能抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白及其制备方法和应用.pdf

本发明公开了一种能抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白即Decorin及其制备方法和在抑制人乳腺癌细胞或组织的生长和转移中的应用。本发明用特异性引物以人骨髓cDNA为模板克隆Decorin饰胶蛋白成熟肽编码序列，并将其直接插入克隆表达载体pET-30a(+)，构建成Decorin/pET-30a(+)重组体，转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆，经IPTG诱导表达，纯化、复性、酶切、高效液相色谱分离制备Decorin蛋白。本发明饰胶蛋白具有抑制野SDF-1α对乳腺癌细胞的趋化迁移、抑制乳腺癌细胞的生长的活性，可应用于制备抑制人乳腺癌细胞或组织的生长和转移的药物。

权利要求书
1、  一种能抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白，其特征在于：所述饰胶蛋白的核酸编码序列为：
5’GATGAGGCTTCTGGGATAGGCCCAGAAGTTCCTGATGACCGCGACTTCGAGCCCTCCCTAGGCCCAGTGTGCCCCTTCCGCTGTCAATGCCATCTTCGAGTGGTCCAGTGTTCTGATTTGGGTCTGGACAAAGTGCCAAAGGATCTTCCCCCTGACACAACTCTGCTAGACCTGCAAAACAACAAAATAACCGAAATCAAAGATGGAGACTTTAAGAACCTGAAGAACCTTCACGCATTGATTCTTGTCAACAATAAAATTAGCAAAGTTAGTCCTGGAGCATTTACACCTTTGGTGAAGTTGGAACGACTTTATCTGTCCAAGAATCAGCTGAAGGAATTGCCAGAAAAAATGCCCAAAACTCTTCAGGAGCTGCGTGCCCATGAGAATGAGATCACCAAAGTGCGAAAAGTTACTTTCAATGGACTGAACCAGATGATTGTCATAGAACTGGGCACCAATCCGCTGAAGAGCTCAGGAATTGAAAATGGGGCTTTCCAGGGAATGAAGAAGCTCTCCTACATCCGCATTGCTGATACCAATATCACCAGCATTCCTCAAGGTCTTCCTCCTTCCCTTACGGAATTACATCTTGATGGCAACAAAATCAGCAGAGTTGATGCAGCTAGCCTGAAAGGACTGAATAATTTGGCTAAGTTGGGATTGAGTTTCAACAGCATCTCTGCTGTTGACAATGGCTCTCTGGCCAACACGCCTCATCTGAGGGAGCTTCACTTGGACAACAACAAGCTTACCAGAGTACCTGGTGGGCTGGCAGAGCATAAGTACATCCAGGTTGTCTACCTTCATAACAACAATATCTCTGTAGTTGGATCAAGTGACTTCTGCCCACCTGGACACAACACCAAAAAGGCTTCTTATTCGGGTGTGAGTCTTTTCAGCAACCCGGTCCAGTACTGGGAGATACAGCCATCCACCTTCAGATGTGTCTACGTGCGCTCTGCCATTCAACTCGGAAACTATAAG3’。

2、  根据权利要求1所述的一种能抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白，其特征在于：所述能抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白氨基酸序列为：
Asp Glu Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro Ser Leu Gly Pro ValCys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Asp Lys Val ProLys Asp Leu Pro Pro Asp Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile Lys Asp GlyAsp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu Val Asn Asn Lys Ile Ser Lys Val Ser ProGly Ala Phe Thr Pro Leu Val Lys Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu Leu ProGlu Lys Met Pro Lys Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn Glu Ile Thr Lys Val Arg Lys ValThr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met Ile Val Ile Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile GluAsn Gly Ala Phe Gln Gly Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala Asp Thr Asn Ile Thr Ser Ile ProGln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr Glu Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala AlaSer Leu Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser Ile Ser Ala Val Asp AsnGly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg Glu Leu His Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val ProGly Gly Leu Ala Glu His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile Ser Val Val Gly SerSer Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn ProVal Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly AsnTyr Lys。

3、  权利要求1所述的一种能抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)根据Genebank数据库提供的人Decorin的cDNA序列设计RT-PCR引物Decorin-F和Decorin-R，扩增Decorin成熟肽编码序列；
