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1、(10)申请公布号 CN 102964461 A (43)申请公布日 2013.03.13 CN 102964461 A *CN102964461A* (21)申请号 201210472158.X (22)申请日 2012.11.20 C08B 37/00(2006.01) A61P 37/04(2006.01) A61P 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 六安同济生生物科技有限公司 地址 237000 安徽省六安市经三路与皋城东 路交汇口科技局科技创业服务中心 (72)发明人 邓辉 余茂耘 胡言龙 (74)专利代理机构 安徽合肥华信知识产权。
2、代理 有限公司 34112 代理人 余成俊 (54) 发明名称 一种提高石斛生物活性多糖溶出率的生物酶 辅助提取方法 (57) 摘要 本发明公开了一种提高石斛生物活性多糖溶 出率的生物酶辅助提取方法， 采用最适 pH 接近中 性的多种生物酶复配分步辅助提取石斛多糖， 先 选用纤维素酶、 木聚糖酶和果胶酶分解石斛细胞 壁的纤维素、 半纤维素及果胶质等物质， 再用蛋白 酶降解细胞中的蛋白和多肽， 使多糖充分溶于水 中， 终产物经 HPSEC 分离和视差折光检测器检测 以及苯酚 - 硫酸法测定还原性糖含量。本发明方 法有效提高石斛生理活性多糖的溶出率， 明显降 低蛋白质含量， 产品质量和产量都有了大。
3、幅提高， 同时生产工艺中无酸碱溶液、 有毒有机试剂的使 用和排放及微波辐射发生， 更为节能、 环保。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 1/1 页 2 1. 一种提高石斛生物活性多糖溶出率的生物酶辅助提取方法， 其特征在于， 该方法在 中性 pH 条件下采用多种生物酶复配分步提纯药用石斛水溶性多糖， 其具体步骤如下 ： （1） 将干燥的石斛粉碎后过 40-50 目筛， 用 95% 食用乙醇索氏回流脱脂 1-2h ； （2） 将上述脱脂产物过滤， 烘干成干粉， 按质量分数取 。
4、4-6 份石斛干粉浸泡于 100 份的 蒸馏水中并调节 pH 值至 7.0， 然后水浴升温至 50-55， 再分别添加相当于石斛干粉质量 1.0-2.0% 的中性纤维素酶、 1.0-2.0% 的中性木聚糖酶和 1.0-2.0% 的果胶酶， 酶解 2-3h， 协 同分解破坏细胞组织中的纤维素、 半纤维素和果胶质 ； （3） 继续向 50-55、 pH 值 7.0 的浸泡液中加入相当于石斛干粉质量 1.0-2.0% 的中性 蛋白酶， 酶解 2-3h， 分解破坏细胞组织中的各类蛋白质和多肽 ； （4）将浸泡液加热至 90-95， 并保温 20-30min， 使加入的酶制剂变性失活， 4000-500。
5、0rpm 离心 30min, 除去变性蛋白及多肽， 上清液即为石斛多糖提取液 ； （5） 将石斛多糖提取液经旋转蒸发仪真空浓缩至适当体积， 然后再加入 4-5 倍浓缩液 体积的无水乙醇， 在 4-6中静置 22-24h 沉淀多糖 ； （6） 将乙醇沉淀物抽滤后得到固形物， 并用 75% 的食用乙醇液进行洗涤 ； （7） 将洗涤后的固形物在 50烘干至恒重， 然后粉碎， 即获得石斛粗多糖 ； （8） 利用高效体积排阻色谱 (HPSEC) 仪和视差折光检测器分离石斛粗多糖为不同分 子量范围的分离产物， 同时利用苯酚 - 硫酸法测定不同分子量范围分离产物的还原性糖含 量 ； 另外参照 2010 药典。
