利用基因置换技术改造力达霉素产生菌的方法.pdf

本发明涉及利用基因置换技术改造抗生素产生菌染色体以构建新型抗生素产生菌的方法，具体而言，是用力达霉素辅基蛋白基因与具有肿瘤靶向性多肽的融合基因，取代力达霉素生物合成基因簇中的辅基蛋白基因(cagA)，以获得能产生既具靶向性、又有抗肿瘤活性的力达霉素重组菌株，利用重组菌株，可以直接发酵产生含有所述融合蛋白的力达霉素，无需使用常规大肠杆菌表达融合蛋白和LDM体外拆分组装的制备方法，既可大大简化操作步骤，又可方便地用于制备具有不同肿瘤靶向性多肽的抗肿瘤导向药物。

权利要求书
1、  一种利用基因置换技术改造力达霉素产生菌的方法，其特征在于所述方法是将靶向性多肽与力达霉素辅基蛋白的融合基因取代力达霉素产生菌的辅基蛋白基因(cagA)，构建产生既具靶向性又有抗肿瘤活性的力达霉素重组菌株。

2、  权利要求1所述靶向性多肽是指可特异性地与肿瘤组织相结合的分子，其选自单链抗体scFv、单域抗体VH、短肽RGD或其它具有靶向性的配体。

3、  权利要求1所述力达霉素重组菌株，是指S.globisporusC-1027-scFv，其于2007年9月25日送交北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，编号为CGMCC No.2187。

4、  权利要求1所述的方法，其具体步骤是：
1)PCR扩增或合成靶向性多肽基因；
2)PCR扩增所置换基因两臂用于同源双交换的基因片段；
3)将1)、2)所述基因和选择性标记基因片段与载体连接，构建基因置换载体；
4)将基因置换载体导入力达霉素产生菌；
5)用选择性标记，以PCR、Southern blot和SDS-PAGE进行重组菌株的筛选和鉴定；
6)基因置换重组菌株产生力达霉素的检测。

5、  权利要求1所述方法构建重组菌株所产力达霉素在制备抗肿瘤药物中的应用。

说明书利用基因置换技术改造力达霉素产生菌的方法
技术领域：
本发明涉及利用基因置换技术改造抗生素产生菌染色体以构建新型抗生素产生菌的方法，具体而言，是用力达霉素辅基蛋白基因与具有肿瘤靶向性多肽的融合基因，取代力达霉素生物合成基因簇中的辅基蛋白基因(cagA)，以获得能产生既具靶向性、又有抗肿瘤活性的力达霉素重组菌株。
背景技术：
一般抗癌药物的毒性很大，采用单抗偶联靶向给药可以减少毒副作用。单抗偶联物虽然具有体内分布特异性，在肿瘤靶部位的浓度较高，但偶联物实际到达肿瘤细胞尤其是实体瘤深部细胞的数量有限。这与肿瘤组织的特异性和偶联物分子的大小等因素有关。烯二炔类抗肿瘤抗生素由于其很强的抗癌活性，更适于制备成为单抗导向药物。
力达霉素是由球孢链霉菌(Streptomyces globisporus C-1027)产生的一种具有极强抗肿瘤活性的新型烯二炔抗生素，由脂溶性发色团和辅基蛋白非共价键结合组成。烯二炔结构的发色团具有极强的细胞毒作用，辅基蛋白对发色团的稳定起保护作用。IV型胶原酶能够破坏基质的平衡，在多种人类肿瘤细胞以及肿瘤新生血管内皮细胞中均呈高表达。抑制IV型胶原酶的活性，即可抑制肿瘤细胞的侵袭转移和肿瘤血管的生成。研究表明，以源于抗IV型胶原酶单克隆抗体3G11单链抗体scFv或可分泌单域抗体VH等作为导向药物的载体，不仅可以提供肿瘤靶向性，而且其自身就具有抑制肿瘤的效果。此外，含RGD(即Arg-Gly-Asp)的小肽能够特异性地与αvβ3整合素结合，而αvβ3整合素在很多肿瘤组织中呈高表达，与肿瘤的侵袭转移密切相关。所以，RGD等小肽亦可形成导向药物的载体。
本研究所已将辅基蛋白与抗IV型胶原酶单链抗体融合蛋白(scFv-LDP)在E.coli中成功表达，表达出来的蛋白可以装配力达霉素的发色团，并在体外和动物体内试验中均获得很好的效果。然而不足之处是，大肠杆菌所表达的融合蛋白集中在包涵体内，包涵体所含外源蛋白未经正确折叠，也未形成正确折叠的二硫键，一般不具有天然构象，也不具有生物活性，所以必须在体外变性、复性以恢复其生物学活性。目前已经发展了上百种复性方法，但是没有一种方法适用于所有外源蛋白的表达。大肠杆菌表达出来的Fv-LDP融合蛋白在应用之前，需经过人工变性复性，以及发色团的体外装配等，工艺十分复杂。
