一种植物乳杆菌及其应用 【发明领域】
本发明涉及一种乳杆菌属的新菌株及其应用，更准确地说，本发明描述了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的一个新菌株LP-Onlly、16S rRNA基因GeneBank(NCBI)序列登录号为AY590777序列，及其调节肠菌群功能、增强肠粘膜屏障功能和对肠道致病菌、食品腐败菌的抑菌作用。本发明还涉及植物乳杆菌LP-Onlly与常规载体组合，可用于预防和/或治疗肠道菌群失调和肠道细菌易位感染。
背景技术
人的胃肠道栖息着各种细菌，根据对人体的影响可分为有益菌、有害菌和中性菌。人体内有益菌占优势，就会表现出健康状态，其中双歧杆菌和乳杆菌是最具代表性的有益菌。
乳酸菌是法国人巴斯德在1857年首次发现的。乳酸菌在食品和医药上的应用非常广泛，乳酸菌及其制品对人体的作用主要有：(1)调节宿主肠道菌群，提高机体免疫力，增强抗病能力；(2)代谢产生的乳酸，可提高胃内食物的消化，促进胃内容物的排出，增进消化，产生的酵素可促进食物营养的分解，促进营养吸收；(3)乳酸菌分解乳糖，产生乳酸，可有效抑制肠道腐败菌的繁殖和有害物质的产生，促进肠蠕动，防止便秘；(4)乳酸菌分解蛋白质，使其变成小分子的肽及氨基酸等，易于消化吸收等。
自上世纪80年代中期Detich等(Ann Surg，1987；205(6)：681～692)提出“细菌易位”的概念以来，肠粘膜屏障破坏引起细菌或内毒素易位已成共识，肠粘膜屏障破坏产生脓毒血症、休克、多脏器功能衰竭，显著地增加了重症患者的死亡率。所以，很多学者提出对感染的治疗应针对它的“源头”——肠道，而不是靶器官。为此，采用肠道益生菌改善肠道微生态，从而达到增强肠上皮细胞紧密连接和肠屏障功能逐渐受到关注。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)为人体原籍菌，具有体内生物活性作用，千百年来，植物乳杆菌一直被用于人类食品，是传统乳酸发酵的重要菌株，也是酸菜等食品能长期贮存的基础，人类在食用大量植物乳杆菌发酵食品的同时，人体肠道也进化适应定植了大量的植物乳杆菌。表型分析结合遗传特征研究表明，健康人消化道共生的优势菌主要为植物乳杆菌(L.plantarum)，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)和干酪乳杆菌(L.paracasei)，其检测率分别占所有分离乳杆菌的52％、26％和17％(The normal Lactobacillus flora of healthy human rectal and oralmucosa，Journal of Applied Microbiology，1998，85：88～94)。除酸菜等植物乳酸发酵食品中含有大量植物乳杆菌外，传统的植物乳杆菌活菌产品为坦桑尼亚的饮料“togwa”，以树薯或小麦为原料，植物乳杆菌为发酵剂制作植物乳杆菌活菌产品，常常用于防治肠道疾病、改善肠粘膜屏障功能(Probiotics in foods not containingmilk or milk constituents，with special reference to Lactobacillus plantarum 299v，American Journal of Clinical Nutrition，2001，73(suppl)：380S～5S)。
【发明内容】
本发明地目的是提供一种植物乳杆菌LP-Onlly，它具有调节肠菌群功能、增强肠粘膜屏障功能和对肠道致病菌、食品腐败菌的抑菌作用。本发明还涉及植物乳杆菌LP-Onlly与常规载体组合，可用于预防和/或治疗肠道菌群失调预防和/或治疗肠道细菌易位感染。它具有调节肠道菌群和增强肠粘膜屏障功能。
