转基因产品检测寡核苷酸芯片的制作方法及其应用 【技术领域】
本发明涉及一种核酸检测技术，特别是涉及一种用于转基因产品检测的寡核苷酸芯片的制作方法及其应用。
背景技术
随着生物技术的快速发展，通过将异源基因导入天然植物的基因组，实现对其原有基因的改造，以期得到具有高营养、高抗逆性等优化性状的植物新品种，并进而提高以其为原料的食品和/或饲料的品质，目前正处于广泛地研究和应用中。
据国际农业生物技术应用咨询服务中心(ISAAA)统计，2001年全世界转基因产品种植面积为5260万公顷，全球现有十多个国家已种植了转基因产品，其中99％的转基因产品种植在美国、阿根廷、加拿大和中国，已批准商业化的转基因产品有大豆、玉米、油菜、棉花、西红柿、马铃薯等。据估计，用这些转基因产品生产加工的食品全世界有近万种。
与此同时，这类通过转基因技术得到的植物和/或以其为原料的食品对人和动物的健康以及生态环境的影响，自转基因技术出现以来，就一直是世界各国及联合国等国际组织关心的焦点问题。
2000年联合国通过了《生物安全议定书》，要求成员国对所有进出境的转基因产品进行检验。全球现已有36个国家和地区出台了各种与转基因产品有关的法律法规。我国政府也高度重视转基因产品的检测，2000年国家科技部批准了国家质检总局“国家转基因产品检测实验室及转基因产品检测方法体系的建立”专项，致力于转基因产品检测方法和工具的研究。
进出口转基因产品地检测，需要解决以下几方面的问题：1.是否为转基因产品；2.是否为某国已批准商业化的转基因产品或品系(EVENT，即由哪家厂商生产的哪种转基因产品)3.如果同时满足上述两项，则还需进一步测定该产品中转基因成份的含量是否在“阈值”内(各国的阈值标准不一)。如果该产品不在该国政府已批准商业化的转基因产品之列或者虽属批准产品但含量超标，则原则上禁止进口或销售。
纵览世界各国转基因产品的检测技术，根据待检对象的不同可分为以下三类：1.检测转基因产品中的异源插入基因；2.检测异源基因的表达物(RNA或蛋白质)；3.检测插入异源基因对受体生物基因表达的影响(主要检测异源基因对其插入位点附近的基因表达的影响以及对整个受体生物代谢产物的影响)。由于第三种方法的检测成本高、耗时长，故目前在实际工作中多应用前两种方法，其检测对象包括：DNA、RNA和蛋白质。其中，蛋白质的检测主要通过血清学方法，由于有些转基因产品不表达蛋白质或表达量不稳定，故血清学方法仅能在个别转基因产品的检测中应用；对DNA和/或RNA的检测则主要采用PCR或直接核酸杂交等基因扩增诊断技术。
基因扩增诊断技术发展迄今可分为以下几类：PCR/电泳检测、传统杂交或测序、PCR-ELISA、实时荧光PCR等。上述方法都是检测单一基因，而转基因产品的检测，特别是一些混合样品如混合原料、食品和饲料等往往需要同时检测几个、几十个、甚至上百个基因，上述方法显然无法满足需求。
基因芯片是20世纪80年代末在美国出现的一项新兴技术。其原理类似于Southern杂交，即事先对支持物(基片)表面进行特定处理使其带上正电荷，将寡核苷酸片段或cDNA用高精度的点样仪喷或点到基片表面制成基因芯片(6.5cm2范围内可容纳100000个核酸位点)。再用荧光标记的待检目标核酸与芯片杂交，最后用专门的高精度扫描仪进行杂交信号的检测。
根据基因芯片上固定的探针长度的不同，可将其分为寡核苷酸芯片(寡核苷酸探针阵列)和cDNA芯片两类。前者以寡核苷酸片段作为探针，后者则以较长的PCR产物作为探针。根据基因芯片的不同用途可将其分为表达谱芯片和诊断检测芯片，表达谱芯片主要用于检测基因的差异性表达、寻找新基因及研究基因功能；诊断检测芯片则广泛应用于各种特定基因序列的检测、基因突变和寡核苷酸多态性的检测，也有人用其进行基因测序。
与普通杂交方法相比，基因芯片的优点在于：通过使用高精确度的点样仪和扫描仪，一次实验便能同时检测几十、几百、甚至成千上万个基因，即具有“高通量”的特点；提高了检测的灵敏度和精确度，结果判断更科学；提高了检测速度和自动化程度，降低了实验成本。
中国实用新型专利ZL 01214517.3公开了一种用于转基因产品鉴定的基因检测芯片，即在平面型支撑载体的平面上被覆有带正电荷材料的膜层，在该膜层的表面以微点阵方式排布有供转基因产品判断用的异源基因探针。但在其说明书未提供任何有关检测探针序列及待检靶基因扩增引物的信息，故根本无法应用于实际工作中。
因此，开发一种灵敏、准确、操作简便的用于转基因产品检测的寡核苷酸芯片是解决目前国内乃至国际转基因产品鉴定难题的当务之急。
【发明内容】
本发明目的之一是填补现有技术的空白，提供一种能用于多种转基因产品检测的寡核苷酸芯片(寡核苷酸探针阵列)；
本发明的另一目的是提供上述芯片的制作方法；
本发明的另一目的是提供与上述多种植物的待检靶基因相对应的特异性扩增引物；
本发明的另一目的是提供上述芯片在检测转基因产品中的应用。
本发明的构思如下：
1.通过政府及国际组织网站、GENEBANK等核酸数据库、专利数据库收集多种已商品化的转基因产品的基因构建图及相应的异源插入基因，并通过克隆和测序给予补充和验证。这些异源插入基因可分为两类：1.启动子、终止子和标记基因；2.性状基因(目标基因，即能改变植物性状的异源核苷酸片段)。根据这些异源插入基因设计相应的探针和引物。
2.收集棉花、大豆、油菜、玉米、马铃薯等五种作物的特异性物种内标基因，据此设计相应的寡核苷酸探针和引物。
3.鉴于不同厂商生产的转基因产品即使含有相同的异源插入基因，其插入位点也各不相同，故通过检测转基因产品基因组中所含异源基因的插入位点(检测这些插入片段的特异性边界序列)即可鉴定出该转基因产品是哪家厂商的产品(品系，EVENT)。本发明人遂测定了Bt9、Bt176、Bt11、Mon810、T25、GA21、RRS(Roundup-ready soybean)、“华蕃一号”等8种转基因作物的特异性边界序列，并据此设计相应的寡核苷酸探针和引物。
4.将上述各类探针分别固定在不同玻片上或者固定在一张玻片的不同区域内，便可达到对多种转基因产品进行筛选、品种检测及品系鉴定的目的。
本说明书和权利要求书中使用的下列异源插入基因名称缩写除非特别说明具有如下含义：
CaMV35s终止子：花椰菜花叶病毒(CaMV)35S终止子；
CaMV35S启动子：花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子；
CaMV CP：花椰菜花叶病毒(CaMV)壳蛋白；
EPSPS：来源于土壤杆菌Agrobacterium，其编码产物为突变型5-稀醇丙酮酰草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)；
Cry I A(b)：苏云金杆菌毒蛋白基因IA(b)，来源于苏云金杆菌Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki；
Cry I A(c)：苏云金杆菌毒蛋白基因IA(c)，来源于苏云金杆菌Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki；
Cry9C：苏云金杆菌毒蛋白基因9C，来源于苏云金杆菌Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki；
CryIIIA：苏云金杆菌毒蛋白基因IIIA，来源于苏云金杆菌Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki；
Nos启动子：Ti烟脂碱合成酶启动子；
Nos终止子：Ti烟脂碱合成酶终止子；
Bar：来源于链霉菌Streptomyces viridochromogenes，其编码产物为草丁磷乙酰转移酶；
Barnase：来源于淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，其编码产物为雄性不育蛋白；
Barstar：来源于淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，其编码产物为育性恢复蛋白；
FMV35S启动子：玄参类植物35S启动子(35S promoter from a modified figwort mosaicvins)；
Gox：来源于细菌Ochrobactrum anthropi，其编码产物为头部修饰的草甘磷氧化还原酶；
Npt II：来源于大肠杆菌E.coli，其编码产物为新霉素磷酸转移酶；
PAT：来源于链霉菌Streptomyces viridochromogenes，其编码产物为草丁磷乙酰转移酶；
Rbcl：其编码产物为1，5-双磷酸盐碳酸酵素大亚基；
Lectin：其编码产物为植物血凝素；
Fbp：其编码产物为叶绿体果糖-1，6-双磷酸盐；
Zein：其编码产物为玉米蛋白；
其中，用于转基因产品“普筛”(判断该植物是否为转基因产品)的待检异源插入基因包括：CaMV35S启动子、Nos终止子、Nos启动子、CAMV35S终止子、FMV35S启动子、Bar、PAT、Npt II、CaMV-CP。其中，CaMV-CP是用于判断CaMV35s启动子阳性是否是由于待检样品受到了花椰菜花叶病毒污染所致，以防假阳性的出现。
用于转基因产品“品种检测”的待检异源插入基因及物种内标基因包括：
转基因大豆：Lectin、CaMV35S启动子、Nos终止子、EPSPS(大豆)；
转基因玉米：Zein、CaMV35S启动子、CaMV35s终止子、Nos终止子、Bar、Cry9C、PAT、CryIA(b)1；
转基因棉花：CaMV35S启动子、Nos终止子、NptII、CryI A(c)；
转基因油菜：Fbp、CaMV35S启动子、Nos终止子、FMV35S启动子、EPSPS(油菜)、GOX、Bar、PAT、Barnase、Barstar。
用于转基因产品“品系鉴定”的特异性边界序列如下所示：BT9
GTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTC
GCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGAACACGGGGTCATT
TCTCTATTACTTCAGCCATAACAAAAGAACTCTTTTCTCTOTCTTATAAACCAAAAACC
