一种检测空调过滤网灰尘中尘螨变应原基因的方法.pdf

本发明涉及一种检测空调过滤网灰尘中尘螨变应原基因的方法。过敏性疾病是由于各种接触或吸入变应原引起的，其中，尘螨引起的变态反应疾病占70％左右。引起变态反应疾病的尘螨主要包括户尘螨和粉尘螨。经过调查发现空调过滤网也是它们嗜好的栖居场所之一。本发明运用PCR方法检测空调过滤网灰尘中尘螨变应原的基因。具体地说通过玻璃颗粒吸附法等方法提取空调过滤网灰尘中总的微生物基因组DNA作模板，分别设计Der p1和Der f1各两套内外扩增引物进行套式PCR反应或分两步进行PCR，通过扩增出目的片段来检测空调过滤网灰尘中尘螨变应原基因。只需要少量的样品即可检测出空调过滤网灰尘中屋尘螨和粉尘螨变应原基因。

1、  一种检测空调过滤网灰尘中尘螨变应原基因的方法。具体地说通过玻璃颗粒吸附法等方法提取空调过滤网灰尘中总的微生物基因组DNA并作为模板，分别设计Der p1和Der f1各两套内外扩增引物进行套式PCR反应或分两步进行PCR，通过扩增出目的片段来检测空调过滤网灰尘中粉尘螨主要变应原Der f1基因和屋尘螨主要变应原Der p1基因。

2、  根据权利要求1所述的玻璃颗粒吸附法提取空调过滤网灰尘中的总的微生物基因组DNA。

3、  根据权利要求1所述的PCR技术检测粉尘螨主要变应原Der f1基因的引物，其特征在于序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3和SEQ ID NO.4。

4、  根据权利要求1所述的PCR技术检测屋尘螨主要变应原Der p1基因的引物。其特征在于序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8。