(2)从人骨髓细胞中提取总RNA，反转录成单链cDNA；
(3)利用引物Decorin-F和Decorin-R以反转录合成的单链cDNA为模板PCR扩增Decorin，得到Decorin的PCR产物；所述PCR热循环程序条件：94℃5min；94℃10S，56.0℃10S，72℃5S，30个循环；72℃，5min；
(4)将步骤(3)获得的Decorin的PCR产物经胶回收后，与PET30a(+)质粒载体用BamHI+EcoRI进行双酶切：pET-30a(+)质粒载体的酶切产物与PCR产物的酶切产物进行连接，将Decorin的PCR产物直接插入pET-30a(+)质粒载体，构建得到Decorin/pET-30a(+)，酶切初步鉴定后进行测序确认；
(5)经确证的Decorin/pET-30a(+)转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，用异丙基-βD-硫代半乳糖苷进行诱导表达，收获并裂解菌体，上清液通过镍固相亲和层析树脂进行纯化，最后用肠激酶切掉His-Tag，过反相高效液相色谱，得到纯化的能抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白Decorin；
所述引物Decorin-F：
5’cgggatcccatcatcaccatcaccatgacgacgacgacaaggatgaggcttctgggataggcc3’；其5’-端具有BamHI酶切位点和EK识别位点-(Asp)4Lys的编码序列；
所述引物Decorin-R：
5’ggaattcttacttatagtttccgagtt’；所述引物含有酶切位点EcoRI和终止密码子。

4、  权利要求1所述的一种能抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白在制备抑制人乳腺癌细胞或组织的生长和转移药物中的应用。

说明书能抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种既能抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白(Decorin)及其制备方法和在抑制肿瘤生长和转移中的应用。
背景技术
最近表皮细胞生长因子受体家族新成员HER-2/neu(c-ErbB-2)癌基因在乳腺癌的发生发展中所起的重要作用引起病理学家和临床医学家的高度关注。HER-2/neu基因定位于人17号染色体，编码一185KD的跨膜糖蛋白，即表皮生长因子-2受体(HER-2)。与表皮生长因子受体家族(EGFR)其它成员一样，HER-2具有酪氨酸激酶活性，介导细胞的生长与分化信号的传导。HER-2可以单体、同源或异源二聚体的形式存在于细胞膜，以异源二聚体的酪氨酸激酶活性为最强。在正常细胞表面，HER-2表达甚微，几乎无异源二聚体存在；因而介导促生长信号的能力亦相对微弱。但HER-2在许多肿瘤细胞则以异源二聚体的形式高水平表达，进而形成强烈的促生长信号。有证据提示HER-2/neu过度表达与乳腺癌的发生、发展及转移密切相关。动物实验发现HER-2/neu在转基因小鼠乳腺上皮表达可诱发转移性肿瘤。临床研究表明：约20～30％的浸润性乳腺癌患者的乳腺癌细胞HER-2/neu明显上调，HER-2高度表达，而且转移灶与原发灶癌细胞的表达水平一致；凡高水平HER-2表达的浸润性乳腺癌病例，对常化疗不敏感、预后不良、容易转移、死亡率高。Herceptin是一新近被FDA批准进入III期抗乳腺癌临床实验的重组人HER-2单克隆抗体。其临床前研究表明：Herceptin通过直接阻断HER-2的胞外段，可明显抑制HER-2表达阳性的乳腺癌细胞生长。临床多中心实验表明：Herceptin与化疗药联合，可明显提高治疗反应率，延缓病程，增加生存期。以上证据支持HER-2可作为新的特异性治疗浸润性乳腺癌的靶点(M.J.Duffy Biochemicalmarkers in breast cancer：which ones are clinically useful Clinical Biochemistry2001；34：347-352)。
小分子富亮氨酸蛋白糖甙家族成员饰胶蛋白(Decorin)因被证实是一强的肿瘤细胞生长负性调节因子而成为肿瘤研究领域的热点。Decorin由核心蛋白及其以共价键相连的氨基糖甙链组成，未成熟肽含有359个氨基酸。内源性Decorin在血管、结蒂组织和某些肿瘤等组织表达，尤以急性损伤组织的上皮下层表达甚强。在肿瘤组织，Decorin由其两种主要支架细胞：成纤维细胞和平滑肌细胞分泌产生并高浓度聚集于肿瘤细胞间的基质中。作为EGFR天然配体，Decorin通过与EGFR相互作用，抑制肿瘤细胞生长、浸润和远距离转移。Decorin对肿瘤细胞生长的负性调节作用以及高度浓集于肿瘤细胞侵及的微环境的特性，实际上是宿主天然抗肿瘤免疫功能的体现(Marko Stander，UlrikeNaumann and Wolfgang Wick Transforming growth factor-beta and P21：multiplemolecular targets of decorin-mediated suppression of neoplastic growth Cell TissueRes 1999；296：221-227；Renato V.Iozzo，David K.Moscatello，David J.McQuillanet al.Decorin is a biological ligand for the epidermal growth factor.The Journal ofBiological Chemistry 1999；274(8)：4489-4492)。Manoranjan等用重组Decorin转染HER-2高表达的乳腺肉瘤细胞MDA-453，使该细胞HER-2的表达量降低约40％，其酪氨酸激酶的活性几乎完全丧失，内源性P21蛋白(一种强的细胞周期素依赖激酶抑制因子)活性增强，进而细胞持续处于周期停止、生长延迟的抑制状态。裸鼠实验显示Decorin转染HER-2高表达的乳腺肉瘤细胞MDA-453不能诱导肿瘤形成。因此，Decorin被认为是作为一种EGFR天然特异性拮抗剂，能安全有效地抑制HER-2高表达的肿瘤细胞(Manoranjan Santra，Inge Eichstetter and Renato V.Iozzo An anti-oncogenic role for Decorindown-regulation of ErbB2 leads to growth suppression and cytodifferentiation ofmammary carcinoma cells.The Journal of Biological Chemistry 2000；275(45)：35153-35161)。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种能抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白(Decorin)。
