一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片及其制备方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201310229106.4	申请日：	2013.06.08
公开号：	CN103344464A	公开日：	2013.10.09
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):G01N 1/28申请日:20130608\|\|\|公开
IPC分类号：	G01N1/28; B01L3/00	主分类号：	G01N1/28
申请人：	南京理工大学
发明人：	孙东平; 陈春涛; 聂英; 朱春林; 黄洋; 杨加志
地址：	210094 江苏省南京市孝陵卫200号
优先权：
专利代理机构：	南京理工大学专利中心 32203	代理人：	朱显国
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内容摘要

本发明涉及微流控芯片，具体的说是一种微流控芯片的制备和修饰方法。本发明主要是通过微机电技术设计制作一种微流控芯片，将溶解后的细菌纤维素在微通道里面再生，作为芯片通道柱的填料，并在经过亲水性修饰的填料表面固定凝集素，依据凝集素对糖基的特异性亲和作用将糖蛋白、脂多糖等表面含特定糖基的物质分离开来。该芯片由玻璃基材构成，以紫外蚀刻技术在基材上刻蚀通道图形，程序控温进行高温键合。该芯片上设有进分离样品进出口和填料进出口、细菌纤维素填料柱、样品微通道和在线监测位点。本发明的主要优点是以再生的细菌纤维素作为芯片填料，其作用优异，凝集素固定步骤简便，光谱监测方便，糖基分离效显著。

权利要求书

权利要求书
1.  一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片，其特征在于，包括微型柱通道、样品通道、样品入口[1]、填料入口[2]、柱前监测点[3]、微型柱[4]、填料出口[5]、柱后监测点[6]、样品出口[7]、玻璃盖片[12]、玻璃基底[13]、聚四氟乙烯管[14]；其中微型柱通道包括微型柱通道前部[8]、微型柱[4]、微型柱通道后部[9]，样品通道包括样品通道前部[10]、微型柱[4]、样品通道后部[11]，且微型柱通道与样品通道于微型柱[4]处重叠，其中样品通道前部[10]、微型柱[4]、样品通道后部[11]位于同一水平线上，微型柱通道前部[8]与微型柱通道后部[9]分别位于样品通道上下两侧，微型柱通道前部[8]与样品通道前部[10]的角度为α，微型柱通道后部[9]与样品通道后部[11]的角度为β；微型柱通道前端设有填料入口[2]，微型柱通道末端设有填料出口[5]，样品通道前端设有样品入口[1]，样品通道末端设有样品出口[7]，所述填料入口[2]、填料出口[5]、样品入口[1]、样品出口[7]分别与一根聚四氟乙烯管[14]连接；样品通道前部设有柱前监测点[3]，样品通道后部设有柱后监测点[6]；所述微型柱通道与样品通道均刻蚀于玻璃盖片[12]，玻璃盖片[12]与玻璃基底[13]于刻蚀面键合；其中微型柱[4]中填充的物质为连接有凝集素的细菌纤维素。

2.   根据权利要求1所述的用于糖基分离的微流控凝集素芯片，其特征在于，所述0°＜α≤90°，0°＜β≤90°。

3.  一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，绘制通道图形，将设计好的通道图形打印在胶片上制成掩膜；
步骤二，采用紫外刻蚀的方法将掩模板上的图形转移到玻璃盖片[12]上；
步骤三，将经过刻蚀后的玻璃盖片[12]在超声波打孔机下于通道末端位置打孔，形成通道出入口，将打孔后的玻璃盖片[12]经过清洗后置于浓硫酸中活化，并与玻璃基底[13]键合，冷却后酸洗；
步骤四，将细菌纤维素进行碱化处理，离心浸泡中和干净，粉碎，过筛，乙醇活化干燥后于溶剂中溶解，封闭样品入口[1]和样品出口[7]，然后将溶解后的细菌纤维素由填料入口注入微型柱[4]的位置，冷冻干燥使再生细菌纤维素蓬松将柱子填满，清洗干净；
步骤五，向样品入口[1]和样品出口[7]中注溶解后的高取代羟丙基纤维素进行通道改性，过夜室温放置后洗干净；
步骤六，选定凝集素，封闭填料入口[2]和填料出口[5]，调节环氧氯丙烷pH，再将环氧氯丙烷于样品入口[1]通入通道中，放置，然后在凝集素等电点条件下，将凝集素溶于TBS缓冲液后于样品入口[1]通入通道中；
步骤七，封闭填料入口[2]和填料出口[5]，将糖基物质溶解于磷酸缓冲溶液，并于样品入口[1]中通入芯片进行分离，后将光谱扫描仪置于芯片柱前监测点[3]、柱后监测点[6]上方进行在线检测；其中整个过程中以聚四氟乙烯管[10]作为进样管道。

4.  根据权利要求3所述的用于糖基分离的微流控凝集素芯片的制备方法，其特征在于，步骤一中，采用AutoCAD软件绘制通道图形，将设计好的通道图形导入AdobeIllustrator通过分辨率大于3000dpi的高分辨率打印机打印在菲林胶片上制成掩膜；其中，所述通道图形包括微型柱通道和样品通道，所述微型柱通道包括微型柱通道前部[8]、微型柱[4]、微型柱通道后部[9]，样品通道包括样品通道前部[10]、微型柱[4]、样品通道后部[11]，且微型柱通道与样品通道于微型柱[4]处重叠，其中样品通道前部[10]、微型柱[4]、样品通道后部[11]位于同一水平线上，微型柱通道前部[8]与微型柱通道后部[9]分别位于样品通道上下两侧，微型柱通道前部[8]与样品通道前部[10]的角度为α，微型柱通道后部[4]与样品通道后部[4]的角度为β，其中0°＜α≤90°，0°＜β≤90°；所述掩模板制作的微结构线宽为0，通道宽为10~400μm，微型柱[4]长度为20~400㎜。

5.  根据权利要求3所述的用于糖基分离的微流控凝集素芯片的制备方法，其特征在于，步骤二中，紫外刻蚀的方法的步骤为：采用标准的紫外光刻法在铬版上刻蚀掩模板上的通道图形，开启光刻机预热10~20分钟，在黄光下取出铬版，置于载物台上真空吸附；将掩膜平铺于铬版上，使用干净的抛光玻璃片压制，进行曝光预操作，曝光时间为30~60秒；铬版曝光后，放在碱液中浸泡15~60s，取出后在去离子水中冲洗干净，浸入去铬液；取出后在去离子水中冲洗干净，置于电热鼓风干燥箱中高温坚膜10~20min；将坚膜后的铬版浸入自制刻蚀液中刻蚀，刻蚀完成后在去离子水中冲洗干净后放入碱液中去胶，去胶后用去离子水冲洗，浸入去铬液中去掉铬层，去铬后用去离子水冲洗后置于电热鼓风干燥箱中烘干。

6.  根据权利要求3所述的用于糖基分离的微流控凝集素芯片的制备方法，其特征在于，步骤三中，将打孔后的玻璃按照洗涤剂、去离子水、丙酮、去离子水的顺序在超声波清洗槽中各清洗20min，最后置于浓硫酸中活化24h；在马弗炉中将经过刻蚀和打孔的玻璃盖片[12]与同样尺寸的玻璃基片[13]程序升温高温键合；其中四个出入口半径20~100μm。

7.  根据权利要求3所述的用于糖基分离的微流控凝集素芯片的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述碱化处理过程为将细菌纤维素经过质量百分数4%的氢氧化钠80℃水浴2h；所述过筛目数为150目；所述细菌纤维素与溶剂质量比为0.5:99.5~5:95；所述溶剂为NaOH和硫脲的混合水溶液，其中NaOH占总溶剂的体积百分数为6%，硫脲占总溶剂的体积百分数为8%。

8.  根据权利要求3所述的用于糖基分离的微流控凝集素芯片的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述高取代羟丙基纤维素经乙醇溶解，其浓度为0.1~0.5%，所述百分数为质量百分数；所述溶解后的高取代羟丙基纤维素以去离子水和无水乙醇冲洗干净。

9.  根据权利要求3所述的用于糖基分离的微流控凝集素芯片的制备方法，其特征在于，步骤六中，调节环氧氯丙烷的pH=5~12；将环氧氯丙烷于样品入口通入通道中30~60 ℃放置10~20 h；将凝集素溶于TBS缓冲液后于样品入口[1] 通入通道中，0~8 ℃放置10~20 h；其中TBS缓冲液配置凝集素的浓度为100μg/mL，TBS缓冲液中另含CaCl2，MgCl2，MnCl2各1.0mmol/L，用HCl调节pH至凝集素等电点。