ATGGCTGACTACCTGCAGATGACCGACGAGGACTACACCGACAGCTAC <210>94
下划线部份为插入片段35S启动子，另一部份为Bt9基因组序列(Petunia CTP Leadingsequence)。
BT176
TTTCCTCCCGATACGCCCCTCCATCTCTCGCCGTTCATGTCCGTGGCTGGCTGCCCTCC
GTGGGAGCAGGCTGGCCGCACTCGTTCCCCGCCGCAGCCGGATCCAACAATGGACAA
CAACCCCAACATCAACGAGTGCATCCCCTACAACTGCCTGAGCAATCCCGAGGTGGA
GGTGCTGGGCGGCGAGCGCATCGAGACCGGCTACACCCCCATCGACATCAGCCTGAG
CCTGACCCAGTTCCTGCTGAGCGAGTTCGTGCCCGGCGCCGGCTTCGTGCTGGGCCTG
GTGGACATCATCTGGGGCATCTTCGGCCCCAGCCAGTGGGACGCCTTCCTGGTGCAG
ATCGAGCAGCTGATCAACCAGCGCATCGAGGAGTT<210>95
下划线部份为插入片段Cry I A(b)，另一部份为BT176基因组序列(P-CDPK)。
GA21
ATGGTGGCTCCGTTCACCGGCCTTAAGTCCAACGCCGCCTTCCCCACCACCAAGAAGG
CTAACGACTTCTCCACCCTTCCCAGCAACGGTGGAAGAGTTCAATGTATGCAGGTGTG
GCCGGCCTACGGCAACAAGAAGTTCGAGACGCTGTCGTACCTGCCGCCGCTGTCTAT
GGCGCCCACCGTGATGATGGCCTCGTCGGCCACCGCCGTCGCTCCGTTCCAGGGGCTC
AAGTCCACCGCCAGCCTCCCCGTCGCCCGCCGCTCCTCCAGAAGCCTCGGCAACGTCA
CGCAACGGCGGAAGGATCCGGTGCATGGCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCAGCCC
ATCAAGGAGATCTCCGCGGCACCGTCAAGCTGCCGGGGTCCAAGTCGCTTTCCAACCGG
ATCCTCCTACTCGCCGCCCTGTCCGAGGGGACAACAGTGGGTTGATAACCTGCTCGAAC
<210>96
下划线部份为插入片段EPSPS(Corn EPSPS)，另一部份为GA21基因组序列(Corn Ctp)。Mon810
TCGAAGGACGAAGGACTCTAACGTTTAACATCCTTTGCCATTGCCCAGCTATCTGTCAC
TTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATCCCATCATTGCGATAA
AGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCC
ACCCACGAGGAGCATCGTGGA<210>97
下划线部分为插入序列，另一部分为MON810玉米基因组序列。BT11
GGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAG
AGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTG
CGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAA
ACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGA
AAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGA
ACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGGAAGTCGATGATA <210>98
下划线部份为插入序列，另一部分为BT11玉米基因组序列。
T25
AAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACG
TCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATC
CCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGA
CAGGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACATGTCTCCGGAGAGGAGACCAGTTGAGA
TTAGGCCAGCTACAGCAGCTGATAGGCCGCGGTTTGTGATATCGTTAACCATTACATTG
AGACGTCTACAGTGAACTTTAGGACAGAGCCACAAACACCACAAGAGTGGATTGATG
ATCTAGAGAGGTTGCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTGGAGGGTGTTGT
GGGCTGGTATTGCTTACGCTGGGC <210>99
下划线部份为35S启动子，另一部份为PAT。
RRS(Roundup Ready soy)
GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCCACTTGCT
TTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGTGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCA
TCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTCAACGATGGCCTTTCCTTTATCGCAATG
ATGGCATTTGTAGGAGCCACCTTCCTTTTCCATTTGGGTTCCCTATGTTTATTTAACCT
GTATGTATGATCTTATTTTGAATGAAATGCAATAAGTTATTTCTAGTAAAAAAAAATAAA
CATTTGATAGAAACAAATTAAAGCATGCAAAAATAACTCATTAGCATCGGTTAAATTGA
AGGGTTTGAATAATTTGCACAAGGTTCTGAATTC <210>100
下划线部分为35S启动子，另一部分为RRS基因组序列。
华蕃一号
CAGAGACTAAAAGGAAGACCATTGATATTCTTGCAAACTGCATTTAAGGAGGCAATAA
AGTAGGGACTTTACACTTGCATATTCTTTAAAAACAGACAAAAATAGGCGGGAAACGA
CAATCTGATCATGAGCGGAGAATTAAGGGAGTCACGTTATGACCCCCGCCGATGACGC
GGGACAAGCCGTTTTACGTTTGGAACTGACAGAACCGCAACGTTGAAGGAGCCACTC
AGCCGCGGGTTTCTGGAGTTTAATGAGCTAAGCACATACGTCAGAAACCATTATTGCGC
GTTCAAAAGTCGCCTAAGGTCACTATCAGCTAGCAAATATTTCTTGTCAAAAATGCTCC
ACTGACGTTCCATAAATTCCCCTCGGTATCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCC
AAATAATCTGCACCGGATCTGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCA
GGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAA
<210>101
下划线部份为插入序列，另一部份为西红柿“华蕃一号”基因组序列。
本发明的技术方案如下：
本发明之转基因产品检测寡核苷酸芯片实质上是一种寡核苷酸探针阵列，根据待检植物靶基因的不同设计不同的15-35聚探针，且使这些探针的Tm值(解链温度)基本相同。这些探针包括但不限于： 异源插入基因 探针 长度 Tm CaMV35S启动子 TGCTCCACCATGTTGACGAAG<210>1 21 61.6 FMV35S启动子 AAAACCAAGAAGGAACTCCCATC<210>4 23 60.7 CAMV35终止子 GAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAA<210>7 30 60.0 Nos启动子 GACCTTAGGCGACTTTTGAACG<210>10 22 60.9 Nos终止子 AATCCTGTTGCCGGTCTTGC<210>13 22 62.3 NptII GCTCCTGCCGAGAAAGTATCC<210>16 21 60.6 Bar CTGTGCCTCCAGGGACTTCA<210>19 20 60.5 PAT GCCACAACACCCTCAACCTCA<210>22 21 62.8 Barnase GTCTGAAGATATCCGCAACCC<210>25 22 60.4 Barstar ACCTGGACGCTTTATGGGATT<210>28 21 60.3 EPSPS(大豆) GGAAAGGCCAGAGGATTTGC<210>31 20 61.1 EPSPS(油菜) GGGTCTTGTTGGTGTTTACGATT<210>34 23 60.1 Cry I A(b) CAGCACGGGGTTGGTGTAGAT<210>37 21 62.1 Cry I A(c) TCTGGTAGATGTGGATGGGAAGT<210>40 23 60.1 CryIIIA AAGCTGCCAACACCCACTTG<210>43 20 60.8 Cry9C CAAGTACACCAACTACTGCGAGACC<210>46 25 62.3 GOX GTTCTTCAGAACTGGCAGGAGC<210>49 22 60.7 CaMV-CP TATGACAACTACCGACGACTCGA<210>52 23 60.0 植物物种 内标基因 探针 长度 Tm Lectin TCTATCAGATCCATCAAAACGACG<210>55 24 61.1 Zein TTCTGGCTCTAACTTGGTTCCG<210>58 22 61.3 Fbp TGCTACTCGTTTCCCGCTCA<210>61 20 61.7 Rbcl(棉花) GGTGGGCTTGATTTTACCAAAG<210>64 22 60.7 Rbcl(马铃薯) TGTCTTCGAGGTGGACTTGATTT<210>67 23 60.5 植物特异 边界序列 探针 长度 Tm Bt9c AGAGAAATGACCCCGTGTTCTC<210>70 22 60.0 Bt176 GGGGTTGTTGTCCATTGTTGG<210>73 21 62.2 GA21 GATCCGGTGCATGGCCG<210>76 17 63.2 Mon810 GGGCAATGGCAAAGGATGTT<210>79 20 62.1 BT11 GACGCTCAGTGGAACGAAAACT<210>82 22 61.0 BT25 CTCCGGAGACATGTCGACTCTAG<210>85 23 60.6 RRS AAAATAAACATAGGGAACCCAAATG<210>88 25 60.5 华蕃一号 GATTACGAATTCCCATGGAGTC<210>91 22 60.0