本发明的目的之一是，将力达霉素的辅基蛋白与具有肿瘤靶向性多肽如抗IV型胶原酶单链抗体scFv，或可分泌单域抗体VH进行偶联，形成融合蛋白。
本发明的目的之二是，为使融合蛋白进一步小型化，构建了力达霉素辅基蛋白与肿瘤靶向肽RGD的融合蛋白。
通过同源重组构建重组菌株，再经发酵获得既具单抗靶向性，又有高效抗肿瘤活性的seFv-LDM、VH-LDM、RGD-LDM等，进而可为临床提供一种新的单抗靶向抗肿瘤药物。
本发明所述利用基因置换技术改造抗生素-力达霉素产生菌染色体以构建新型抗生素产生菌的方法，迄今为止，尚未见有国内外的相关报道。
力达霉素的生物合成基因簇已被克隆(GenBank登录号AY048670)。力达霉素辅基蛋白基因位于结构基因A1和A4之间，这为构建力达霉素的辅基蛋白与具有肿瘤靶向性多肽融合蛋白的基因操作提供了有利条件。
发明内容：
本发明提供了利用基因置换技术改造力达霉素产生菌的方法，即利用基因置换技术在力达霉素产生菌Streptomyces globisporus C-1027中，用力达霉素(lidamycin，LDM)辅基蛋白基因与具有肿瘤靶向性多肽的融合基因，取代力达霉素生物合成基因簇中的辅基蛋白基因(cagA)，获得能够产生既具靶向性、又有抗肿瘤活性融合蛋白的力达霉素重组菌株。
本发明所述改造抗生素产生菌的方法，其总体步骤是：
1、确定编码靶向肽的核酸序列
本发明所涉及的靶向肽选自多种来源，包括但不限于肿瘤特异性抗原的单链抗体、单域抗体、具有肿瘤特异性结合活性的小肽等。本发明的一个优选实施方案中，所述靶向肽为抗IV型胶原酶单链抗体序列；另一个优选实施方案中，所述靶向肽为抗IV型胶原酶单域抗体序列；再一个优选实施方案中，所述靶向肽为环RGD十肽序列；
2.设计相应引物，PCR方法扩增，获得编码靶向肽的基因片段；
3.基因置换载体的构建
包括，用于同源双交换被置换基因两臂的PCR扩增、选择性标记基因片段的插入及与载体的连接；
4.将基因置换载体导入C-1027产生菌；
5.重组菌株的筛选和鉴定
用选择性标记进行筛选，以PCR、Southern blot进行染色体基因置换的鉴定，SDS-PAGE进行融合蛋白表达的检测；
6.基因置换重组菌株产生力达霉素的检测
根据力达霉素抗微生物抑菌活性与抗肿瘤活性具平行性的特点(赵春燕等，中国抗生素杂志，2005，(30)：9)，将本发明所获含融合蛋白重组菌株，用本领域公知的方法，在适于力达霉素产生的营养培养基和需氧培养条件下培养。例如，可在实验室或工业发酵罐中通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)培养。在所述条件下，发酵进行大约30-200小时后，优选进行80-140小时后结束发酵。在发酵终点，通过监测发酵培养液的抑菌活性，监测重组菌株的生长状况。
本发明按照上述步骤，首先分别设计引物，以S.globisporus C-1027的总DNA为模板进行PCR反应，在力达霉素辅基蛋白基因(cagA)终止密码子TGA两侧，扩增出用于双交换两臂的同源片段，以含有抗IV型胶原酶单链抗体质粒为模板，根据已知序列，PCR扩增抗IV型胶原酶单链抗体scFv；根据链霉菌偏好密码子合成单域抗体VH；合成RGb十肽基因。将上述靶向多肽片段，分别与选择性抗性标记-阿普霉素抗性基因片段连入质粒载体，最终得到可以用于同源双交换的含靶向多肽-辅基蛋白基因(cagA)的融合蛋白基因重组质粒。经验证无误后，转化E.coli，通过接合转移，转入S.globisporus C-1027中，对于抗性筛选正确的转化子，经多次传代培养进行确认，最终获得重组菌株，其中的S.globisporusC-1027-scFv，已于2007年9月25日送交北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，编号为CGMCC No.2187。本发明对重组菌株进行了PCR、测序和Southern验证，结果确认构建正确。利用特定的培养基进行发酵，对发酵液进行SDS-PAGE分析表明，原辅基蛋白条带消失，融合蛋白呈现表达，抗菌活性检测也呈阳性。初步检测表明，重组菌株可以产生有活性的力达霉素。
