BT蛋白CRY30GA1、其编码基因及应用.pdf

本发明提供了一种新的Bt蛋白Cry30Ga1及其编码基因，所述蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的蛋白。本发明蛋白可以用于制备Bt杀虫剂，所述基因可以转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。

权利要求书
1、  一种Bt蛋白Cry30Ga1，其氨基酸序列是：
1)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或
2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的蛋白。

2、  编码权利要求1所述蛋白的基因。

3、  如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4、  含有权利要求2或3所述基因的表达载体。

5、  由权利要求4所述表达载体转化的宿主细胞。

6、  如权利要求5所述的宿主细胞，其为植物宿主细胞。

7、  含有权利要求所述蛋白的杀虫剂。

8、  权利要求2或3所述基因或权利要求4所述表达载体在制备转基因植物中的应用。

9、  权利要求2或3所述基因或权利要求4所述表达载体在提高植物抗虫性中的应用。

说明书Bt蛋白Cry30Ga1、其编码基因及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新的Bt蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素，据FAO统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济损失高达14％，病害损失达12％，草害损失达11％。损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半，英国的4倍多。另外，蚊媒病在预防医学中占有重要位置，其中登革热和黄热病等蚊媒病传播力强、流行面广、发病率高、危害性大。据WHO统计，全世界每年感染登革热人数多达8000万，我国的海南省在1980和1986年曾经暴发过两次登革热，发病分别达到437469例和113589例。登革热和黄热病主要由埃及伊蚊传播。
为了减少这些损失，多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididal crystalproteins，简称ICPs)，ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。
自1981年Schnepf从菌株HD-1Dipel中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来(Adang M.J et al，Characterized full-length andtruncated plasmid clones of the crystal protein of Bacillus thuringiensissubsp.kurstaki HD-73 and their toxicity to Manduca sexta，Gene，1985，36(3)：289～300.)，人们已经分离克隆了390多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N，Zeigler D R，Feitelson J，et al.Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidalcrystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev，1998，62：807-813；http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。一般而言，Cry1，Cry2和Cry9等毒蛋白对鳞翅目害虫有效；其中研究的最多的是Cry1和Cry9类蛋白，它们编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kD，许多基因目前已被广泛应用于植物的鳞翅目害虫的防治(Kozie，M.G.，Beland，G.L，Bowman，C.，et al.Field performance of elite transgenicmaize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillusthuringiensis.Bio/Technology，1993，11：194-200；Perlak，F.J.，Deaton，R.W.，Armstrong，T.A.，et al.Insect resistant cotton plants.bio/technology，1990；8：939-943；Van Frankenhuyzen，K.，Gringorten，L.，and Gauhier，D.1997.Cry9Cal toxin，a Bacillus thuringiensis insecticidal crystalprotein with high activity against the spruce bud worm(Choristoneurafnniferana).Appl.Environ，Microbviol.63：4132-4134；王飞，2001，苏云金芽孢杆菌特异菌株生物学特性及cry9新基因的研究，硕士论文，南开大学)。苏云金芽胞杆菌以色列亚种(B.thuringiensis subsp.israelensis，简称Bti)产生的毒素蛋白对蚊虫具有很好杀虫活性，被广泛运用于蚊虫的防治(Goldberg L J，and Margalit J，1977.A bacterialspore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles sergentii，Uranotaenia unguiculata，Culex univitattus，Aedes aegypti，and Culexpipiens.Mosqito News，37：355-358；)。同时，Cyt蛋白具有溶细胞性，对某些Cry蛋白具有增效作用及延缓昆虫的抗性(Wu，D.，Johnson，J.J.，and Federici，B.A.1994.Synergism of mosquitocidal toxicity betweenCytA and CryIVD Proteins using inclusion sproduced from clonedgenes of Bacillus thuringiensis.Mol.Microbiol.13：965-972；Wirth，M.C.，Georghiou，G.P，and Federeci，B.A.1997.CytA enables CryIVendotoxins of Bacillus thuringiensis to overcome high levels of CryIVresistance in the mosquito，Culex quinquefasciatus.Proc.Natl.Acad.Sci.94：10536-10540)