通过点样仪将上述探针转移到经化学基团修饰的玻片上，经SDS、纯水处理制成。玻片修饰基团可选自醛基、异硫氰基或巯基之一。
另外，为了监控杂交反应中的非特异性杂交，特设立阴性对照，该阴性对照为一段与待检靶基因无关的寡核苷酸片段(探针)；该寡核苷酸片段可选自人类、微生物等的基因组序列。若杂交后检测无信号，表明正常；若有信号，表明杂交失败。
为了监控杂交反应中假阴性的出现，特设立阳性对照，该阳性对照为一段与18SrRNAPCR产物相配对的寡核苷酸片段(探针)；同时，该寡核苷酸片段亦用作探针阵列的定位点，用于确定探针阵列杂交区的位置；若杂交后检测有信号，表明正常；若无信号，表明杂交失败。
为了减少杂交的空间位阻，合成时，在寡核苷酸片段的5’端加一段polyT(连接臂)，连接臂的长度为5-20聚时，杂交效果好。最后，为了使寡核苷酸片段能固定在玻片上。在寡核苷酸片段的5’端须进行化学基团修饰。当玻片修饰基团为异硫氰基或醛基时，采用氨基修饰；当玻片修饰基团为巯基时，采用巯基修饰。
将上述合成好的探针溶解在0.1M pH9.0的Na2CO3/NaHCO3溶液中制成终浓度为10μM的点样液；同时设立不含寡核苷酸片段的点样液，作为空白对照，用于监控杂交后的背景。若杂交后检测无信号，表明正常；若有信号，表明点样液受污染。
将点样液加于点样板中，用点样仪点成所要的矩阵，37℃放置1-2h，1％氨水冲洗一次，晾干备用。
本发明的转基因产品检测芯片的制作方法如下：
1.载玻片的修饰；
2.探针设计及合成；
3.探针的固定。
具体步骤包括：
1.载玻片的修饰
根据修饰基团的不同，可采用三种方法制备玻片：
1)PDC法制备玻片
将净玻片浸于含1％3-氨丙基三甲基硅烷的95％丙酮溶液中2min，丙酮浸洗5min，重复6次，110℃烘烤45min，再将玻片浸于含0.2％1，4-苯二异氰酸酯的10％吡啶/DMF溶液中2h，丙酮溶液冲洗一次，室温晾干，放于4℃备用；
2)戊二醛法制备玻片
将净玻片浸于1N NaOH溶液中煮沸10分钟进行羟基化预处理。将预处理过的玻片浸于含1％3-氨丙基三甲基硅烷的95％丙酮溶液中2min，丙酮浸洗5min，重复6次，110℃烘烤45min，再将玻片浸于5％戊二醛水溶液中50℃条件下过夜。取出玻片，用0.2％SDS洗涤5分钟，重复3次，室温晾干备用；
3)二硫键法制备玻片
将净玻片用25％的氨水浸泡过夜，MilliQ水浸洗三分钟，无水乙醇冲洗一次，室温下将玻片浸在1％MPTS、95％乙醇、16mM乙酸溶液中30分钟，95％乙醇、16mM乙酸溶液冲洗一次，N2罐中6～8小时。
2.探针设计及合成
设计15-35聚针对不同待检靶基因的寡核苷酸探针，且尽量将针对不同探针的Tm值(解链温度)调整到基本相同。
另外，为了监控杂交反应中的非特异性杂交，特设立阴性对照，该阴性对照为一段与待检靶基因无关的寡核苷酸片段(探针)；该寡核苷酸片段可选自人类、微生物等的基因组序列；
为了监控杂交反应中假阴性的出现，特设立阳性对照，该阳性对照为一段与18S rRNAPCR产物相配对的寡核苷酸片段(探针)；同时，该寡核苷酸片段亦用作探针阵列的定位点，用于确定探针阵列杂交区的位置；
为了减少杂交时的空间位阻，合成时，在寡核苷酸片段的5’端加上一段连接臂(polyT)，实验证明，连接臂的长度为5-20聚时，杂交效果好。此外，为了使寡核苷酸探针能固定在玻片上，还需在其5’端进行化学基团修饰。当玻片修饰基团为异硫氰基或醛基时，采用氨基修饰；当玻片修饰基团为巯基时，采用巯基修饰。
3.探针的固定
合成上述探针(由TaKaRa公司合成)，按所给nmol数，加TE(PH7.5)配成100uM的贮存液，取10ul以TE(PH7.5)稀释5倍，配成20uM浓度50ul(最好用GeneQuant仪定量后将浓度调整一致)，从中取20ul与20ul 0.1M PH9.0 Na2CO3/NaHCO3缓冲液对倍稀释成终浓度为10uM的点样液40ul。同时设立不含寡核苷酸片段的点样液为空白对照，用于监控杂交后的背景。
取上述点样液各8ul于384孔板中，用点样仪点成所要的矩阵。各条探针重复点样5次，点间距500um。37℃放置1-2h，1％氨水冲洗一次，晾干备用。
本发明的转基因产品检测芯片的应用方法如下：
1.根据待检靶基因设计相应的PCR扩增引物，分别为： 靶基因名称 引物序列(5’-3’) Tm 产物长度 (bp) CaMV 35S 启动子 AGACTGGCGAACAGTTCATACAGA<210>2 60.8 188 GCAATGGAATCCGAGGAGGT<210>3 61.1 FMV35S 启动子 CAGCATTCCAGATTGGGTTCA<210>5 60.7 172 CTTTTGGCTAATGGTTTGGAGAC<210>6 60.1 CaMV35s 终止子 CCCAGATAAGGGAATTAGGGTTC<210>8 60.5 134 CCCTGGATTTTGGTTTTAGGAAT<210>9 60.9 Nos终止子 TGAATCCTGTTGCCGGTCTT<210>13 60.2 138 AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC<210>14 60.1 NptII GGAAGGGACTGGCTGCTATTG<210>17 61.3 157 GATGTTTCGCTTGGTGGTCG<210>18 61.1 Nos启动子 GAACCGCAACGATTGAAGGA<210>11 60.8 177 TGGATACCGAGGGGAATTTATG<210>12 60.7 Cry I A(b) TGTTCCCCAACTACGACTCCA<210>38 60.2 151 AGGTGCGGGCTCCTGATGCT<210>39 66.5 Cry I A(c) AGACTCAACAGCAGTGGAAATAACA<210>41 60.2 123 GTGAATAGGGGTCACAGAAGCATA<210>42 60.3 Cry9C CTGCTGCTGCTGAAGGATGC<210>47 61.7 199 CCCTGCGGAACTGGTGGTAG<210>48 62.6 CryIIIA GGTTCTTTTCCTCACTACCTATGCTC<210>44 61.6 101 CCTCTTTCTCGTATCCCCACTCTT<210>45 62.3 GOX AGTTCGCTGGTCTCACTGCTG<210>50 60.3 133 GGACGGAAACCCATCCACTT<210>51 60.9 EPSPS (大豆) AGAGCCGTGGATAGATTAAGGAAG<210>32 60.6 149 AGACCGCCGAACATGAAGGA<210>33 62.6 EPSPS (油菜) GGGTCTTGTTGGTGTTTACGATT<210>35 60.1 182 TGTAGGTGATTGGCGTTGGAG<210>36 60.9 Barnase TCCGTTTGTTTACTGGTGCTTG<210>26 60.5 192 GAGGGCTTGTGCTTCTGATTTT<210>27 60.4 Barstar AACAAATCAGAAGTATCAGCGACCT<210>29 60.9 145 AACTGCCTCCATTCCAAAACG<210>30 61.6 Bar GCTCCACGCTCTACACCCAC<210>20 60.2 181 AAACCCACGTCATGCCAGTT<210>21 60.0 PAT GACAGAGCCACAAACACCACAA<210>23 60.7 144 CAATCGTAAGCGTTCCTAGCCT<210>24 60.8 CaMV-CP GGGACCAAATTATTGATCTAACCTCT<210>53 61.0 148 TCTCCTGAATCGCTTTCGTCTT<210>54 60.9 Lectin CAAGTCGTCGCTGTTGAGTTTG<210>56 61.0 165 GCTGGTGGAGGCATCATAGGT<210>57 61.3 Fbp CCTCACCTCAGCCACGAATC<210>62 60.1 169 GTCAGTGTTTGAAGCTCATACCCA<210>63 61.0 Zein CCAAGAACTGGATGAACGGTTAG<210>59 60.7 184 GAGAAGCCGGTCGAGGTAGATAG<210>60 61.5 Rbcl (棉花) GATTATCCGCTAAGAATTACGGTAGA<210>65 60.4 134 TTCGGCACAAAATAGGAAACG<210>66 60.6 Rbcl (马铃薯) GAGCGGGATAAATTGAACAAGTATG<210>68 61.7 198 TTCGGCACAAAACAAGAAACG<210>69 