融合蛋白TTB7H4IGV及其制备方法和用途.pdf

融合蛋白TT-B7-H4IgV及其制备方法和用途，所述的B7-H4IgV为B7-H4分子胞外区可变区IgV，TT为T辅助细胞表位肽或破伤风类毒素表位，在融合蛋白的N端还连接6个His残基，其连接方式为：6×His-TT-B7-H4IgV；该融合蛋白TT-B7-H4IgV应用于以B7-H4为靶点的抗肿瘤疫苗的制备。本发明选择B7-H4作为靶点，以TT作为抗原呈递，构建了融合蛋白TT-B7-H4IgV；该融合蛋白经Western blot鉴定、测序与预期相一致；用纯化的融合蛋白TT-hB7-H4IgV免疫昆明小鼠，经ELISA、流式细胞术测定抗血清的生物学活性，证明抗B7-H4抗血清与B7-H4有良好的结合活性，说明该融合蛋白TT-hB7-H4IgV能够诱导机体产生了抗B7-H4多克隆抗体。

权利要求书
1、  一种融合蛋白TT-B7-H4IgV，其特征在于，所述的B7-H4IgV为B7-H4分子胞外区可变区IgV，TT为T辅助细胞表位肽或破伤风类毒素表位，在融合蛋白的N端还连接6个His残基，其连接方式为：6×His-TT-B7-H4IgV；其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、  一种融合蛋白TT-B7-H4IgV的重组核苷酸序列，其特征在于，其连接方式为：6×His序列-BamHI酶切位点-TT表位序列-EcorI酶切位点-B7-H4IgV重组序列-SalI酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3、  如权利要求2所述的融合蛋白TT-B7-H4IgV的重组核苷酸序列，其特征在于：构建于重组质粒pQE-30-TT-hB7-H4IgV，TT-hB7-H4IgV重组核苷酸序列通过BamHI、SaIl多克隆位点连接于质粒pQE-30中。

4、  一种融合蛋白TT-B7-H4IgV的制备方法：其特征在于：
1)重组质粒pQE-30-TT-B7-H4IgV的构建
根据人B7-H4的cDNA基因序列，截取B7-H4胞外段IgV序列，上游引入BamHI酶切位点和T辅助细胞表位，T辅助细胞表位为破伤风类毒素表位TT830-843，其氨基酸序列为：Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu，下游引入SalI酶切位点，其重组序列如SEQ.ID.NO.2所示：
该重组序列中的4-12bp为linker序列，13-30bp为6个His编码序列，31-36bp为BamHI酶切位点，37-78bp为TT辅助表位肽编码基因序列，79-87bp为linker序列，88-93bp为EcorI酶切位点，94-326bp为B7-H4IgV区编码序列，327-333bp为SalI酶切位点；
通过BamHI和SalI多克隆位点将上述重组序列克隆入载体pBluescriptIISK-G；
将上述pBluescript II SK-G-TT-hB7-H4IgV载体转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA后，将其与质粒pQE-30分别用BamHI和SalI进行双酶切，酶切产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳分离，分别回收pBluescript II SK-G-TT-hB7-H4IgV获得的小片段333bp和pQE-30中的大片段，将回收后的小片段和大片段用T4连接酶在16℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，铺板、培养，挑取单克隆，提取质粒，经BamHI和SalI双酶切鉴定和DNA测序，获得含有B7-H4IgV融合基因原核克隆载体，重组质粒pQE-30-TT-B7-H4IgV构建成功；
2)重组质粒pQE-30-TT-B7-H4IgV的转化
感受态细胞的制备
取DH5α甘油菌种按1:100的体积比接种入LB培养液，在37℃振荡培养过夜，次日转接一次，继续培养至OD600为0.4-0.6，无菌操作下将菌液冰浴10min，在离心为3000rpm×5min，温度为4℃下弃去上清液，加入沉淀物1/2体积预冷的100mmol/L的CaCl2，吹起沉淀，冰浴40min，在离心为3000rpm×5min，温度为4℃下弃去上清液后加入沉淀物1/25体积的含质量浓度25％的甘油和100mmol/L的CaCl2的混合溶液再次吹起沉淀，分装入Eppendorf管中，-70℃保存备用；
感受态细胞的转化、培养
将大肠杆菌感受态细胞从-70℃中取出，冰浴融解5-10分钟，加入含有重组质粒pQE-30-TT-hB7-H4IgV的悬液，轻微混匀，继续冰浴30分钟，然后铺板，LB固体培养基培养，37℃孵箱培养过夜；
3)重组蛋白的诱导表达、纯化
pQE-30-TT-B7-H4IgV工程菌的诱导表达
将含有pQE-30-TT-B7-H4IgV重组质粒的菌株接种于10ml含Amp的LB培养液中，于37℃培养过夜，次日按1％的体积比转接于10ml含Amp的LB培养液中，于37℃振荡培养至对数生长期A600nm＝0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L诱导表达，于37℃振荡培养3-5h，离心收集菌体，-20℃保存；
按5g菌体加50mL的PBS溶液的比例将重组质粒表达的菌体重悬，冰浴条件下进行超声裂菌；12000rpm离心15min，分别收集上清液和沉淀，将沉淀用4mol/L尿素洗涤，4℃条件下12000r/min离心20min；按1g沉淀加10mL的含0.1M的NaH2PO4、pH8.0的0.01M的Tris和8M的尿素的混合溶液，4℃搅拌2h，12000rpm离心15min，共离心2次，收集上清；
用Ni-NTA柱亲和层析纯化上清所溶解的目的蛋白沉淀，同样按1g沉淀加5ml的含8mol/L尿素、0.1mol/L的NaH2PO4和pH为8.0的0.01mol/L的Tris的混合溶液充分平衡Ni柱，采用含10mmol/L的咪唑、8mol/L的尿素、0.1mol/L的NaH2PO4和pH为8.0的0.01mol/L的Tris的混合液洗脱杂蛋白，再用含300mmol/L的咪唑、8mol/L的尿素、0.1mol/L的NaH2PO4和pH为8.0的0.01mol/L的Tris的混合液洗脱目的蛋白，收集目的蛋白所在的洗脱峰溶液；
将收集的目的蛋白洗脱峰溶液采用含4mol/L的尿素、0.1mol/L的NaH2PO4和0.01mol/L的Tris的混合溶液稀释10倍，装入透析袋，采用含2mmol/L的尿素、0.1mol/LNaH2PO4和pH为8.0的0.01mol/L的Tris的混合液透析，再采用pH为7.0的无菌水；透析袋内液和外液的体积比为1：10，收集透析袋中的液体，4℃条件下12000r/min离心20min，取上清冻干。

5、  如权利要求1所述的融合蛋白TT-B7-H4IgV，其特征在于，该融合蛋白TT-B7-H4IgV应用于以B7-H4为靶点的抗肿瘤疫苗的制备。

