选择Cry1A(b)基因为单烤贝插入的株系；
4)Cry1A(b)抗虫目的基因的表达水平分析：
上述转基因株系进行RT-PCR表达检测，选择Cry1A(b)抗虫目的基因在转基因植株叶片中高表达，在水稻茎秆中中等表达，在水稻籽粒中微量表达，在水稻根中不表达的株系。
本发明的有益效果：
一、以Rubisco引导的Cry1A(b)抗虫目的基因与以Ubiquitin组成型启动子引导的Cry1A(b)抗虫目的基因相比较，在转基因植株叶片中的表达量前者显著高于后者(表1)；在水稻茎秆中的表达量前者低于后者；在水稻种子中的表达量前者极弱表达显著低于后者；在水稻根系中前者不表达而后者仍有表达(图4)；转基因水稻植株的绿叶部位对外源Cry1A(b)抗虫目的基因高表达，达到水稻植株高抗稻纵卷叶螟的目的；转基因水稻植株的种子部分对外源Cry1A(b)抗虫目的基因极弱表达，增加了转基因大米的食用安全性；转基因水稻植株的根系部位对外源Cry1A(b)抗虫目的基因不表达，对土壤生态环境较好。因此，从分子水平提示Rubisco引导的Cry1A(b)抗虫目的基因显著提高了转基因水稻对稻纵卷叶螟的抗性，同时增加了转基因水稻的安全性。
二、经试验明确，以Rubisco引导的Cry1A(b)转基因水稻花粉对家蚕的饲养没有影响(表2)，从而增加了采用本发明方法育成的转基因水稻，在南方水稻与蚕桑混栽地区生产应用的可行性；
三、应用本发明方法在转基因水稻植株中，可成功删除用于筛选的抗生素抗性基因(图1)，进一步提高了转基因稻米食用的安全性；
四、应用本发明育成的抗虫转基因水稻，可不喷施农药达到有效防治稻纵卷叶螟发生的目的(表1)，降低了水稻种植成本，对确保水稻获得高产稳产起到了重要作用，生态、经济及社会效益明显。
附图说明
图1：转Cry1A(b)抗虫基因株系(31253，32080，31260，32090，31268，31250，31251，31254和32086)和阳性对照KMD(克螟稻)的PCR检测结果
图2：转Cry1A(b)抗虫基因株系(31250，31251，31253，31260，31268，32080，32086，32090和31254)和阳性对照KMD(克螟稻)的EcoRI内切酶的Southern杂交图谱
图3：转Cry1A(b)抗虫基因株系(31250，31251，31253，31260，31268，32080，32086和32090)和阳性对照KMD(克螟稻)的Hind III内切酶Southern杂交图谱
图4：转Cry1A(b)抗虫基因株系(31268，32090，31253，32080和31260)及对照KMD(克螟稻)叶片、茎秆、籽粒和根系的反转录RT-PCR检测结果
其中，图4又为说明书摘要附图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明并不受这些内容所限定。
对所涉材料的说明：
1.克隆载体pCR4-TOPO：生产和销售商为：Invitrogen Corporation 1600Faraday Ave.Carlsbad，CA 92008，USA
2.质粒载体35S-Cry1A(b)-NosTer(pAB-Nos)：Sardana R，Dukiandjiev S，GibandM，Cheng XY，Cowan K，Sauder C，Altosaar I.Plant Cell Reports 1996，15，677-681(2004年10月29日与加拿大渥太华大学University of Ottawa，Technology Transfer & Business Enterprise，800 King Edward Ave.，Rm.3042，Ottawa，Ontario KIN 6N5，Canada签订“生物材料转移与合作研究开发协议”)
3.质粒载体pRN72：Chengkun He博士(Ray Wu实验室)提供，Department ofMolecular Biology and Genetics，Cornell University，317 Biotech，BuildingIthaca，NY 14853，USA
4.质粒载体pSB11：In-Cheol Jang，Won-Bin Choi，Kyung-Hee Lee，Sang Ik Song，Baek Hie Nahm，and Ju-Kon Kim*.Plant Physiology，2002，129，1473-1481(2004年8月29日Ju-Kon Kim提供，Department of Biological Science，Myongji University，Yongin 449-728，Korea)
