一个小分子非编码RNA基因HSAMIR101及其抗肿瘤用途.pdf

本发明公开了一种与原发性肝细胞癌相关的小分子RNA基因hsa-miR-101及其应用。本发明还提供了一种分析小分子RNA基因与肿瘤发生发展相关性的方法，以及小分子RNA基因hsa-miR-101在原发性肝癌治疗方面的用途。本发明的目的是提供小分子RNA基因hsa-miR-101作为肿瘤治疗性药物的应用，本发明在医学和生物制药领域有较大的实际意义和广阔的应用前景。

权利要求书
1.  一种分离核酸，具有SEQ ID NO：1所示的序列。

2.  权利要求1所述的核酸作为治疗肿瘤的药物的应用。

3.  根据权利要求2所述的核酸作为治疗肿瘤的药物的应用，其特征在于：所述的肿瘤为原发性肝细胞癌。

4.  权利要求1所述的核酸作为促进肿瘤细胞凋亡的药物的应用。

5.  权利要求1所述的核酸作为逆转肿瘤细胞的耐药的药物的应用。

说明书一个小分子非编码RNA基因hsa-miR-101及其抗肿瘤用途
技术领域
本发明涉及一个与原发性肝癌相关的小分子非编码RNA基因hsa-miR-101，以及该基因在辅助诊断与治疗原发性肝细胞癌方面的用途。该发明属于生物技术领域。
技术背景
原发性肝细胞癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，我国是肝癌的主要发生地，肝癌的发生率高达十万分子三十五。近年来肝癌发病率有明显上升的趋势，严重危害人类的健康与生命安全。
微小RNA(microRNA)是广泛存在于各种生物物种内的一类小分子非编码的核糖核酸，其长度约为20-22个碱基。它不编码蛋白质或多肽，而是通过与靶基因的mRNA(信使RNA)的3’UTR(3’端非翻译区)的特异性结合，促进其降解或抑制其翻译过程来实现对基因表达的调控。许多证据表明，microRNA参与了细胞的多种生物学过程，其自身调控的异常直接影响着恶性肿瘤的发病及恶化。由于microRNA与肿瘤发生的密切关系，它们在肿瘤诊断和治疗中可能具有极为广阔的应用前景。
我们首先利用cDNA芯片技术高通量检测了HCC与对照标本中存在的miRNA表达改变。通过比较癌与非癌肝组织中miRNA表达谱的差异，我们鉴定了41个在肝癌中表达发生显著改变的miRNA，并选取了其中的hsa-miR-101进行较深入的功能探讨。结果发现hsa-miR-101在70％以上的HCC病例中以及所有肝癌细胞株中均低表达，提示hsa-miR-101可能具有抑癌基因活性。进一步的实验结果表明，过表达hsa-miR-101可提高肿瘤细胞对血清饥饿和多种化疗药物包括curcumin、etoposide和doxorubicin的敏感性。我们还发现，hsa-miR-101可有效抑制肿瘤细胞体外的集落形成能力以及体内的成瘤能力。这些结果表明hsa-miR-101不仅可作为临床上肝癌诊断的辅助指标，而且在肝癌治疗中有着非常广阔的应用前景。
经对现有技术的国内外文献检索，至今未见有关hsa-miR-101与原发性肝癌的研究报道。
发明内容
本发明公开了一种能有效抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡的小分子RNA基因hsa-miR-101，及其在原发性肝癌诊断和治疗方面的用途。该基因成熟体序列有以下核苷酸组成：
5’-AUGUCAUUUAAUUACUUAAGC-3’
首先，本发明的小分子RNA基因hsa-miR-101在大多数肝癌组织中下调明显，因此在肝癌的临床诊断及预后判断方面，有重要的参考意义；
其次，本发明的小分子RNA基因可以有效降低肝癌细胞的增殖及成瘤能力，可有效促进肝癌细胞对血清饥饿及各种化疗药物的敏感性，因此是一种全新作用机制的抗肿瘤药物，在肝癌治疗中有极为重要的应用前景。