本发明的另一目的在于提供上述饰胶蛋白(Decorin)的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述饰胶蛋白(Decorin)在制备抑制肿瘤细胞生长和转移的药物中的应用。
本发明利用特异性的PCR引物从人骨髓cDNA中采用PCR的方法克隆Decorin的成熟肽编码序列，然后直接连接到原核克隆表达载体PET30a(+)，转化至克隆菌株JM109，经测序鉴定序列正确后，转化至表达菌株BL21(DE3)，利用IPTG诱导表达Decorin饰胶蛋白，然后分离包含体、纯化、复性、酶切标签蛋白、HPLC分离目标蛋白，最终得到Decorin饰胶蛋白纯品；利用HER-2高表达的乳腺肉瘤细胞MDA-MB-231，采用MTT的方法检测Decorin对乳腺癌细胞的抑制效应。
本发明的目的通过如下技术方案来实现：一种能抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白(Decorin)，所述能抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白Decorin的核酸编码序列(饰胶蛋白Decorin基因成熟肽的核酸编码序列)为：5’GATGAGGCTTCTGGGATAGGCCCAGAAGTTCCTGATGACCGCGACTTCGAGCCCTCCCTAGGCCCAGTGTGCCCCTTCCGCTGTCAATGCCATCTTCGAGTGGTCCAGTGTTCTGATTTGGGTCTGGACAAAGTGCCAAAGGATCTTCCCCCTGACACAACTCTGCTAGACCTGCAAAACAACAAAATAACCGAAATCAAAGATGGAGACTTTAAGAACCTGAAGAACCTTCACGCATTGATTCTTGTCAACAATAAAATTAGCAAAGTTAGTCCTGGAGCATTTACACCTTTGGTGAAGTTGGAACGACTTTATCTGTCCAAGAATCAGCTGAAGGAATTGCCAGAAAAAATGCCCAAAACTCTTCAGGAGCTGCGTGCCCATGAGAATGAGATCACCAAAGTGCGAAAAGTTACTTTCAATGGACTGAACCAGATGATTGTCATAGAACTGGGCACCAATCCGCTGAAGAGCTCAGGAATTGAAAATGGGGCTTTCCAGGGAATGAAGAAGCTCTCCTACATCCGCATTGCTGATACCAATATCACCAGCATTCCTCAAGGTCTTCCTCCTTCCCTTACGGAATTACATCTTGATGGCAACAAAATCAGCAGAGTTGATGCAGCTAGCCTGAAAGGACTGAATAATTTGGCTAAGTTGGGATTGAGTTTCAACAGCATCTCTGCTGTTGACAATGGCTCTCTGGCCAACACGCCTCATCTGAGGGAGCTTCACTTGGACAACAACAAGCTTACCAGAGTACCTGGTGGGCTGGCAGAGCATAAGTACATCCAGGTTGTCTACCTTCATAACAACAATATCTCTGTAGTTGGATCAAGTGACTTCTGCCCACCTGGACACAACACCAAAAAGGCTTCTTATTCGGGTGTGAGTCTTTTCAGCAACCCGGTCCAGTACTGGGAGATACAGCCATCCACCTTCAGATGTGTCTACGTGCGCTCTGCCATTCAACTCGGAAACTATAAG3’。
所述能抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白Decorin氨基酸序列(饰胶蛋白Decorin基因成熟肽的氨基酸编码序列)为：
Asp Glu Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro Ser Leu Gly Pro ValCys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val Val Gln Cys SerAsp Leu Gly LeuAsp Lys ValPro Lys Asp Leu Pro Pro Asp Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile Lys AspGly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu Val Asn Asn Lys Ile Ser Lys Val SerPro Gly Ala Phe Thr Pro Leu Val Lys Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys GluLeu Pro Glu Lys Met Pro Lys Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn Glu Ile Thr Lys Val ArgLys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met Ile Val Ile Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys Ser SerGly Ile Glu Asn Gly Ala Phe Gln Gly Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala Asp Thr Asn IleThr Ser Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr Glu Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser ArgVal Asp Ala Lya Ser Leu Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser IleSer Ala Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg Glu Leu His Leu Asp Asn AsnLys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu Ala Glu His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn AsnAsn Ile Ser Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr SerGly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val TyrVal Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn Tyr Lys。