说明书

说明书一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片及其制备方法
技术领域
本发明涉及流控芯片领域，特别是一种基于玻璃材质、细菌纤维素基质填料、应用于糖基化合物和微生物分离检测的凝集素芯片及其制备方法。
背景技术
凝集素芯片是糖组学研究的一项新技术，属于微流控芯片中分析芯片的一种。结构糖组学的研究主要聚焦在质谱技术和前沿亲和层析技术，但是质谱在区分糖异质体时仍然存在困难，而且对粗提样本的应用存在限制,通过凝集素亲和技术提取样本的核心糖谱信息，能以高通量的方式提供糖结构信息，因此，凝集素芯片可以作为质谱技术的互补技术，用于区分糖异质体和对粗提样本的识别。蛋白质的糖基化在许多生物过程，如免疫、细胞识别、信号传导以及病毒侵入等发挥着重要的作用。
糖蛋白上的糖链在很大程度上影响着蛋白质的结构和功能。因此蛋白质糖基化的分析不论是在蛋白质组学的研究还是在药物筛选中都具有重要的意义。应用固定有凝集素的微流控芯片对糖蛋白进行分离分析具有重大的使用价值。微生物表面含有糖蛋白，但微生物发生病变或者其它改变，其糖蛋白的种类或是数目会有改变，表现在凝集素芯片上就是对凝集素亲和作用的强弱会发生明显变化。所以可以通过观测微生物表面糖蛋白的改变情况来进行微生物代谢状况预测。
毛秀丽等在Anal. Chem.,76,2004,分别以寡糖链、糖肽以及整个糖蛋白（糖形）为分析对象，进行以微流控芯片和质谱或者二者联用为基础的 N-连接蛋白质糖基化分析平台和方法的研究。在微流控芯片上实现了简单糖的快速电泳分离和直接、间接激光诱导荧光检测；发展了以芯片电泳与外切糖苷酶酶解结合，激光诱导荧光检测为基础，以糖肽为分析对象的糖链结构类型分析方法，对火鸡卵白蛋白的糖链结构进行推测，结果表明该蛋白含有高甘露糖型和杂合型的糖链；设计并制备了一种集成化凝集素亲和微流控芯片。该芯片采用电泳的方法，以电渗流为推动力，在需要保持活性的物质研究方面会有较大的局限性。Jolita等在J.Chromatogr.B,831,2006,以改性纤维素作为基质，采用五乙烯六胺作为悬臂分别接枝了两种凝集素来制作了凝集素亲和色谱柱，该色谱柱在分离糖基化合物是表现出了较高的重现性，但该方法操作步骤相对繁琐。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片及其制备方法。
实现本发明目的的技术解决方案为：一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片，包括微型柱通道，样品通道，样品入口，填料入口，柱前监测点，微型柱，填料出口，柱后监测点，样品出口，玻璃盖片，玻璃基底，聚四氟乙烯管；其中微型柱通道包括微型柱通道前部、微型柱、微型柱通道后部，样品通道包括样品通道前部、微型柱、样品通道后部，且微型柱通道与样品通道于微型柱处重叠，其中样品通道前部、微型柱、样品通道后部位于同一水平线上，微型柱通道前部与微型柱通道后部分别位于样品通道上下两侧，微型柱通道前部与样品通道前部的角度为α，微型柱通道后部与样品通道后部的角度为β；微型柱通道前端设有填料入口，微型柱通道末端设有填料出口，样品通道前端设有样品入口，样品通道末端设有样品出口，所述填料入口、填料出口、样品入口、样品出口分别与一根聚四氟乙烯管固定；样品通道前部设有柱前监测点，样品通道后部设有柱后监测点；所述微型柱通道与样品通道刻蚀于玻璃盖片，玻璃盖片与玻璃基底高温键合。
一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，绘制通道图形，将设计好的通道图形打印在胶片上制成掩膜。
步骤二，采用紫外刻蚀的方法将掩模板上的图形转移到玻璃盖片上。
步骤三，将经过刻蚀后的玻璃盖片在超声波打孔机下于通道末端位置打孔，形成通道出入口；打孔后的玻璃经过清洗后置于浓硫酸中活化，在马弗炉中程序升温与玻璃基底高温键合，冷却后酸洗。
步骤四，将细菌纤维素进行碱化处理，离心浸泡中和干净，粉碎，过筛，乙醇活化干燥后于溶剂中溶解，封闭样品入口和样品出口，然后将溶解后的细菌纤维素由填料入口注入微型柱的位置，冷冻干燥使再生细菌纤维素蓬松将柱子填满，清洗干净。
步骤五，向样品入口和样品出口中注溶解后的高取代羟丙基纤维素进行通道改性，过夜室温放置后洗干净。
步骤六，选定凝集素，封闭填料入口和填料出口，调节环氧氯丙烷pH，再将环氧氯丙烷于样品入口通入通道中，放置，然后在凝集素等电点条件下，将凝集素溶于TBS缓冲液后于样品入口通入通道中。
步骤七，封闭填料入口和填料出口，将糖基物质溶解于磷酸缓冲溶液，并于样品入口中通入芯片进行分离，后将光谱扫描仪置于芯片检测点上方进行在线检测。
其中整个过程中以细管作为进样管道。
本发明与现有技术相比，其显著优点为：1.本发明以再生细菌纤维素为微型柱的基质填料，比表面积大，能极大的增强柱子中物质的接触面积；2.本发明以羟丙基纤维素为亲水性修饰涂层，修饰方法简便，效果好；3.本发明用环氧氯丙烷作为纤维素羟基和凝集素之间的共价偶联物质，操作简单，连接效果好，芯片的重现性好；4.本发明采用压力作为推动力，比电泳的方法更适合于活体（微生物）检测。
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
附图说明
图1为芯片通道结构示意图。
图2为芯片立体结构示意图。
图3为芯片制作工艺流程图。
具体实施方式
本发明的一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片，包括微型柱通道，样品通道，样品入口1，填料入口2，柱前监测点3，微型柱4，填料出口5，柱后监测点6，样品出口7，玻璃盖片12，玻璃基底13，聚四氟乙烯管14；其中微型柱通道包括微型柱通道前部8、微型柱4、微型柱通道后部9，样品通道包括样品通道前部10、微型柱4、样品通道后部11，且微型柱通道与样品通道于微型柱4处重叠，其中样品通道前部10、微型柱[4]、样品通道后部11位于同一水平线上，微型柱通道前部8与微型柱通道后部9分别位于样品通道上下两侧，微型柱通道前部8与样品通道前部10的角度为α，微型柱通道后部9与样品通道后部11的角度为β，其中0°＜α≤90°，0°＜β≤90°；微型柱通道前端设有填料入口2，微型柱通道末端设有填料出口5，样品通道前端设有样品入口1，样品通道末端设有样品出口7，所述填料入口2、填料出口5、样品入口1、样品出口7分别与一根聚四氟乙烯管14固定；样品通道前部设有柱前监测点3，样品通道后部设有柱后监测点6；所述微型柱通道与样品通道刻蚀于玻璃盖片12，玻璃盖片12与玻璃基底13高温键合。
其中微型柱4中填充的是连接有凝集素的细菌纤维素。
本发明的一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片的制备方法，具体步骤如下：
步骤一，采用AutoCAD软件绘制通道图形，将设计好的通道图形导入AdobeIllustrator通过高分辨率打印机(分辨率大于3000dpi)打印在菲林胶片上制成掩膜；其中，所述掩模板制作的微结构线宽为0，通道宽为10~400μm，四个出入口半径20~100μm，微型柱长度为20~400㎜；所述通道图形包括微型柱通道和样品通道，所述微型柱通道包括微型柱通道前部8、微型柱4、微型柱通道后部9，样品通道包括样品通道前部10、微型柱4、样品通道后部11，且样品通道前部10、微型柱4、样品通道后部11位于同一水平线上，微型柱通道前部8与微型柱通道后部9分别位于样品通道上下两侧，微型柱通道前部8与样品通道前部10的角度为α，微型柱通道后部9与样品通道后部11的角度为β，其中0°＜α≤90°，0°＜β≤90°。
步骤二，采用标准的紫外光刻法在铬版上刻蚀掩模板上的通道图形，开启光刻机预热10~20分钟，在黄光下取出铬版，置于载物台上真空吸附；将掩膜平铺于铬版上，使用干净的抛光玻璃片压制，进行曝光预操作，曝光时间为30~60秒；铬版曝光后，放在碱液中浸泡15~60s，取出后在去离子水中冲洗干净，浸入去铬液；取出后在去离子水中冲洗干净，置于电热鼓风干燥箱中高温坚膜10~20min；将坚膜后的铬版浸入自制刻蚀液中刻蚀，刻蚀完成后在去离子水中冲洗干净后放入碱液中去胶，去胶后用去离子水冲洗，浸入去铬液中去掉铬层，去铬后用去离子水冲洗后置于电热鼓风干燥箱中烘干。