实现上述发明目的的解决方案是：
一种植物乳杆菌LP-Onlly，该植物乳杆菌已于2004年12月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC(地址：中国北京市海淀区中关村一条13号，中国科学院微生物研究所)保藏，并收到保藏登记号CGMCCNO 1258。其分类命名为：植物乳杆菌，拉丁名：Lactobacillus plantarum。
植物乳杆菌LP-Onlly，其16S rRNA基因GeneBank(NCBI)序列登录号为AY590777。
植物乳杆菌LP-Onlly具有调节肠道菌群功能。
植物乳杆菌LP-Onlly具有增强肠粘膜屏障功能。
植物乳杆菌LP-Onlly具有抑制肠道致病菌和食品腐败微生物的功能。
植物乳杆菌LP-Onlly抑制的肠道致病菌主要指肠杆菌、李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、痢疾杆菌、产气荚膜梭菌。
植物乳杆菌LP-Onlly抑制的食品腐败微生物主要指枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌。
植物乳杆菌LP-Onlly与常规载体组合，可用于预防和/或治疗肠道菌群失调。
植物乳杆菌LP-Onlly与常规载体组合，可用于预防和/或治疗肠道细菌易位感染。
【附图说明】
图1：腹腔感染大鼠肠菌群DNA指纹图谱。
图中：M为Marker，Lane 1～8为植物乳杆菌组，Lane 9～10为正常大鼠，Lane11～17为PN组。
图2：PN组小肠上皮occludin蛋白表达(×400)。
图3：益生菌组小肠上皮occludin蛋白表达(×400)。
图4：PN组大肠上皮occludin蛋白表达(×400)。
图5：益生菌组大肠上皮occludin蛋白表达(×400)。
图6：PN组小肠上皮透视电镜(2×104)。
图7：益生菌组大肠上皮透视电镜(2×104)。
图8：PN组小肠上皮透视电镜(2×104)。
图9：益生菌组大肠上皮透视电镜(2×104)。
【具体实施方式】
本发明的植物乳杆菌LP-Onlly直接自健康婴儿粪便中分离获得，其形态为杆状，革兰氏染色阳性，不形成芽孢，产生乳酸，兼性厌氧。它能利用L-阿拉伯糖、山梨醇、蜜二糖、D-松二糖、D-阿糖醇、葡萄糖酸钠、α-甲基-D-甘露糖甙，不能利用山梨糖、鼠李糖、D-塔格糖、α-甲基-D-葡萄糖甙。
其发酵过程：于MRS液体培养基中37℃培养72h。
该植物乳杆菌LP-Onlly已于2004年12月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市海淀区中关村一条13号，中国科学院微生物研究所)保藏，并收到保藏登记号CGMCC NO 1258。
本发明涉及的植物乳杆菌，其16S RNA基因序列于GeneBank(NCBI)备案，其登录号为AY590777。
下面结合实施例和图进一步说明本发明：
实施例1：菌株镜检
无菌条件下用接种环挑植物乳杆菌LP-Onlly，涂于载玻片上，制片并革兰氏染色，在显微镜下观察菌体形态。
实施例2：MRS平板纯化分离
无菌条件下用接种环挑植物乳杆菌LP-Onlly，在MRS平板上划线，平板置于培养箱中37℃培养72h，挑选单菌落进行镜检，达到菌株纯种分离。
实施例3：菌株发酵