发明效果：
本发明在力达霉素产生菌Streptomyces globisporus C-1027中，用力达霉素辅基蛋白基因与具有肿瘤靶向性多肽的融合基因，取代力达霉素生物合成基因簇中的辅基蛋白基因(cagA)，获得能够产生既具靶向性、又有抗肿瘤活性融合蛋白的力达霉素重组菌株。利用重组菌株，可以直接发酵产生含有所述融合蛋白的力达霉素，无需使用常规大肠杆菌表达融合蛋白和LDM体外拆分组装的制备方法，既可大大简化操作步骤，又可方便地用于制备具有不同肿瘤靶向性多肽的抗肿瘤导向药物。
附图说明：
图1.重组菌株S.globisporus C-1027-scFv构建示意图
其中：
E-同源重组左臂片段；
G-同源重组右臂片段；
cagA-力达霉素辅基蛋白基因；
P1，P2-PCR验证P片段引物位置；
Q1，Q2-PCR验证Q片段引物位置；
A1-辅基蛋白左侧基因片段；
A4-辅基蛋白右侧基因片段；
Amr-阿普霉素抗性基因；
cagA-scFv-单链抗体-辅基蛋白融合基因；
图2.S.globisporus C-1027和S.globisporus C-1027-scFv的PCR验证其中：
1-经HindIII单酶切的λDNA对照；
2-原始菌株S.globisporus C-1027的P片段PCR验证结果；
3-原始菌株S.globisporus C-1027的Q片段PCR验证结果；
4-重组菌株S.globisporus C-1027-scFv的P片段PCR验证结果；
5-重组菌株S.globisporus C-1027-scFv的Q片段PCR验证结果；
6-经EcoRI和HindIII双酶切的λDNA对照；
图3.原始菌株S.globisporus C-1027和重组菌株S.globisporus C-1027-scFv的southernBlot分析
其中：
1-λDNA经EcoRI和HindIII双酶切后琼脂糖凝胶电泳结果；
2-原始菌株总DNA经BamHI酶切琼脂糖凝胶电泳结果；
3-重组菌株总DNA经BamHI酶切琼脂糖凝胶电泳结果；
4-E片段作探针，λDNA经EcoRI和HindIII双酶切后放射自显影结果；
5-E片段作探针，原始菌株总DNA经BamHI酶切后放射自显影结果；
6-E片段作探针，重组菌株总DNA经BamHI酶切后放射自显影结果；
图4.原始菌株S.globisporus C-1027和重组菌株S.globisporus C-1027-scFv的发酵产物SDS-PAGE分析
其中：
1-力达霉素辅基蛋白LDP；
2-原始菌株发酵液；
3-重组菌株发酵液；
4-低分子量标准蛋白Marker；
图5.重组菌株S.globisporus C-1027-FvH的PCR验证结果
其中：
1，4-Marker III(4,500bp；3,000bp；2,000bp；1,200bp；800bp；500bp；200bp)；
2-重组菌株S.globisporus C-1027-FvH的左臂片段PCR验证结果，长度3,000bp；
3-重组菌株S.globisporus C-1027-FvH的右臂片段PCR验证结果，长度2,000bp；
图6.重组菌株S.globisporus C-1027-RGD十肽基因的PCR验证结果
其中：
1，4-经EcoRI和HindIII双酶切的λDNA对照；
2-重组菌株S.globisporus C-1027-RGD十肽基因左臂PCR结果，长度为2143bp；
3-重组菌株S.globisporus C-1027-RGD十肽基因右臂PCR结果，长度为1562bp；
具体实施方案：
以下所列实施例仅为便于本领域技术人员人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
<实施例1>质粒pBS-scFv的构建及转化子筛选