步骤三，将经过刻蚀、去胶、去铬后的玻璃盖片12在超声波打孔机下分别于样品通道前端，样品通道后端，微型柱通道前端，微型柱通道末端位置打孔，形成样品入口1，样品出口7，填料入口2，填料出口5；将打孔后的玻璃按照洗涤剂、去离子水、丙酮、去离子水的顺序在超声波清洗槽中各清洗20min，最后置于浓硫酸中活化24h；在马弗炉中将经过刻蚀和打孔的玻璃盖片12与同样尺寸的玻璃基片13程序升温高温键合，冷却后酸洗。
步骤四，将细菌纤维素经过质量百分数4%的氢氧化钠80℃水浴2h后，经离心浸泡中和干净，粉碎，过150目筛，乙醇活化干燥后于溶剂中溶解；封闭样品入口1，样品出口7，然后由填料入口2将溶解后的细菌纤维素注入微型柱4的位置，多余的溶液经填料出口5出来，冷冻干燥使再生细菌纤维素蓬松将柱子填满，再用去离子水和无水乙醇反复清洗干净；其中细菌纤维素与溶剂质量比为0.5:99.5~5:95；所述溶剂为NaOH和硫脲的混合水溶液，其中NaOH占总溶剂的体积百分数为6%，硫脲占总溶剂的体积百分数为8%。
步骤五，向样品入口1和填料入口2中注入经乙醇溶解的高取代羟丙基纤维素进行通道改性，过夜室温放置，先后以去离子水和无水乙醇冲洗干净；其中羟丙基纤维素的浓度为0.1~0.5%，所述百分数为质量百分数。
步骤六，选定凝集素，封闭填料入口2和填料出口5，调节环氧氯丙烷的pH=5~12，再将环氧氯丙烷于样品入口1通入通道中，30~60 ℃放置10~20 h，使细菌纤维素上的羟基与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物，在凝集素等电点条件下，将凝集素溶于TBS缓冲液后于样品入口1加入环氧化合物，0~8 ℃放置10~20 h；其中TBS缓冲液配置凝集素的浓度为100μg/mL，TBS缓冲液中另含CaCl2，MgCl2，MnCl2各1.0mmol/L，用HCl调节pH至等电点。
步骤七，封闭填料入口2和填料出口5，将糖基物质溶解于磷酸缓冲溶液，并于样品入口1中通入芯片进行分离，后将光谱扫描仪置于芯片检测点上方进行在线检测。
其中整个过程中以聚四氟乙烯管14作为进样管道，将细管固定在各进出口。
本发明主要是通过微机电技术设计制作一种微流控芯片，将再生的细菌纤维素作为芯片通道柱的填料填充在微通道里面，经过疏水性修饰在填料表面固定凝集素，依据凝集素对糖基的特异性亲和作用将糖蛋白、脂多糖等表面含特定糖基的物质分离开来。芯片内壁经过亲水性改性，在微通道里面填充蓬松的细菌纤维素基质，通过一系列化学键作用将凝集素固定在芯片通道里面，这种固定了凝集素的芯片通过与糖基的亲和强弱作用将糖蛋白或者微生物等表面含糖基的物质分离开来。
实施例1：
本发明的一种具有糖基化合物分离功能的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，采用AutoCAD软件绘制通道图形，将设计好的通道图形导入AdobeIllustrator通过高分辨率打印机(分辨率大于3000dpi)打印在菲林胶片上制成掩膜；其中，所述掩模板制作的图形线宽为零，通道宽为10μm，通道末端储液池半径为20μm，微型柱长度为20㎜；α为30°，β为40°。
步骤二，采用标准的紫外光刻法在铬版上刻蚀掩模板上的微结构，开启光刻机预热10分钟，在黄光下取出铬版，置于载物台上真空吸附；将掩膜平铺于铬版上，使用干净的抛光玻璃片压制，进行曝光预操作，选择曝光时间为30秒进行曝光；铬版曝光后，放在碱液液中浸泡15s，取出后在去离子水中冲洗干净，浸入去铬液；取出后在去离子水中冲洗干净，置于电热鼓风干燥箱中高温坚膜10min；将坚膜后的铬版浸入自制刻蚀液中刻蚀，刻蚀完成后在去离子水中冲洗干净后放入碱液中去胶，去离子水冲洗，浸入去铬液中去掉铬层，去离子水冲洗后置于电热鼓风干燥箱中烘干。
步骤三，将经过刻蚀、去胶、去铬后的玻璃基片在超声波打孔机下打孔；将打孔后的玻璃按照洗涤剂、去离子水、丙酮、去离子水的顺序在超声波清洗槽中各清洗20min，最后置于浓硫酸中活化24h。在马弗炉中将经过刻蚀和打孔的玻璃盖片与同样尺寸的玻璃基片程序升温高温键合，冷却后酸洗。
步骤四，将实验室发酵所得细菌纤维素BC经过4%质量分数氢氧化钠80℃水浴2h后，经离心浸泡中和干净，粉碎，过150目筛，乙醇活化干燥，按细菌纤维素与溶剂质量比0.5:99.5经质量百分数为6%NaOH和8%硫脲配置的溶剂溶解，注入芯片中填料柱的位置，冷冻干燥使再生BC蓬松将柱子填满，再用去离子水和无水乙醇反复清洗干净。该操作过程，将1和7孔封闭。
步骤五，向通道中注入经乙醇溶解的高取代羟丙基纤维素（H-HPC）进行通道改性，过夜室温放置，先后以去离子水和无水乙醇冲洗干净；其中羟丙基纤维素的浓度为0.1%，所述百分数为质量百分数。此过程羟丙基纤维素溶液从1和2入口经注射泵通过聚四氟乙烯管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔5和7出来。
步骤六，对于选定好的凝集素伴刀豆求凝集素(Con A)，本发明的做法包含两步：第一步，在pH=9时，将环氧氯丙烷通入通道中，30℃放置20h，细菌纤维素上的羟基与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物；第二步，在TBS缓冲液中于凝集素等电点（pH=7.4）条件下将环氧化合物与凝集素上氨基偶联，0℃放置10h，其中TBS缓冲液配置凝集素的浓度为100μg/mL，HCl调节pH至等电点，其中TBS缓冲液中含CaCl2，MgCl2，MnCl2各1.0mmol/L。此过程时2和5孔封闭，TBS缓冲液从1入口经注射泵通过细管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔7出来。
步骤七，以和芯片进出口孔道孔径相配的聚四氟乙烯细管作为芯片与外界连接管路，糖基物质在磷酸缓冲溶液中通入芯片进行分离。该过程2和5孔封闭，样品从1入口经注射泵通过细管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔7出来。
以微生物培养液为样品进行目标蛋白的分离，经检测，能有效地分离目标蛋白。
实施例2：
本发明的一种具有糖基化合物分离功能的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，采用AutoCAD软件绘制通道图形，将设计好的通道图形导入AdobeIllustrator通过高分辨率打印机(分辨率大于3000dpi)打印在菲林胶片上制成掩膜；其中，所述掩模板制作的图形线宽为零，通道宽为400μm，通道末端储液池半径为100μm，微型柱长度为400㎜；α为90°，β为60°。
步骤二，采用标准的紫外光刻法在铬版上刻蚀掩模板上的微结构，开启光刻机预热20分钟，在黄光下取出铬版，置于载物台上真空吸附；将掩膜平铺于铬版上，使用干净的抛光玻璃片压制，进行曝光预操作，选择曝光时间为60秒进行曝光；铬版曝光后，放在碱液液中浸泡60s，取出后在去离子水中冲洗干净，浸入去铬液；取出后在去离子水中冲洗干净，置于电热鼓风干燥箱中高温坚膜20min；将坚膜后的铬版浸入自制刻蚀液中刻蚀，刻蚀完成后在去离子水中冲洗干净后放入碱液中去胶，去离子水冲洗，浸入去铬液中去掉铬层，去离子水冲洗后置于电热鼓风干燥箱中烘干。
步骤三，将经过刻蚀、去胶、去铬后的玻璃基片在超声波打孔机下打孔；将打孔后的玻璃按照洗涤剂、去离子水、丙酮、去离子水的顺序在超声波清洗槽中各清洗20min，最后置于浓硫酸中活化24h。在马弗炉中将经过刻蚀和打孔的玻璃盖片与同样尺寸的玻璃基片程序升温高温键合，冷却后酸洗。
步骤四，将实验室发酵所得细菌纤维素BC经过4%质量分数氢氧化钠80℃水浴2h后，经离心浸泡中和干净，粉碎，过150目筛，乙醇活化干燥，按细菌纤维素与溶剂质量比5:95经质量百分数为6%NaOH和8%硫脲配置的溶剂溶解，注入芯片中填料柱的位置，冷冻干燥使再生BC蓬松将柱子填满，再用去离子水和无水乙醇反复清洗干净。该操作过程，将1和7孔封闭。
步骤五，向通道中注入经乙醇溶解的高取代羟丙基纤维素（H-HPC）进行通道改性，过夜室温放置，先后以去离子水和无水乙醇冲洗干净；其中羟丙基纤维素的浓度为0.5%，所述百分数为质量百分数。此过程羟丙基纤维素溶液从1和2入口经注射泵通过聚四氟乙烯管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔5和7出来。