5.根癌土壤杆菌EHA101，根癌土壤杆菌EHA105，质粒载体pPZP201，质粒载体pCambia 1300：S.Muthukrishnan教授提供，University DistinguishedProfessor of Biochemistry，Biochemistry Department，Kansas State University.Manhattan，Kansas 66506-5501，239 USA
6.引物HygF、HygR、BtF、BtR和CryF：Integrated DNA Technologies，Inc公司合成；1710 Commericial Park，Coralville，IA52241-2760，USA
7.阳性对照KMD(克螟稻)：浙江大学舒庆尧教授提供。用内含Ubiquitin启动子引导的Cry1A(b)抗虫目的基因并连接了Hpt潮霉素抗性基因的质粒载体的根癌土壤杆菌EHA105，对浙江省推广品种秀水11进行遗传转化选育而成的转基因水稻。其中的Ubiquitin启动子为组成型启动子，Hpt潮霉素抗性基因与Cry1A(b)抗虫目的基因构建在同一质粒载体中，紧密连锁。
实施例：
应用转基因技术提高水稻植株对稻纵卷叶螟抗性的方法，按以下步骤进行：
(1)抗虫基因质粒载体pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos的构建：
1)用添加了SalI内切酶位点的引物BtF：5′-tgtgtcgacatggacaacaacccaaacat-3′作为正向引物，添加了XbaI内切酶位点的引物BtR：5′-ctgtctagagtactcagcctcgaaggtaa-3′作为反向引物，扩增p35S-Cry1A(b)-NosTer质粒载体中大小为1.8kb的Cry1A(b)基因序列，电泳后从凝胶上切下大小约为1.8kb的条带并回收，连接到pCR4-TOPO克隆载体中，形成pTOPO-Cry1A(b)质粒载体；
2)用Sal I内切酶完全酶切、XbaI内切酶部分酶切(因Cry1A(b)序列中也有一个XbaI内切酶位点)pTOPO-Cry1A(b)质粒载体，电泳后从凝胶上切下大小约为1.8kb的Cry1A(b)条带并回收，连接到pRN72克隆载体中，形成pRN72-Cry1A(b)-Nos质粒载体；
3)用HindIII内切酶和EcoR I内切酶双酶切pRN72-Cry1A(b)-Nos质粒载体，电泳后从凝胶上切下大小约4.9kb的RbcS-Cry1A(b)-Nos条带(2.8kb的RbcS+1.8kb的Cry1A(b)+0.3kb的Nos)并回收，连接到pPZP201克降载体中，形成pPZP201-RbcS(2.8kb)-Cry1A(b)-Nos质粒载体，其中的RbcS为Rubisco组织特异表达启动子，大小为2.8kb；
4)用HindIII内切酶和SalI内切酶双酶切质粒载体pSB11，电泳后从凝胶上切下大小为1.3kb的RubS条带并回收。用HindIII内切酶和SalI内切酶双酶切质粒pPZP201-RbcS(2.8kb)-Cry1A(b)-Nos，取分离了RbcS(2.8kb)片段后的载体部分与回收的大小为1.3kb的RubS条带连接，形成pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos质粒载体，其中的RubS也是Rubisco组织特异表达启动子，但大小仅为1.3kb。
(2)根癌土壤杆菌EHA101/pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos和根癌土壤杆菌EHA105/pCambia 1300的建立：
1)根癌土壤杆菌EHA101/pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos的建立：将质粒载体pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos瞬间高压(2330伏，2.6秒)电转化到根癌土壤杆菌EHA101中，形成内含pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos质粒的根癌土壤杆菌EHA101/pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos；
2)根癌土壤杆菌EHA105/pCambia 1300的建立：将质粒载体pCambia 1300瞬间高压(2380伏，2.3秒)电转化到根癌土壤杆菌EHA105中，形成内含pCambia1300质粒的根癌土壤杆菌EHA101/pCambia 1300；
(3)水稻愈伤组织Hpt抗性基因和Cry1A(b)抗虫目的基因的遗传转化：