61.4 18s RNA GAGAAACGGCTACCACATCCA<210>103 60.0 254 CGTGCCATCCCAAAGTCCAA<210>104 60.8 Bt9c CCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATA<210>71 63.3 190 GTAGCTGTCGGTGTAGTCCTCGT<210>72 60.3 Bt176 CTCTCGCCGTTCATGTCCGT<210>74 60.0 213 GGTCAGGCTCAGGCTGATGT<210>75 60.0 GA21 ACGGTGGAAGAGTTCAATGTATG<210>77 60.0 270 TCTCCTTGATGGGCTGCA<210>78 59.6 Mon810 TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG<210>80 62.7 170 TCCATCTTTGGGACCACTGTC<210>81 61.4 Bt11 GCTGAAGCCAGTTACCTTCGG<210>83 61.6 212 TATCATCGACTTCCATGACCA<210>84 60.0 T25 CCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATA<210>86 62.1 231 AGATCATCAATCCACTCTTGTGGTG<210>87 60.6 RRS TGTAGGAGCCACCTTCCTTTTC<210>89 61.2 177 AACCCTTCAATTTAACCGATGC<210>90 60.2 华蕃一号 TACGGCGAGTTCTGTTAGGTCC<210>92 62.0 146 CCAGGCTTTACACTTTATGCTTC<210>93 62.3
2.基因组DNA抽提：
可采用CTAB法或其他公司生产的DNA抽提试剂盒，均为现有公知技术。
3.PCR反应标记
对待检靶基因进行荧光标记可采用标记引物法、荧光掺入法或TDT酶加法。具体如下：
标记引物法反应体系采用25ul反应体系。各成分加量为10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.5ul，dNTP(10mM)0.5ul，各引物终浓度0.3uM，模板DNA 100ng，Taq酶0.5ul，ddH2O补足体积至25ul。PCR反应程序：94℃ 3min变性；94℃ 15S，55℃ 15S，72℃ 15S，35个循环；72℃ 10min。实验过程注意避光。
掺入法反应体系采用25ul反应体系。各成分加量为10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.5ul，d(ATG)TP(10mM)0.5ul，dCTP(1mM)0.5ul，Cy5-dCTP(0.1mM)0.5ul，各引物终浓度0.3uM，模板DNA 100ng，Taq酶0.5ul，ddH2O补足体积至25ul。PCR反应程序：94℃ 3min变性；94℃ 15S，55℃ 15S，72℃ 15S，35个循环；72℃ 10min。实验过程注意避光。
TDT酶加法反应体系采用25ul反应体系。各成分加量为10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.5ul，dNTP(10mM)0.5ul，各引物终浓度0.3uM，模板DNA 100ng，Taq酶0.5ul，ddH2O补足体积至25ul。PCR反应程序：94℃ 3min变性；94℃ 15S，55℃ 15S，72℃ 15S，35个循环；72℃ 10min。实验过程注意避光。
取PCR反应产物1ul，5×缓冲液5ul，TDT酶2U，ddH2O补足体积至25ul。37℃ 30min。
4.杂交
取6ul PCR反应液，加经55℃预热的杂交液6μl，混匀后95℃ 3分钟、0℃5分钟后全部转移到芯片的点样区域，加盖玻片(注意不要有气泡)；杂交舱里加几滴水，以保持湿度；将芯片放入杂交舱，密封杂交舱，然后放进55℃水浴内保温1小时。
5.洗片
打开杂交舱，取出芯片，用0.2％SDS冲掉盖玻片，然后把芯片放入盛有0.2％SDS的染色缸，放置5分钟，用ddH2O冲洗二遍。室温避光干燥。
6.扫片
将玻片放入激光共聚焦扫描仪(GMS418扫描仪)扫描，并通过配套软件分析检测结果。
本发明之用于转基因产品检测的寡核苷酸芯片能同时检测多种已商品化的转基因产品的异源插入基因；棉花、大豆、油菜、玉米、马铃薯等五种作物的特异性物种内标基因以及Bt9、Bt176、Bt11、Mon810、T25、GA21、RRS(Roundup-ready soybean)、“华蕃一号”等8种转基因作物的特异性边界序列等多种靶基因，可谓“集转基因产品的‘普筛’、‘品种检测’和‘品系鉴定’等诸多功能于一身”。
其中，对某一转基因作物的“品种检测”涵盖了该作物中可能含有的启动子、终止子、标记基因、性状基因等多种异源插入序列，达到了相互验证的目的；再加之该芯片还设立了阴阳对照和空白对照系统，故而从根本上确保了检测结果的特异性，具有高效、灵敏、准确的特点，有效填补了现有技术的空白。
【附图说明】
图1是本发明的转基因产品检测寡核苷酸芯片的制作及操作流程示意图；
图2是本发明的转基因产品检测寡核苷酸芯片的一种结构示意图，本发明亦可将“普筛”、“品种检测”、“品系鉴定”三类探针分别固定于不同的玻片上，制成三类独立的芯片；
图3是本发明的转基因产品检测寡核苷酸芯片之“普筛”探针的检测结果示意图A为油菜检测结果，CaMV35S启动子、Nos终止子、FMV35启动子、Bar、PAT、NptII阳性；
B为玉米检测结果，CaMV35S启动子、Nos终止子、35S终止子、Bar阳性；
C为大豆检测结果，CaMV35S启动子、Nos终止子阳性；
D为棉花检测结果，CaMV35S启动子、Nos终止子、NptII阳性；
图4是本发明的转基因产品检测寡核苷酸芯片之“植物品种”检测探针的检测结果示意图A为转基因大豆的检测结果；
B为转基因玉米的检测结果；
C为转基因棉花的检测结果；
图5是本发明的转基因产品检测寡核苷酸芯片之“植物品系”鉴定探针的检测结果示意图
A为RRS的检测结果；
B为T25的检测结果；
C为GA21的检测结果；
D为Mon810的检测结果；
【具体实施方式】
实施例1载玻片的修饰
将净玻片浸于含1％3-氨丙基三甲基硅烷的95％丙酮溶液中2min，丙酮浸洗5min，重复6次，110℃烘烤45min，再将玻片浸于含0.2％ 1，4-苯二异氰酸酯的10％吡啶/DMF溶液中2h，丙酮溶液冲洗一次，室温晾干，放于4℃备用。
实施例2探针的设计
设计15-35聚针对不同待检靶基因的寡核苷酸探针，且尽量将针对不同探针的Tm值(解链温度)调整到基本相同。 异源插入基因 探针 长度 Tm CaMV35S启动子 TGCTCCACCATGTTGACGAAG<210>1 21 61.6 FMV35S启动子 AAAACCAAGAAGGAACTCCCATC<210>4 23 60.7 CAMV35终止子 GAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAA<210>7 30 60.0 Nos启动子 GACCTTAGGCGACTTTTGAACG<210>10 22 60.9 Nos终止子 AATCCTGTTGCCGGTCTTGC<210>13 22 62.3 NptII GCTCCTGCCGAGAAAGTATCC<210>16 21 60.6 Bar CTGTGCCTCCAGGGACTTCA<210>19 20 60.5 PAT GCCACAACACCCTCAACCTCA<210>22 21 62.8 Barnase GTCTGAAGATAATCCGCAACCC<210>25 22 60.4 Barstar ACCTGGACGCTTTATGGGATT<210>28 21 60.3 EPSPS(大豆) GGAAAGGCCAGAGGATTTGC<210>31 20 61.1 EPSPS(油菜) GGGTCTTGTTGGTGTTTACGATT<210>34 23 60.1 Cry I A(b) CAGCACGGGGTTGGTGTAGAT<210>37 21 62.1 Cry I A(c) TCTGGTAGATGTGGATGGGAAGT<210>40 23 60.1 CryIIIA AAGCTGCCAACACCCACTTG<210>43 20 60.8 Cry9C CAAGTACACCAACTACTGCGAGACC<210>46 25 62.3 GOX GTTCTTCAGAACTGGCAGGAGC<210>49 22 60.7 CaMV-CP TATGACAACTACCGACGACTCGA<210>52 23 60.0 植物物种 内标基因 探针 长度 Tm Lectin TCTATCAGATCCATCAAAACGACG<210>55 24 61.1 Zein TTCTGGCTCTAACTTGGTTCCG<210>58 22 61.3 Fbp TGCTACTCGTTTCCCGCTCA<210>61 20 61.7 Rbcl(棉花) GGTGGGCTTGATTTTACCAAAG<210>64 22 60.7 Rbcl(马铃薯) TGTCTTCGAGGTGGACTTGATTT<210>67 23 60.5 植物特异 边界序列 探针 长度 Tm Bt9c AGAGAAATGACCCCGTGTTCTC<210>70 22 60.0 Bt176 GGGGTTGTTGTCCATTGTTGG<210>73 21 62.2 GA21 GATCCGGTGCATGGCCG<210>76 17 63.2 Mon810 GGGCAATGGCAAAGGATGTT<210>79 20 62.1 BT11 GACGCTCAGTGGAACGAAAACT<210>82 22 61.0 BT25 CTCCGGAGACATGTCGACTCTAG<210>85 23 60.6 RRS AAAATAAACATAGGGAACCCAAATG<210>88 25 60.5 华蕃一号 GATTACGAATTCCCATGGAGTC<210>91 22 60.0