上述能抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白(Decorin)的制备方法，包括如下步骤：
(1)根据Genebank数据库提供的人Decorin的cDNA序列设计RT-PCR引物Decorin-F和Decorin-R，扩增Decorin成熟肽编码序列。
(2)从人骨髓细胞中提取总RNA，反转录成单链cDNA。
(3)利用引物Decorin-F和Decorin-R以反转录合成的单链cDNA为模板PCR扩增Decorin，得到Decorin的PCR产物。所述PCR热循环程序条件如下：94℃5min；94℃ 10S，56.0℃ 10S，72℃ 5S，30个循环；72℃，5min。
(4)将步骤(3)获得的Decorin的PCR产物经胶回收后，与PET30a(+)质粒载体用BamHI+EcoRI进行双酶切：pET-30a(+)质粒载体的酶切产物与PCR产物的酶切产物进行连接，将Decorin的PCR产物直接插入pET-30a(+)质粒载体，构建得到Decorin/pET-30a(+)，酶切初步鉴定后进行测序确认。
(5)经确证的Decorin/pET-30a(+)转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导表达，收获并裂解菌体，上清液通过Ni亲和介质(镍固相亲和层析树脂)进行纯化，最后用肠激酶切掉His-Tag，过RP-HPLC(反相高效液相色谱)得到纯化的能抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白(Decorin)。
所述引物Decorin-F：
5’cgggatcccatcatcaccatcaccatgacgacgacgacaaggatgaggcttctgggataggcc3’；其5’-端具有BamHI酶切位点和EK识别位点-(Asp)4Lys的编码序列；
所述引物Decorin-R：
5’ggaattcttacttatagtttccgagtt’；所述引物含有酶切位点EcoRI和终止密码子。
上述能抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白(Decorin)在抑制人乳腺癌细胞或组织的生长和转移中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：本发明抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白Decorin蛋白具有如下特点：1)能特异性识别HER-2高表达的乳腺肿瘤细胞，故高选择性地大量聚集在乳腺原发肿瘤及其转移灶组织；2)Decorin能特性异性阻断HER-2高表达乳腺癌的浸润性生长和转移。
附图说明
图1为酶切鉴定Decorin/PET30a(+)。
其中，1，Decorin/PET30a(+)BamHI单酶切；2，Decorin/PET30a(+)BamHI&EcoRI双酶切；3，Decorin/PET30a(+)EcoRI单酶切；4，Decorin/PET30a(+)；M，Marker。
图2为Decorin/PET30a(+)重组体的测序结果。
图3为Decorin/His-tag的诱导表达。
其中，1、蛋白分子量Marker，Kd；2、包含体溶液；3、4、Ni亲和层析后的目标蛋白。
图4为Decorin/His-tag的EK酶切除His-tag。
其中，1、Ni亲和层析后复性的Decorin/His-tag；2、酶切后HPLC分离后的Decorin；3、复性的Decorin/His-tagEK酶切产物；4、蛋白分子量Marker，Kd。
图5为Decorin对MDA-MB-231乳腺癌细胞的抑制效应。
图6为Decorin对SDF-1α诱导MDA-MB-231乳腺癌细胞趋化迁移的抑制效应。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
Decorin基因的克隆及其原核表达系统的构建
1.引物设计：根据Genebank数据库提供的人Decorin的cDNA序列按照一般引物设计原则和PET30a(+)克隆的要求，采用primer5.0以编码区为模板设计RT-PCR引物Decorin-F和Decorin-R，直接扩增Decorin成熟肽编码序列。
所述人Decorin基因cDNA序列的5′-末端引物(Decorin-F)(用以克隆人Decorin基因成熟肽编码序列)：
5’cgggatcccatcatcaccatcaccatgacgacgacgacaaggatgaggcttctgggataggcc3’；其5’-端具有BamHI酶切位点和EK识别位点-(Asp)4Lys的编码序列；
所述人Decorin基因cDNA序列的3′-末端引物(Decorin-R)(用以克隆人Decorin基因成熟肽编码序列)：5’ggaattcttacttatagtttccgagtt’；所述引物含有酶切位点EcoRI和终止密码子。
2.总RNA的提取：自液氮中取出人骨髓细胞样品约0.25ml，立即加入0.75ml TRIZOL LS Reagent(总RNA提取试剂)，待样品解冻后，用吸管反复吹打裂解骨髓细胞。裂解的细胞匀浆在15～30℃条件下保温5min以便核蛋白复合体的解离。然后加入0.2ml氯仿，用力振荡15s并在15～30℃条件下保温2～15min。12,000×g、2～8℃离心15min。离心后的样品分为三层，RNA即存在于上层无色清液中(总体积约为TRIZOL LS Reagent的70％)。取上层清液于新的EP管中，加入0.5ml异丙醇混匀，15～30℃保温10min，12,000×g，2～8℃离心10min。去上清，用1ml 70％的乙醇涡旋洗涤沉淀，7,500×g，2～8℃离心5min。去上清，室温挥发残余乙醇5～10min，然后将沉淀溶解于20ul DEPC处理的水中，检测A260/A280比值，保存于-70℃备用。(RNA提取过程中的所有器皿、溶液和水均经DEPC(焦碳酸二乙酯)处理)。
3.反转录合成单链cDNA：单链cDNA的合成按SuperScriptTM FirstStrand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen life technologies，Cat.No.11904-018)所提供的方法采用oligo(dT)primer进行，概述如下：
a.按如下顺序加入各组分到已编号的0.2ml的PCR薄壁管中混匀，65℃保温5min，然后置于冰上至少1min。
  组分  样品RNA  非反转录对照  对照RNA  5μg 总RNA  4μl  4μl
  对照RNA(50ng/μl)  1μl  10mM dNTP混合液  1μl  1μl  1μl  Oligo(dT)12-18(0.5μg/μl)  1μl  1μl  1μl  DEPC-处理的水  to 10μl  to 10μl  to 10μl