6、中 铁皮石斛 中规定方法测定多糖分解产物中的甘露糖和葡萄糖 比值。 2. 根据权利要求 1 所述的一种提高石斛生物活性多糖溶出率的生物酶辅助提取方法， 其特征在于， 所述步骤 （4） 获得的石斛粗多糖可直接或经过超滤装置分级制备成不同分子 量的石斛多糖， 添加到食品、 保健品和或进一步纯化后添加到药品中， 用于易疲劳， 抵抗力 差和癌症放化疗患者服用。 权 利 要 求 书 CN 102964461 A 2 1/6 页 3 一种提高石斛生物活性多糖溶出率的生物酶辅助提取方法 技术领域 0001 本发明涉及一种石斛多糖提取方法， 具体涉及一种提高石斛生物活性多糖溶出率 的生物酶辅助提取方法。 背景。
7、技术 0002 1. 药用石斛及其多糖的药用价值 0003 在国际上有 “药界大熊猫” 之称的野生霍山石斛， 又名米斛， 距今已有 200 多年的 历史。原产于我国安徽霍山等地， 是国家现代中药重大专项 200 多个濒危稀缺品种中首位 保护品种。是药用石斛中的极品， 也是霍山县独有的、 拥有原产地地理标志的名贵中药材， 历史上被誉为 “中华九大仙草之首” 、 “健康软黄金” 。 神农本草 、本草纲目 均有记载。 霍山石斛所含有的多糖能大幅度提高人体内 SOD （延缓衰老的主要物质） ， 在增强免疫力、 抗 疲劳、 延缓衰老和促进癌细胞凋亡等方面有明显作用， 从而达到保健益寿的功效。 除霍山石 。
8、斛之外， 其它药用石斛 ( 如铁皮石斛等 ) 也有着相似的保健和药用价值。 0004 2. 石斛多糖提取技术的应用现状 0005 石斛多糖传统提取分为以下步骤 ： 脱脂， 浸提， 浓缩， 脱蛋白， 醇沉和干燥， 已公开 的专利中有以下不足 ： 0006 脱脂中有的采用有毒的有机试剂 - 石油醚 （如专利 ： 保肝抗肝纤维化活性石斛多 糖及其抗体亲和层析制备方法 -CN 102504043 A、 一种铁皮石斛多糖提取物、 其药物组合物 和其制备方法及其应用 -CN 101015649A） ； 0007 浸提中有采用了微波处理 （如专利 ： 一种霍山石斛中生物活性多糖的提取、 纯化方 法 -CN 。
9、102391385 A， 一种降糖活性石斛多糖及其提取方法 - CN 101979639 A） ， 微波能耗 高， 设备贵， 有潜在辐射泄漏危害人体健康， 且微波处理对石斛多糖的提取效果在专利中也 未有单因素对比实验证明 ； 0008 而脱蛋白有的采用有毒的有机试剂 - 氯仿和正丁醇抽提 （如专利 ： 一种铁皮石斛 多糖提取物、 其药物组合物和其制备方法及其应用 -CN 102504043 A， 保肝抗肝纤维化活性 石斛多糖及其抗体亲和层析制备方法 - CN 102504043 A， 一种金钗石斛多糖提取物的制备 和应用 -CN 101407557） 0009 目前仅有 2 例采用生物酶提取石。
10、斛多糖的专利 ： 一种降糖活性石斛多糖及其提取 方法 -CN 101979639 A 和运用生物工程酶技术提取石斛多糖的工艺及其制品和应用 -CN 101724667 A， 但是都采用单一的纤维素酶， 且都采用了潜在有害人体健康的微波处理， 其 中前者在酸性条件 （4.5-5.5） 下处理原料， 酸能非专一性的破坏糖苷键， 使石斛多糖降解成 小分子糖链或单糖， 破坏其生理活性， 且具腐蚀性的酸性溶液对设备要求高， 工业化生产难 度高。 0010 3. 生物酶的性质和作用 0011 纤维素酶是由多种水解酶组成的一个复杂酶系。 习惯上， 将纤维素酶分成三类 ： C1 酶、 Cx 酶和 葡糖苷酶。C。
