背景技术
重症急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，
SARS)的广泛流行严重威胁着人类的健康。国内外研究表明，SARS
病原是一种变异的冠状病毒，长为29742bp的正单链RNA病毒，其
RNA和RNA之间重组率非常高。
虽然目前我国对SARS病原、诊断、来源等方面的研究均已取得
一定进展，但尚缺乏合适的SARS感染动物模型，尤其是灵长类动物
模型。因此，缺乏SARS动物模型已经成为限制预防和/或治疗SARS
药物筛选、疫苗评价和发病机制等的研究瓶颈问题。
虽然，已知建立了众多针对不同病原体的灵长类动物感染模型，
但是针对造成SARS的冠状病毒变异株建立灵长类动物感染模型而
言，在动物品种、健康状态的选择、感染病毒的处理、剂量、途径以
及感染后的病毒检测、免疫血清学确定等环节存在大量技术问题亟待
解决。国外仅有一篇关于SARS冠状病毒感染食蟹猴的信件短报
(Nature，Vol.423，15MAY2003)，其中没有披露具体的构建方法，
所得动物感染模型的效果也不甚清楚。
本发明人有效的克服了现有诸多技术问题，成功的构建了中国恒
河猴及食蟹猴SARS相关冠状病毒感染模型。在所述动物中感染的重
复性、稳定性好，为进一步研究该病毒的病原特性、发病机理、药物
筛选、疫苗评价等方面的研究奠定了重要基础。
发明内容
本发明的一个方面涉及一种SARS相关冠状病毒灵长类动物感染
模型，尤其是SARS相关冠状病毒中国恒河猴及食蟹猴感染模型。
恒河猴与食蟹猴感染SARS相关冠状病毒后，均表现一度体温生
高，产生抗SARS相关冠状病毒抗体IgM和IgG，体液分离病毒阳性，
RT-PCR检测病毒阳性可达感染后20天，此模型的建立，在病毒学及
免疫学指标上，对SARS相关冠状病毒的包括病原学、免疫学、发病
机理的研究，以及药物筛选、疫苗评价等应用方面有着不可替代作用，
在SARS相关冠状病毒选择敏感感染动物研究方面有代表性的意义。
本发明的另一方面，涉及一种构建SARS相关冠状病毒中国恒河
猴及食蟹猴感染模型的方法。
在本发明的一个具体实施方案中，对待感染的中国恒河猴及食蟹
猴采用经鼻腔滴鼻接种的方式，病毒接种量为：0.5-1ml107半数组织
细胞病变剂量(TCID50)。在本发明的又一实施方案中，对待感染的
中国恒河猴及食蟹猴采用经气管内注射病毒的接种方式，病毒接种量
为：0.5-1ml106TCID50。在本发明的又一实施方案中，对待感染的
中国恒河猴及食蟹猴采用静脉注射病毒的方式，接种量为：0.5-1ml105
TCID50。事实上，也可以选择上述三种接种病毒方式的任意组合对所
述动物进行接种。
由上述方法感染的本发明所述动物在接种后第3-5天出现发热，
第5天后RT-PCR检测病毒基因阳性，可持续到20天，期间病毒分
离阳性。
SARS感染人的途径为接触性感染和气溶胶方式感染，主要以高
热和肺部感染症状为主。本实验方法首先通过呼吸道感染，包括滴鼻，
气管内注入病毒培养液，也通过静脉注射感染，发现通过静脉注射感
染病毒量较少也能成功感染两种猴，同时以同样方法感染绒猴，未获
成功。表明非人灵长类对SARS相关冠状病毒敏感性不同。
本发明的又一方面，涉及SARS相关冠状病毒中国恒河猴及食蟹
猴感染模型用于SARS相关冠状病毒体内感染过程、发病机理、机体
抵抗作用研究的用途。
SARS疾病目前留有许多问题未能解决，包括感染的靶器官、靶
组织和靶细胞，对免疫系统的攻击，免疫系统细胞的反应等，在人体
内无法取材，而在模型猴中可开展时间动力学任何指标的取材、示踪
以及相关条件病原协同致病的研究中的用途。
本发明的又一方面，涉及SARS相关冠状病毒中国恒河猴及食蟹
猴感染模型用于抗SARS相关冠状病毒药物筛选和疫苗评价中的用
途。
恒河猴与食蟹猴感染SARS相关冠状病毒后，均能检测到病毒学
和免疫学指标，如：在一定时间内产生抗SARS相关冠状病毒IgM和
IgG抗体，体液和组织内成功分离病毒，感染后20天内RT-PCR检测
病毒阳性，这些病毒学及免疫学指标，对SARS相关冠状病毒药物筛
选、疫苗评价等应用方面有着不可替代作用。具体地，所述动物模型
能够用于如任何抗SARS病毒药物，包括中药的效果评价中。如果待
测药物具有抗SARS相关冠状病毒的作用，则所述药物的效果能通过
猴体内改变以上指标而评价药效以及毒副作用。
在我国现有实验动物中没有其他动物比实验用猴更接近人类，因
而，对疫苗的评价，这种模型具有无可替代的优越性。
实施例
实施例1SARS病毒毒株的制备
SARS毒种由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供，其
分离自SARS病人，在Vero-E6细胞上培养传代，经RT-PCR和电镜
形态观察确定为SARS冠状病毒，所述病毒已经根据国际承认用于专
利程序的微生物保藏布达佩斯条约于2003年6月26日保藏在国际保
藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，
并给予了保藏号为0962，该国际保藏单位的地址是中国北京市海淀区