说明书融合蛋白TT-B7-H4IgV及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及融合蛋白重组质粒的构建、在原核细胞中的表达、目的蛋白的纯化，特别涉及一种能够诱导出抗B7-H4抗血清的融合蛋白TT-B7-H4IgV及其制备方法和用途。
背景技术
1、B7-H4分子及其研究
B7-H4(B7-S1，B7x)是在2003年时，由Chen等三个实验室利用生物信息学的方法相继发现的B7家族新成员。他们是以现有的B7家族成员的胞外段可变区(IgV+IgC)为查询序列，对GenBank中的EST序列(表达序列标签)进行搜索时发现的，并在人胎盘cDNA文库中得到了全长序列。B7-H4不能与CD28、CTLA-4和ICOS结合，它与未知受体结合，调节免疫反应。近年来，越来越多的资料表明，B7-H4可能与肿瘤免疫逃逸、自身免疫性疾病等的发病机理与治疗息息相关。
1.1 B7-H4的结构与分布特点
1.1.1 B7-H4的结构
经查找美国NCBI蛋白质数据库，B7-H4蛋白由信号肽区、一对VC免疫球蛋白胞外段、跨膜区和胞浆区组成，共282个氨基酸，属I型跨膜糖蛋白，通过GPI铆定于细胞膜，其中IgV区为54-130位氨基酸。B7-H4分子最显著的特征是胞浆区仅含有两个氨基酸残基。在空间结构上，该分子在配体-受体结构域上与B7家族的同源性分别为：B7-1 13％，B7-2 13％，B7h 14％，B7-H1 20％，B7-DC16％及B7-H3 24％。hB7-H4分子的IgV区和mH7-H4的IgV区同源性高达91％，然而该区同CD80和CD86的同源性仅为23％。B7-H4的氨基酸序列如下：MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKASLCVSSFFAISWALLPLSPYLMLK。
1.1.2 B7-H4的分布
RT-PCR实验结果显示正常组织中发现有B7-H4mRNA表达，如胎盘、肝脏、肺、脾、骨骼肌、肾、小肠等等。然而，免疫组化的结果显示，正常组织中不表达B7-H4，仅在某些肿瘤组织中能检测到表达，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌；与B7-H1表达情况不同，在黑色素瘤细胞表面检测不到B7-H4的表达。通过细胞流式术检测，发现在活化后的人T细胞、B细胞、巨噬细胞、DC细胞上B7-H4呈诱导性表达。此外，小鼠脾B220+B细胞组成性表达B7-H4，而活化后则下调表达。对小鼠组织的Northern blot实验发现，根据组织类型的不同，小鼠的B7-H4共有4种不同的mRNA剪切形式。肝组织具有这四种剪切形式的高水平表达，它们的大小分别为7.5，4，2.6和1.8kb。灵敏的RT-PCR分析显示，人类组织至少拥有两个转录本。同时还有研究表明，正常外周组织能在转录水平上对B7-H4的表达进行严密的调控。
1.2 B7-H4的受体研究
B7-H4-Ig融合蛋白标记和流式细胞分析(FCM)发现，B7-H4-Ig融合蛋白可以结合佛波脂和离子毒素或抗CD3/CD28抗体活化的T细胞，这提示在活化T细胞上存在B7-H4的可能受体。将B7-H4-Ig融合蛋白分别和高表达CD28，ICOS，PD-1和CTLA-4的转基因细胞相互作用，实验结果表明，B7-H4-Ig融合蛋白不能与上述各转基因细胞结合。另外，CTLA-Ig能与转B7-2基因的CHO细胞结合，但却不能与转B7-H4基因的细胞结合。这些均表明表达在活化T细胞上的B7-H4受体不同于CD28，ICOS，PD-1和CTLA-4。
BTLA是CD28家族成员之一，它表达在活化的T细胞和静止的B细胞上，在BTLA的胞浆段有两个ITIM(免疫受体酪氨酸抑制基序)，介导抑制T细胞的作用，有实验证实B7-H4-Ig明显能与野生型(WT)细胞结合，但与突变型(BTLA-/-)细胞却不能结合。这样的结合差异性提示，BTLA可能是B7-H4的受体。现无文献报道B7-H4和BTLA的直接结合，而有实验表明BTLA并不能与B7-H4直接结合，同时发现HVEM(疱疹病毒介体)是BTLA的特异性配体，所以BTLA是否是B7-H4的受体有待进一步验证。
1.3 B7-H4的生物学活性及其作用机理研究
1.3.1 B7-H4是B7家族的新成员
T淋巴细胞的活化与抗原特异性T细胞免疫应答的产生及维持至少需要2个信号，即MHC-复合物提供的特异性信号以及由APC表面分子提供的共刺激信号。共刺激信号路径不仅提供增强和维持T细胞应答的关键的正性第二信号，而且提供下调T细胞应答的关键的负性第二信号。在T细胞活化和耐受的免疫调节中，B7-CD28家族成员介导的T淋巴细胞共刺激信号传导途径起着至关重要的作用。它们不仅在启动、增强和维持T细胞应答中提供了关键的正性信号，而且还可提供重要的负性信号来限制、终止或削弱T细胞的免疫应答。最近5年发现的B7家族的成员主要有：B7-H1/PD-1，B7h/ICOS、B7-H3、B7-H4和BTLA等。已经发现B7-H4与B7-H1一样，对免疫应答反应有着负性调节作用，它能通过抑制T细胞的增殖、细胞因子的释放和细胞周期的进程来负性调控T细胞的免疫应答，且B7-H4分子的表达与某些肿瘤的诊断，治疗及预后息息相关。所有数据表明B7-H4参与了肿瘤免疫逃逸反应，但其中具体的分子机制尚未阐明。
1.3.2 B7-H4能抑制T细胞活化和增殖
实验证明，B7-H4的未知受体存在于活化后的T细胞上，且不同于CD28，CTLA-4，ICOS，PD-1和B7-H3的受体。在CD28的共刺激作用下，特别是在低剂量的CD3抗体存在的情况下，B7-H4-Ig与受体相结合，可以抑制T细胞的增殖，且在高剂量的TCR和CD3抗体的作用下，可以克服B7-H4的抑制作用。说明B7-H4是一种T细胞活化的负性调节分子，B7-H4-Ig会降低T细胞对TCR/CD28信号通路的反应性。
IL-2的分泌是T细胞活化的标志，而B7-H4-Ig可以抑制T细胞分泌的IL-2的释放。IL-2基因在活化的T细胞上表达受多条信号通路的控制，包括细胞表面的受体与配体结合，导致NFAT，NF-κ B和AP1转录因子的激活等。研究发现，在B7-H4-Ig的共刺激作用下AP1家族成员之一JunB的表达量下降了49％，而JunB分子的过表达会导致IL-2的大量产生。因此说明B7-H4-Ig通过抑制JunB的表达影响T细胞分泌IL-2分子，从而抑制T细胞的活化。
体外实验证明，用抗B7-H4的单抗阻断B7-H4的功能后，可以增强T细胞的增殖，增加IL-2的释放水平。在小鼠EAE模型形成实验中，使用B7-H4单抗组的小鼠更容易形成EAE模型。检测小鼠的脑单核细胞浸润发现，使用单抗后的小鼠，其CD4+T细胞，CD8+T细胞浸润也明显增加。这些数据都表明B7-H4在T细胞活化中发挥抑制性调节作用。
1.3.3 B7-H4能抑制T细胞的免疫应答反应
B7-H4能够抑制T细胞的活化以及T细胞的免疫应答反应。体外实验证实，固化的B7-H4分子可以抑制T细胞的增殖和细胞因子的释放。体内实验亦证明，给B6小鼠注射B7-H4-Ig可以抑制T细胞的分化和T细胞毒作用。与之相一致的结果是，用单抗阻断膜上B7-H4分子可以阻断B7-H4分子的抑制作用，且该抑制作用是通过阻滞T细胞的细胞周期实现的，而对T细胞的促凋亡作用很微弱，表明B7-H4是在T细胞活化的早期阶段发挥作用，对细胞因子的抑制作用无选择性。B7-H4的这些特征为肿瘤，自身免疫性疾病，病毒感染和移植排斥的治疗提供了新的靶位。