11、1 酶是对纤维素最初起作用的酶， 破坏纤维素链的结晶结构。Cx 说 明 书 CN 102964461 A 3 2/6 页 4 酶是作用于经C1酶活化的纤维素、 分解-1， 4-糖苷键的纤维素酶。 葡糖苷酶可以将纤 维二糖、 纤维三糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖 ； 0012 木聚糖酶能破坏植物的纤维组织， 将木聚糖分解成木糖的酶， 木聚糖酶可以分解 细胞壁以及 - 葡聚糖， 降低物料的粘度 ； 0013 果胶酶是多酶复合物， 通常包括原果胶酶、 果胶甲酯水解酶、 果胶酸酶。通过它们 的联合作用使果胶质得以完全分解。天然的果胶质在原果胶酶作用下， 转化成水可溶性的 果胶 ； 果胶被果胶甲酯水。
12、解酶催化去掉甲酯基团， 生成果胶酸 ； 果胶酸经果胶酸水解酶类 和果胶酸裂合酶类降解生成半乳糖醛酸。 0014 纤维素酶、 木聚糖酶和果胶酶联合使用能专一、 有效破环纤维素、 半纤维素和果胶 质形成的紧密网络， 使多糖充分溶出释放。 0015 蛋白酶催化蛋白质中肽键水解， 能分解破坏蛋白质和多肽， 使其变性降解， 利于原 料中蛋白类物质的去除和多糖的分离纯化。 0016 4. 石斛生理活性与多糖含量、 多糖分子量及多糖组成的关系 0017 同一品种的石斛品质 ( 生理活性 ) 与其自身多糖含量有关 ； 不同品种的石斛品质 ( 生理活性 ) 不能简单的以其多糖含量为依据， 因为多糖的组成复杂且不。
13、同， 含糖量最高不 意味着品质一定最好， 所以不同石斛间品质对比不能仅以其总多糖含量为标准。 0018 多糖的药理活性与其初级结构、 高级结构、 分子量、 溶解度、 粘度有着密切的关系， 多糖分子的活性与其分子量有着一定关系， 一般分子量为 100-300kDa 的高分子多糖呈现 较强的活性。 0019 多糖的生理活性是基于糖链的一级结构和高级结构， 但糖分子结构十分复杂， 难 以简单确定对应关系。因为甘露糖为多种多糖的组成成分， 是目前唯一用于在临床上的糖 质营养素， 广泛分布于体液和组织中， 尤其是在神经、 皮肤、 睾丸、 视网膜、 肝和肠。 其直接被 利用合成糖蛋白。 其在人体内生理效应。
14、如下 ： 1） 调节免疫系统， 2） 巨噬细胞表面有 4 种 接受器都有甘露糖成分， 3） 增加伤口愈合， 4） 抗发炎效果， 5） 抑制肿瘤生长与转移， 增加癌 症存活率 ， 6） 可以避免某些细菌感染， 如泌尿道感染。所以， 2010 版药典在 铁皮石斛 一 篇中， 以多糖分解产物的 HPLC 色谱图中甘露糖和葡萄糖的峰面积比 （2.4-8.0） 为依据， 确 定其品质， 而 2010 版药典对 石斛 无此判定依据。 0020 4. 石斛多糖分子量和含量的测定方法 0021 已有的利用酶技术提取的石斛多糖的专利仍采用基于酸解产生的还原性糖的量 来确定多糖含量的测定方法 （见 2010 版药。
15、典 铁皮石斛 ） ， 这在概念上混淆了总糖和多糖 的概念。 传统水提醇沉法提取的多糖过程中， 基本不发生纤维素， 半纤维素等不溶性多糖的 分解， 所以提取产物中产物中不含由纤维素， 半纤维素分解产生的单糖和寡糖链， 上述检测 方法是合适的 ； 而酶技术在提取过程中使纤维素， 半纤维素分解产生了不确定量的还原性 单糖和寡糖， 采用上述检测方法实际是测定提取物中总糖含量， 把总糖含量当作多糖含量， 实际放大了多糖含量， 所以是凡利用酶技术提取石斛多糖的专利， 在采用上述检测方法 （或 没有明确提及检测方法） 而宣称提取的多糖含量增加的， 都是不可采信的。 0022 多糖分子量和含量的测定可以采用高。