b.按如下顺序准备反应混合液。
 10X反转录缓冲液  每个反应2μl  4个反应8μl 25mM MgCl2(氯化镁)  4μl  16μl 0.1M DTT(二硫苏糖醇)  2μl  8μl RNaseOUTTM Recombinant RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)  1μl  4μl
c.向a步骤中的每管加入一份9μl的反应混合液，轻轻混匀，低速离心收集。
d.42℃保温2min。
e.除非反转录对照外，每管加入1μl(50单位)SuperScript II(反转录酶)，混匀，42℃保温50min。
f.70℃保温15min终止反应，置于冰上冷却。
g.每管加入1μl RNase H(RNA酶)，37℃保温20min，然后保存于-20℃备用。
4.Decorin的PCR扩增
利用引物Decorin-F和Decorin-R以反转录合成的单链cDNA为模板PCR扩增Decorin，得到Decorin的PCR产物。PCR热循环程序条件如下：94℃5min；94℃10S，56.0℃10S，72℃5S，30个循环；72℃，5min。
5.Decorin/PET30a(+)的构建
Decorin的PCR产物经胶回收后，与预先制备PET30a(+)质粒载体按照下表进行双酶切：
  组分  pET-30a(+) Decorin  pET-30a(+)质粒，100ng/μl，μl  50  PCR产物，30-50ng/μl，μl  50  BamHI，10U/μl，μl  5  5  EcoRI，10U/μl，μl  5  10xM缓冲液，μl  7  7
  灭菌ddH2O，μl  4.5  3
酶切产物全部上样到1×TAE(三硝基氨基甲烷-EDTA-醋酸钠缓冲液)配制的1.5％琼脂糖凝胶(含EB1μg/ml)上进行电泳。紫外透射反射分析仪检测条带分离开后，凝胶成像系统照相。根据DNA Marker判断目标条带所在的位置，分别用手术刀片准确切下目标带所在的凝胶块，转入干净的1.5ml试管中。用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit回收目标片段，回收过程按试剂盒说明书进行。pET-30a(+)的酶切产物最后用20μl灭菌ddH2O洗脱，浓度约为0.05pmol/μl；PCR产物的酶切产物最后用40μl灭菌ddH2O洗脱，浓度约为0.2-0.6pmol/μl。
pET-30a(+)(质粒载体)和PCR产物的双酶切回收产物的连接按下面的反应体系进行：10μl连接反应体系如下：16℃连接反应0.5h以上。
  组分  Decorin  pET-30a(+)/BamHI+EcoRI(质粒载体的酶切产物)，0.05pmol/μl，μl  1.0  Decorin/BamHI+EcoRI(饰胶蛋白基因的酶切产物)，0.25pmol/μl，μl  2.0  灭菌ddH2O，μl  2.0  Solution I(连接反应液)，μl  5.0  终体积，μl  10.0
上述连接体系采用热休克方法直接转化至感受态JM109菌株。
阳性克隆的筛选：PCR法作初步鉴定：挑取单个菌落，接种于盛有500μlLB(含有50μg/ml Kanamycin(卡那霉素))液体培养基的1.5ml EP管中，37℃，250r/min振荡培养4h，以此菌液为模板，PCR法确认pET-30a(+)质粒载体中插入片段的大小。PCR体系同前，只是PCR模板为各自的阳性菌落培养液，PCR循环中的退火温度比进行PCR基因扩增时相应降低1～2℃。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，有PCR产物且产物DNA片段与用于克隆连接的外源DNA片段大小相同的初步确定为阳性克隆。
质粒提取及酶切鉴定：从PCR筛选出的阳性克隆中挑取一个单菌落接种5mL LB液体培养基(50μg/ml Kanamycin)，37℃，过夜培养(约12～14h)。次日，10000g，1min离心，收集细胞。按E.Z.N.A.Plasmid Miniprep KitI 说明书提取质粒，质粒经BamHI/EcoRI单/双酶切，再次验证是否有外源片段插入。经PCR和酶切筛选的重组质粒进一步测序鉴定。
酶切鉴定结果表明，Decorin基因已经成功插入PET30a(+)载体(图1)，构建得到Decorin/pET-30a(+)重组质粒，测序结果表明，Decorin克隆成功，序列完全正确(图2)。
实施例2
Decorin/pET-30a(+)重组质粒的原核表达和纯化
1、经确证的Decorin/pET-30a(+)重组质粒约200ng加入200μl感受态大肠杆菌BL21(DE3)(NOVAGEN)细胞中(氯化钙法制备)，轻轻混匀，在冰上放置30min，然后在42℃热休克90s，立即转到冰上放置2min，随后加入800μl LB培养液在37℃条件下振荡培养45min，取200μl铺到含50μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜(约12hr)，随机挑取5个阳性菌落分别接种于50ml的LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)37℃振荡培养约12hr，然后分别取5ml上述培养液转接于500ml的LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)37℃振荡培养约3hr，然后再取上述培养液20ml转接到2000ml的LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)37℃振荡培养，当OD600＝0.5时，分别加入终浓度为0.75mM的IPTG 37℃诱导表达3hr，3000×g离心15min收获菌体。然后按ProBondTM resinFor Purification of 6xHis-Tagged Proteins(镍固相亲和层析树脂)(Invitrogen，Catalog nos.R801-01，R801-15)的操作说明进行纯化，具体操作如下：
1)Guanidinium(盐酸胍)裂解缓冲液(6M盐酸胍，20mM NaPO4，pH7.8500mM NaCl)至37℃。
2)重悬菌体于40ml盐酸胍裂解缓冲液中。
3)在冰上超声处理细胞裂解液5s，间隔5s，重复4次。
4)在60℃条件下缓慢振荡30min以保证菌体全部裂解。
5)3,000×g离心15min，将上清转入干净的试管中，取5μl裂解液上清用作SDS-PAGE检测样品。
6)加10mlProBondTM resin(树脂)到40ml上清液中。
7)室温下轻微振荡结合30min，800×g离心15min，去除上清液。
8)用40ml Denaturing(变性)结合缓冲液(8M尿素(Urea)，20mM NaPO4，pH 7.8，500mM NaCl)重悬沉淀，在室温下振荡洗涤2min，800×g离心15min，小心去除上清液，并取50μl上清用作SDS-PAGE检测样品。此步骤重复一次。