用接种环将植物乳杆菌LP-Onlly从斜面上挑取二环至装有50ml MRS液体培养基中，37℃培养24h，再以5％接种量接入50ml MRS液体培养基中，37℃培养72h，即得植物乳杆菌LP-Onlly发酵液。
实施例4：植物乳杆菌LP-Onlly抑菌性能
植物乳杆菌LP-Onlly于MRS液体培养基37℃好氧培养24h，将该菌液点于MRS固体平板上，每板平行三个点，于37℃好氧培养24h。将各种200μl培养过夜的指示菌液(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、伤寒沙门氏菌、志贺氏痢疾杆菌、单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌及青春双歧杆菌)分别与7ml软琼脂混匀，倒在点有植物乳杆菌LP-Onlly的MRS平板上(软琼脂保持在45～50℃)，好氧或厌氧(根据指示菌)37℃培养24h(好氧)或48h(厌氧)，拍照并测量指示菌斑点周围的抑菌圈大小(表1)。
表1结果表明，植物乳杆菌LP-Onlly对大部分肠道有害菌均有抑制作用，其中对枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌和伤寒沙门氏菌的抑制作用最强，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、志贺氏痢疾杆菌、产气荚膜梭菌的抑制作用略弱，而对益生菌如嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌及青春双歧杆菌均无抑制作用。
表1植物乳杆菌LP-Onlly抑菌性能
抑菌圈直径(mm)
指示菌
1 2 3 平均
大肠杆菌 10.0 10.6 12.6 11.1
金黄色葡萄球菌 12.0 12.2 10.3 11.5
嗜酸乳杆菌 - - - -
枯草芽孢杆菌 20.6 30.4 29.4 26.8
植物乳杆菌 - - - -
粪肠球菌 12.9 13.7 10.2 12.3
伤寒沙门氏菌 20.7 19.1 19.8 19.9
志贺氏痢疾杆菌 11.4 11.5 13.9 12.3
单核细胞增生李斯特菌 18.7 20.8 25.4 21.6
蜡样芽孢杆菌 26.3 21.5 19.9 22.6
产气荚膜梭菌 10.7 6.7 9.6 9.0
青春双歧杆菌 - - - -
注：“-”表示植物乳杆菌LP-Onlly对指示菌没有抑制作用。
实施例5：植物乳杆菌LP-Onlly调节肠道菌群功能动物实验
1.植物乳杆菌LP-Onlly调节小鼠肠道菌群功能动物实验
1.1植物乳杆菌LP-Onlly调节正常小鼠肠道菌群功能动物实验
40只正常小鼠，分成两组，一组为植物乳杆菌LP-Onlly组(15只)，每天灌喂植物乳杆菌LP-Onlly发酵液1ml(＞1×108cfu/ml)，连续6d，另一组为对照组(25只)，检测小鼠肠道微生物变化情况，数据用x±s表示，应用统计软件SPSS 10.0进行t检验及相关分析。(表2)
表2结果表明，与对照组相比，灌喂植物乳杆菌LP-Onlly发酵液可使小鼠肠道的双歧杆菌明显增加，且有显著性差异(P＜0.05)。这表明植物乳杆菌LP-Onlly具有调节肠道菌群功能方面的作用。
表2 植物乳杆菌对正常小鼠肠道菌群的调节作用(x±s，lg10n/ml)
肠道微生物 对照组 植物乳杆菌组
(n＝25) (n＝15)
肠球菌 6.376±0.409 6.215±0.401
大肠杆菌 7.704±0.303 7.683±0.282
乳杆菌 9.280±0.354 9.138±0.500
双歧杆菌 8.698±0.234 8.900±0.228*
*与正常对照组比较，植物乳杆菌组P＜0.05。