基础质粒pBS03的构建：以质粒pBluescript II KS+(Keiser等，Practical StreptomycesGenetics.Norwich：The John Innes Foundation，2000.)为出发质粒，用PstI酶切质粒pOJ446(来源同质粒pBluescript II KS+)得到链霉菌复制基因(oriT)，再用BclI酶切质粒pIJ680(来源同质粒pBluescript II KS+)得到硫链丝菌素抗性基因(tsr)，将上述两个基因片段依次连接进入质粒pBluescript II KS+，得到基础质粒pBS03。
分别设计引物，使用Pfu DNA聚合酶，以S.globisporus C-1027的总DNA为模板进行PCR反应，在辅基蛋白基因(cagA)终止密码子TGA两侧E和G扩增出用于双交换的两臂A1和A4，长度分别为1320bp和1000bp；以含有抗IV型胶原酶单链抗体基因的pKFv1027质粒(ZL专利号：01131299.8)为模板，扩增抗IV型胶原酶单链抗体基因scFv，长度为750bp；质粒pKC1138(来源同质粒pBluescript II KS+)经Bam HI和BglII酶切，得到阿普霉素抗性基因片段，长度1500bp。将上述四个片段连入质粒载体pBS03，最终得到可以用于同源双交换的含cagA-scFv融合蛋白基因的重组质粒pBS-scFv。将构建好的重组质粒pBS-scFv转化大肠杆菌E.coli ET12567(ATCC：BAA-525)，通过接合转移转入S.globisporus C-1027中，挑取接合转移后发生双交换的菌落，经抗性筛选，得到对阿普霉素有抗性而对硫链丝菌素敏感的转化子(AmrThios)S.globisporus C-1027-scFv(图1)，转化子可以在含阿普霉素的S5(KNO30.1％，NaCl 0.05％，K2HPO4 0.05％，FeSO4 0.001％，MgSO4 0.05％，Starch 2％，Agar1.5％，pH 7.5)平板上生长，而不能在含硫链丝菌素的S5平板上生长。
<实施例2>PCR验证重组菌株
通过PCR方法，对所得到的转化子(AmrThios)进行基因置换的验证，其具体步骤是，针对双交换两臂外侧的序列和单链抗体基因序列，分别设计引物，以转化子S.globisporusC-1027-scFv和原始菌株S.globisporusC-1027总DNA为模板进行扩增。实验设计的引物为：
P片段扩增Am抗性基因和scFv基因片段：
P1：5’-CTCCTTCTCGCACATCGG-3’，P2：3’-CTACTCCTCAAACCCACCG-5’；
Q片段扩增scFv基因片段、辅基蛋白基因cagA、和A4基因片段：
Q1：5’-GGGTGGCTGTCCTGGTTTC-3’，Q2：3’CTTCCTCCCGTGCTAGTGG-5’。
PCR扩增结果表明，P片段长度为2000bp左右，Q片段长度为1800bp。转化子得到了与预期一致的扩增产物(图2)，由于引物Q1和P2位于scFv上，因而对照菌株没有扩增产物。对PCR产物进行测序，结果表明，与力达霉素辅基蛋白基因融合所得转化子中含有抗IV型胶原酶单链抗体与力达霉素辅基蛋白基因融合的力达霉素基因重组菌株S.globisporusC-1027-scFv。
<实施例3>Southern Blot验证重组菌株
分别接种重组菌株和对照菌株于YEME培养基(酵母浸膏0.3％，蛋白胨0.5％，麦芽浸膏0.3％，葡萄糖1.0％，蔗糖34.0％，MgCl2.6H2O 0.1％；pH 7.0)中，避光，28℃培养48h，转速250rpm，提取总DNA，用BamH I酶切过夜，经1％琼脂糖凝胶电泳后，转膜，用A1基因片段作探针，按Gene Images CDP-Star Detection Kit说明书(美国Amersham Biosciences公司)进行Southern杂交分析。以A1基因片段作探针，BamHI酶切总DNA，重组菌株应得到4728bp、原始菌株应得到4041bp杂交片段，实验结果表明，构建的重组菌株S.globisporusC-1027-scFv正确，重组菌株中的融合蛋白基因已经成功取代cagA基因(图3)。
<实施例4>重组菌株SDS-PAGE分析