自本世纪初发现苏云金芽胞杆菌至今已有100多年的历史，在农作物和园艺植物害虫、森林害虫以及卫生害虫的防治方面得到广泛的应用，也起到良好的效果。但是，由于大规模和反复使用苏云金芽胞杆菌，许多昆虫种群已相继在不同程度上对杀虫晶体蛋白产生了抗性。以Bt杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有50多年的历史，最初一直没有检测到昆虫对Bt的抗性，但是，上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实(M cGaughey，W.H.1985.Insect resistance to the biological insecticide Bacillus thuringiensis.Science.229：193-195)，原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年，McGaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodia interpunctella)在Dipel(Bt subsp.kurstaik HD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性(Tabashnik，B.E.，Finson，N.，Groeters，F.R.，etal.1994.Reversal of resistance to Bacillus thuringiensisin Plutella xylostella.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91：4120-4124)，上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成(冯夏.1996.广东小菜蛾对苏云金杆菌的抗性研究。昆虫学报，39(3)：238-244；Hofte，H.，Van Rie，J.，Jansens，S.，Van Houtven，A.，Vanderbruggen，H.，and Vaeck，M.，1988.Monoclonal antibody analysis and insecticidal spectrum ofthree types of lepidopteran-specific insecticidal crystal proteins ofBacillus thuringiensis.Appl.Environ.Microbiol.54：2010-2017)。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性(Schnepf，E.，Crickmore，N.，Van Pie，J.，et al.1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal Crystalproteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.65(3)：775-806)。另外，有研究证明Bti在大田的使用中尚未发现抗性问题(Regis L，et al.，2000.The useof bacterial larvicides in mosquito and black fly control programsinBrazil.Mem.Instituto Oswaldo Cruz，95：207-210.)，但是蚊虫对其抗性问题不断在实验室中得到证实，这种情况也可能会在大田中出现(Georghiou G P，and Wirth M C，1997.Influence of exposure to singleversus multiple toxins of Bacillus thuringiensis subsp.israelensis ondevelopment of resistance in the mosquito Culex quinquefasciatus(Diptera：Culicidae).Applied and Environmental Microbiology，63：1095-1101.)。
为避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力基因资源是解决这个问题的有效途径，这对我国的生物防治有着十分重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的在于针对上述不足提供一种新的BT毒力蛋白资源。
本发明的第二个目的在于提供编码所述蛋白的基因。
本发明的目的还在于提供上述蛋白及基因的应用。
本发明从四川省成都平原土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)新菌株HS18-1。通过对HS18-1的毒力测试表明，HS18-1对鳞翅目害虫、双翅目害虫等等，均具有极高的毒力。
根据cry30类基因保守序列设计1对特异引物，扩增其基因组DNA，结果表明该菌株存在cry30类基因，进一步设计其全长基因引物，克隆得到cry30Ba基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，序列SEQ ID NO1的全长为1995bp，分析表明，GC含量为32.53％，编码664个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。在softberry网站采用bacterial sigma 7.0promoter程序对全序列进行预测表明，在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列，将其命名为cry30Gal。本发明进一步分析了Cry30Gal蛋白的氨基酸组成(见表1)。
表1 Cry30Gal蛋白的氨基酸组成
 氨基酸百分比％氨基酸百分比％Ala(A)：6.78Met(M)：2.11Cys(C)：1.05Asn(N)：9.34Asp(D)：3.16Pro(P)：5.72Glu(E)：4.82Gln(Q)：4.37Phe(F)：3.31Arg(R)：3.92Gly(G)：6.17Ser(S)：6.93His(H)：0.90Thr(T)：7.83Ile(I)：10.09Val(V)：3.01Lys(K)：4.22Trp(W)：1.20Leu(L)：9.19Tyr(Y)：5.57
应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第390位的Tyr替换为Pro。因此，本发明Bt蛋白还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有Cry30Gal蛋白同等活性的由Cry30Gal衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。
此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