1.2 植物乳杆菌LP-Onlly调节菌群失调小鼠的肠道菌群功能动物实验
小鼠59只，分成以下三组，进行植物乳杆菌LP-Onlly对肠道菌群失调小鼠的肠道菌群功能调节作用研究。
对照组25只小鼠；大黄组17只小鼠，每天灌胃大黄液1ml，连续给药8d，造成肠道菌群失调，第9d处死；植物乳杆菌组17只小鼠，每天灌胃大黄液1ml，连续8d，但在给大黄液的第3d起时，另外再多灌胃植物乳杆菌LP-Onlly发酵液1ml(＞1×108cfu/ml)，连续6d，第9d处死；分别取各组小鼠的粪便检测小鼠肠道微生物变化情况，数据用x±s表示，应用统计软件SPSS 10.0进行t检验及相关分析。(表3)
表3植物乳杆菌对小鼠肠道菌群失调的肠道菌群调节作用(x±s，lg10n/ml)
肠道微生物 对照组 大黄组 植物乳杆菌组
(n＝25) (n＝17) (n＝17)
肠球菌 6.376±0.409 6.087±0.406* 6.334±0.396*
大肠杆菌 7.704±0.303 8.194±0.387*** 7.888±0.328*
乳杆菌 9.280±0.354 9.010±0.346** 9.208±0.302*
双歧杆菌 8.698±0.234 8.362±0.560* 8.587±0.329*
与对照组比较，*为P＜0.05，**为P＜0.01，***为P＜0.001。
由表3可见，大黄组与对照组比较，四种肠道主要菌群数量均有明显变化，表现为肠球菌和双歧杆菌数量明显下降(P＜0.05)，乳杆菌数显著减少(P＜0.01)，而大肠杆菌数极显著增加(P＜0.001)，这表明小鼠在被灌胃大黄后，其肠道菌群失调。而植物乳杆菌组与对照相比，在服大黄液的第3d后再加服植物乳杆菌LP-Onlly，虽然大黄仍服8d，但肠道中的四种细菌数量均能保持在正常范围，与大黄组比较均有显著性差异。这表明在肠道菌群失调后，植物乳杆菌LP-Onlly能调节菌群失调，维持肠道正常菌群平衡。
2.植物乳杆菌LP-Onlly对腹腔感染大鼠肠道菌群的调节作用
15只大鼠经盲肠结扎穿孔法及颈静脉空肠置管制成腹腔感染模型后(表4)，分别给予肠外营养(PN组)和PN+植物乳杆菌LP-Onlly发酵液(植物乳杆菌组)持续5d，第6d处死，取盲肠内粪便进行肠道菌群计数(表5)，并对其DNA指纹图谱分析，以探讨植物乳杆菌LP-Onlly对腹腔感染大鼠肠道菌群的调节作用。
表4结果表明，植物乳杆菌LP-Onlly组腹腔感染大鼠死亡率明显低于PN组。这表明植物乳杆菌LP-Onlly发酵液通过调节腹腔感染大鼠肠道微生态，从而降低其死亡率。
表4 PN组与植物乳杆菌组腹腔感染大鼠死亡率比较
组别 实验数(只) 死亡数(只) 死亡率(％)
PN组 33 26 78.7
植物乳杆菌组 16 8 50
表5肠道菌群计数分析(x±s，lg10n/ml)
肠道细菌 PN组 植物乳杆菌组
(n＝7) (n＝8)
肠杆菌 7.061±0.191 7.231±0.171
双歧杆菌 8.006±0.272 8.313±0.303*
乳杆菌 5.416±0.304 5.713±0.178*
产气荚膜杆菌 5.702±0.373 5.056±0.355*
注：*与PN组比较，P＜0.05
表5中可明显发现，植物乳杆菌组大鼠肠道乳杆菌和双歧杆菌数量较PN组的为多，而肠道内的潜在致病菌产气荚膜梭菌数量较PN组的大鼠少，且都有显著性差异。这表明了本发明中的植物乳杆菌LP-Onlly具有调节肠道菌群功能。
以ITS通用引物对PS2(5’-TG(C/T)ACA CACCGC CCG T-3’)、PL2(5’-GGGT(G/C/T)CCC CAT TC(A/G)G-3’)为引物，对上述大鼠粪便DNA进行PCR扩增，并作琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)。