16、效体积排阻色谱 （HPSEC） 法测定多糖分子 量， 该方法利用体积排阻色谱柱和视差折光检测器来分离和检测多糖， 同时收集不同分子 量范围的多糖， 再利用酸解产生还原性糖的方法 （如苯酚 - 硫酸法） 测定不同分子量范围分 说 明 书 CN 102964461 A 4 3/6 页 5 离产物的还原性糖含量， 得出不同分子量范围的多糖占总糖的含量比例。 发明内容 0023 本发明旨在提供一种温和、 环保的提高石斛生物活性多糖溶出率的生物酶辅助提 取石斛多糖方法。 0024 本发明采用的技术方案如下 ： 0025 一种提高石斛生物活性多糖溶出率的生物酶辅助提取方法， 该方法在中性 pH 条 件下采。
17、用多种生物酶复配分步提纯药用石斛水溶性多糖， 其具体步骤如下 ： 0026 （1） 将干燥的石斛粉碎后过 40-50 目筛， 用 95% 食用乙醇索氏回流脱脂 1-2h ； 0027 （2） 将上述脱脂产物过滤， 烘干成干粉， 按质量分数取 4-6 份石斛干粉浸泡于 100 份的蒸馏水中并调节pH值至7.0， 然后水浴升温至50-55， 再分别添加相当于石斛干粉质 量 1.0-2.0% 的中性纤维素酶、 1.0-2.0% 的中性木聚糖酶和 1.0-2.0% 的果胶酶， 酶解 2-3h， 协同分解破坏细胞组织中的纤维素、 半纤维素和果胶质 ； 0028 （3） 继续向 50-55、 pH 值 7。
18、.0 的浸泡液中加入相当于石斛干粉质量 1.0-2.0% 的 中性蛋白酶， 酶解 2-3h， 分解破坏细胞组织中的各类蛋白质和多肽 ； 0029 （4）将浸泡液加热至 90-95， 并保温 20-30min， 使加入的酶制剂变性失活， 4000-5000rpm 离心 30min, 除去变性蛋白及多肽， 上清液即为石斛多糖提取液 ； 0030 （5） 将石斛多糖提取液经旋转蒸发仪真空浓缩至适当体积， 然后再加入 4-5 倍浓 缩液体积的无水乙醇， 在 4-6中静置 22-24h 沉淀多糖 ； 0031 （6） 将乙醇沉淀物抽滤后得到固形物， 并用 75% 的食用乙醇液进行洗涤 ； 0032 （7。
19、） 将洗涤后的固形物在 50烘干至恒重， 然后粉碎， 即获得石斛粗多糖 ； 0033 （8） 利用高效体积排阻色谱 (HPSEC) 仪和视差折光检测器分离石斛粗多糖为不同 分子量范围的分离产物， 同时利用苯酚 - 硫酸法测定不同分子量范围分离产物的还原性糖 含量 ； 另外参照 2010 药典中 铁皮石斛 中规定方法测定多糖分解产物中的甘露糖和葡萄 糖比值。 0034 所述步骤 （4） 获得的石斛粗多糖可直接或经过超滤装置分级制备成不同分子量的 石斛多糖， 添加到食品、 保健品和或进一步纯化后添加到药品中， 用于易疲劳， 抵抗力差和 癌症放化疗患者服用。 0035 与现有技术相比， 本发明的优点。
20、在于 ： 0036 本发明采用多种生物酶复配分步提纯药用石斛水溶性多糖， 反应过程 pH 为中性， 添加的生物酶能专一的分解纤维素 , 半纤维素、 果胶质和蛋白质， 而不破坏石斛多糖结构， 使石斛多糖保持原有活性， 且有效提高石斛生理活性多糖的溶出率， 比不加酶处理的提高 2.4 倍， 明显降低蛋白质含量， 纯度提高近 2 倍， 产品质量和产量都有了大幅提高， 同时生产 工艺中无酸碱溶液、 有毒有机试剂的使用和排放及微波辐射发生， 更为节能、 环保。 具体实施方式 0037 下面将通过实例对本发明作进一步的描述， 这些描述并不是要对本发明内容作出 限定。 本领域的技术人员对本发明内容的拄术特征。