5、  根据权利要求1所述的套式PCR技术检测空调过滤网灰尘中粉尘螨和屋尘螨主要变应原基因的方法。

一种检测空调过滤网灰尘中尘螨变应原基因的方法
技术领域
本发明涉及变应原基因检测的方法，具体地说是一种检测空调过滤网灰尘中尘螨变应原基因的方法。
背景技术
过敏性疾病(如哮喘、过敏性鼻炎等)是临床上的常见病、多发病，据2000年WHO/IAACI报告指出近些年来哮喘的发病率和死亡率呈上升趋势。全国部分城市对青少年哮喘流行病学统计(ISSAC调查)哮喘发病率为3.3％-5.1％，远较10年前(约1％)升高；目前全国至少有一千万以上儿童患哮喘。
过敏性疾病是由于各种接触或吸入变应原引起的，变应原大部分为蛋白质，也可为多肽或糖类以及人工合成的物质如药物等。最常见的变应原是尘螨。尘螨是强烈的变应原之一，可引起的全身性变态反应疾病包括变应性哮喘、变应性鼻球结膜炎、特应性湿疹/皮炎、变应性荨麻疹等。螨性变应疾病占各种变态反应疾病的70％左右。在我国和世界的大部分地区，分布最广泛的、研究最深入的两种引起全身性变态反应疾病的尘螨包括户尘螨和粉尘螨。它们喜好在温暖、潮湿环境中繁衍，经调查空调过滤网也是它们嗜好的栖居场所之一。人们在密封空调室内工作、生活和学习时间越来越多，因而室内空调过滤网灰尘中尘螨变应原可成为室内主要的致敏因素之一。
螨体虽小，但生理器官系统俱全，成分非常复杂，含有数十种变应原，已经确定的尘螨变应原有十余类，每一类别的分子量、酶的功能、IgE的结合率和结合力，以及含量等，大部分已测得。其中I类变应原(户尘螨的Der p1和粉尘螨的Der f1)是尘螨变应原重要的组成部分。该成份于尘螨粪便颗粒中含量最高(每颗0.1ng)，具有巯基蛋白酶的活性。Der pl、Der f1理化性质相似，氨基酸序列高度同源，Mr为25×10³，pI为4.5～7.2，最佳温度条件为37℃，pH6.0。与过敏者血清IgE结合率为80％～100％。其氨基酸序列为一种与木瓜蛋白酶相似的半胱氨酸蛋白酶。
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，能直接观察和判断。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93--95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
运用PCR的方法检测尘螨特异的DNA序列具有简单、实用、灵敏度和特异性高等优点。只需要少量的样品即可检测出屋尘螨和粉尘螨变应原基因的存在。本研究为研制防螨和杀螨新型空调设备提供了技术基础。同时，为居家环境中的尘螨检测提供了一种技术手段。
发明内容
本发明的目的就是运用PCR的方法检测空调过滤网灰尘中尘螨变应原基因的方法，具有简单、实用、灵敏度和特异性高等优点。只需要少量的样品即可检测出屋尘螨和粉尘螨变应原基因的存在。本研究为研制防螨和杀螨新型空调设备提供了技术基础。同时，为居家环境中的尘螨检测提供了一种技术手段。
具体地说通过玻璃颗粒吸附法是提取空调过滤网灰尘中总的微生物基因组DNA作模板，分别设计Der p1和Der f1各两套内外扩增引物进行套式PCR，进行套式PCR反应，通过扩增出目的片段来检测空调过滤网灰尘中尘螨变应原基因。
具体实施方式
本发明的内容，通过以下的实施例作具体说明：实施例1：提取空调过滤网灰尘中的总的微生物基因组DNA
采用玻璃颗粒吸附法提取空调过滤网灰尘中的总的微生物基因组DNA，先配制下列溶液：
灰尘裂解液
5mol/L异硫氰酸胍
0.1mol/L EDTA(pH8.0)
玻璃颗粒-DNA结合缓冲液(含50mg/ml玻璃颗粒5～25u)：
6mol/L高氯酸钠
50mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
10mmol/L TDTA(Trans-1，2-diaminocyclohexane-N，N，N’，N’，-tetracetic acid)
洗脱缓冲液：
0.2mol/L高氯酸钠
50mmol/L Tris-Cl，pH8.0
10mmol/L TDTA
操作步骤：
(1)称取空调过滤网灰尘100mg悬浮于500ul灰尘裂解液中，混匀，55℃放置2小时，离心12000rpm 15min，取上清。
(2)在上清中加入2.5ml玻璃颗粒-DNA结合缓冲液，室温摇荡混匀20分钟。
(3)离心30秒种沉淀结合DNA的玻璃颗粒。
(4)用500ul结合缓冲液再悬浮漂洗沉淀1次，离心30秒，弃上清。
(5)加入1ml洗脱液悬浮玻璃颗粒，室温摇荡混匀20分钟。
(6)离心30秒种，吸出上清转移至1个新Eppendorf管中。
(7)加入2倍容积100％的乙醇，反复颠倒Eppendorf管数次，12000g离心5分钟沉淀DNA。
(8)弃上清，加入500ul 90％乙醇悬浮漂洗DNA沉淀，1000g离心3分钟，弃上清，室温蒸发乙醇20分钟或真空干燥10分钟，DNA可直接溶解于200ul TE中，供下面的PCR反应模板之用。
实施例2：空调过滤网灰尘中粉尘螨主要变应原Der f1基因的检测