1.3.4 B7-H4与调节性T细胞
调节性T细胞的免疫抑制作用机制有很多种，IL-10介导的复杂作用是其中的一种。通过研究调节性T细胞与APCs的相互作用，发现调节性T细胞会触发APCs分泌大量的IL-10，IL-10可以诱导APCs细胞表达大量的B7-H4，导致APCs产生免疫抑制。敲除APCs上的B7-H4，可以抑制调节性T细胞介导的APCs的免疫抑制作用。由APCs细胞分泌的IL-10可以刺激其本身表达更多的B7-H4，这是最新发现的调节性T细胞介导的免疫抑制机制，这种机制是在APCs水平上发挥作用。实验证明，B7-H4在APCs上过表达，产生了“调节性APCs”，从而抑制了免疫应答反应。为了进一步研究在肿瘤环境中的B7-H4、巨噬细胞、调节性T细胞之间的病理关系，Kryczek I等对103个患者体内卵巢癌细胞和卵巢癌相关巨噬细胞上的B7-H4表达量进行了统计，观察到巨噬细胞上的B7-H4的密度与调节性T细胞上的数量正相关，且调节性T细胞的数量和B7-H4的表达量与卵巢癌患者的预后呈负相关。同时，调节性T细胞能通过促使巨噬细胞自分泌IL-10和IL-6，刺激B7-H4在巨噬细胞上表达增多，通过B7-H4的作用，调节性T细胞将抑制信号传递给APCs(巨噬细胞来源)。
1.3.5 B7-H4与B细胞
众所周知，B7家族的共刺激分子在调节T细胞免疫应答中起着重要的作用。如B7-1和B7-2与CD28结合时，可以发挥正性的刺激作用，当B7-1和B7-2与CTLA-4结合时，发挥着抑制性作用。然而，B7家族共刺激分子如何调节B细胞的功能却知之甚少。有一些研究证明，经过LPS和CD40的刺激可以诱导B细胞表面B7家族分子的表达，激活B细胞。Suvas等证明了表达在细胞表面的B7家族分子，对正常的B细胞和B细胞淋巴瘤都发挥着重要的作用，因此可以认为B7家族分子在决定B细胞的最终命运上发挥着重要的作用。B7-H4是B7家族最新发现的成员，已有实验证明B7-H4可以抑制T细胞的激活、增殖，抑制细胞因子释放和T细胞毒作用，B7-H4通过对免疫应答的影响，参与肿瘤免疫逃逸。EBV是在95％人群都有感染的人疱疹病毒，它与一些恶性肿瘤的发病密切相关，如Burttis’s淋巴瘤、Hodgki n’s病等，但是EBV病毒发挥作用的具体机制还不明。效应性T细胞可以清除EBV感染的B细胞，因此在机体对抗这些恶性肿瘤时发挥重要的作用。然而，有实验证明EBV能够通过诱导HLA分子和共刺激分子在B细胞表面的表达，协助感染后的B细胞逃避效应性T细胞的攻击。Hyunkeun Song等观察转染了EBV的B细胞，证明了EBV可以诱导B7-H4在B细胞上的表达，使用抗B7-H4抗体与表达在B细胞上的B7-H4相互作用后，可以增强Fas介导的B细胞凋亡。这些数据表明，B7-H4可以成为EBV相关的恶性肿瘤的治疗靶位。
1.3.6 B7-H4在巨噬细胞表面的表达
经过对抑制性免疫细胞数十年的研究，人们对主要的免疫抑制性细胞-CD4+CD25+调节性T细胞的功能了解已经比较透彻。最近在卵巢癌患者体内又发现了一群新的免疫抑制性细胞，称为B7-H4+肿瘤相关巨噬细胞。肿瘤相关巨噬细胞是卵巢癌间质中的重要组成成分，且与肿瘤的进程密切相关。对人卵巢癌相关巨噬细胞研究发现有一部分肿瘤相关的巨噬细胞能够表达B7-H4，且该细胞能够明显抑制肿瘤特异性T细胞的增殖、细胞因子的释放和细胞毒作用。体内实验同样证明，与敲除了B7-H4的巨噬细胞相比，B7-H4+巨噬细胞能够抑制肿瘤特异性T细胞的作用，促进SCID/NOD小鼠上接种的肿瘤细胞生长，且B7-H4+巨噬细胞和CD4+的调节性T细胞共存于卵巢癌的微环境中，这些数据证明这两种细胞有着类似的功能。Ilona Kryczek等的实验也证实B7-H4+APCs(巨噬细胞来源)和CD4+调节性T细胞的确存在着功能上的联系，CD4+CD25+的调节性T细胞通过刺激APCs表达B7-H4导致APC细胞的免疫抑制，且对肿瘤患者腹水和实体瘤检测发现，B7-H4+巨噬细胞的数量远远多于调节性T细胞的数量，由此可见B7-H4+巨噬细胞在肿瘤免疫逃逸中的作用是不容忽视的。这些新的发现，为卵巢癌的诊断和治疗提供了新的策略。
1.3.7 B7-H4在肾小管上皮的表达
肾小管损伤的发病机制至今还不清楚，已证明肾小管上皮细胞和T细胞的相互作用在疾病进程中占有很重要的位置，肾小管上皮细胞表达共刺激分子通过促进T细胞的激活，导致肾小管的损伤。B7-H4是B7家族共刺激分子中最新发现的成员，Chen Y等对20例特发性膜性肾病患者，19例IgA肾病患者，16例狼疮性肾病患者和15例急性肾移植排斥患者进行肾活检，用免疫组化检测B7-H4在各种类型患者肾小管上皮的表达情况。结果显示B7-H4在所有类型患者肾小管上皮细胞上均有特异性表达，特别是在肾小管严重损伤的患者肾小管上皮B7-H4的表达明显。各类患者体内B7-H4的表达水平与血清肌酸酐，血清尿素氮，24小时蛋白尿水平无关联。
体外实验证明表达B7-H4的肾小管上皮细胞可以促进细胞因子(IL-2和INF-γ)的释放和与之共培养T细胞的增殖，说明表达B7-H4的肾小管上皮细胞可以诱导T细胞的活化和细胞因子的释放，B7-H4在肾小管损伤中是个潜在的刺激因素。
1.3.8 B7-H4与胰岛β细胞
糖尿病(DM)是一种常见的代谢性内分泌疾病，因其发病率、死亡率、致残率高，严重危害人类健康，而日益受到医学界的广泛关注。胰岛素的产生和分泌不足是疾病的主要原因。胰岛素主要由胰岛β细胞产生，在I型糖尿病中，T细胞对胰岛β细胞的杀伤作用导致胰岛素产生不足，在疾病发病过程占有极其重要的地位。B7-H4通过与活化后T细胞与B细胞上的未知受体结合，参与细胞免疫和体液免疫。RT-PCR结果显示人胰岛β细胞表达B7-H4mRNA，而流式结果显示胰岛β细胞不表达B7-H4分子。为了研究I型糖尿病患者体内胰岛β细胞表达的B7-H4对T细胞活化的调节作用，建立了体外实验系统，包括特异性抗胰岛β细胞的T细胞，人胰岛β细胞系CM和Hp62，和初始胰岛β细胞，B7-H4蛋白由转染了B7-H4载体的293T细胞产生。结果表明，在患者体内，固化的B7-H4分子可以明显地抑制由CD3单抗刺激的CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖和活化，同时B7-H4分子阻滞T细胞G0/G1期，从而诱导T细胞的凋亡。通过转染表达B7-H4载体的人胰岛β细胞系CM和Hp62细胞来刺激T细胞免疫应答，发现与转染了空载体的细胞相比，前者可以明显抑制T细胞的杀伤作用。因此，激活细胞B7-H4信号通路可以抑制I型糖尿病患者体内T细胞对胰岛β细胞的杀伤，对细胞起保护作用，从而为糖尿病的免疫治疗提供新策略。
1.4 B7-H4在肿瘤及其他疾病中的研究与应用
B7家族的分子在肿瘤免疫中占有极其重要的地位。B7-H1，B7-DC，B7-H3，B7-H4都是B7家族新发现的成员。它们在免疫系统中发挥着独一无二的作用，而这种功能又往往是交叉重叠的。B7家族的共刺激分子通过各种机制，对免疫系统起着调节作用，这些功能都已经被实验证实，在肿瘤免疫逃逸的过程中，这些B7家族的分子也发挥着重要的辅助作用，最近研究火热的人自有B7-H1，B7-H4等，它们对于肿瘤的诊断、治疗和预后都有着极其重要的作用。特别是对于最新发现的B7-H4分子的研究逐渐深入，越来越多的实验证明B7-H4具有成为肿瘤治疗靶位的价值。