步骤六，对于选定好的凝集素伴刀豆求凝集素(Con A)，本发明的做法包含两步：第一步，在pH=11时，将环氧氯丙烷通入通道中，50℃放置10h，细菌纤维素上的羟基与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物；第二步，在TBS缓冲液中于凝集素等电点（pH=7.4）条件下将环氧化合物与凝集素上氨基偶联，8℃放置20h，其中TBS缓冲液配置凝集素的浓度为100μg/mL，HCl调节pH至等电点，其中TBS缓冲液中含CaCl2，MgCl2，MnCl2各1.0mmol/L。此过程时2和5孔封闭，TBS缓冲液从1入口经注射泵通过细管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔7出来。
步骤七，以和芯片进出口孔道孔径相配的聚四氟乙烯细管作为芯片与外界连接管路，糖基物质在磷酸缓冲溶液中通入芯片进行分离。该过程2和5孔封闭，样品从1入口经注射泵通过细管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔7出来。
以微生物培养液为样品进行目标蛋白的分离，经检测，能有效地分离目标蛋白。
实施例3：
本发明的一种具有糖基化合物分离功能的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，采用AutoCAD软件绘制通道图形，将设计好的通道图形导入AdobeIllustrator通过高分辨率打印机(分辨率大于3000dpi)打印在菲林胶片上制成掩膜；其中，所述掩模板制作的图形线宽为零，通道宽为200μm，通道末端储液池半径为800μm，微型柱长度为200㎜；α为50°，β为90°。
步骤二，采用标准的紫外光刻法在铬版上刻蚀掩模板上的微结构，开启光刻机预热15分钟，在黄光下取出铬版，置于载物台上真空吸附；将掩膜平铺于铬版上，使用干净的抛光玻璃片压制，进行曝光预操作，选择曝光时间为45秒进行曝光；铬版曝光后，放在碱液液中浸泡45s，取出后在去离子水中冲洗干净，浸入去铬液；取出后在去离子水中冲洗干净，置于电热鼓风干燥箱中高温坚膜15min；将坚膜后的铬版浸入自制刻蚀液中刻蚀，刻蚀完成后在去离子水中冲洗干净后放入碱液中去胶，去离子水冲洗，浸入去铬液中去掉铬层，去离子水冲洗后置于电热鼓风干燥箱中烘干。
步骤三，将经过刻蚀、去胶、去铬后的玻璃基片在超声波打孔机下打孔；将打孔后的玻璃按照洗涤剂、去离子水、丙酮、去离子水的顺序在超声波清洗槽中各清洗20min，最后置于浓硫酸中活化24h。在马弗炉中将经过刻蚀和打孔的玻璃盖片与同样尺寸的玻璃基片程序升温高温键合，冷却后酸洗。
步骤四，将实验室发酵所得细菌纤维素BC经过4%质量分数氢氧化钠80℃水浴2h后，经离心浸泡中和干净，粉碎，过150目筛，乙醇活化干燥，按细菌纤维素与溶剂质量比3:97经质量百分数为6%NaOH和8%硫脲配置的溶剂溶解，注入芯片中填料柱的位置，冷冻干燥使再生BC蓬松将柱子填满，再用去离子水和无水乙醇反复清洗干净。该操作过程，将1和7孔封闭。
步骤五，向通道中注入经乙醇溶解的高取代羟丙基纤维素（H-HPC）进行通道改性，过夜室温放置，先后以去离子水和无水乙醇冲洗干净；其中羟丙基纤维素的浓度为0.3%，所述百分数为质量百分数。此过程羟丙基纤维素溶液从1和2入口经注射泵通过聚四氟乙烯管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔5和7出来。
步骤六，对于选定好的凝集素伴刀豆求凝集素(Con A)，本发明的做法包含两步：第一步，在pH=10时，将环氧氯丙烷通入通道中，40℃放置15h，细菌纤维素上的羟基与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物；第二步，在TBS缓冲液中于凝集素等电点（pH=7.4）条件下将环氧化合物与凝集素上氨基偶联，4℃放置15h，其中TBS缓冲液配置凝集素的浓度为100μg/mL，HCl调节pH至等电点，其中TBS缓冲液中含CaCl2，MgCl2，MnCl2各1.0mmol/L。此过程时2和5孔封闭，TBS缓冲液从1入口经注射泵通过细管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔7出来。
步骤七，以和芯片进出口孔道孔径相配的聚四氟乙烯细管作为芯片与外界连接管路，糖基物质在磷酸缓冲溶液中通入芯片进行分离。该过程2和5孔封闭，样品从1入口经注射泵通过细管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔7出来。
以微生物培养液为样品进行目标蛋白的分离，经检测，能有效地分离目标蛋白。
实施例4：
本发明的一种具有糖基化合物分离功能的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，采用AutoCAD软件绘制通道图形，将设计好的通道图形导入AdobeIllustrator通过高分辨率打印机(分辨率大于3000dpi)打印在菲林胶片上制成掩膜；其中，所述掩模板制作的图形线宽为零，通道宽为200μm，通道末端储液池半径为800μm，微型柱长度为200㎜；α为45°，β为45°。
步骤二，采用标准的紫外光刻法在铬版上刻蚀掩模板上的微结构，开启光刻机预热15分钟，在黄光下取出铬版，置于载物台上真空吸附；将掩膜平铺于铬版上，使用干净的抛光玻璃片压制，进行曝光预操作，选择曝光时间为45秒进行曝光；铬版曝光后，放在碱液液中浸泡45s，取出后在去离子水中冲洗干净，浸入去铬液；取出后在去离子水中冲洗干净，置于电热鼓风干燥箱中高温坚膜15min；将坚膜后的铬版浸入自制刻蚀液中刻蚀，刻蚀完成后在去离子水中冲洗干净后放入碱液中去胶，去离子水冲洗，浸入去铬液中去掉铬层，去离子水冲洗后置于电热鼓风干燥箱中烘干。
步骤三，将经过刻蚀、去胶、去铬后的玻璃基片在超声波打孔机下打孔；将打孔后的玻璃按照洗涤剂、去离子水、丙酮、去离子水的顺序在超声波清洗槽中各清洗20min，最后置于浓硫酸中活化24h。在马弗炉中将经过刻蚀和打孔的玻璃盖片与同样尺寸的玻璃基片程序升温高温键合，冷却后酸洗。
步骤四，将实验室发酵所得细菌纤维素BC经过4%质量分数氢氧化钠80℃水浴2h后，经离心浸泡中和干净，粉碎，过150目筛，乙醇活化干燥，按细菌纤维素与溶剂质量比3:97经质量百分数为6%NaOH和8%硫脲配置的溶剂溶解，注入芯片中填料柱的位置，冷冻干燥使再生BC蓬松将柱子填满，再用去离子水和无水乙醇反复清洗干净。该操作过程，将1和7孔封闭。
步骤五，向通道中注入经乙醇溶解的高取代羟丙基纤维素（H-HPC）进行通道改性，过夜室温放置，先后以去离子水和无水乙醇冲洗干净；其中羟丙基纤维素的浓度为0.3%，所述百分数为质量百分数。此过程羟丙基纤维素溶液从1和2入口经注射泵通过聚四氟乙烯管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔5和7出来。
步骤六，对于选定好的凝集素麦胚凝集素(WGA)，本发明的做法包含两步：第一步，在pH=9时，将环氧氯丙烷通入通道中，40℃放置15h，细菌纤维素上的羟基与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物；第二步，在TBS缓冲液中于凝集素等电点（pH=7.8）条件下将环氧化合物与凝集素上氨基偶联，4℃放置15h，其中TBS缓冲液配置凝集素的浓度为100μg/mL，HCl调节pH至等电点，其中TBS缓冲液中含CaCl2，MgCl2，MnCl2各1.0mmol/L。此过程时2和5孔封闭，TBS缓冲液从1入口经注射泵通过细管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔7出来。
步骤七，以和芯片进出口孔道孔径相配的聚四氟乙烯细管作为芯片与外界连接管路，糖基物质在磷酸缓冲溶液中通入芯片进行分离。该过程2和5孔封闭，样品从1入口经注射泵通过细管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔7出来。
以微生物培养液为样品进行目标蛋白的分离，经检测，能有效地分离目标蛋白。