9)用40ml变性洗涤缓冲液(8M Urea，20mM NaPO4，pH 6.0，500mMNaCl)重悬沉淀，在室温下振荡洗涤2min，800×g离心15min，小心去除上清液，并取50μl上清用作SDS-PAGE检测样品。此步骤重复一次。
10)用80ml非变性洗涤缓冲液(20mM imidazole(咪唑)，20mM NaPO4，pH 8.0，500mM NaCl)重悬沉淀，在室温下振荡洗涤2min，800×g离心15min，小心去除上清液，并取50μl上清用作SDS-PAGE检测样品。此步骤重复三次。
11)用8ml溶出缓冲液(500mM咪唑，20mM NaPO4，pH 8.0，500mMNaCl)重悬沉淀，在室温下振荡洗涤15min，800×g离心15min，小心吸取上清于干净的试管中，并取50μl上清用作SDS-PAGE检测样品，其余保存于-80℃。
SDS-PAGE检测结果表明，Decorin/pET-30a(+)重组体能够在大肠杆菌BL21(DE3)中正常表达，Ni亲和纯化出约37KD的目标蛋白带，与理论分子量37.4KD一致，纯度至少在80％以上(图3)。
12)在4℃用复性缓冲液A(3M尿素，20mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mMEDTA，1mM 2-巯基乙醇(2-Mecaptoethanol)，135mM NaCl)透析上述样品16～24hr。用复性缓冲液B(1.5M尿素，20mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA，1mM 2-巯基乙醇，135mM NaCl)继续透析上述样品16～24hr。用复性缓冲液C(20mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA，135mM NaCl，0.1mM GSH(还原型谷胱甘肽)，0.01mM GSSG(氧化型谷胱甘肽))继续透析上述样品16～24hr。用复性缓冲液D(20mM Tris-HCl(pH 7.5)，135mM NaCl)继续透析上述样品16～24hr。
13)超滤浓缩后按说明书提供的条件用肠激酶EnterokinaseMaxTM(EKMaxTM)(Invitrogen，Catalog nos.E180-01，E180-02)切除His-Tag。
14)反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离Decorin、His-Tag和肠激酶(Enterokinase)，最后得纯化的Decorin饰胶蛋白，储存于-80℃备用(图4)。
实施例3
生物活性测定
1、MTT
收集对数期MDA-MB-231细胞(人乳腺癌细胞系)，调整细胞悬液浓度(5×103Cells/ml)，接种于7块96孔板，每孔200μL；置37℃、5％CO2温箱培养使细胞贴壁；加入预定终浓度(10μmol/L)的Decorin蛋白，置37℃、5％CO2培养箱，开始计时培养，分别在第0hr(加药完毕开始计时时为0点)、24hr、48hr、72hr、96hr、120hr、144hr等时间点取出96孔板进行常规MTT检测，最后进行数据统计，以OD(490nm)值为纵轴，处理时间为横轴，描绘Decorin对乳腺癌细胞MDA-MB-231生长的抑制效应(图5)。
2、Decorin抑制野生型SDF-1α诱导的MDA-MB-231细胞迁徙的活性
分别用不同浓度梯度的Decorin(10-9～10-5mol/L)预处理MDA-MB-231细胞，37℃、3hr，然后将经预处理的细胞加入趋化小巢的上腔中，并将装有细胞的上腔置于加有20nM的SDF-1α的下腔之上，处理5小时，然后取下上腔底部滤膜，用棉刷轻轻去除膜上表面黏附的细胞，保留下表面黏附的细胞，将滤膜置入甲醇溶液固定后用苏木精伊红染色，记数滤膜下表面的细胞数。与未经任何处理的细胞相比，观察Decorin对SDF-1α诱导MDA-MB-231迁徙的抑制作用。结果表明：Decorin明显抑制SDF-1α诱导的MDA-MB-231迁徙，其抑制作用呈明显的剂量依赖关系(图6)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110>温州医学院
<120>能抑制肿瘤细胞生长和转移的饰胶蛋白及其制备方法和应用
<130>2
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>987
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(987)
<223>饰胶蛋白Decorin基因成熟肽的编码序列
<400>1
gat gag gct tct ggg ata ggc cca gaa gtt cct gat gac cgc gac ttc    48
Asp Glu Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe
1               5                   10                  15
gag ccc tcc cta ggc cca gtg tgc ccc ttc cgc tgt caa tgc cat ctt    96
Glu Pro Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu
            20                  25                  30
cga gtg gtc cag tgt tct gat ttg ggt ctg gac aaa gtg cca aag gat   144
Arg Val Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp
        35                  40                  45
ctt ccc cct gac aca act ctg cta gac ctg caa aac aac aaa ata acc    192
Leu Pro Pro Asp Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr
    50                  55                  60
gaa atc aaa gat gga gac ttt aag aac ctg aag aac ctt cac gca ttg    240
Glu Ile Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu
65                  70                  75                  80
att ctt gtc aac aat aaa att agc aaa gtt agt cct gga gca ttt aca    288