对重组菌株S.globisporus C-1027-scFv进行发酵，发酵条件参照[赵春燕等，中国抗生素杂志，2005，(30)：9]，避光，28℃，转速250rpm，旋转摇床振荡培养48小时，以原始菌株S.globisporus C-1027为阳性对照，于第五天分别取100ml重组菌株和对照菌株发酵液进行离心，离心后的上清，用饱和硫酸铵沉淀LDM-scFv融合蛋白，用少量的水溶解沉淀并透析，对透析液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，15％，120V)分析。结果显示，S.globisporusC-1027原始菌株发酵产物中明显能够分辨出辅基蛋白条带(10.5KDa)，而在重组菌株S.globisporus C-1027-scFv发酵产物中，则不能检测到该辅基蛋白条带。重组菌株中，在预期的LDP-scFv蛋白大小的位置，可检测到一条微弱条带，分子量约38kD左右，而原始对照菌株中没有该条带，证明该条带为表达的融合蛋白条带(图4)。
<实施例5>重组菌株抗菌活性检测
对已经构建好的重组菌株S.globisporus C-1027-scFv和原始菌株S.globisporusC-1027进行发酵，以藤黄八叠球菌(Micrococcus luteus CMCC：<B>28001)为鉴定菌，以原始菌株为阳性对照，用抑菌圈试验来检测重组菌株S.globisporus C-1027-scFv发酵液的抗菌活性。由于力达霉素同时具有强烈的抗肿瘤作用和抗革兰氏阳性菌的作用，并且二者之间具有平行性(赵春燕等，微生物法测定力达霉素的效价，中国抗生素杂志，2005)，因此，本发明采用更易操作的抑菌圈试验来检测重组菌株的分泌活性。结果表明，重组菌株S.globisporus C-1027-scFv发酵液在第五天能够检测到抑菌活性(表1)，表明所构建的重组菌株能够产生力达霉素。
表1重组菌株发酵液抑菌活性检测结果
  菌株  抑菌圈直径(mm)  阳性对照(原始菌株S.globisporus C-1027)  21  重组菌株(S.globisporus C-1027-scFv)  12  试验菌株S.globisporus C-1027-FvH  13  试验菌株S.globisporus C-1027-tenP  10  阴性对照(培养基上清)  0
注：S.globisporus C-1027-tenP即S.globisporus C-1027-RGD十肽基因
<实施例6>可分泌单域抗体VH与力达霉素融合蛋白重组菌株的构建
按照实施例1～5相似的方法，本发明采用抗IV型胶原酶单域抗体VH(ZL专利号：01131299.8)，根据链霉素偏好密码子重新设计合成与力达霉素辅基蛋白偶联的策略，既可缩短外源基因的长度，减少融合表达时的不利影响，又可利用VH具有类似scFv的抗体结合活性以及分子较小更易渗透到肿瘤组织内部的特点，同时使用链霉菌偏爱的密码子和增加DNA序列中的GC含量来设计VH基因序列。借助DNAworks 2.0软件，设计合成了12条寡核苷酸片段，利用重叠PCR的方法，将这12个寡核苷酸片段拼接成完整的单域抗体VH基因(序列见SEQ ID NO.1)。将重组质粒pBS-sdFvH转化入大肠杆菌ET12567，再通过接合转移转入力达霉素原产生菌株S.globisporus C-1027中，利用抗性差异，筛选得到重组菌株S.globisporus C-1027-FvH，并对重组菌株进行了PCR验证及发酵液SDS-PAGE检测。PCR验证(图5)结果，左臂片段长度3000bp，右臂片段长度2000bp。初步判定，重组菌株构建成功。对重组菌株S.globisporus C-1027-FvH发酵液活性初步测活结果见表1。
<实施例7>可分泌环RGD十肽与力达霉素融合蛋白重组菌株的构建
按照实施例1～5相似的方法，本发明参照文献设计合成了含RGD的环状十肽序列、RGD三肽和RGDSP五肽，并按同样的重组菌株构建策略，将其分别融合在LDP的C末端构建质粒。其中，含RGD的环状十肽序列见序列2(SEQ ID No.2)，将重组质粒接合转移进原始菌株S.globisporus C-1027，挑取重组子，进行了PCR验证。左臂PCR引物分别为：