1)以浙粳22(农业部植物新品种保护申请号20070398.6)粳稻(Oryza Sativa.Ljaponica ssp)种子的成熟胚或开花后12-15天的未成熟胚为外植体，诱导产生愈伤组织；
2)将根癌土壤杆菌EHA101/pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos培养在含有100mg/L卡那霉素Kan和100mg/L壮观霉素Spe的LB液体培养基(注1)中激活并培养至OD600值为0.4-0.8的对数生长期，另一根癌土壤杆菌菌株EHA105/pCambia 1300培养在含有100mg/L潮霉素Hpt和50mg/L链霉素Strep的LB液体培养基中激活并培养至OD600值为0.4-0.8的对数生长期；
注1：10g/L蛋白胨+5g/L氯化钠，pH＝7.2
3)将根癌土壤杆菌EHA101/pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos菌液与根癌土壤杆菌EHA105/pCambia 1300菌液按体积4∶1的比例混合配制成混合菌液，将水稻愈伤组织在混合菌液中浸染1-5分钟，再将这种根癌土壤杆菌浸染过的愈伤组织移入含有100mg/L的Hpt选择培养基(注2)中生长，选择培养获得抗Hpt的愈伤组织；
注2：N6培养基+2.5mg/L 2，4-D+0.3g/L水解酪蛋白+50mg/L潮霉素+500mg/L头孢霉素，pH＝5.9
4)抗Hpt愈伤组织在分化培养基(注3)上培养成绿苗，最终获得含有Cry1A(b)抗虫目的基因和Hpt抗性基因共转化的T0代转基因植株；
注3：MS培养基+2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+1g/L水解酪蛋白，pH＝5.9
(4)T0代转基因植株Hpt和Cry1A(b)基因的分子鉴定和稻纵卷叶螟抗性鉴定：
1)T0代转基因植株Hpt和Cry1A(b)基因的分子鉴定：
取T0代转基因植株功能叶，提取总DNA；用引物HygF：5′-atcggcgagtacttctacacagcc-3′和HygR：5′-ctcgtgctttcagcttcgatgtag-3′扩增DNA提取液中大小为881bp的Hpt基因内部DNA序列，以确认Hpt抗性基因的存在；用引物CryF：5′-caccacagaacaacaatgtgccacc-3′和BtR：5′-ctgtctagagtactcagcctcgaaggtaa-3′扩增DNA提取液中大小为604bp的Cry1A(b)基因内部DNA序列，以确认Cry1A(b)抗虫目的基因的存在；选择同时含有Hpt基因和Cry1A(b)基因的阳性T0代转基因植株进行稻纵卷叶螟抗性鉴定；
2)T0代转基因植株的稻纵卷叶螟抗性鉴定：
获得的同时含有Hpt抗性基因和Cry1A(b)抗虫目的基因的阳性T0代转基因植株种植在水漕内，保持嫩绿，并且不喷施任何对稻纵卷叶螟有杀伤力的农药，让稻纵卷叶螟自然发生；根据稻纵卷叶螟的为害程度，确定转基因植株对稻纵卷叶螟的抗性；
(5)收取Hpt和Cry1A(b)分子鉴定均为阳性，而且对稻纵卷叶螟有极强抗性的T0代转基因植株上的自交种子，产生T1代种子；同样，收取对稻纵卷叶螟有极强抗性的T1代转基因植株上的自交种子，产生T2代种子。通过二次自交，使得Hpt抗性基因与Cry1A(b)抗虫目的基因分离；
(6)T2代转基因植株的稻纵卷叶螟抗性鉴定和分子鉴定：
1)稻纵卷叶螟抗性鉴定：
        表1：转基因水稻植株对稻纵卷叶螟的抗性
  供试材料  供试植株数  卷叶苞率％  RubS引导的转基因水稻  36  0  KMD(抗虫对照)  36  5.2
  浙粳22(感虫对照)  36  100
T2代转基因植株已通过步骤(5)二次自交加代，Hpt抗性基因与Cry1A(b)抗虫目的基因充分分离；T2代转基因植株分株系种植于大田，每株系种植6行、每行6株，水稻生长前期管理同一般大田，进入分蘖期后不喷施任何对稻纵卷叶螟有杀伤力的农药并保持稻苗嫩绿，使稻纵卷叶螟暴发(表1)；根据转基因植株在大田的农艺性状表现和稻纵卷叶螟的为害情况，从中选择出农艺性状稳定，并对稻纵卷叶螟表现出极强抗性的株系进行分子鉴定；
2)花粉对家蚕饲养的毒性鉴定：
取上述转基因植株及阳性对照KMD和阴性对照浙粳22的花粉，均匀地抖在大小和叶位相同的新鲜桑叶上饲养2龄家蚕，3天后统计家蚕的死亡数，结果表2所示。说明用RubS特异表达启动子引导的Cry1A(b)抗虫转基因植株产生的花粉与阴性对照浙粳22产生的花粉一样，对家蚕的生长没有明显的毒副作用；而由Ubiquitin组成型启动子引导的Cry1A(b)抗虫转基因植株KMD产生的花粉，对家蚕有明显的毒副作用；