Ile Leu Val Asn Asn Lys Ile Ser Lys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr
                85                  90                  95
cct ttg gtg aag ttg gaa cga ctt tat ctg tcc aag aat cag ctg aag    336
Pro Leu Val Lys Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys
            100                 105                 110
gaa ttg cca gaa aaa atg ccc aaa act ctt cag gag ctg cgt gcc cat    384
Glu Leu Pro Glu Lys Met Pro Lys Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His
        115                 120                 125
gag aat gag atc acc aaa gtg cga aaa gtt act ttc aat gga ctg aac    432
Glu Asn Glu Ile Thr Lys Val Arg Lys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn
    130                 135                 140
cag atg att gtc ata gaa ctg ggc acc aat ccg ctg aag agc tca gga    480
Gln Met Ile Val Ile Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly
145                 150                 155                 160
att gaa aat ggg gct ttc cag gga atg aag aag ctc tcc tac atc cgc    528
Ile Glu Asn Gly Ala Phe Gln Gly Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg
                165                 170                 175
att gct gat acc aat atc acc agc att cct caa ggt ctt cct cct tcc    576
Ile Ala Asp Thr Asn Ile Thr Ser Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser
            180                 185                 190
ctt acg gaa tta cat ctt gat ggc aac aaa atc agc aga gtt gat gca    624
Leu Thr Glu Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala
        195                 200                 205
gct agc ctg aaa gga ctg aat aat ttg gct aag ttg gga ttg agt ttc    672
Ala Ser Leu Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe
    210                 215                 220
aac agc atc tct gct gtt gac aat ggc tct ctg gcc aac acg cct cat    720
Asn Ser Ile Ser Ala Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His
225                 230                 235                 240
ctg agg gag ctt cac ttg gac aac aac aag ctt acc aga gta cct ggt    768
Leu Arg Glu Leu His Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly
                245                 250                 255
ggg ctg gca gag cat aag tac atc cag gtt gtc tac ctt cat aac aac    816
Gly Leu Ala Glu His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn
            260                  265                 270
aat atc tct gta gtt gga tca agt gac ttc tgc cca cct gga cac aac    864
Asn Ile Ser Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn
        275                 280                 285
acc aaa aag gct tct tat tcg ggt gtg agt ctt ttc agc aac ccg gtc    912
Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val
    290                 295                 300
cag tac tgg gag ata cag cca tcc acc ttc aga tgt gtc tac gtg cgc    960
Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg
305                 310                 315                 320
tct gcc att caa ctc gga aac tat aag                                987
Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn Tyr Lys
                325
<210>2
<211>329