B7-H4在肿瘤组织的表面有着丰富的表达，如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌，胰腺癌等，而正常组织中几乎检测不到的表达B7-H4分子表达在肾癌，B7-H4mRNA则无处不在，这些数据都说明了B7-H4分子在转录后水平上发挥着他们不同的调节功能。它们的组织表达特异性是由微环境环境中的组织特异性促进分子、转录因子等决定的，促炎因子IFN-γ可以上调B7-H1在肿瘤细胞的表达。目前，对于IFN-γ是否可以上调B7-H4在肿瘤细胞的表达尚无研究。
有研究证明，肿瘤患者体内B7-H4在APCs上表达上调，形成APCs免疫耐受，从而抑制了肿瘤免疫应答反应。B7-H4分子能抑制T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，用RNAi的方法敲除肿瘤细胞上B7-H4的表达，能够促进肿瘤细胞的凋亡，肿瘤细胞上过表达B7-H4，能够促进小鼠接种肿瘤的形成。在肿瘤微环境中，巨噬细胞上B7-H4的表达能抑制T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，而阻断巨噬细胞上B7-H4的表达，能够抑制小鼠接种肿瘤的生长。因此有理由假设通过阻断B7-H4分子来阻断B7-H4的抑制信号通路，可以提高T细胞的免疫应答反应，打破肿瘤细胞的免疫耐受，阻断免疫逃逸，及消除APCs的抑制性作用。
1.5 B7-H4分子与自身免疫性疾病
有实验证明，在GVHD(移植物抗宿主反应)模型中，B7-H4-Ig可以有效抑制CTL的增殖、分化和成熟，从而延长小鼠的寿命。如果将B6小鼠的脾脏移植给接受亚致死剂量照射的BDF1(B6×DAB/2)小鼠会刺激CD8+CTL急速的扩增和细胞毒活性的增强，从而伴随多器官功能衰竭，最终导致小鼠的死亡。如果给与小鼠B7-H4-Ig的保护，能降低CTL的反应，降低小鼠的免疫反应。而受体鼠隔天给予阻断型抗B7-H4抗体，实验结果发现，抗体组与对照组(Ig)相比呈现强烈的反应性CTL活性。还有实验证明，用特异性抗体封闭B7-H4的功能，可增强CTL应答，加速EAE疾病的产生。综上所述，B7-H4在体内也可抑制T细胞免疫应答，对自身免疫性疾病和移植后排斥反应的治疗具有应用价值。
B7-CD28家族中新的T细胞共刺激分子及其信号传导通路的发现，使人们对共刺激分子在免疫应答不同阶段的相互作用有了进一步了解。人们推测，这些分子通过精细的免疫调节网络调节和控制着T细胞活化、增殖、分化为效应T细胞和记忆细胞以及T细胞数量的动态平衡。B7家族最新发现的B7-H4分子正是这样一个重要的分子。它在T细胞应答相对早期起明显的抑制作用。因此，B7-H4在初始T细胞的活化过程中是对T细胞活化负性调控的一个关键点。广泛而可诱导的表达谱揭示，B7-H4在外周组织中的表达也具有免疫应答负性调控作用。特别是在肿瘤组织的特异性表达，揭示了B7-H4分子参与肿瘤免疫逃逸，是帮助肿瘤生长的关键分子。经过不断深入研究，通过控制B7-H4与其特异性受体的结合很可能为肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、移植后排斥等疾病的治疗开辟崭新而高效的途径。B7-H4是否有助于肿瘤免疫逃避，而阻断B7-H4是否能提高肿瘤免疫治疗效果，需要进一步验证。
2、肿瘤免疫逃逸与肿瘤疫苗研究进展
虽然在动物及临床实验中发现不同肿瘤疫苗可诱发特异性抗肿瘤免疫反应，但其临床治疗总有效率仅为2.6％。免疫系统不能引起肿瘤消退是肿瘤疫苗研究所面临的一个巨大困难。大量的研究证据表明，肿瘤存在着许多逃避免疫系统识别和攻击的机制，包括肿瘤抗原表达的下调、丢失或突变；HLA-I类抗原和免疫共刺激分子表达的下调或丢失；肿瘤细胞分泌免疫抑制性可溶性因子；肿瘤细胞膜上表达免疫抑制性分子；诱导具有免疫抑制功能的调节性T淋巴细胞；共刺激分子表达下调和共抑制分子表达上调等。其中，肿瘤组织中的免疫反应抑制是肿瘤细胞逃逸免疫攻击的重要因素。有研究表明，许多具有免疫抑制功能的可溶性因子(TGF-β、IL-10、前列腺素E2、Fas、TRAIL等)和细胞膜分子(CTLA-4、PD-1、B7-H1、B7-H4等)在肿瘤细胞表达上调，协助肿瘤的免疫逃逸。肿瘤的免疫治疗近年来发展很快，阻断参与肿瘤免疫逃避分子的作用，已成为提高肿瘤疫苗治疗效果的一种有效手段。但是由于缺乏特异性的肿瘤抗原，缺乏有效的抗原呈递等原因，使肿瘤疫苗目前的应用受限。因此选择特异而有效的治疗靶点、有效的抗原呈递成为肿瘤免疫治疗成功的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种融合蛋白TT-B7-H4IgV及其制备方法和用途，使其能够在体内诱导出针对B7-H4的多克隆抗体，鉴于B7-H4是一种参与免疫应答及调节、肿瘤免疫逃避的信号分子且其受体分子未知，期望该多克隆抗体能够与B7-H4分子结合，阻断B7-H4信号通路，打破肿瘤免疫逃避，为研制抗肿瘤药物提供新的策略和途径。
为了实现上述目的，本发明选择B7-H4分子作为靶点，以TT作为抗原呈递，构建融合蛋白TT-B7-H4IgV；所采用的技术方案是：
所述的B7-H4IgV为B7-H4分子胞外区可变区IgV，TT为T辅助细胞表位肽或破伤风类毒素表位，在融合蛋白的N端还连接6个His残基，其连接方式为：6×His-TT-B7-H4IgV；其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
融合蛋白TT-B7-H4IgV的重组核苷酸序列，其连接方式为：6×His序列-BamHI酶切位点-TT表位序列-EcorI酶切位点-B7-H4IgV重组序列-SalI酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
构建于重组质粒pQE-30-TT-hB7-H4IgV，TT-hB7-H4IgV重组核苷酸序列通过BamHI、SaIl多克隆位点连接于质粒pQE-30中。
融合蛋白TT-B7-H4IgV的制备方法如下：
1)重组质粒pQE-30-TT-B7-H4IgV的构建
根据人B7-H4的cDNA基因序列，截取B7-H4胞外段IgV序列，上游引入BamHI酶切位点和T辅助细胞表位，T辅助细胞表位为破伤风类毒素表位TT830-843，其氨基酸序列为：Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu，下游引入SalI酶切位点，其重组序列如SEQ.ID.NO.2所示：
该重组序列中的4-12bp为linker序列，13-30bp为6个His编码序列，31-36bp为BamHI酶切位点，37-78bp为TT辅助表位肽编码基因序列，79-87bp为linker序列，88-93bp为EcorI酶切位点，94-326bp为B7-H4IgV区编码序列，327-333bp为SalI酶切位点；
通过BamHI和SalI多克隆位点将上述重组序列克隆入载体pBluescriptIISK-G；