从图1中可明显看出，PN组Lane11～17中图谱条带明显少于正常组Lane 9-10和植物乳杆菌组Lane 1～8，且Lane11、14、15有一非常明亮的条带(如图中标注)。这表明，PN组大鼠肠菌群失调，肠道中正常菌群种类减少、非肠道菌群增多，而植物乳杆菌组条带明显多于PN组Lane，与正常组Lane 9～10图谱条带较为接近。图中结果还显示，植物乳杆菌组大鼠菌群条带和正常大鼠具有较高的一致性，而PN组则有明显差异。此结果提示，植物乳杆菌LP-Onlly能纠正腹腔感染大鼠PN时的肠道菌群紊乱，具有调节肠道菌群功能作用。
3.结论
上述实验结果表明，本发明中的植物乳杆菌LP-Onlly具有调节肠道菌群功能的作用，与常规载体组合，可预防和/或治疗肠道菌群失调。
实施例6：植物乳杆菌LP-Onlly增强肠屏障功能动物实验
动物模型实验在益生菌功能性评价实验中应用越来越广泛。
本发明采用雄性SD大鼠，分别给予肠外营养(PN组)和PN+植物乳杆菌LP-Onlly发酵液(益生菌组)持续5天，第6天处死，取腔静脉血、肺、肝及肠系膜淋巴组织匀浆作细菌培养测细菌易位率；取末段回肠和结肠，电镜观察肠上皮细胞紧密连接超微结构，免疫组化法测定其跨膜结合蛋白(Occludin)表达，从而判断该菌株是否具有增强肠粘膜屏障功能。
1大鼠腹腔感染模型的建立
雄性SD大鼠，体重250～320g(复旦大学医学院动物中心提供)。2％盐酸氯氨酮注射液(30mg/g)作腹腔内注射麻醉后，将大鼠固定于仰卧位，颈部和腹部去毛，用0.1％新洁尔灭酊消毒，沿腹部正中作4cm切口打开腹腔，采用盲肠结扎穿孔法制成模型，即将盲肠远端三分之一处结扎，并于顶端以12号针头贯穿，置2mm宽皮片一根，并予固定以防滑脱。在距盲肠30-40cm的空肠作荷包，置入外径为1.2mm的软硅胶管作空肠造瘘管，将硅胶管由颈背部皮下引出，分层关腹。参照Steiger等方法经颈外静脉置入外径为1.2mm的软硅胶管，将硅胶管经腹部皮下隧道从颈背部皮下引出，穿过螺旋式保护弹簧与旋转装置相连。
2.动物分组及PN液配置
将15只造模成功的动物分为两组：(1)PN组(n＝7)，第1～5d给予PN支持，PN液以微量输液泵维持24h，均匀输入，平均每只大鼠输液数量约80ml/d；(2)益生菌组(n＝8)，第1～5d给予PN液支持结合植物乳杆菌LP-Onlly发酵液(活菌含量为108cfu/ml)，其中PN液输液量同PN组，益生菌发酵液经空肠造瘘管每天分三次缓慢注入共约10ml/d。上述两组大鼠于造模成功后第6d处死并取样检测或观察。
PN液配方(表6)，两组均等氮、热量，每天提供非氮热量348kJ(约240kcal/kg)，供氮504mg。
表6 PN液配方(每100ml溶液的含量)
配方 剂量
50％Glucose(ml) 33
8.5％Novamin(ml) 45
20％Intralipid(ml) 17
水乐维他(ml) 1
安达美注射液(ml) 1
10％kCl(ml) 1
10％NaCl(ml) 1
RI(u) 4
肝素(u) 40
非蛋白热卡(KJ) 435
总热量(Kcal) 101
总氮量(mg) 630
3.观察指标
(1)粘膜occludin蛋白免疫组化测定：
取末端回肠和结肠组织冰冻切片，采用间接免疫荧光法检测小肠和结肠粘膜occludin蛋白含量。一抗为山羊抗大鼠occludin抗体(Santa Crus)，1∶300稀释；二抗采用ABC试剂盒抗山羊IgG(Santa Crus)。使用HPIAS1000高清晰度彩色图文病理报告分析系统，在相同放大倍数(×400)下，于各时间组切片中随机选5个视野，采用光密度法测定每视野相应细胞occludin密度，并计算阳性显色面积占测量窗内的百分比。