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1、(10)申请公布号 CN 103344464 A (43)申请公布日 2013.10.09 CN 103344464 A *CN103344464A* (21)申请号 201310229106.4 (22)申请日 2013.06.08 G01N 1/28(2006.01) B01L 3/00(2006.01) (71)申请人南京理工大学地址 210094 江苏省南京市孝陵卫 200 号 (72)发明人孙东平陈春涛聂英朱春林黄洋杨加志 (74)专利代理机构南京理工大学专利中心 32203 代理人朱显国 (54) 发明名称一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片及其制备方法 (5。

2、7) 摘要本发明涉及微流控芯片，具体的说是一种微流控芯片的制备和修饰方法。本发明主要是通过微机电技术设计制作一种微流控芯片，将溶解后的细菌纤维素在微通道里面再生，作为芯片通道柱的填料，并在经过亲水性修饰的填料表面固定凝集素，依据凝集素对糖基的特异性亲和作用将糖蛋白、脂多糖等表面含特定糖基的物质分离开来。该芯片由玻璃基材构成，以紫外蚀刻技术在基材上刻蚀通道图形，程序控温进行高温键合。该芯片上设有进分离样品进出口和填料进出口、细菌纤维素填料柱、样品微通道和在线监测位点。本发明的主要优点是以再生的细菌纤维素作为芯片填料，其作用优异，凝集素固定步。

3、骤简便，光谱监测方便，糖基分离效显著。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页说明书 8 页附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书2页说明书8页附图2页 (10)申请公布号 CN 103344464 A CN 103344464 A *CN103344464A* 1/2 页 2 1. 一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片，其特征在于，包括微型柱通道、样品通道、样品入口 1、填料入口 2、柱前监测点 3、微型柱 4、填料出口 5、柱后监测点 6、样品出口 7、玻璃盖片 12、玻璃基底 13、聚四氟乙烯管 14。

4、；其中微型柱通道包括微型柱通道前部 8、微型柱 4、微型柱通道后部 9，样品通道包括样品通道前部 10、微型柱 4、样品通道后部 11，且微型柱通道与样品通道于微型柱 4 处重叠，其中样品通道前部 10、微型柱 4、样品通道后部 11 位于同一水平线上，微型柱通道前部 8 与微型柱通道后部 9 分别位于样品通道上下两侧，微型柱通道前部 8 与样品通道前部 10 的角度为，微型柱通道后部9与样品通道后部11的角度为；微型柱通道前端设有填料入口 2，微型柱通道末端设有填料出口 5，样品通道前端设有样品入口 1，样品通道末端设有样品出口 7，所述填。

5、料入口 2、填料出口 5、样品入口 1、样品出口 7 分别与一根聚四氟乙烯管 14 连接；样品通道前部设有柱前监测点 3，样品通道后部设有柱后监测点 6 ；所述微型柱通道与样品通道均刻蚀于玻璃盖片 12，玻璃盖片 12 与玻璃基底 13 于刻蚀面键合；其中微型柱 4 中填充的物质为连接有凝集素的细菌纤维素。 2. 根据权利要求 1 所述的用于糖基分离的微流控凝集素芯片，其特征在于，所述 0 90， 0 90。 3. 一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，绘制通道图形，将设计好的通道图形打印在胶片上制成掩膜；。

6、步骤二，采用紫外刻蚀的方法将掩模板上的图形转移到玻璃盖片 12 上；步骤三，将经过刻蚀后的玻璃盖片 12 在超声波打孔机下于通道末端位置打孔，形成通道出入口，将打孔后的玻璃盖片 12 经过清洗后置于浓硫酸中活化，并与玻璃基底 13 键合，冷却后酸洗；步骤四，将细菌纤维素进行碱化处理，离心浸泡中和干净，粉碎，过筛，乙醇活化干燥后于溶剂中溶解，封闭样品入口 1 和样品出口 7，然后将溶解后的细菌纤维素由填料入口注入微型柱 4 的位置，冷冻干燥使再生细菌纤维素蓬松将柱子填满，清洗干净；步骤五，向样品入口 1 和样品出口 7 中注溶解后的高取代羟丙基纤。

7、维素进行通道改性，过夜室温放置后洗干净；步骤六，选定凝集素，封闭填料入口2和填料出口5，调节环氧氯丙烷pH，再将环氧氯丙烷于样品入口 1 通入通道中，放置，然后在凝集素等电点条件下，将凝集素溶于 TBS 缓冲液后于样品入口 1 通入通道中；步骤七，封闭填料入口 2 和填料出口 5，将糖基物质溶解于磷酸缓冲溶液，并于样品入口 1 中通入芯片进行分离，后将光谱扫描仪置于芯片柱前监测点 3、柱后监测点 6 上方进行在线检测；其中整个过程中以聚四氟乙烯管 10 作为进样管道。 4. 根据权利要求 3 所述的用于糖基分离的微流控凝集素芯片的制备方法，其特征。

8、在于，步骤一中，采用 AutoCAD 软件绘制通道图形，将设计好的通道图形导入 AdobeIllustrator 通过分辨率大于 3000dpi 的高分辨率打印机打印在菲林胶片上制成掩膜；其中，所述通道图形包括微型柱通道和样品通道，所述微型柱通道包括微型柱通道前部 8、微型柱 4、微型柱通道后部 9，样品通道包括样品通道前部 10、微型柱 4、样品通道后部 11，且微型柱通道与样品通道于微型柱 4 处重叠，其中样品通道前部 10、微型柱 4、样品通道后部 11 位于同一水平线上，微型柱通道前部 8 与微型柱通道权利要求书 CN 103344464。

9、 A 2 2/2 页 3 后部 9 分别位于样品通道上下两侧，微型柱通道前部 8 与样品通道前部 10 的角度为，微型柱通道后部 4 与样品通道后部 4 的角度为，其中 0 90， 0 90；所述掩模板制作的微结构线宽为 0，通道宽为 10400m，微型柱 4 长度为 20400 。 5. 根据权利要求 3 所述的用于糖基分离的微流控凝集素芯片的制备方法，其特征在于，步骤二中，紫外刻蚀的方法的步骤为：采用标准的紫外光刻法在铬版上刻蚀掩模板上的通道图形，开启光刻机预热 1020 分钟，在黄光下取出铬版，置于载物台上真空吸附；将掩膜平铺于铬版上，使用干。

10、净的抛光玻璃片压制，进行曝光预操作，曝光时间为 3060 秒；铬版曝光后，放在碱液中浸泡 1560s，取出后在去离子水中冲洗干净，浸入去铬液；取出后在去离子水中冲洗干净，置于电热鼓风干燥箱中高温坚膜 1020min ；将坚膜后的铬版浸入自制刻蚀液中刻蚀，刻蚀完成后在去离子水中冲洗干净后放入碱液中去胶，去胶后用去离子水冲洗，浸入去铬液中去掉铬层，去铬后用去离子水冲洗后置于电热鼓风干燥箱中烘干。 6. 根据权利要求 3 所述的用于糖基分离的微流控凝集素芯片的制备方法，其特征在于，步骤三中，将打孔后的玻璃按照洗涤剂、去离子水、丙酮、去离子水的顺序在。

11、超声波清洗槽中各清洗 20min，最后置于浓硫酸中活化 24h ；在马弗炉中将经过刻蚀和打孔的玻璃盖片 12 与同样尺寸的玻璃基片 13 程序升温高温键合；其中四个出入口半径 20100m。 7. 根据权利要求 3 所述的用于糖基分离的微流控凝集素芯片的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述碱化处理过程为将细菌纤维素经过质量百分数 4% 的氢氧化钠 80水浴 2h ；所述过筛目数为 150 目；所述细菌纤维素与溶剂质量比为 0.5:99.55:95 ；所述溶剂为 NaOH和硫脲的混合水溶液，其中NaOH占总溶剂的体积百分数为6%，硫脲占总溶剂的体积百分数为 8%。。

12、 8. 根据权利要求 3 所述的用于糖基分离的微流控凝集素芯片的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述高取代羟丙基纤维素经乙醇溶解，其浓度为 0.10.5%，所述百分数为质量百分数；所述溶解后的高取代羟丙基纤维素以去离子水和无水乙醇冲洗干净。 9. 根据权利要求 3 所述的用于糖基分离的微流控凝集素芯片的制备方法，其特征在于，步骤六中，调节环氧氯丙烷的 pH=512 ；将环氧氯丙烷于样品入口通入通道中 3060 放置 1020 h ；将凝集素溶于 TBS 缓冲液后于样品入口 1 通入通道中， 08 放置 1020 h ；其中 TBS 缓冲液配置凝集素的浓度为 10。

13、0g/mL， TBS 缓冲液中另含 CaCl2， MgCl2， MnCl2 各 1.0mmol/L，用 HCl 调节 pH 至凝集素等电点。权利要求书 CN 103344464 A 3 1/8 页 4 一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片及其制备方法技术领域 0001 本发明涉及流控芯片领域，特别是一种基于玻璃材质、细菌纤维素基质填料、应用于糖基化合物和微生物分离检测的凝集素芯片及其制备方法。背景技术 0002 凝集素芯片是糖组学研究的一项新技术，属于微流控芯片中分析芯片的一种。结构糖组学的研究主要聚焦在质谱技术和前沿亲和层析技术，但是质谱在区分糖异质体时仍然存在。