将上述pBluescriptII SK-G-TT-hB7-H4IgV载体转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA后，将其与质粒pQE-30分别用BamHI和SalI进行双酶切，酶切产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳分离，分别回收pBluescriptII SK-G-TT-hB7-H4IgV获得的小片段333bp和pQE-30中的大片段，将回收后的小片段和大片段用T4连接酶在16℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，铺板、培养，挑取单克隆，提取质粒，经BamHI和SalI双酶切鉴定和DNA测序，获得含有B7-H4IgV融合基因原核克隆载体，重组质粒pQE-30-TT-B7-H4IgV构建成功；
2)重组质粒pQE-30-TT-B7-H4IgV的转化
感受态细胞的制备
取DH5α甘油菌种按1:100的体积比接种入LB培养液，在37℃振荡培养过夜，次日转接一次，继续培养至OD600为0.4-0.6，无菌操作下将菌液冰浴10min，在离心为3000rpm×5min，温度为4℃下弃去上清液，加入沉淀物1/2体积预冷的100mmol/L的CaCl2，吹起沉淀，冰浴40min，在离心为3000rpm×5min，温度为4℃下弃去上清液后加入沉淀物1/25体积的含质量浓度25％的甘油和100mmol/L的CaCl2的混合溶液再次吹起沉淀，分装入Eppendorf管中，-70℃保存备用；
感受态细胞的转化、培养
将大肠杆菌感受态细胞从-70℃中取出，冰浴融解5-10分钟，加入含有重组质粒pQE-30-TT-hB7-H4IgV的悬液，轻微混匀，继续冰浴30分钟，然后铺板，LB固体培养基培养，37℃孵箱培养过夜；
3)重组蛋白的诱导表达、纯化
pQE-30-TT-B7-H4IgV工程菌的诱导表达
将含有pQE-30-TT-B7-H4IgV重组质粒的菌株接种于10ml含Amp的LB培养液中，于37℃培养过夜，次日按1％的体积比转接于10ml含Amp的LB培养液中，于37℃振荡培养至对数生长期A600nm＝0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L诱导表达，于37℃振荡培养3-5h，离心收集菌体，-20℃保存；
按5g菌体加50mL的PBS溶液的比例将重组质粒表达的菌体重悬，冰浴条件下进行超声裂菌；12000rpm离心15min，分别收集上清液和沉淀，将沉淀用4mol/L尿素洗涤，4℃条件下12000r/min离心20min；按1g沉淀加10mL的含0.1M的NaH2PO4、pH8.0的0.01M的Tris和8M的尿素的混合溶液，4℃搅拌2h，12000rpm离心15min，共离心2次，收集上清；
用Ni-NTA柱亲和层析纯化上清所溶解的目的蛋白沉淀，同样按1g沉淀加5ml的含8mol/L尿素、0.1mol/L的NaH2PO4和pH为8.0的0.01mol/L的Tris的混合溶液充分平衡Ni柱，采用含10mmol/L的咪唑、8mol/L的尿素、0.1mol/L的NaH2PO4和pH为8.0的0.01mol/L的Tris的混合液洗脱杂蛋白，再用含300mmol/L的咪唑、8mol/L的尿素、0.1mol/L的NaH2PO4和pH为8.0的0.01mol/L的Tris的混合液洗脱目的蛋白，收集目的蛋白所在的洗脱峰溶液；
将收集的目的蛋白洗脱峰溶液采用含4mol/L的尿素、0.1mol/L的NaH2PO4和0.01mol/L的Tris的混合溶液稀释10倍，装入透析袋，采用含2mmol/L的尿素、0.1mol/LNaH2PO4和pH为8.0的0.01mol/L的Tris的混合液透析，再采用pH为7.0的无菌水；透析袋内液和外液的体积比为1：10，收集透析袋中的液体，4℃条件下12000r/min离心20min，取上清冻干。
该融合蛋白TT-B7-H4IgV应用于以B7-H4为靶点的抗肿瘤疫苗的制备。
获得pQE-30-TT-hB7-H4IgV重组质粒，转入感受态大肠杆菌，经IPTG诱导表达成功，并扩大培养；裂菌后提取蛋白Ni-NTA亲和层析纯化得到纯度为93％的目的蛋白，并用Western blot鉴定。
用纯化的TT-B7-H4IgV蛋白免疫昆明小鼠，经ELISA、流式细胞术测定抗血清的生物学活性，证明抗B7-H4抗血清与B7-H4有良好的结合活性，并用融合蛋白免疫B7-H4IgVSP2/0荷瘤小鼠，观察结果表明其对肿瘤细胞生长有一定的抑制作用，证明融合蛋白TT-B7-H4IgV应用于以B7-H4为靶点的抗肿瘤疫苗的制备。
本发明的技术效果：
本发明选择B7-H4作为靶点，以TT作为抗原呈递，构建了融合蛋白TT-B7-H4IgV；该融合蛋白经Western blot鉴定、测序与预期相一致；用纯化的融合蛋白TT-hB7-H4IgV免疫昆明小鼠，经ELISA、流式细胞术测定抗血清的生物学活性，证明抗B7-H4抗血清与B7-H4有良好的结合活性，说明该融合蛋白TT-hB7-H4IgV能够诱导机体产生了抗B7-H4多克隆抗体。
融合蛋白免疫SP2/0荷瘤小鼠，观察结果表明其对肿瘤细胞生长有一定的抑制作用，为研制抗肿瘤药物提供新的策略和途径。
附图说明
图1是重组质粒pQE-30-TT-B7-H4IgV的质粒图谱，
图2重组表达质粒pQE-30-TT-B7-H4IgV的双酶切凝胶电泳鉴定图
图3是重组蛋白TT-B7-H4IgV的表达纯化的SDS-PAGE电泳鉴定图。
图4是Ni-NTA柱亲和层析纯化洗脱蛋白的分光光度计图谱；横坐标为蛋白整个纯化的起止时间，纵坐标为通过分光光度计的蛋白吸收OD值。
图5是以ELISA检测重组蛋白TT-B7-H4IgV免疫小鼠血清抗体滴度图。横坐标代表抗血清的稀释倍数，纵坐标代表OD值。
图6是抗TT-B7-H4IgV抗血清与IFN-γ刺激的B7-H4分子表达上调的SP2/0细胞结合的流式细胞术鉴定；其中，
A：IFN-γ刺激前SP2/0细胞上B7-H4的表达情况；
B：IFN-γ刺激后SP2/0细胞上B7-H4的表达情况；
C：IFN-γ刺激后的SP2/0细胞与B7-H4单抗的结合情况；
D：IFN-γ刺激后的SP2/0细胞与抗TT-B7-H4IgV抗血清的结合情况。
图7是B7-H4IgV蛋白对小鼠移植瘤的抑制作用；横坐标是小鼠接种肿瘤细胞后的天数；纵坐标是肿瘤的体积。
图8是融合蛋白TT-B7-H4IgV与生理盐水(对照)对肿瘤实体抑制图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案做详细描述。
1、重组质粒pQE-30-TT-B7-H4IgV的构建
查询GeneBank中人B7-H4cDNA基因序列(NM024626)，截取B7-H4胞外段IgV序列，上游引入BamHI酶切位点和T辅助细胞表位，(T辅助细胞表位为破伤风类毒素表位TT830-843，其氨基酸序列为：NSKFIGITE，以引发体内较强的细胞免疫反应，从而促进肿瘤疫苗更好发挥作用)，下游引入SalI酶切位点，其重组序列如下所示(SEQ.ID.NO.2)：
atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatcccagt atataaaagc aaattctaaa 60