中关村北一条13号。病毒TCID50为106pfu/ml。
实施例2动物模型的建立
1.病毒接种
选择13月龄雌性和雄性中国恒河猴各一只，编号为#900和#883，
接种前按实验用猴国家标准微生物SPF级进行复检，并检查SARS病
毒抗体。经鼻腔接种实施例1所获得的SARS病毒，病毒接种量为：
#900猴106TCID50(1ml体积)，#883猴105TCID50(1ml体积)。
所有动物实验均按《实验动物所实验动物使用及实验规程》在SARS
专用P3动物实验室中进行。
2.接种后动物相关临床症状表现
两只恒河猴在如前述剂量的病毒接种的第2～3天时，有一过性的
体温升高，39℃左右，随后恢复到38℃左右。白细胞亦未见异常改变。
无咳嗽、流涕、呕吐、皮疹、腹泻、气促、呼吸困难、明显食欲不振
等临床表现。
3.接种后动物样本病毒监测
在SARS冠状病毒接种恒河猴1天后，每天收集咽拭子、鼻拭子和
粪便标本，接种Vero细胞，进行病毒分离，每日观察细胞病变，持续
观察10天后盲传，具体方法参见[黄祯祥，田鹏，李玉英。病毒的组织
培养技术。见：黄祯祥主编。医学病毒学基础及实验技术。北京：科学
出版社，1990，130-141]。结果表明：持续观察10天后未见细胞病
理改变(CPE)出现，盲传2代后，仍未见CPE，盲传3代后，出现细
胞病变。
4.动物模型中SARS冠状病毒RNA的检测
在SARS冠状病毒接种恒河猴1天后，每天收集咽拭子、鼻拭子和
粪便标本，用QIAamp Viral RNA Mini Kit(德国Qiagen公司)，在
P3实验室内提取病毒RNA，用对应于SARS冠状病毒1b区的引物进
行套式RT-PCR检测。引物序列为：
外侧引物1#：5’-GCTGCATTGGTTTGTTATATCGTTATGC-3’
(SEQ ID NO：1)，
2#：5’ATACAGAATACATAGATTGCTGTTATCC3’(SEQ ID
NO：2)；
内侧引物3#：5’-TCACTTGCTTCCGTTGAGGTAGCCAG
CGTGGTGGTTCATACAA-3’(SEQ ID NO：3)，
4#：
5’-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCTCCCGGCAGAAAGCTGTAA
G CT-3’(SEQ ID NO：4)。
使用One Step RT-PCR试剂盒(TAKALA公司产品)进行第一
轮RT-PCR反应，具体反应条件参见文献[陶生策，杨仁全，李泽等。
SARS冠状病毒基因芯片的制作与初步临床样本验证。清华大学学报
(自然科学版)，2003，43：715-720]，目的PCR产物长度为797bp。
两轮PCR反应结束后取5μl产物行2％琼脂糖凝胶电泳，结果参见附
图1。
电泳结果显示：针对提取自恒河猴咽拭子、鼻拭子和粪便标本中
的SARS病毒冠状病毒RNA，以细胞培养冠状病毒为阳性对照，以正
常恒河猴咽拭子为阴性对照，进行上述套式RT-PCR检测，发现在病
毒接种第5天可从咽拭子中检测到大小为797bp的目的条带，说明这
些标本中存在冠状病毒。
上述结果证实：本发明采用SARS冠状病毒鼻腔接种能有效感染
恒河猴，所述病毒在该动物模型中可能有复制和排毒。
5.动物模型的病理学检测
在动物接受病毒接种的第7天，用BADD组织活检枪取肺组织，
10％福尔马林固定，石蜡包埋，常规病理组织切片处理后，H-E染色、
镜检。
两只恒河猴的肺脏活检组织病理学观察结果显示，肺组织均存在
不同程度的肺泡间隔增宽、上皮增生、毛细血管扩张充血和淋巴细胞
浸润，并且可见散在分布的巨噬细胞等间质性肺炎表现(参见图2A，
图2B为正常对照肺组织)。由此证实，采用本发明方法构建的动物模
型，能够有效模拟SARS病毒在灵长类动物中的感染过程。
6.动物模型中SARS病毒相关抗体的血清学检测
在SARS冠状病毒接种后第5、9、13、17和20天，经静脉采血
1ml分离血清，-80℃下保存备用。血清SARS冠状病毒特异性抗体
(IgG、IgM)检测采用“SARS冠状病毒抗体诊断试剂盒(酶联免疫
法)IgG、IgM”(北京华大吉比爱生物技术有限公司)。具体操作按
说明书进行。
结果显示：病毒接种第5天，#900猴和#883猴抗SARS冠状病
毒IgM阳性；病毒接种第17、20、24、28、32天，#900猴和#883
猴血清抗SARS冠状病毒IgG抗体阳性。
讨论
本发明人率先用从我国SARS病人标本中分离的SARS冠状病毒
实验接种中国恒河猴，病毒攻击5天后，套式RT-PCR可从猴咽拭子
中扩增出SARS冠状病毒基因，肺组织活检病理学观察也见到肺间质
性炎变，并且抗SARS病毒抗体阳转，由此，成功的建立了一个SARS
冠状病毒感染的恒河猴模型，在所得动物模型中能够有效实现病毒的
体内复制。
同时所述恒河猴模型也出现了SARS感染样病理改变，虽然并未
出现持续高热、咳嗽等，但恒河猴的白细胞计数无升高，此点表现与
病人相似。
从实验结果看，本发明所获得的恒河猴模型在感染SARS冠状病
毒后能够出现SARS感染样病理学改变和排毒现象，其可用于SARS
感染的发病机理研究、抗SARS病毒的药物筛选、疫苗评价。