(2)肠粘膜形态电镜检测
取距回盲部5cm处回肠及结肠段各约0.5cm，纵行剖开，清洗，切成小块(1×1mm2)戊二醛固定，超薄制片，透射电镜观察上皮细胞紧密连接。
(3)腔静脉血、肠系膜淋巴组织、肝脏和肺组织细菌含量测定
取腔静脉血1ml、肠系膜淋巴组织(5g)、肝脏中叶(5g)和右肺下叶组织(5g)在匀浆机中匀浆后分别倒入心脑浸出液管中，35℃培养18～24h，然后置于伊红美蓝平板，35℃培养18～24h后计数。
(4)统计学处理
数据用x±s表示，应用统计软件spss10.0进行x2检验、方差分析、t检验及相关分析，P＜0.05为显著性差异。
4.结果分析
(1)肠上皮跨膜结合蛋白(occludin)含量
肠上皮屏障功能与紧密连接(Tight Junctions，TJ)复合体密切相关，体外研究表明肠上皮细胞TJ的开放引起细菌易位几率的增加，调节TJ的物质包括免疫调节物和TJ蛋白等。其中两种跨膜结合蛋白occludin和claudin是最主要的TJ特异整合膜蛋白。在肠道菌群紊乱情况下，肠源性病原菌可以和肠上皮黏附，通过改变细胞的膜骨架系统而影响跨膜结合蛋白。肠上皮的跨膜结合蛋白occludin水平的检测不仅可以反映肠道菌群紊乱情况下致病菌对肠道屏障的破坏情况，也可以反映肠道菌群的恢复情况。
从图2～5可明显发现，益生菌组小肠和大肠的上皮细胞表面、细胞间及胞质均有较多occludin蛋白表达，而PN组的occludin蛋白表达很低。与PN组动物相比，益生菌组小肠、大肠的occludin蛋白表达阳性面积占测量窗内百分比都具有显著性差异(表7)。这表明，较PN组而言，植物乳杆菌LP-Onlly可以显著提高肠上皮跨膜结合蛋白含量，从而增强肠粘膜屏障功能。
表7 PN组和益生菌组的小肠、大肠上皮细胞occludin蛋白含量的比较(A，x±s)
组别 n 小肠上皮细胞occludin 大肠上皮细胞occludin
蛋白含量(％) 蛋白含量(％)
PN组 7 1.207±0.587 1.254±0.203
益生菌组 8 1.981±0.513* 2.276±0.526**
与PN组比较，*为P＜0.05，**为P＜0.01。
(2)电镜检查
从图6～9中可看出，益生菌组小肠上皮有轻微微绒毛脱失，线粒体内质网空泡变性，但紧密连接较明显；大肠肠上皮细胞间紧密连接正常。而PN组小肠上皮微绒毛脱失，线粒体内质网空泡变性，紧密连接不清；大肠肠上皮细胞间紧密连接，但宽而短。这表明植物乳杆菌LP-Onlly可以明显地促进肠上皮紧密连接，从而增强肠粘膜屏障功能。
(3)腔静脉血、肠系膜淋巴组织、肝脏和肺组织细菌易位
PN组大鼠肠系膜腔静脉血、肠系膜淋巴组织、肝脏和肺组织细菌易位率为60.7％，而益生菌组细菌易位率仅为34.3％，较PN组显著减少(表8)。这表明植物乳杆菌LP-Onlly可以明显降低细菌易位率，从而增强肠粘膜屏障功能。
表8腔静脉血及腹腔脏器细菌易位数
腔静脉血及腹腔脏器细菌易位数
组别 n 腔静脉血 肠系膜淋巴组织 肝脏 肺组织 易位率
(％)
PN组 7 4 6 4 3 60.7
益生菌组 8 2 4 3 2 34.3
5.结论
上述结果表明，本发明植物乳杆菌LP-Onlly可增加腹腔感染大鼠肠上皮跨膜结合蛋白含量，维持肠上皮紧密连接保持正常的肠粘膜形态，减少细菌易位，从而增强肠粘膜屏障功能。上述植物乳杆菌LP-Onlly与常规载体组合，可预防和/或治疗肠道细菌易位感染。