tttataggta taactgaagc agcagcagaa ttcctgagct gcacttttga acctgacatc 120
aaactttctg atatcgtgat acaatggctg aaggaaggtg ttttaggctt ggtccatgag 180
ttcaaagaag gcaaagatga gctgtcggag caggatgaaa tgttccgcgg ccggacagca 240
gtgtttgctg atcaagtgat agttggcaat gcctctttgc ggctgaaaaa cgtgcaactc 300
acagatgctg gcacctacaa atgttgagtc gac                              333
其中，4-12bp为linker序列，13-30bp为6个His编码序列，31-36bp为BamHI酶切位点，37-78bp为TT辅助表位肽编码基因序列，79-87bp为linker序列，88-93bp为EcorI酶切位点，94-326bp为B7-H4IgV区编码序列，327-333bp为SalI酶切位点。
6×His序列的引入是为了融合蛋白的纯化，引入EcorI酶切位点方便日后单独剪切TT辅助标位肽和B7-H4IgV区编码序列。
上述序列交北京奥科生物技术有限责任公司合成，并将其通过BamHI和SalI多克隆位点克隆入载体pBluescript II SK-G。
将上述pBluescriptII SK-G-TT-hB7-H4IgV载体转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA后，将其与质粒pQE-30分别用BamHI和SalI进行双酶切。酶切产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳分离，分别回收pBluescript II SK-G-TT-hB7-H4IgV获得的小片段(333bp)和pQE-30中的大片段。将回收后的小片段和大片段用T4连接酶在16℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，铺板、培养，挑取单克隆，提取质粒，经BamHI和SalI双酶切鉴定和DNA测序，获得含有B7-H4IgV融合基因原核克隆载体，重组质粒pQE-30-TT-B7-H4IgV构建成功，其多克隆位点分布如图1所示。
2 重组质粒pQE-30-TT-B7-H4IgV的转化
感受态细胞的制备
取DH5α甘油菌种按1:100的比例接种入的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，次日转接一次，继续培养至OD600约0.4左右。(无菌操作)将菌液冰浴10min，离心(3000rpm×5min，4℃)后弃去上清，加入1/2体积预冷的100mmol/LCaCl2，轻轻吹起沉淀，冰浴40min，离心(3000rpm×5min，4℃)，弃上清后加入1/25体积的含25％甘油的100mmol/L CaCl2，吹起沉淀，分装入Eppendorf管中，-70℃保存备用。
感受态细胞的转化、培养
将大肠杆菌感受态细胞从-70℃中取出，冰浴融解5-10分钟，加入含有重组pQE-30-TT-hB7-H4IgV质粒，一管感受态加1μl的重组质粒，轻微混匀，继续冰浴30分钟，然后铺板，LB固体培养基培养，37℃孵箱培养过夜。
质粒的提取与鉴定
在质粒转化后37℃过夜培养的培养皿上挑取边缘整齐，生长状态良好的克隆，接种到10ml含氨苄Amp的LB培养基中，37℃、200rpm培养8小时，用质粒提取试剂盒提取质粒，用BamHI和SalI双酶切后，行琼脂糖凝胶电泳观察是否有插入片断以及插入的片断是否与预期的长度一致，将酶切鉴定阳性的克隆送北京奥科生物技术有限责任公司进行DNA测序。结果如图2所示：其中，泳道1：DNA marker(DL2000)，泳道2：重组质粒pQE-30-TT-hB7-H4IgV BamHI和SalI双酶切；该插入片段的基因序列与预期(SEQ.ID.NO.2)完全一致，说明重组质粒pQE-30-TT-hB7-H4IgV构建成功。
3 重组蛋白的诱导表达、纯化与鉴定
pQE-30-TT-B7-H4IgV工程菌的诱导表达
将含有pQE-30-TT-B7-H4IgV重组质粒的菌株，接种于10ml含Amp的LB培养液中，于37℃培养过夜，次日按1％的比例转接于10ml含Amp的LB培养液中，于37℃振荡培养至对数生长期(A600nm＝0.4～0.6)时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L诱导表达，于37℃振荡培养3-5h。离心收集菌体，-20℃保存。
融合蛋白的纯化和复性
取含pQE-30-TT-B7-H4IgV重组质粒的菌株大量诱导菌液，5000rpm离心10min，收菌，超声裂菌；4℃条件下12000rpm离心20min，分别收集上清液和沉淀。将沉淀用8mol/L尿素溶液重悬，4℃下静置溶解。将溶解的沉淀和上清分别取样进行SDS-PAGE电泳，对目的蛋白的表达形式进行分析，证实目的蛋白存在于沉淀中，说明蛋白是以包涵体的形式表达。
按5g菌体加50mL PBS溶液的比例将菌体重悬，冰浴条件下进行超声裂菌；12000rpm离心15min，分别收集上清液和沉淀，将沉淀用4mol/L尿素洗涤，4℃条件下12000r/min离心20min；按1g沉淀加10mL的含0.1MNaH2PO4和0.01MTris(pH8.0)的8M尿素溶液，4℃搅拌2h，12000rpm离心15min，共离心2次，收集上清。
用Ni-NTA柱亲和层析纯化上清所溶解的目的蛋白沉淀，因为Ni-NTA柱上带的基团能够与融合蛋白的6×His结合。用5ml A液(8mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，pH8.0的0.01mol/LTris)充分平衡Ni柱，先用B液(10mmol/L咪唑，8mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，pH8.0的0.01mol/LTris)洗脱杂蛋白，再用C液(300mmol/L咪唑，8mol/L尿素，0.1mol/INaH2PO4，pH8.0的0.01mol/LTris)洗脱目的蛋白，收集目的蛋白洗脱峰。
目的蛋白的复性方法为浓度梯度法，具体实施方案是，先将收集的目的蛋白洗脱峰以稀释液(4mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，0.01mol/LTris)稀释10倍，装入透析袋，先透析至透析液D液(2mmol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，pH8.0的0.01mol/LTris)，再透析入pH7.0的无菌水；透析袋内液和外液的体积比为1：10。收集透析袋中的液体，4℃条件下12000r/min离心20min，取上清冻干。