另外，选取一段人HLA序列，并设计相应的探针(CTGGAACAGCCAGAAGGAC<210>105，长度19，Tm 61)作为阴性对照，用于监控杂交反应中的非特异性杂交；
选取一段与18S rRNA PCR产物相配对的寡核苷酸片段(CGCGCAAATTACCCAATCCTGA<210>102，长度22，Tm 60.4)并设计相应的引物： 靶基因 引物序列(5’-3’) Tm 产物长度 (bp) 18s RNA GAGAAACGGCTACCACATCCA<210>103 60.0 254 CGTGCCATCCCAAAGTCCAA<210>104 60.8
作为阳性对照，用于监控杂交反应中假阴性的出现；同时，亦用作探针阵列的定位点，用于确定探针阵列杂交区的位置；
为了减少杂交时的空间位阻，合成时，在寡核苷酸片段的5‘端加上一段连接臂(polyT)，实验证明，连接臂的长度为5-20聚时，杂交效果好。此外，为了使寡核苷酸探针能固定在玻片上，还需在其5‘端进行氨基修饰。
实施例3探针的固定
合成上述探针(由TaKaRa公司合成)，按所给nmol数，加TE(PH7.5)配成100uM的贮存液，取10ul以TE(PH7.5)稀释5倍，配成20uM浓度50ul(最好用GeneQuant定量后将浓度调整一致)，从中取20ul与20ul 0.1M PH 9.0 Na2CO3/NaHCO3缓冲液对倍稀释成终浓度为10uM的点样液40ul。同时设立不含寡核苷酸片段的点样液为空白对照，用于监控杂交后的背景。
取上述点样液各8ul于384孔板中，用点样仪点成所要的矩阵。各条探针重复点样5次，点间距500um。37℃放置1-2h，1％氨水冲洗一次，晾干备用。
实施例4本发明的寡核苷酸芯片的应用
a. 根据待检靶基因设计相应的PCR扩增引物，分别为： 靶基因名称 引物序列(5’-3’) Tm 产物长度 (bp) CaMV 35S 启动子 AGACTGGCGAACAGTTCATACAGA<210>2 60.8 188 GCAATGGAATCCGAGGAGGT<210>3 61.1 FMV35S 启动子 CAGCATTCCAGATTGGGTTCA<210>5 60.7 172 CTTTTGGCTAATGGTTTGGAGAC<210>6 60.1 CaMV35s 终止子 CCCAGATAAGGGAATTAGGGTTC<210>8 60.5 134 CCCTGGATTTTGGTTTTAGGAAT<210>9 60.9 Nos终止子 TGAATCCTGTTGCCGGTCTT<210>13 60.2 138 AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC<210>14 60.1 NptII GGAAGGGACTGGCTGCTATTG<210>17 61.3 157 GATGTTTCGCTTGGTGGTCG<210>18 61.1 Nos启动子 GAACCGCAACGATTGAAGGA<210>11 60.8 177 TGGATACCGAGGGGAATTTATG<210>12 60.7 Cry I A(b) TGTTCCCCAACTACGACTCCA<210>38 60.2 151 AGGTGCGGGCTCCTGATGCT<210>39 66.5 Cry I A(c) AGACTCAACAGCAGTGGAAATAACA<210>41 60.2 123 GTGAATAGGGGTCACAGAAGCATA<210>42 60.3 Cry9C CTGCTGCTGCTGAAGGATGC<210>47 61.7 199 CCCTGCGGAACTGGTGGTAG<210>48 62.6 CryIIIA GGTTCTTTTCCTCACTACCTATGCTC<210>44 61.6 101 CCTCTTTCTCGTATCCCCACTCTT<210>45 62.3 GOX AGTTCGCTGGTCTCACTGCTG<210>50 60.3 133 GGACGGAAACCCATCCACTT<210>51 60.9 EPSPS (大豆) AGAGCCGTGGATAGATTAAGGAAG<210>32 60.6 149 AGACCGCCGAACATGAAGGA<210>33 62.6 EPSPS (油菜) GGGTCTTGTTGGTGTTTACGATT<210>35 60.1 182 TGTAGGTGATTGGCGTTGGAG<210>36 60.9 Barnase TCCGTTTGTTTACTGGTGCTTG<210>26 60.5 192 GAGGGCTTGTGCTTCTGATTTT<210>27 60.4 Barstar AACAAATCAGAAGTATCAGCGACCT<210>29 60.9 145 AACTGCCTCCATTCCAAAACG<210>30 61.6 Bar GCTCCACGCTCTACACCCAC<210>20 60.2 181 AAACCCACGTCATGCCAGTT<210>21 60.0 PAT GACAGAGCCACAAACACCACAA<210>23 60.7 144 CAATCGTAAGCGTTCCTAGCCT<210>24 60.8 CaMV-CP GGGACCAAATTATTGATCTAACCTCT<210>53 61.0 148 TCTCCTGAATCGCTTTCGTCTT<210>54 60.9 Lectin CAAGTCGTCGCTGTTGAGTTTG<210>56 61.0 165 GCTGGTGGAGGCATCATAGGT<210>57 61.3 Fbp CCTCACCTCAGCCACGAATC<210>62 60.1 169 GTCAGTGTTTGAAGCTCATACCCA<210>63 61.0 Zein CCAAGAACTGGATGAACGGTTAG<210>59 60.7 184 GAGAAGCCGGTCGAGGTAGATAG<210>60 61.5 Rbcl (棉花) GATTATCCGCTAAGAATTACGGTAGA<210>65 60.4 134 TTCGGCACAAAATAGGAAACG<210>66 60.6 Rbcl (马铃薯) GAGCGGGATAAATTGAACAAGTATG<210>68 61.7 198 TTCGGCACAAAACAAGAAACG<210>69 61.4 18s RNA GAGAAACGGCTACCACATCCA<210>103 60.0 254 CGTGCCATCCCAAAGTCCAA<210>104 60.8 Bt9c CCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATA<210>71 63.3 190 GTAGCTGTCGGTGTAGTCCTCGT<210>72 60.3 Bt176 CTCTCGCCGTTCATGTCCGT<210>74 60.0 213 GGTCAGGCTCAGGCTGATGT<210>75 60.0 GA21 ACGGTGGAAGAGTTCAATGTATG<210>77 60.0 270 TCTCCTTGATGGGCTGCA<210>78 59.6 Mon810 TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG<210>80 62.7 170 TCCATCTTTGGGACCACTGTC<210>81 61.4 Bt11 GCTGAAGCCAGTTACCTTCGG<210>83 61.6 212 TATCATCGACTTCCATGACCA<210>84 60.0 T25 CCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATA<210>86 62.1 231 AGATCATCAATCCACTCTTGTGGTG<210>87 60.6 RRS TGTAGGAGCCACCTTCCTTTTC<210>89 61.2 177 AACCCTTCAATTTAACCGATGC<210>90 60.2 华蕃一号 TACGGCGAGTTCTGTTAGGTCC<210>92 62.0 146 CCAGGCTTTACACTTTATGCTTC<210>93 62.3
b.基因组DNA抽提：
采用Promega磁珠法，使用Wizard Magnetic DNA purification system for food(PromegaFF3750)试剂盒，操作方法见说明书。
c.PCR反应标记
反应体系采用25ul反应体系。各成分加量为10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.5ul，d(ATG)TP(10mM)0.5ul，dCTP(1mM)0.5ul，Cy5-dCTP(0.1mM)0.5ul，各引物终浓度0.3uM，模板DNA 100ng，Taq酶0.5ul，ddH2O补足体积至25ul。
PCR反应程序：94℃3min变性；94℃ 15S，55℃ 15S，72℃ 15S，35个循环；72℃10min。实验过程注意避光。
d.杂交和检测
取6ul PCR反应液，加经55℃预热的杂交液6μl，混匀后95℃ 3分钟、0℃ 5分钟后全部转移到芯片的点样区域，加盖玻片(注意不要有气泡)；杂交舱里加几滴水，以保持湿度；将芯片放入杂交舱，密封杂交舱，然后放进55℃水浴内保温1小时。
打开杂交舱，取出芯片，用0.2％SDS冲掉盖玻片，然后把芯片放入盛有0.2％SDS的染色缸，放置5分钟，用ddH2O冲洗二遍。室温避光干燥。
将玻片放入激光共聚焦扫描仪(GMS418扫描仪)扫描，并通过配套软件分析检测结果。
序列表
<110>上海博星基因芯片有限责任公司
上海博星基因芯片研究所
国家质量监督检验检疫总局动植物检疫实验所
<120>转基因产品检测寡核苷酸芯片的制作方法及其应用
<130> 1
<160> 105
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
tgctccacca tgttgacgaag 21
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