21、所作的等同替换， 或相应的改进， 仍属于 本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 102964461 A 5 4/6 页 6 0038 实施例 0039 一种提高石斛生物活性多糖溶出率的生物酶辅助提取方法 ： 0040 （1） 将干燥的野生霍山石斛或铁皮石斛 （产地霍山） 石斛粉碎后过 40 目筛， 称取 50g 加入 500mL 95% 食用乙醇索氏回流脱脂 1h ； 0041 （2） 将上述脱脂产物烘干成干粉， 按质量分数， 取5g石斛干粉浸泡于100mL的蒸馏 水中并调节 pH 值至 7.0， 然后水浴升温至 50， 再分别添加相当于石斛干粉质量 1.5% 的中 性纤维素酶、 2.0%。
22、 的木聚糖酶和 1.5% 的果胶酶， 酶解 2h， 协同分解破坏细胞组织中的纤维 素、 半纤维素和果胶质 ； 0042 （3） 继续向 50、 pH 值 7.0 的浸泡液中加入相当于石斛干粉质量 2% 的中性蛋白 酶， 并保温 2h， 分解破坏细胞组织中的各类蛋白质和多肽 ； 0043 （4）将 浸 泡 液 加 热 至 95 ， 并 保 温 10min， 使 加 入 的 酶 制 剂 变 性 失 活， 4000-5000rpm 离心 30min, 除去变性蛋白及多肽， 上清液即为石斛多糖提取液 ； 0044 （5） 将石斛多糖提取液经旋转蒸发仪真空浓缩 （温度 60） 至 10mL， 然后再加入。
23、 40mL 无水乙醇， 在 4中静置 24h 沉淀多糖 ； 0045 （6） 将乙醇沉淀物抽滤后得到固形物， 并用 75% 的食用乙醇液进行洗涤 ； 0046 （7） 将洗涤后的固形物在 50烘干至恒重， 然后粉碎， 即获得石斛粗多糖 5.0（霍 山石斛） 或 5.6g（铁皮石斛） 。 0047 （8）利用高效液相色谱仪和视差折光检测器分离、 检测多糖分子量 高效色 谱仪， 视差折光检测器 （日本 shodex RI SE-51） ， 体积排阻色谱柱 （Bio-Gel TSK-50， 6.5300mm） ， 对照 ： 标准多糖 （T- 葡聚糖系列， Pharmacia） 和葡萄糖， 流动相 ：。
24、 0.2mol/L 磷 酸盐缓冲液 （pH6.0） ， 同时利用苯酚 - 硫酸法测定还原性糖含量， 结果表明 ： 从小分子单糖 到 400KD 以上的的大分子多糖在提取物中都存在 , 见表 1- 两种石斛多糖提取方法的效果 比对。其中霍山石斛多糖提取物中， 酸解后的还原性总糖含量为 79%， 分子量为 400KD 以上 的多糖占总糖的 17%， 300KD-200KD 的多糖质量占总糖的 26%， 200KD -100KD 的多糖质量占 总糖的 38%， 小于 100KD 的多糖和单糖混合物占 19% ； 而铁皮石斛 ( 产地霍山 ) 提取物中， 酸 解后的还原性总糖含量为81%， 分子量为4。
25、00KD以上的多糖占总糖的18%， 300KD-200KD的多 糖质量占总糖的 36%， 200KD -100KD 的多糖质量占总糖的 25%， 小于 100KD 的多糖和单糖混 合物占 21%。 0048 参照 2010 药典中 铁皮石斛 中规定方法测定多糖分解产物中的甘露糖和葡萄 糖比值。结果表明 ： 本方法提取的霍山石斛总糖分解产物中甘露糖和葡萄糖的的峰面积比 值为 7.8， 而铁皮石斛 ( 产地霍山 ) 的总糖分解产物中甘露糖和葡萄糖的的峰面积比值为 6.4。 0049 对比实施例 0050 石斛多糖传统提取方法 ： 0051 将干燥的野生霍山石斛或铁皮石斛 （产地霍山） 石斛 50g。