上清冻干再以10ml生理盐水复溶，用Lowery法测定蛋白浓度为1mg/ml，用灰度扫描法检测蛋白纯度为93％，将样品蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用抗his单抗进行WesternBlot鉴定，结果显示目的蛋白TT-B7-H4IgV与抗his单抗有良好的反应性。
融合蛋白TT-B7-H4IgV表达纯化的鉴定
重组质粒转化大肠杆菌后，经诱导表达，稳定筛选，构建工程菌。经发酵后，收集大量菌体，裂菌显示目的蛋白以包涵体形式存在，经对包涵体洗涤，Ni-NTA柱亲和层析，复性后SDS-PAGE显示蛋白单一条带，Western-blot鉴定显示能与抗His单克隆抗体特异性结合。
其SDS-PAGE电泳鉴定结果、Western-blot鉴定结果如图3所示，其中，泳道1：蛋白mark从上至下分子量依次为：116000Da、66200D、45000Da、35000Da、25000Da、18400Da、14400Da；泳道2：诱导前的含pQE-30-TT-B7-H4IgV重组质粒的全菌蛋白；泳道3：诱导后的含pQE-30-TT-B7-H4IgV重组质粒的全菌蛋白；泳道4：超声裂菌离心后的上清；泳道5：超声裂菌后离心后的沉淀；泳道6：超声裂菌后离心后的沉淀用4mol/L尿素洗涤；泳道7：Ni-NTA柱亲和层析纯化洗脱的杂质峰；泳道8：融合蛋白TT-B7-H4IgV的Ni-NTA柱亲和层析纯化洗脱峰；泳道9；融合蛋白TT-B7-H4IgVWestem-blot鉴定。泳道2与3比较，明显发现泳道3多出14.4KDa的目的蛋白显色带，说明经过诱导后目的蛋白表达；泳道4、5、6比较说明目的蛋白出现在超声裂菌后离心后的沉淀中，目的蛋白以包涵体形式表达，且经4mol/L尿素洗涤后溶解；泳道7与8比较说明目的蛋白经过Ni-NTA柱亲和层析纯化得到纯化的融合蛋白TT-B7-H4IgV。泳道9的用抗his单抗进行的WesternBlot鉴定说明融合蛋白TT-B7-H4IgV与抗his单抗有良好的反应性。
图4是Ni-NTA柱亲和层析纯化洗脱蛋白的分光光度计图谱，横坐标为蛋白整个纯化的起止时间，纵坐标为通过分光光度计的蛋白吸收OD值；图左的峰(峰1)为洗脱的杂蛋白峰，图右的峰(峰2)为目的蛋白TT-B7-H4IgV洗脱峰，结果显示得到纯化的融合蛋白TT-B7-H4IgV浓度相当高，用灰度扫描法检测蛋白纯度为93％。
4.动物免疫实验和抗血清免疫学活性鉴定
4.1 昆明小鼠分组与免疫方案
分组：将30只昆明小鼠分成3组，分别为生理盐水对照组，TT-B7-H4IgV+生理盐水组和TT-B7-H4IgV+Freund佐剂组。在第4次免疫后10天摘眼球采血，测定血清中抗B7-H4抗体效价及其与肿瘤细胞的结合作用。
免疫方案：背部皮下多点注射；TT-B7-H4IgV：50μg/只；第1次使用完全佐剂，第2和3次使用不完全佐剂，第4次不用佐剂，作腹腔注射；佐剂溶液总体积为200μL/只，分别隔周注射；第4次，使用TT-B7-H4IgV50μg/只，生理盐水200μL/只，腹腔注射。
4.2 抗血清活性鉴定
4.2.1 ELISA法测定血清抗TT-B7-H4IgV抗体效价
在第4次免疫后10天采血，收集抗TT-B7-H4IgV抗血清，通过间接ELISA测定血清抗B7-H4抗体效价(参见《细胞和分子免疫学实验技术》)，每个样品均设6个孔。
ELISA实验方法所需溶液的配制：a.包被缓冲液：碳酸盐缓冲液0.32gNa2CO3：(终浓度0.015mol/L)，0.59g NaHCO3(终浓度0.035mol/L)，纯水定容至200mL(pH9.6)，有效期两周；b.洗涤液：含0.5％Tween-20的PBS(pH7.4)；c.封闭液：含1％BSA的洗涤液；d.稀释液：含0.5％BSA的洗涤液；e.底物缓冲液：1.84g Na2HPO4·12H2O、柠檬酸：0.51g纯水定容至100mL(pH5.0)；f.底物显色液：8mg OPD，30μL 3％H2O2；h.终止液：1mol/LH2SO4。
操作方法：a包被：取96孔ELISA板，将纯化的TT-B7-H4IgV蛋白溶解于包被缓冲液中(0.5μg/mL)，按100μL/孔加入板孔中，4℃包被过夜，倒掉包被液，加入封闭液，室温封闭2h；b弃去封闭液，用洗涤液洗6次，每次2min分别加入倍比100、1000、10000、100000的稀释的抗TT-B7-H4IgV抗血清，100μL/孔，室温孵育1h；c弃去抗TT-B7-H4IgV抗血清，用洗涤液洗6次，每次3min加入HRP标记的大鼠抗小鼠IgG二抗，100μL/孔，室温孵育1h；d弃去二抗，用洗涤液洗6次，每次3min，加入底物显色液，100μL/孔，室温下显色10-20min；f加入终止液，50μL/孔，终止反应酶标仪读数，测定每孔在490nm的吸光值。
当实验组与对照组OD值之比大于2.0时的最大稀释度判为该抗血清的抗体滴度；实验结果如图5所示，结果显示获得的抗血清中的多抗与纯化后的TT-B7-H4IgV蛋白有较好的结合活性，阴性对照与TT-B7-H4IgV蛋白无特异性结合。其中，非佐剂免疫组(溶解于生理盐水)和佐剂免疫组(与Freund福氏佐剂混合)产生的抗TT-B7-H4IgV抗体的效价都达到1：10000，结果证实经免疫后获得的抗TT-B7-H4IgV抗血清可与TT-B7-H4IgV蛋白特异性结合。
4.2.2 抗TT-B7-H4IgV抗血清与IFN-γ刺激的B7-H4分子表达上调的SP2/0细胞结合鉴定
4.2.2.1 IFN-γ对TT-B7-H4IgV在SP2/0细胞上表达的刺激实验
小鼠SP2/0细胞(小鼠骨髓瘤细胞)低表达B7-H4蛋白，传代后加入终浓度为20ng/ml的IFN-γ刺激2天后，用流式细胞术检测大鼠抗小鼠B7-H4单抗(大鼠抗小鼠B7-H4单克隆抗体购于R&D公司)分别与IFN-γ刺激前和刺激后的SP2/0细胞的结合情况。
所需溶液的配制：
a 储存液(DPBS×10)：NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4 11.5g，KH2PO4 2g，蒸馏水加至1000ml，临用时用蒸馏水1：10稀释。
b 洗涤液：DPBS×1 900ml，FCS 50ml(终浓度5％)，4％NaN3 50ml(终浓度0.2％)。
c 固定液：DPBS×1 1000ml，葡萄糖20g(终浓度2％)，甲醛10ml，NaN3 0.2g(终浓度0.02)。
操作步骤：
(1)取对数生长期的细胞，经胰酶消化后，用10％FCS DMEM(胎牛血清浓度为10％的DMEM培养基)调整细胞浓度为1×107/ml。
(2)各取40μlSP2/0细胞悬液分别加入预先有2ul Anti-mB7-H4单抗、2μlAnti-Blys单抗(对照)的塑料离心管中，再各取40μl IFN-γ刺激后的SP2/0细胞悬液分别加入预先有10ul Anti-mB7-H4单抗、10μlAnti-Blys单抗(对照)塑料离心管，每管加50μl 1:20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清，4℃静置30min，间隔15min重悬一次。
(3)用洗涤液洗涤3次，每次加入1ml(1000rpm×5min，4℃)。
(4)弃上清，加入50μl 1：50稀释的FITC(异硫氰酸荧光素)标记的羊抗鼠二抗，充分振摇，4℃避光静置30min，间隔15min重悬一次。