agactggcga acagttcata caga 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
gcaatggaat ccgaggaggt 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
aaaaccaaga aggaactccc atc 23
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
cagcattcca gattgggttca 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
cttttggcta atggtttgga gac 23
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 7
gaaaccctta gtatgtattt gtatttgtaa 30
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
cccagataag ggaattaggg ttc 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 9
ccctggattt tggttttagg aat 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 10
gaccttaggc gacttttgaa cg 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 11
gaaccgcaac gattgaagga 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 12
tggataccga ggggaattta tg 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 13
aatcctgttg ccggtcttgc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 14
tgaatcctgt tgccggtctt 20
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 15
aaatgtataa ttgcgggact ctaatc 26
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 16
gctcctgccg agaaagtatc c 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 17
ggaagggact ggctgctatt g 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 18
gatgtttcgc ttggtggtcg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 19
ctgtgcctcc agggacttca 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 20
gctccacgct ctacacccac 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 21
aaacccacgt catgccagtt 20
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 22
gccacaacac cctcaacctc a 21
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 23
gacagagcca caaacaccac aa 22
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 24
caatcgtaag cgttcctagc ct 22
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 25
gtctgaagat aatccgcaac cc 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 26
tccgtttgtt tactggtgct tg 22
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 27
gagggcttgt gcttctgatt tt 22
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 28
acctggacgc tttatgggat t 21
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 29
aacaaatcag aagtatcagc gacct 25
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 30
aactgcctcc attccaaaac g 21
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 31
ggaaaggcca gaggatttgc 20
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 32
agagccgtgg atagattaag gaag 24
<210> 33
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 33
agaccgccga acatgaagga 20
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 34
gggtcttgtt ggtgtttacg att 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 35
gggtcttgtt ggtgtttacg att 23
<210> 36
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 36
tgtaggtgat tggcgttgga g 21
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<212> DNA
<213> Artificial
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cagcacgggg ttggtgtaga t 21
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<213> Artificial
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tgttccccaa ctacgactcc a 21
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 39
aggtgcgggc tcctgatgct 20
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<213> Artificial
<400> 40
tctggtagat gtggatggga agt 23
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<212> DNA
<213> Artificial
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agactcaaca gcagtggaaa taaca 25
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<213> Artificial
<400> 42
gtgaataggg gtcacagaag cata 24
<210> 43
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 43
aagctgccaa cacccacttg 20
<210> 44
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 44
ggttcttttc ctcactacct atgctc 26
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 45
cctctttctc gtatccccac tctt 24
<210> 46
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 46
caaggtacacc aactactgcg agacc 25
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 47
ctgctgctgc tgaaggatgc 20
<210> 48
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 48
ccctgcggaa ctggtggtag 20
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<212> DNA
<213> Artificial
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gttcttcaga actggcagga gc 22
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 50
agttcgctgg tctcactgct g 21