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
Asp Glu Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe
1               5                   10                  15
Glu Pro Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu
            20                  25                  30
Arg Val Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp
        35                  40                  45
Leu Pro Pro Asp Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr
    50                  55                  60
Glu Ile Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu
65                  70                  75                  80
Ile Leu Val Asn Asn Lys Ile Ser Lys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr
                85                  90                  95
Pro Leu Val Lys Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys
            100                 105                 110
Glu Leu Pro Glu Lys Met Pro Lys Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His
        115                 120                 125
Glu Asn Glu Ile Thr Lys Val Arg Lys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn
    130                 135                 140
Gln Met Ile Val Ile Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly
145                 150                 155                 160
Ile Glu Asn Gly Ala Phe Gln Gly Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg
                165                 170                 175
Ile Ala Asp Thr Asn Ile Thr Ser Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser
            180                 185                 190
Leu Thr Glu Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala
        195                 200                 205
Ala Ser Leu Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe
    210                 215                 220
Asn Ser Ile Ser Ala Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His
225                 230                 235                 240
Leu Arg Glu Leu His Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly
                245                 250                 255
Gly Leu Ala Glu His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn
            260                 265                 270
Asn Ile Ser Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn
        275                 280                 285
Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val
    290                 295                 300
Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg
305                 310                 315                 320
Ser AlaIle Gln Leu Gly Asn Tyr Lys
               325
<210>3
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>根据人Decorin基因cDNA序列设计的5’-末端引物，用以克隆人Decorin基因成熟肽编码序列
<400>3
cgggatccca tcatcaccat caccatgacg acgacgacaa ggatgaggct tctgggatag    60
gcc                                                                  63
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>根据人Decorin基因cDNA序列设计的3’-末端引物，用以克隆人Decorin基因成
熟肽编码序列
<400>4
ggaattctta cttatagttt ccgagtt                 27