附图说明
图1：Northern blot检测hsa-miR-101的表达水平。A，hsa-miR-101在不同细胞株，人非肝癌组织(N699)以及成年小鼠正常肝(mLiv)中的表达水平；B，hsa-miR-101在成对的肝癌(T)与癌旁(P)组织中表达水平的比较。
图2：hsa-miR-101能提高细胞对凋亡刺激的敏感性。A，在血清饥饿环境下，过表达hsa-miR-101促进HepG2细胞的凋亡；B，过表达hsa-miR-101后HepG2在血清饥饿时的细胞活力明显下降；C，在血清饥饿环境下，过表达hsa-miR-101导致HepG2细胞caspase-3/7活性提高，此作用可被hsa-miR-101的抑制剂回复，D，hsa-miR-101导致不同肝癌细胞株对血清饥饿诱导的凋亡敏感；E，hsa-miR-101促进HepG2细胞在不同化疗药物刺激下的凋亡，其中用etoposide，curcumin及doxorubicin的处理浓度和时间分别为1.5μg/ml，48hrs；12.5μM，48hrs；0.2μg/ml，36hrs。关于实验组组间差异的比较，除图中用“”明确标识的比较组别外，其余均是对hsa-miR-101与平行的细胞组或NC进行的比较。数据来自三次独立实验。*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001。
图3：过表达hsa-miR-101显著抑制了HepG2细胞在裸鼠的皮下成瘤能力，图示4周后肿瘤的形成情况代表图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，来进一步说明本发明。需要注意的是，以下实施例只用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的hsa-miR-101可以采用常规的化学合成方式合成。
实施例1：hsa-miR-101在肝癌组织标本中表达水平的检测
从肝癌及非癌肝组织中提取总RNA，RNA样品与RNA上样缓冲液按3∶1比例混合后，80℃变性10min，然后置于冰上5min；用微量加热器迅速上样后，在10W的电功率下，用15％的变性聚丙烯酰胺凝胶进行约40min电泳分离；电泳完成后凝胶切角做好标记，将凝胶和膜按顺序组装到半干转印槽里，恒流8mA/cm2转膜1小时；取下Hybond N+尼龙膜并切角做好标记，70,000μJ/cm2UV交联，再真空80℃干烤2h；用2×SSC润湿尼龙膜后，平铺到杂交管内壁，并赶走膜与管壁间的气泡，加入预杂交液，放入杂交箱，37℃最低速旋转过夜；然后加入50ul标记好的探针(～1×107cpm/ml)杂交过夜；杂交完毕后用洗膜液洗膜三次，每次5min，对于microRNA的检测要用非严谨的洗膜液，对于U6的检测则用严谨洗膜液；用保鲜膜把洗完的膜包好，压磷屏和扫描。各样品中目的条带的强度用GeneTools software(version3.03，SynGene，Cambridge，UK)进行分析。
通过Northernblot方法我们检测了多种肝癌细胞株及肝癌组织标本中hsa-miR-101的表达情况，结果发现在多种肝癌组织及肝癌细胞株中，hsa-miR-101的表达均明显降低(附图1)。
实施例2：hsa-miR-101过表达
把hsa-miR-101的小分子RNA导入细胞是通过采用Invitrogen公司的转染试剂Lipofectamine RNAi MAX来进行反转而实现的，以24孔板为例，其他孔板可根据孔的大小按比例放大或者缩小：胰蛋白酶消化细胞，重悬于含有10％FBS的无双抗DMEM培养基中，使得细胞密度为3×104个细胞/ml；将小分子RNA稀释于100μl opti-MEM中，轻敲管壁混匀；每管加入1μl Lipofectamine RNAi MAX，轻敲管壁混匀，室温放置15min；将RNAiMAX/siRNA稀释液加入24孔板中，然后再加入500μl细胞稀释液(使细胞密度在转染24h后大约为30-50％汇合)，混匀后培养箱中培养一定时间后进行相关功能检测。