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 51
ggacggaaac ccatccactt 20
<210> 52
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<213> Artificial
<400> 52
tatgacaact accgacgact cga 23
<210> 53
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 53
gggaccaaat tattgatcta acctct 26
<210> 54
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 54
tctcctgaat cgctttcgtc tt 22
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 55
tctatcagat ccatcaaaac gacg 24
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<213> Artificial
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caagtcgtcg ctgttgagtt tg 22
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<213> Artificial
<400> 57
gctggtggag gcatcatagg t 21
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<213> Artificial
<400> 58
ttctggctct aacttggttc cg 22
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<212> DNA
<213> Artificial
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ccaagaactg gatgaacggttag 23
<210> 60
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<213> Artificial
<400> 60
gagaagccgg tcgaggtaga tag 23
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<213> Artificial
<400> 61
tgctactcgt ttcccgctca 20
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<213> Artificial
<400> 62
cctcacctca gccacgaatc 20
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<213> Artificial
<400> 63
gtcagtgttt gaagctcata ccca 24
<210> 64
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<213> Artificial
<400> 64
ggtgggcttg attttaccaa ag 22
<210> 65
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 65
gattatccgc taagaattac ggtaga 26
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 66
ttcggcacaa aataggaaac g 21
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 67
tgtcttcgag gtggacttga ttt 23
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 68
gagcgggata aattgaacaa gtatg 25
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 69
ttcggcacaa aacaagaaac g 21
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 70
agagaaatga ccccgtgttc tc 22
<210> 71
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 71
ccttcgcaag acccttcctc tata 24
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 72
gtagctgtcg gtgtagtcct cgt 23
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 73
ggggttgttg tccattgttgg 21
<210> 74
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 74
ctctcgccgt tcatgtccgt 20
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<212> DNA
<213> Artificial
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ggtcaggctc aggctgatgt 20
<210> 76
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<213> Artificial
<400> 76
gatccggtgc atggccg 17
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 77
acggtggaag agttcaatgt atg 23
<210> 78
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 78
tctccttgat gggctgca 18
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 79
gggcaatggc aaaggatgtt 20
<210> 80
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 80
tcgaaggacg aaggactcta acg 23
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 81
tccatctttg ggaccactgtc 21
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 82
gacgctcagt ggaacgaaaa ct 22
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 83
gctgaagcca gttaccttcg g 21
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 84
tatcatcgac ttccatgacc a 21
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 85
ctccggagac atgtcgactc tag 23
<210> 86
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 86
ccttcgcaag acccttcctc tata 24
<210> 87
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 87
agatcatcaa tccactcttg tggtg 25
<210> 88
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 88
aaaataaaca tagggaaccc aaatg 25
<210> 89
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 89
tgtaggagcc accttccttt tc 22
<210> 90
<211> 22
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<213> Artificial
<400> 90
aacccttcaa tttaaccgat gc 22
<210> 91
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
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gattacgaat tcccatggag tc 22
<210> 92
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 92
tacggcgagt tctgttaggt cc 22
<210> 93
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 93
ccaggcttta cactttatgc ttc 23
<210> 94
<211> 225
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 94