26、 粉碎后过 40 目筛， 加入 500mL 石油醚索氏回流脱脂 1h ； 脱脂产物烘干成干粉， 按质量分数， 取 5 份干粉浸泡于 100 份的蒸馏水中， 100水浴提取 4 小时， 提取三次， 合并提取液， 真空浓缩 （温度 60） 至 体积为 10mL ； 加入氯仿和正丁醇的混和溶液 （体积比为 4 ： 1） 充分混匀后静置分层， 分离有 机相去除蛋白 ； 然后再向水溶液中加入 4 倍体积的 95% 食用乙醇， 在 4中静置 24h 沉淀多 说 明 书 CN 102964461 A 6 5/6 页 7 糖 ； 将乙醇沉淀物抽滤后得到粗多糖， 并用 70% 的食用乙醇液进行洗涤 ； 将洗涤后。
27、的粗多糖 在 50烘干至恒重， 然后粉碎， 即获得石斛粗多糖 3.6（霍山石斛） 或 3.8g（铁皮石斛） 。 0052 按照前述方法， 其中霍山石斛提取物中 , 测得提取物中总糖含量为 40%， 分子量 为 400KD 以上的多糖占总糖的 19%， 300KD-200KD 的多糖质量占总糖的 30%， 200KD -100KD 的多糖质量占总糖的 43%， 小于 100KD 的多糖和单糖混合物占 8% ； 而铁皮石斛 ( 产地霍 山 ) 提取物中， 测得提取物中总糖含量为 43%， 分子量为 400KD 以上的多糖占总糖的 20%， 300KD-200KD的多糖质量占总糖的39%， 200K。
28、D -100KD的多糖质量占总糖的31%， 小于100KD 的多糖和单糖混合物占 10% ； 本方法提取的霍山石斛总糖分解产物中甘露糖和葡萄糖的的 峰面积比值为6.5， 而铁皮石斛(产地霍山)的总糖分解产物中甘露糖和葡萄糖的的峰面积 比值为 5.3。 0053 0054 表 1 两种石斛多糖提取方法的效果比对 0055 注 ： 1. 得率 ： 为粗多糖占原料的百分含量 ； 0056 2. 总糖含量 ： 为粗多糖经酸解后， 其中还原性糖的含量占粗多糖质量的百分含 量。 0057 通过实施例和对比实施例可知 ： 本发明方法与传统技术相比 （详见表 1） : 0058 1. 本发明无有毒试剂的使用 。
29、； 0059 2. 粗多糖得率由 7.2% 上升到 10%（霍山石斛）或 7.6% 上升到 11.2%（铁皮石 斛） ， 其中提取的具有生理活性的多糖 （分子量 100KD-300KD） 的产率 （以霍山石斛为例） 由 2.102%7.2%*40%* （30%+43%） 上升到5.056%10%*79%* （26%+38%） ， 提高了2.40倍， 或 （以 铁皮石斛为例） 由 2.287%7.6%*43%* （39%+31%） 上升到 5.534%11.2%*81%* （36%+25%） ， 提高了 2.41 倍 ； 0060 3. 酶法辅助提取石斛多糖使提取物中小分子糖 （小于 100KD。
30、 的多糖和单糖混合 说 明 书 CN 102964461 A 7 6/6 页 8 物） 的含量增加 ： 由 8% 增加到 19%（霍山石斛） ， 或 10% 增加到 21%（铁皮石斛） ， 所以通过 酸解测定还原性总糖来确定总多糖含量的方法是不可取的， 必须按多糖分子量大小分段测 定 ； 0061 4. 酶法辅助提取石斛多糖使提取物中的葡萄糖单元增加 ： 霍山石斛总糖分解产 物中甘露糖和葡萄糖的的峰面积比值由7.8降低为6.4， 而铁皮石斛(产地霍山)的总糖分 解产物中甘露糖和葡萄糖的的峰面积比值由 6.5 降低为 5.2， 同样证明通过酸解测定还原 性总糖来确定总多糖含量的方法是不可取的， 必须按多糖分子量大小分段测定。 说 明 书 CN 102964461 A 8 。