Lt1：5’CACGGACTACTGGAAGGACACC3’；
Lt2：5’GCGACATGTTCGGCTGC 3。
右臂引物分别为：
Rten1：5’ATCTTCAGGCGCAGCCGAACATGTC3’；
Rten2：3’CAAGCGTCTTCTGTCCGTGGC5’。
试验结果(图6)表明，左臂PCR产物长度为2143bp，右臂PCR产物长度为1562bp，与预期的长度一致。初步证明，重组菌株构建成功。对重组菌株S.globisporus C-1027-tenP发酵液活性初步测活结果见表1。
序列表
<110>中国医学科学院医药生物技术研究所
<120>利用基因置换技术改造力达霉素产生菌的方法
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>391
<212>DNA
<213>Streptomyces globisporus
<400>1
TTCTCGAGGG CGGTGGCGGT TCGCAGGTCA AGCTCCAGCA GTCGGGCACC GAGGTCGTCA  60
L  E  G  G  G  G  S  Q  V  K  L  Q  Q  S  G  T  E  V  V
1           5              10             15
AGCCGGGCGC CTCGGTCAAG CTCTCGTGCA AGGCCTCGGG CTACATCTTC ACCTCGTACG 120
K  P  G  A  S  V  K  L  S  C  K  A  S  G  Y  I  F  T  S  Y
20          25             30             25
ACATCGACTG GGTCCGCCAG ACCCCGGAGC AGGGCCTGGA GTGGATCGGC TGGATCTTCC 180
D  I  D  W  V  R  Q  T  P  E  Q  G  L  E  W  I  G  W  I  F
30          35             40             45
CGGGCGAGGG CTCGACCGAG TACAACGAGA AGTTCAAGGG CCGCGCCACC CTCTCGGTCG 240
P  G  E  G  S  T  E  Y  N  E  K  F  K  G  R  A  T  L  S  V
50          55             60             65
ACAAGTCGTC GTCGACCGCC TACATGGAGC TCACCCGCCT CCGCTCGGAG GACTCGGCCG 300
D  K  S  S  S  T  A  Y  M  E  L  T  R  L  R  S  E  D  S  A
70          75             80             85
TCTACTTCTG CGCCCGCGGC GACTACTACC GCCGCTACTT CGACCTCTGG GGCCAGGGCA 360
V  Y  F  C  A  R  G  D  Y  Y  R  R  Y  F  D  L  W  G  Q  G
90          95
CCACGGTCAC CGTCTCCTCG TGAAGATCTC C                                391
T T V T  V  S  S  ter
<210>2
<211>60
<212>DNA
<213>Streptomyces globisporus
<400>2
CTCGAGGGCG GTGGCGGTTC GGCCTGCCGC GGCGACATGT TCGGCTGCGC CTGAAGATCT  60
L  E  G  G  G  G  S  A  C  R  G  D  M  F  G  C  A  ter