gtggattgat gtgatatctc cactgacgta agggatgacg cacaatccca ctatccttcg 60
caagaccctt cctctatata aggaagttca tttcatttgg agagaacacg gggtcatttc 120
tctattactt cagccataac aaaagaactc ttttctcttc ttattaaacc aaaaaccatg 180
gctgactacc tgcagatgac cgacgaggac tacaccgaca gctac 225
<210> 95
<211> 380
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 95
tttcctcccg atacgcccct ccatctctcg ccgttcatgt ccgtggctgg ctgccctccg 60
tgggagcagg ctggccgcac tcgttccccg ccgcagccgg atccaacaat ggacaacaac 120
cccaacatca acgagtgcat cccctacaac tgcctgagca atcccgaggt ggaggtgctg 180
ggcggcgagc gcatcgagac cggctacacc cccatcgaca tcagcctgag cctgacccag 240
ttcctgctga gcgagttcgt gcccggcgcc ggcttcgtgc tgggcctggt ggacatcatc 300
tggggcatct tcggccccag ccagtgggac gccttcctgg tgcagatcga gcagctgatc 360
aaccagcgca tcgaggagtt 380
<210> 96
<211> 459
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 96
atggtggctc cgttcaccgg ccttaagtcc aacgccgcct tccccaccac caagaaggct 60
aacgacttct ccacccttcc cagcaacggt ggaagagttc aatgtatgca ggtgtggccg 120
gcctacggca acaagaagtt cgagacgctg tcgtacctgc cgccgctgtc tatggcgccc 180
accgtgatga tggcctcgtc ggccaccgcc gtcgctccgt tccaggggct caagtccacc 240
gccagcctcc ccgtcgcccg ccgctcctcc agaagcctcg gcaacgtcag caacggcgga 300
aggatccggt gcatggccgg cgccgaggag atcgtgctgc agcccatcaa ggagatctcc 360
ggcaccgtca agctgccggg gtccaagtcg ctttccaacc ggatcctcct actcgccgcc 420
ctgtccgagg ggacaacagt ggttgataac ctgctgaac 459
<210> 97
<211> 196
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 97
tcgaaggacg aaggactcta acgtttaaca tcctttgcca ttgcccagct atctgtcact 60
ttattgtgaa gatagtggaa aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag 120
gaaaggccat cgttgaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca 180
cgaggagcat cgtgga 196
<210> 98
<211> 332
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 98
ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 60
cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct 120
gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 180
cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 240
tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gcctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 300
ttaagggatt ttggtcatgg aagtcgatga ta 332
<210> 99
<211> 432
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 99
aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct 60
tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc acaatcccac 120
tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat ttcatttgga gaggacaggg 180
tacccgggga tcctctagag tcgacatgtc tccggagagg agaccagttg agattaggcc 240
agctacagca gctgatatgg ccgcggtttg tgatatcgtt aaccattaca ttgagacgtc 300
tacagtgaac tttaggacag agccacaaac accacaagag tggattgatg atctagagag 360
gttgcaagat agataccctt ggttggttgc tgaggtggag ggtgttgtgg gctggtattg 420
cttacgctgg gc 432
<210> 100
<211> 390
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 100
gatagtggga ttgtgcgtca tcccttacgt cagtggagat atcacatcaa tccacttgct 60
ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt ccacgtgotc ctcgtgggtg ggggtccatc 120
tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttc aacgatggcc tttcctttat cgcaatgatg 180
gcatttgtag gagccacctt ccttttccat ttgggttccc tatgtttatt ttaacctgta 240
tgtatgatct tattttgaat gaaatgcaat aagttatttc tagtaaaaaa aaataaacat 300
ttgatagaaa caaattaaag catgcaaaaa taactcatta gcatcggtta aattgaaggg 360
tttgaataat ttgcacaagg ttctgaattc 390
<210> 101
<211> 526
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 101
cagagactaa aaggaagacc attgatattc ttgcaaactg catttaagga ggcaataaag 60
tagggacttt acacttgcat attctttaaa aacagacaaa aataggcggg aaacgacaat 120
ctgatcatga gcggagaatt aagggagtca cgttatgacc cccgccgatg acgcgggaca 180
agccgtttta cgtttggaac tgacagaacc gcaacgttga aggagccact cagccgcggg 240
tttctggagt ttaatgagct aagcacatac gtcagaaacc attattgcgc gttcaaaagt 300
cgcctaaggt cactatcagc tagcaaatat ttcttgtcaa aaatgctcca ctgacgttcc 360
ataaattccc ctcggtatcc aattagagtc tcatattcac tctcaatcca aataatctgc 420
accggatctg gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc 480
gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaa 526
<210> 102
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 102
cgcgcaaatt acccaatcct ga 22
<210> 103
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 103
gagaaacggc taccacatcc a 21
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 104
cgtgccatcc caaagtccaa 20
<210> 105
<211> 19
<212> DNA
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<400> 105
ctggaacagc cagaaggac 19