实施例3：细胞凋亡检测
按需要处理细胞后吸去培养上清，用4％多聚甲醛室温固定15min后，用1μg/ml(终浓度)的DAPI染液室温染色5min，再于莱卡荧光显微镜下观察细胞核形态。染色质固缩和DNA发生断裂的细胞均认为是发生凋亡的细胞，细胞凋亡率按以下的方法计算：
细胞凋亡率(％)＝凋亡细胞数/总细胞数(总细胞数≥500个)
我们检测了在血清饥饿及化疗药物处理条件下hsa-miR-101对肿瘤细胞凋亡的影响，结果发现在HepG2细胞(美国ATCC)中过表达hsa-miR-101实验组在血清饥饿48h后凋亡率是阴性对照(NC)组或平行的HepG2组的～2倍，而饥饿72h后凋亡率差异进一步上升，过表达hsa-miR-101使得细胞凋亡率提高了接近3倍(图2A)。结果提示hsa-miR-101可增加HepG2细胞对血清饥饿诱导的凋亡反应的敏感性。用Alamar Blue检测血清饥饿后HepG2的生长状况发现在血清饥饿下hsa-miR-101组的生长活力大幅度下降(图2B)，提示了hsa-miR-101具有使细胞对血清饥饿更敏感的作用。通过检测caspase-3/7的活性也可以进一步说明我们结果的可靠性(图2C)。对其他肝癌细胞株QGY-7703(美国ATCC)和SMMC-7721(美国ATCC)进行血清饥饿的处理，同样也观察到了hsa-miR-101的促凋亡效果(图2D)。进一步研究发现hsa-miR-101过表达可显著提高HepG2细胞对etoposide、Mcurcumin和doxorubicin等化疗药物的敏感性(图2E)，提示hsa-miR-101可以逆转肿瘤细胞对某些化疗药物的耐药性，可以作为未来肿瘤治疗的潜在药物。
实施例4：裸鼠成瘤实验
利用RNAiMAX反转50nM的hsa-miR-101或NC到HepG2细胞，培养48h后用胰酶消化并计数后按1×106个/ml的浓度用PBS悬浮。选用9只5周龄的BALB/c裸鼠，在其两只后腿部分别皮下注射1×105或5×104过表达hsa-miR-101或NC的HepG2细胞。连续观察并测量肿瘤的生长及大小至1个月以上。
小鼠体内成瘤实验结果表明，过表达hsa-miR-101可以显著抑制肿瘤细胞的体内成瘤能力，提示hsa-miR-101具有类似肿瘤抑癌因子的基因活性(图3和4)。
由此可见，本发明中的hsa-miR-101不仅在体外实验中可有效促进肝癌细胞的凋亡，逆转肝癌细胞的耐药，而且在体内实验中也可有效抑制肝癌肿瘤的形成。因此hsa-miR-101可以作为未来肿瘤治疗的潜在药物。
本发明具有实用性的例证：
(1)本发明所提供的小分子RNA基因hsa-miR-101可用于肝癌患者，特别是耐药肝癌患者的辅助治疗；
(2)可以利用本发明所介绍的研究该类小分子非编码RNA基因功能的方法，筛选鉴定其它肿瘤相关miRNA基因，促进新的抗肝癌药物的发现；
(3)可以筛选鉴定有效调控hsa-miR-101的药物，寻找具有调节hsa-miR-101分子加工表达的活性分子药物；
(4)hsa-miR-101分子很可能还参与了其他类型肿瘤的发生发展过程。因此，本发明对今后深入研究hsa-miR-101分子与其他肿瘤的关系提供了经验和应用基础。
序列表
<110>中山大学
<120>一个小分子非编码RNA基因hsa-miR-101及其抗肿瘤用途
<160>1
<210>1
<211>11
<212>RNA
<400>1
augucauuua auuacuuaag c    11