        表2：转基因水稻植株产生的花粉对二龄家蚕饲养的毒性
  供试材料  饲养家蚕数  死亡率％  Ubiquitin引导的转基因水稻(KMD，抗虫对照)  100  100  RubS引导的转基因水稻  100  4.5  非转基因水稻(浙粳22，感虫对照)  100  4.2
3)Hpt抗性基因和Cry1A(b)抗虫目的基因的分子鉴定：
采用步骤(4)1)扩增与检测的同样方法，鉴定T2代转基因植株中的Hpt抗性基因和Cry1A(b)抗虫目的基因；从中选择没有Hpt抗性基因，但是有Cry1A(b)抗虫目的基因(图1)，而且在田间对稻纵卷叶螟表现极强抗性的株系进行Southern杂交分子验证；
4)Cry1A(b)抗虫目的基因的Southern杂交：
利用SDS法提取上述没有Hpt抗性基因，但有Cry1A(b)抗虫目的基因而且在田间表现出对稻纵卷叶螟有极强抗性的株系以及阳性对照KMD和阴性对照浙粳22的总DNA，每份样品的DNA量为20ug左右；选用EcoRI和Hind III两种DNA内切酶分别进行水稻总DNA(每个样品取10ug DNA)酶切，在1％琼脂糖凝胶上电泳(电压为40V，电泳7小时)，电泳结束后切除凝胶上多余的部分，并放于凝胶变性液进行DNA变性，两次变性后的凝胶再放入中和液进行中和，最后将凝胶放于盐桥上，同时将切割好的尼龙膜放于凝胶上方，尼龙膜上面依次放吸水纸和重物，进行DNA转膜过夜；转膜完成后将尼龙膜放在紫外灯下交联1分钟，并在烘箱中烘干尼龙膜以备用；
探针制备：根据Cry1A(b)基因内部DNA的序列设计引物CryF(5′-caccacagaacaacaatgtgccacc-3′)和BtR(5′-ctgtctagagtactcagcctcgaaggtaa-3′)，PCR扩增转化质粒pPZP201-RubS-Cry1A(b)-Nos，获得长度为604bp的一段序列，利用凝胶回收试剂盒纯化回收DNA；回收后的DNA经过随机引物扩增，并用α-32P-dCTP同位素标记合成具有同位素标记的DNA片段；
杂交：将尼龙膜放于杂交管并加入预杂交液封闭尼龙膜上未杂交的部分，预杂交结束后将制备好的探针移入杂交管，进行杂交过夜；
洗膜和显影：用2×SSC和0.1％SDS洗膜两次将尼龙膜上没有杂交的探针从膜上洗下来，再用1×SSC和0.1％SDS洗膜两次，将膜上非特异性杂交的探针洗下来，保证杂交的准确性，将洗好的尼龙膜用保鲜膜包起来，并放入压片盒，在暗室中放入X光片，并在-70℃条件下压片4天；压片后将X光片在暗室中取出，并放于显影液中显影，大约5分钟后在X光片出现杂交条带，此时将X光片放入定影液定影。用EcoR I和Hind III两种DNA内切酶获得的Southern结果，选择Cry1A(b)基因为单烤贝插入的株系(图2和图3)，这些株系进一步做RT-PCR表达检测，以明确插入的Cry1A(b)抗虫目的基因在植株各个不同组织的表达水平；
5)Cry1A(b)抗虫目的基因的表达水平分析：
上述转基因株系进行Cry1A(b)基因的RT-PCR表达检测，其方法主要是：
RNA抽提：利用植物RNA专用提取试剂盒RNARose Reagent提取转基因材料及相应对照品种叶片、茎、籽粒和根系的总RNA；经非变性胶电泳检测和OD260值测定转基因株系RNA，并用逆转录酶扩增并获得cDNA；
cDNA调整：利用UBI作为调整cDNA的内标，经PCR反应凝胶电泳，根据不同材料的条带亮度，调节各材料cDNA的量使其达到一致；
RT-PCR：经过内标调整的cDNA，用检测Cry1A(b)基因的引物进行RT-PCR扩增；比较转基因材料和对照品种(以Ubiquitin组成型启动子引导的抗虫转基因水稻“克螟稻”)之间的条带亮度，最终获得Rubisco启动子驱动的Cry1A(b)基因在水稻叶片、茎、籽粒和根系中的表达情况，条带亮度高的为表达量较高，条带亮度暗的为表达量较低；
选择RubS引导的Cry1A(b)抗虫目的基因在转基因植株叶片中的表达量显著高于Ubiquitin组成型启动子引导的Cry1A(b)抗虫目的基因在水稻叶片中的表达量，在水稻茎秆中的表达量低于Ubiquitin组成型启动子引导的Cry1A(b)抗虫目的基因在水稻茎秆中的表达量，在水稻籽粒中的表达量显著低于Ubiquitin组成型启动子引导的Cry1A(b)抗虫目的基因在水稻籽粒中的表达量，在根中RubS引导的Cry1A(b)抗虫目的基因在转基因植株中不表达的株系(图4)；
因此，从分子水平选择Rubisco引导的Cry1A(b)基因对稻纵卷叶螟的抗性得到显著提高，同时结合应用“共转化”转基因技术分离了Hpt抗性基因的转基因水稻株系，以增加转基因水稻的安全性。