(5)用洗涤液洗涤3次，每次加入1mL(1000rpm×5min，4℃)。
(6)加400μl固定液固定后，FCM(流式细胞计数)分析。
实验结果如图6A、B所示：SP2/0细胞上表达B7-H4分子(8.3％)，发现IFN-γ可以刺激B7-H4在SP2/0细胞膜上表达增多(52.0％)。
4.2.2.2 抗TT-B7-H4IgV抗血清与IFN-γ刺激的SP2/0细胞结合鉴定
用IFN-γ刺激后的SP2/0细胞分别与大鼠抗小鼠B7-H4单抗和已获得的抗血清相互作用，以生理盐水组抗血清作为阴性对照，FITC染色显示流式细胞术检测。
大鼠抗小鼠B7-H4单抗(浓度500μg/ml)2μl和抗TT-B7-H4IgV抗血清10μl与6×105个细胞有较好的结合活性，检测结果分别为52.8％、48.5％；如图6C、D所示；证明用融合蛋白TT-B7-H4IgV免疫小鼠产生的抗血清能够有效地和表达在SP2/0肿瘤细胞表面的B7-H4结合，说明用融合蛋白TT-B7-H4IgV免疫小鼠产生了抗B7-H4的多克隆抗体，且该多克隆抗体可以与表达在SP2/0细胞上的B7-H4结合(48.5％)。
5 抑瘤实验
5.1 分组并免疫小鼠
BALB/c小鼠，共20只，体重：18～20g，随机分2组，每10只一组。A组：实验组，按照上述4.1有关“B7-H4IgV+生理盐水组”所述的免疫方案，用生理盐水溶解B7-H4IgV蛋白进行免疫，四次免疫完毕后隔周持续进行腹腔免疫；B组：对照组，仅用生理盐水，免疫方法与A组相同。
5.2 接种肿瘤细胞
第4次免疫后10天检测抗体滴度，发现A组小鼠抗血清中抗B7-H4抗体滴度均升高达到1：10000以上；取对数生长期状态的SP2/0肿瘤细胞，按照5×106/只接种至小鼠背部皮下，12天后肿瘤组织生长至可检测的水平。
每周观察小鼠体内抗体滴度变化，待观察到形成肿瘤组织块后隔天检测肿瘤体积和小鼠体重，小鼠死亡时取出肿瘤组织称重。肿瘤体积(cm3)＝宽度(cm)2×长度(cm)×0.52。统计学处理：数据以x±SD表示，采用SPSS软件进行统计分析，数据采用t检验，p<0.05为有统计学意义。
结果显示：在实验的整个过程中，实验组有8只小鼠成瘤，对照组有9只小鼠成瘤，两组的成瘤小鼠都不存在肿瘤完全消退的情况，如图8所示。对于肿瘤体积测量如图7所示，在接种肿瘤细胞第14天(第一次测量)，A组(实验组)的小鼠肿瘤组织体积和B组(对照组)小鼠的肿瘤组织大小相差不大，P>0.05；在接种肿瘤细胞第16天(第二次测量)，两组小鼠的肿瘤组织大小对比分析，无统计学意义，P>0.05；到接种肿瘤细胞第18天(第三次测量)，A组的肿瘤组织生长速度有低于B组的趋势，但仍无统计学意义，P>0.05；到了接种肿瘤的第20天(第四次测量)，B组小鼠的肿瘤生长速度明显快于A组小鼠的生长速度，B组最大的肿瘤组织块体积达0.86cm3，A组最大的肿瘤体积为0.37cm3，统计两组的肿瘤组织大小，P<0.05；在接种肿瘤细胞的第22天(第五次测量)，A组小鼠的肿瘤组织块大小无明显的变化，B组小鼠的肿瘤组织增长迅速，两组肿瘤组织大小区别进一步加大，P<0.05；到接种后的第24天(第六次测量)，B组(对照组)有一只小鼠死亡，对两组的肿瘤细胞生长情况观察终止，测量两组小鼠的肿瘤组织大小，B组最大的肿瘤组织块为1.30cm3，A组最大的肿瘤组织块为0.60cm3，统计两组的肿瘤体积大小，B组的肿瘤体积明显大于A组的肿瘤体积，P<0.05。小鼠死亡后取出肿瘤称重，其结果如表1所示。
在接种肿瘤细胞约18天后，对照组小鼠的肿瘤生长速度明显快于实验组，且小鼠肿瘤开始破溃，明显消瘦，活动减少，但两组小鼠的体重均无明显减轻，两者间体重对比也无统计学意义。与生理盐水组相比，B7-H4IgV组肿瘤体积大小在接种肿瘤细胞后20天，22天，24天与生理盐水组有统计学差异(t＝4.576，P＝0.0004)，如图7所示。B7-H4IgV组的肿瘤重量小于生理盐水对照组，B7-H4IgV蛋白的抑瘤率达到48.6％。
表1

融合蛋白TT-B7-H4IgV氨基酸或核苷酸序列表
<110>中国人民解放军第四军医大学
<120>融合蛋白TT-B7-H4IgV及其制备方法和用途
<160>2
<210>1
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys
1               5                   10                 15                20
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Ala Ala Ala Glu Phe Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile
21              25                  30                 35                 40
Lys Leu Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Leu Gly Leu Val His Glu
41             45                   50                55                 60
Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met Phe Arg Gly Arg Thr Ala
61             65                  70                75                 80
Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu
81            85                  90                95                 100
Thr Asp Ala Gly Thr Tyr Lys Cys
101           105           108
<210>2
<211>333
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatcccagt atataaaagc aaattctaaa    60
tttataggta taactgaagc agcagcagaa ttcctgagct gcacttttga acctgacatc    120
aaactttctg atatcgtgat acaatggctg aaggaaggtg ttttaggctt ggtccatgag    180
ttcaaagaag gcaaagatga gctgtcggag caggatgaaa tgttccgcgg ccggacagca    240
gtgtttgctg atcaagtgat agttggcaat gcctctttgc ggctgaaaaa cgtgcaactc    300
acagatgctg gcacctacaa atgttgagtc gac                                 333