本发明的基因和蛋白质可以从菌株HS18-1中克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成的方法得到。
可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进而可以通过诸如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主，得到转cry30Gal基因的转化体，例如农作物或者果树等植物，使其具备抗虫活性。
此外，还可以通过发酵本发明菌株HS18-1，得到含有Cry30Gal蛋白的发酵液，将其制备成杀虫剂，用于农作物害虫的防治。本领域技术人员还可以将上述基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产本发明Bt蛋白。
本领域技术人员还可以根据本发明公开的基因，将其转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性。从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。
附图说明
图1显示的是cry30Gal全长基因克隆，其中M，marker；1，cry30Gal基因。
图2显示的是重组质粒pET-30Ga的酶切鉴定图谱，其中1重组质粒pET-30Ga；2，用Nde I+EcoR I双酶切pET-30a；3，Nde I+EcoR I双酶切pET-30Ga；4，插入的DNA；M1、M2为Marker。
图3显示的是在E.coli BL21(DE3)中表达Cry30Gal的SDS-PAGE检测，其中M为蛋白marker；1.阴性对照(E.coiiBL21(DE3)(pET-30a))；2.裂解上清；3.Cry30Gal包涵体。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 cry30Gal基因的克隆
本发明从四川省成都平原土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)新菌株，该菌株已于2008年10月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，保藏号为CGMCC No.2817。
本例通过如下方法克隆得到cry30Gal基因的全长序列。
采用基因组DNA纯化试剂盒(购自赛百盛公司)提取菌株HS18-1的总DNA。设计引物序列如下：
P1：5’ATGAATTTATATCAAAATGAAAATGA3’
P2：5’TTAGTTCATTTTACAAGCTTCTACAC3’
PCR反应体系：
10×buffer        2.5μl
MgCl2(25mM)       1.5μl
Taq酶             0.2μl
dNTPs(2.5mM)                 2μl
引物                         2μl
模板                         5μl
最终反应体积                 25μl
热循环反应：94℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃停止反应。扩增反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果。结果如图1所示，通过扩增得到了约为2000bp的序列，将该序列进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，与目的序列一致。
实施例2 cry30Gal基因的表达及杀虫活性测定
根据cry30Ga基因开放阅读框两端序列，设计并合成一对特异性引物cry30F：5′-GCGCATATG(NdeI)ATGAAGCCGTATCAAAGTG-3′；cry30R：5′-CGGAATTC(EcoR I)TTAGTTCATTTTACAAGCTTCTACAC-3′，分别在5’端引物Nde I和EcoR I酶切位点。以BtMC28质粒为模板进行扩增，扩增的产物采用Nde I和EcoR I进行双酶切，酶切产物与同样进行双酶切后的载体pET-30a(+)连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，提取其质粒酶切电泳验证了插入片断大小符合预期目的后(图2)，再转入受体菌E.coli.BL21(DE3)。将重组质粒命名为pET-30Ga，含重组质粒的重组子命名为E.coli.BL21(30Ga)。SDS-PAGE分析表明cry30Ga基因的表达产物在菌体超声破碎后的沉淀中(图3)，分子量约为76kDa左右，与预测的蛋白分子量相符。cry30Ga基因表达产物分别对甜菜夜蛾，棉铃虫及伊蚊的生测结果表明：表达产物对这三种虫都具有较好的杀虫活性。对甜菜夜蛾杀虫活性最高，LC50为19.82μg/mL；对伊蚊的LC50为21.27μg/mL；对棉铃虫杀虫活性最低，LC50为34.03μg/mL。蛋白对鳞翅目杀虫活性的的测定方法参见(Song FP，Zhang J，Gu AX，et al.，2003.Identification of crylI-type genes from Bacillusthuringiensis strains and characterization of a novel cry1I-type gene.Appl.Environ.Microbiol 69：5207-5211)，蛋白对双翅目杀虫活性的的测定方法参见(Ibarra JE，del Rincón MC，Sergio Ordúz，et al.，2003.Diversity of Bacillus thuringienisis Strains from Latin America withInsecticidal Activity against Different Mosquito Species.Appl EnvironMicrobiol 69：5269-5274)。
序列表
<110>四川农业大学
<120>Bt蛋白Cry30Gal、其编码基因及应用
<130>KHP09112220.6
<160>6
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1995
<212>DNA
<213>Bacillus thuringiensis HS18-1
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1995)
<400>1





<210>2
<211>664
<212>PRT
<213>Bacillus thuringiensis HS18-1
<400>2




<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3

<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4

<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5

<210>6
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6