14、困难，而且对粗提样本的应用存在限制 , 通过凝集素亲和技术提取样本的核心糖谱信息，能以高通量的方式提供糖结构信息，因此，凝集素芯片可以作为质谱技术的互补技术，用于区分糖异质体和对粗提样本的识别。蛋白质的糖基化在许多生物过程，如免疫、细胞识别、信号传导以及病毒侵入等发挥着重要的作用。 0003 糖蛋白上的糖链在很大程度上影响着蛋白质的结构和功能。因此蛋白质糖基化的分析不论是在蛋白质组学的研究还是在药物筛选中都具有重要的意义。应用固定有凝集素的微流控芯片对糖蛋白进行分离分析具有重大的使用价值。微生物表面含有糖蛋白，但微生物发生病变或者其它改变，其糖蛋白的种类或是。

15、数目会有改变，表现在凝集素芯片上就是对凝集素亲和作用的强弱会发生明显变化。所以可以通过观测微生物表面糖蛋白的改变情况来进行微生物代谢状况预测。 0004 毛秀丽等在Anal. Chem.,76,2004,分别以寡糖链、糖肽以及整个糖蛋白（糖形）为分析对象，进行以微流控芯片和质谱或者二者联用为基础的 N- 连接蛋白质糖基化分析平台和方法的研究。在微流控芯片上实现了简单糖的快速电泳分离和直接、间接激光诱导荧光检测；发展了以芯片电泳与外切糖苷酶酶解结合，激光诱导荧光检测为基础，以糖肽为分析对象的糖链结构类型分析方法，对火鸡卵白蛋白的糖链结构进行推测，结果表明该蛋。

16、白含有高甘露糖型和杂合型的糖链；设计并制备了一种集成化凝集素亲和微流控芯片。该芯片采用电泳的方法，以电渗流为推动力，在需要保持活性的物质研究方面会有较大的局限性。 Jolita等在J.Chromatogr.B,831,2006,以改性纤维素作为基质，采用五乙烯六胺作为悬臂分别接枝了两种凝集素来制作了凝集素亲和色谱柱，该色谱柱在分离糖基化合物是表现出了较高的重现性，但该方法操作步骤相对繁琐。发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片及其制备方法。 0006 实现本发明目的的技术解决方案为：一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片，包括微。

17、型柱通道，样品通道，样品入口，填料入口，柱前监测点，微型柱，填料出口，柱后监测点，样品出口，玻璃盖片，玻璃基底，聚四氟乙烯管；其中微型柱通道包括微型柱通道前部、微型柱、微型柱通道后部，样品通道包括样品通道前部、微型柱、样品通道后部，且微型柱通道与样品通道于微型柱处重叠，其中样品通道前部、微型柱、样品通道后部位于同一水平线上，微型柱通道前部与微型柱通道后部分别位于样品通道上下两侧，微型柱通道前部与样说明书 CN 103344464 A 4 2/8 页 5 品通道前部的角度为，微型柱通道后部与样品通道后部的角度为；微型柱通道前端设。

18、有填料入口，微型柱通道末端设有填料出口，样品通道前端设有样品入口，样品通道末端设有样品出口，所述填料入口、填料出口、样品入口、样品出口分别与一根聚四氟乙烯管固定；样品通道前部设有柱前监测点，样品通道后部设有柱后监测点；所述微型柱通道与样品通道刻蚀于玻璃盖片，玻璃盖片与玻璃基底高温键合。 0007 一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片的制备方法，包括如下步骤：步骤一，绘制通道图形，将设计好的通道图形打印在胶片上制成掩膜。 0008 步骤二，采用紫外刻蚀的方法将掩模板上的图形转移到玻璃盖片上。 0009 步骤三，将经过刻蚀后的玻璃盖片在超声波打孔机下于通。

19、道末端位置打孔，形成通道出入口；打孔后的玻璃经过清洗后置于浓硫酸中活化，在马弗炉中程序升温与玻璃基底高温键合，冷却后酸洗。 0010 步骤四，将细菌纤维素进行碱化处理，离心浸泡中和干净，粉碎，过筛，乙醇活化干燥后于溶剂中溶解，封闭样品入口和样品出口，然后将溶解后的细菌纤维素由填料入口注入微型柱的位置，冷冻干燥使再生细菌纤维素蓬松将柱子填满，清洗干净。 0011 步骤五，向样品入口和样品出口中注溶解后的高取代羟丙基纤维素进行通道改性，过夜室温放置后洗干净。 0012 步骤六，选定凝集素，封闭填料入口和填料出口，调节环氧氯丙烷 pH，再将环氧氯丙。

20、烷于样品入口通入通道中，放置，然后在凝集素等电点条件下，将凝集素溶于 TBS 缓冲液后于样品入口通入通道中。 0013 步骤七，封闭填料入口和填料出口，将糖基物质溶解于磷酸缓冲溶液，并于样品入口中通入芯片进行分离，后将光谱扫描仪置于芯片检测点上方进行在线检测。 0014 其中整个过程中以细管作为进样管道。 0015 本发明与现有技术相比，其显著优点为： 1. 本发明以再生细菌纤维素为微型柱的基质填料，比表面积大，能极大的增强柱子中物质的接触面积； 2. 本发明以羟丙基纤维素为亲水性修饰涂层，修饰方法简便，效果好； 3. 本发明用环氧氯丙烷作为纤维素羟基和凝。

21、集素之间的共价偶联物质，操作简单，连接效果好，芯片的重现性好； 4. 本发明采用压力作为推动力，比电泳的方法更适合于活体（微生物）检测。 0016 下面结合附图对本发明作进一步详细描述。附图说明 0017 图 1 为芯片通道结构示意图。 0018 图 2 为芯片立体结构示意图。 0019 图 3 为芯片制作工艺流程图。具体实施方式 0020 本发明的一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片，包括微型柱通道，样品通道，样品入口 1，填料入口 2，柱前监测点 3，微型柱 4，填料出口 5，柱后监测点 6，样品出口 7，玻璃盖片 12，玻璃基底 13，聚四。

22、氟乙烯管 14 ；其中微型柱通道包括微型柱通道前部 8、微型柱 4、微型柱通道后部9，样品通道包括样品通道前部10、微型柱4、样品通道后部11，且微型柱通说明书 CN 103344464 A 5 3/8 页 6 道与样品通道于微型柱 4 处重叠，其中样品通道前部 10、微型柱 4、样品通道后部 11 位于同一水平线上，微型柱通道前部8与微型柱通道后部9分别位于样品通道上下两侧，微型柱通道前部 8 与样品通道前部 10 的角度为，微型柱通道后部 9 与样品通道后部 11 的角度为，其中 0 90， 0 90；微型柱通道前端设有填料入口 2，微型柱通。

23、道末端设有填料出口 5，样品通道前端设有样品入口 1，样品通道末端设有样品出口 7，所述填料入口 2、填料出口 5、样品入口 1、样品出口 7 分别与一根聚四氟乙烯管 14 固定；样品通道前部设有柱前监测点 3，样品通道后部设有柱后监测点 6 ；所述微型柱通道与样品通道刻蚀于玻璃盖片 12，玻璃盖片 12 与玻璃基底 13 高温键合。 0021 其中微型柱 4 中填充的是连接有凝集素的细菌纤维素。 0022 本发明的一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片的制备方法，具体步骤如下：步骤一，采用 AutoCAD 软件绘制通道图形，将设计好。

24、的通道图形导入 AdobeIllustrator 通过高分辨率打印机 ( 分辨率大于 3000dpi) 打印在菲林胶片上制成掩膜；其中，所述掩模板制作的微结构线宽为 0，通道宽为 10400m，四个出入口半径 20100m，微型柱长度为 20400 ；所述通道图形包括微型柱通道和样品通道，所述微型柱通道包括微型柱通道前部 8、微型柱 4、微型柱通道后部 9，样品通道包括样品通道前部 10、微型柱 4、样品通道后部 11，且样品通道前部 10、微型柱 4、样品通道后部 11 位于同一水平线上，微型柱通道前部8与微型柱通道后部9分别位于样品通道上。

25、下两侧，微型柱通道前部 8 与样品通道前部 10 的角度为，微型柱通道后部 9 与样品通道后部 11 的角度为，其中 0 90， 0 90。 0023 步骤二，采用标准的紫外光刻法在铬版上刻蚀掩模板上的通道图形，开启光刻机预热 1020 分钟，在黄光下取出铬版，置于载物台上真空吸附；将掩膜平铺于铬版上，使用干净的抛光玻璃片压制，进行曝光预操作，曝光时间为 3060 秒；铬版曝光后，放在碱液中浸泡 1560s，取出后在去离子水中冲洗干净，浸入去铬液；取出后在去离子水中冲洗干净，置于电热鼓风干燥箱中高温坚膜 1020min ；将坚膜后的铬版浸入。

26、自制刻蚀液中刻蚀，刻蚀完成后在去离子水中冲洗干净后放入碱液中去胶，去胶后用去离子水冲洗，浸入去铬液中去掉铬层，去铬后用去离子水冲洗后置于电热鼓风干燥箱中烘干。 0024 步骤三，将经过刻蚀、去胶、去铬后的玻璃盖片 12 在超声波打孔机下分别于样品通道前端，样品通道后端，微型柱通道前端，微型柱通道末端位置打孔，形成样品入口 1，样品出口 7，填料入口 2，填料出口 5 ；将打孔后的玻璃按照洗涤剂、去离子水、丙酮、去离子水的顺序在超声波清洗槽中各清洗 20min，最后置于浓硫酸中活化 24h ；在马弗炉中将经过刻蚀和打孔的玻璃盖片 12 与同样尺。

27、寸的玻璃基片 13 程序升温高温键合，冷却后酸洗。 0025 步骤四，将细菌纤维素经过质量百分数 4% 的氢氧化钠 80水浴 2h 后，经离心浸泡中和干净，粉碎，过 150 目筛，乙醇活化干燥后于溶剂中溶解；封闭样品入口 1，样品出口 7，然后由填料入口 2 将溶解后的细菌纤维素注入微型柱 4 的位置，多余的溶液经填料出口 5 出来，冷冻干燥使再生细菌纤维素蓬松将柱子填满，再用去离子水和无水乙醇反复清洗干净；其中细菌纤维素与溶剂质量比为 0.5:99.55:95 ；所述溶剂为 NaOH 和硫脲的混合水溶液，其中 NaOH 占总溶剂的体积百分数为 6%，。

28、硫脲占总溶剂的体积百分数为 8%。 0026 步骤五，向样品入口 1 和填料入口 2 中注入经乙醇溶解的高取代羟丙基纤维素进行通道改性，过夜室温放置，先后以去离子水和无水乙醇冲洗干净；其中羟丙基纤维素的浓说明书 CN 103344464 A 6 4/8 页 7 度为 0.10.5%，所述百分数为质量百分数。 0027 步骤六，选定凝集素，封闭填料入口 2 和填料出口 5，调节环氧氯丙烷的 pH=512，再将环氧氯丙烷于样品入口 1 通入通道中， 3060 放置 1020 h，使细菌纤维素上的羟基与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物，在凝集素等电点条件下，将凝集素溶。

29、于 TBS 缓冲液后于样品入口 1 加入环氧化合物， 08 放置 1020 h ；其中 TBS 缓冲液配置凝集素的浓度为 100g/mL， TBS 缓冲液中另含 CaCl2， MgCl2， MnCl2各 1.0mmol/L，用 HCl 调节 pH 至等电点。 0028 步骤七，封闭填料入口 2 和填料出口 5，将糖基物质溶解于磷酸缓冲溶液，并于样品入口 1 中通入芯片进行分离，后将光谱扫描仪置于芯片检测点上方进行在线检测。 0029 其中整个过程中以聚四氟乙烯管 14 作为进样管道，将细管固定在各进出口。 0030 本发明主要是通过微机电技术设计制作一种微流控芯片，将再生的。

30、细菌纤维素作为芯片通道柱的填料填充在微通道里面，经过疏水性修饰在填料表面固定凝集素，依据凝集素对糖基的特异性亲和作用将糖蛋白、脂多糖等表面含特定糖基的物质分离开来。芯片内壁经过亲水性改性，在微通道里面填充蓬松的细菌纤维素基质，通过一系列化学键作用将凝集素固定在芯片通道里面，这种固定了凝集素的芯片通过与糖基的亲和强弱作用将糖蛋白或者微生物等表面含糖基的物质分离开来。 0031 实施例 1 ：本发明的一种具有糖基化合物分离功能的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：步骤一，采用 AutoCAD 软件绘制通道图形，将设计好的通道图形导。

31、入 AdobeIllustrator 通过高分辨率打印机 ( 分辨率大于 3000dpi) 打印在菲林胶片上制成掩膜；其中，所述掩模板制作的图形线宽为零，通道宽为 10m，通道末端储液池半径为 20m，微型柱长度为 20 ；为 30，为 40。 0032 步骤二，采用标准的紫外光刻法在铬版上刻蚀掩模板上的微结构，开启光刻机预热 10 分钟，在黄光下取出铬版，置于载物台上真空吸附；将掩膜平铺于铬版上，使用干净的抛光玻璃片压制，进行曝光预操作，选择曝光时间为 30 秒进行曝光；铬版曝光后，放在碱液液中浸泡 15s，取出后在去离子水中冲洗干净，浸。

32、入去铬液；取出后在去离子水中冲洗干净，置于电热鼓风干燥箱中高温坚膜 10min ；将坚膜后的铬版浸入自制刻蚀液中刻蚀，刻蚀完成后在去离子水中冲洗干净后放入碱液中去胶，去离子水冲洗，浸入去铬液中去掉铬层，去离子水冲洗后置于电热鼓风干燥箱中烘干。 0033 步骤三，将经过刻蚀、去胶、去铬后的玻璃基片在超声波打孔机下打孔；将打孔后的玻璃按照洗涤剂、去离子水、丙酮、去离子水的顺序在超声波清洗槽中各清洗 20min，最后置于浓硫酸中活化 24h。在马弗炉中将经过刻蚀和打孔的玻璃盖片与同样尺寸的玻璃基片程序升温高温键合，冷却后酸洗。 0034 步骤四，将实验。

33、室发酵所得细菌纤维素 BC 经过 4% 质量分数氢氧化钠 80水浴 2h 后，经离心浸泡中和干净，粉碎，过 150 目筛，乙醇活化干燥，按细菌纤维素与溶剂质量比 0.5:99.5经质量百分数为6%NaOH和8%硫脲配置的溶剂溶解，注入芯片中填料柱的位置，冷冻干燥使再生 BC 蓬松将柱子填满，再用去离子水和无水乙醇反复清洗干净。该操作过程，将 1 和 7 孔封闭。 0035 步骤五，向通道中注入经乙醇溶解的高取代羟丙基纤维素（H-HPC）进行通道改性，过夜室温放置，先后以去离子水和无水乙醇冲洗干净；其中羟丙基纤维素的浓度为 0.1%，说明书 CN 1033。

34、44464 A 7 5/8 页 8 所述百分数为质量百分数。此过程羟丙基纤维素溶液从 1 和 2 入口经注射泵通过聚四氟乙烯管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔 5 和 7 出来。 0036 步骤六，对于选定好的凝集素伴刀豆求凝集素 (Con A)，本发明的做法包含两步：第一步，在 pH=9 时，将环氧氯丙烷通入通道中， 30放置 20h，细菌纤维素上的羟基与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物；第二步，在 TBS 缓冲液中于凝集素等电点（pH=7.4）条件下将环氧化合物与凝集素上氨基偶联， 0放置 10h，其中 TBS 缓冲液配置凝集素的浓度为 100g。

35、/mL， HCl 调节 pH 至等电点，其中 TBS 缓冲液中含 CaCl2， MgCl2， MnCl2各 1.0mmol/L。此过程时 2 和 5 孔封闭， TBS 缓冲液从 1 入口经注射泵通过细管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔 7 出来。 0037 步骤七，以和芯片进出口孔道孔径相配的聚四氟乙烯细管作为芯片与外界连接管路，糖基物质在磷酸缓冲溶液中通入芯片进行分离。该过程 2 和 5 孔封闭，样品从 1 入口经注射泵通过细管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔 7 出来。 0038 以微生物培养液为样品进行目标蛋白的分离，经检测，能有效地分。

36、离目标蛋白。 0039 实施例 2 ：本发明的一种具有糖基化合物分离功能的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：步骤一，采用 AutoCAD 软件绘制通道图形，将设计好的通道图形导入 AdobeIllustrator 通过高分辨率打印机 ( 分辨率大于 3000dpi) 打印在菲林胶片上制成掩膜；其中，所述掩模板制作的图形线宽为零，通道宽为 400m，通道末端储液池半径为 100m，微型柱长度为 400 ；为 90，为 60。 0040 步骤二，采用标准的紫外光刻法在铬版上刻蚀掩模板上的微结构，开启光刻机预热 20 分钟，。

37、在黄光下取出铬版，置于载物台上真空吸附；将掩膜平铺于铬版上，使用干净的抛光玻璃片压制，进行曝光预操作，选择曝光时间为 60 秒进行曝光；铬版曝光后，放在碱液液中浸泡 60s，取出后在去离子水中冲洗干净，浸入去铬液；取出后在去离子水中冲洗干净，置于电热鼓风干燥箱中高温坚膜 20min ；将坚膜后的铬版浸入自制刻蚀液中刻蚀，刻蚀完成后在去离子水中冲洗干净后放入碱液中去胶，去离子水冲洗，浸入去铬液中去掉铬层，去离子水冲洗后置于电热鼓风干燥箱中烘干。 0041 步骤三，将经过刻蚀、去胶、去铬后的玻璃基片在超声波打孔机下打孔；将打孔后的玻璃按照洗。

38、涤剂、去离子水、丙酮、去离子水的顺序在超声波清洗槽中各清洗 20min，最后置于浓硫酸中活化 24h。在马弗炉中将经过刻蚀和打孔的玻璃盖片与同样尺寸的玻璃基片程序升温高温键合，冷却后酸洗。 0042 步骤四，将实验室发酵所得细菌纤维素 BC 经过 4% 质量分数氢氧化钠 80水浴 2h 后，经离心浸泡中和干净，粉碎，过 150 目筛，乙醇活化干燥，按细菌纤维素与溶剂质量比 5:95 经质量百分数为 6%NaOH 和 8% 硫脲配置的溶剂溶解，注入芯片中填料柱的位置，冷冻干燥使再生 BC 蓬松将柱子填满，再用去离子水和无水乙醇反复清洗干净。该操作过程，将 1 。

39、和 7 孔封闭。 0043 步骤五，向通道中注入经乙醇溶解的高取代羟丙基纤维素（H-HPC）进行通道改性，过夜室温放置，先后以去离子水和无水乙醇冲洗干净；其中羟丙基纤维素的浓度为 0.5%，所述百分数为质量百分数。此过程羟丙基纤维素溶液从 1 和 2 入口经注射泵通过聚四氟乙烯管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔 5 和 7 出来。说明书 CN 103344464 A 8 6/8 页 9 0044 步骤六，对于选定好的凝集素伴刀豆求凝集素 (Con A)，本发明的做法包含两步：第一步，在 pH=11 时，将环氧氯丙烷通入通道中， 50放置 10。

40、h，细菌纤维素上的羟基与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物；第二步，在 TBS 缓冲液中于凝集素等电点（pH=7.4）条件下将环氧化合物与凝集素上氨基偶联， 8放置 20h，其中 TBS 缓冲液配置凝集素的浓度为 100g/mL， HCl 调节 pH 至等电点，其中 TBS 缓冲液中含 CaCl2， MgCl2， MnCl2各 1.0mmol/L。此过程时 2 和 5 孔封闭， TBS 缓冲液从 1 入口经注射泵通过细管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔 7 出来。 0045 步骤七，以和芯片进出口孔道孔径相配的聚四氟乙烯细管作为芯片与外界连接管路，糖基物。

41、质在磷酸缓冲溶液中通入芯片进行分离。该过程 2 和 5 孔封闭，样品从 1 入口经注射泵通过细管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔 7 出来。 0046 以微生物培养液为样品进行目标蛋白的分离，经检测，能有效地分离目标蛋白。 0047 实施例 3 ：本发明的一种具有糖基化合物分离功能的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：步骤一，采用 AutoCAD 软件绘制通道图形，将设计好的通道图形导入 AdobeIllustrator 通过高分辨率打印机 ( 分辨率大于 3000dpi) 打印在菲林胶片上制成掩膜；其中，所述掩模。

42、板制作的图形线宽为零，通道宽为 200m，通道末端储液池半径为 800m，微型柱长度为 200 ；为 50，为 90。 0048 步骤二，采用标准的紫外光刻法在铬版上刻蚀掩模板上的微结构，开启光刻机预热 15 分钟，在黄光下取出铬版，置于载物台上真空吸附；将掩膜平铺于铬版上，使用干净的抛光玻璃片压制，进行曝光预操作，选择曝光时间为 45 秒进行曝光；铬版曝光后，放在碱液液中浸泡 45s，取出后在去离子水中冲洗干净，浸入去铬液；取出后在去离子水中冲洗干净，置于电热鼓风干燥箱中高温坚膜 15min ；将坚膜后的铬版浸入自制刻蚀液中刻蚀，刻蚀。

43、完成后在去离子水中冲洗干净后放入碱液中去胶，去离子水冲洗，浸入去铬液中去掉铬层，去离子水冲洗后置于电热鼓风干燥箱中烘干。 0049 步骤三，将经过刻蚀、去胶、去铬后的玻璃基片在超声波打孔机下打孔；将打孔后的玻璃按照洗涤剂、去离子水、丙酮、去离子水的顺序在超声波清洗槽中各清洗 20min，最后置于浓硫酸中活化 24h。在马弗炉中将经过刻蚀和打孔的玻璃盖片与同样尺寸的玻璃基片程序升温高温键合，冷却后酸洗。 0050 步骤四，将实验室发酵所得细菌纤维素 BC 经过 4% 质量分数氢氧化钠 80水浴 2h 后，经离心浸泡中和干净，粉碎，过 150 目筛，乙醇活。

44、化干燥，按细菌纤维素与溶剂质量比 3:97 经质量百分数为 6%NaOH 和 8% 硫脲配置的溶剂溶解，注入芯片中填料柱的位置，冷冻干燥使再生 BC 蓬松将柱子填满，再用去离子水和无水乙醇反复清洗干净。该操作过程，将 1 和 7 孔封闭。 0051 步骤五，向通道中注入经乙醇溶解的高取代羟丙基纤维素（H-HPC）进行通道改性，过夜室温放置，先后以去离子水和无水乙醇冲洗干净；其中羟丙基纤维素的浓度为 0.3%，所述百分数为质量百分数。此过程羟丙基纤维素溶液从 1 和 2 入口经注射泵通过聚四氟乙烯管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔 5 和 7 出来。。

45、 0052 步骤六，对于选定好的凝集素伴刀豆求凝集素 (Con A)，本发明的做法包含两步：第一步，在 pH=10 时，将环氧氯丙烷通入通道中， 40放置 15h，细菌纤维素上的羟基与环说明书 CN 103344464 A 9 7/8 页 10 氧氯丙烷作用生成环氧化合物；第二步，在 TBS 缓冲液中于凝集素等电点（pH=7.4）条件下将环氧化合物与凝集素上氨基偶联， 4放置 15h，其中 TBS 缓冲液配置凝集素的浓度为 100g/mL， HCl 调节 pH 至等电点，其中 TBS 缓冲液中含 CaCl2， MgCl2， MnCl2各 1.0mmol/L。。

46、此过程时 2 和 5 孔封闭， TBS 缓冲液从 1 入口经注射泵通过细管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔 7 出来。 0053 步骤七，以和芯片进出口孔道孔径相配的聚四氟乙烯细管作为芯片与外界连接管路，糖基物质在磷酸缓冲溶液中通入芯片进行分离。该过程 2 和 5 孔封闭，样品从 1 入口经注射泵通过细管注入，经柱前监测点、微型柱、柱后监测点从孔 7 出来。 0054 以微生物培养液为样品进行目标蛋白的分离，经检测，能有效地分离目标蛋白。 0055 实施例 4 ：本发明的一种具有糖基化合物分离功能的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：步骤一，。

47、采用 AutoCAD 软件绘制通道图形，将设计好的通道图形导入 AdobeIllustrator 通过高分辨率打印机 ( 分辨率大于 3000dpi) 打印在菲林胶片上制成掩膜；其中，所述掩模板制作的图形线宽为零，通道宽为 200m，通道末端储液池半径为 800m，微型柱长度为 200 ；为 45，为 45。 0056 步骤二，采用标准的紫外光刻法在铬版上刻蚀掩模板上的微结构，开启光刻机预热 15 分钟，在黄光下取出铬版，置于载物台上真空吸附；将掩膜平铺于铬版上，使用干净的抛光玻璃片压制，进行曝光预操作，选择曝光时间为。

48、 45 秒进行曝光；铬版曝光后，放在碱液液中浸泡 45s，取出后在去离子水中冲洗干净，浸入去铬液；取出后在去离子水中冲洗干净，置于电热鼓风干燥箱中高温坚膜 15min ；将坚膜后的铬版浸入自制刻蚀液中刻蚀，刻蚀完成后在去离子水中冲洗干净后放入碱液中去胶，去离子水冲洗，浸入去铬液中去掉铬层，去离子水冲洗后置于电热鼓风干燥箱中烘干。 0057 步骤三，将经过刻蚀、去胶、去铬后的玻璃基片在超声波打孔机下打孔；将打孔后的玻璃按照洗涤剂、去离子水、丙酮、去离子水的顺序在超声波清洗槽中各清洗 20min，最后置于浓硫酸中活化 24h。在马弗炉中将经过刻蚀和打孔的玻璃盖片与同样尺寸的玻璃基片程序升温高温键合，冷却后酸洗。 0058 步骤四，将实验室发酵所得细菌纤维素 BC 经过 4% 质量分数氢氧化钠 80水浴 2h 后，经离心浸泡中和干净，粉碎，过 150 目筛，乙醇活化干燥，按细菌纤维素与溶剂质量比 3:97 经质量百分数为 6%NaOH。

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