本发明采用套式PCR技术对空调过滤网灰尘中粉尘螨主要变应原Der f1基因的检测。可以采用两套引物放在一起进行套式PCR反应，也可以采用下面分两步进行PCR的方法。具体操作如下：
(1)设计并合成粉尘螨主要变应原Der f1基因的检测正向外引物Derfp1，其序列为5’atc aat tcg gtt aac gtt aac  3’
(2)设计并合成粉尘螨主要变应原Der f1基因的检测反向外引物Derfr1，其序列为5’ttg gtc gtc ggc att gtt gtt 3’
(3)先将引物离心，然后分别用灭菌水稀释，终浓度均为50pmol/ul。PCR反应体积为20ul；10×buffer 2ul；dNTP 1.6ul；引物分别加0.5ul；Taq酶1ul；实施例1提供模板1ul；灭菌水13.4ul。
(4)PCR反应程序为：
95℃，3分30秒
94℃，40秒
55℃，50秒  30cycles
72℃，50秒
72℃，10min。按上述条件进行PCR反应。
(5)PCR产物电泳：琼脂糖胶浓度为2％，每个样品上样8ul，120V电泳40min，Marker为DNA 100bp ladder。
(6)从琼脂糖胶中回收目的DNA片段，其大小约为360bp，按照胶回收试剂盒3S Spin Agrose Gel DNA Purification Kit试剂盒地方法进行提取。回收的DNA溶解于400ul TE中，供第二次的PCR反应模板之用。
(7)设计并合成粉尘螨主要变应原Der f1基因的检测正向内引物Der fp2，其序列为5’gaa att gga ttt acg atc act gc  3’
(8)设计并合成粉尘螨主要变应原Der f1基因的检测反向内引物Der fr2，其序列为5’gta tgg ata gct tct ttc ttc aac 3’
(9)先将合成的引物离心，然后分别用灭菌水稀释，终浓度均为50pmol/ul。PCR反应体积为20ul；10×buffer 2ul；dNTP 1.6ul；引物分别加0.5ul；Taq酶1ul；第一次的PCR反应产物为模板取1ul；灭菌水13.4ul。
(10)PCR反应程序为：
95℃，3分30秒
94℃，40秒
55℃，50秒  30cycles
72℃，50秒
72℃，10min。
按上述条件进行PCR反应。
(11)PCR产物电泳：琼脂糖胶浓度为2％，每个样品上样8ul，120V电泳40min，Marker为DNA 100bp ladder。有大小约为300bp。目的DNA片段即为检测阳性。
(12)可以按照胶回收试剂盒3S Spin Agrose Gel DNA Purification Kit试剂盒的方法进行目的DNA回收并进行克隆和DNA序列分析与GENEBANK进行比较分析。
实施例3：空调过滤网灰尘中屋尘螨主要变应原Der p1基因的检测实
本发明采用套式PCR技术对空调过滤网灰尘中屋尘螨主要变应原Der p1基因的检测。可以采用两套引物放在一起进行套式PCR反应，也可以采用下面分两步进行PCR的方法。具体操作如下：
(1)设计并合成屋尘螨主要变应原Der p1基因的检测正向外引物Der p p1，其序列为5’gaa act aac gcc tgc agt atc 3’
(2)设计并合成屋尘螨主要变应原Der p1基因的检测反向外引物Der pr1，其序列为5’att tgg tcg tcg gca tga ttg 3’
(3)先将引物离心，然后分别用灭菌水稀释，终浓度均为50pmol/ul。PCR反应体积为20ul；10×buffer 2ul；dNTP 1.6ul；引物分别加0.5ul；Taq酶1ul；实施例1提供模板1ul；灭菌水13.4ul。
(4)PCR反应程序为：
95℃，3分30秒
94℃，40秒
55℃，50秒  30cycles
72℃，50秒
72℃，10min。
按上述条件进行PCR反应。
(5)PCR产物电泳：琼脂糖胶浓度为2％，每个样品上样8ul，120V电泳40min，Marker为DNA 100bp ladder。
(6)从琼脂糖胶中回收目的DNA片段，其大小约为360bp，按照胶回收试剂盒3S Spin Agrose Gel DNA Purification Kit试剂盒的方法进行提取。回收的DNA溶解于400ul TE中，供第二次的PCR反应模板之用。
(7)设计并合成屋尘螨主要变应原Der p1基因的检测正向内引物Derpp2，其序列为5’gaa atg ctc cag ctg aaa tcg at 3’
(8)设计并合成屋尘螨主要变应原Der p1基因的检测反向内引物Der pr2，其序列为5’t cga tag tag ctt tct tgg acg 3’
(9)先将合成的引物离心，然后分别用灭菌水稀释，终浓度均为50pmol/ul。PCR反应体积为20ul；10×buffer 2ul；dNTP 1.6ul；引物分别加0.5ul；Taq酶1ul；第一次的PCR反应产物为模板取1ul；灭菌水13.4ul。
(10)PCR反应程序为：
95℃，3分30秒
94℃，40秒
55℃，50秒  30cycles
72℃，50秒
72℃，10min。
按上述条件进行PCR反应。
(11)PCR产物电泳：琼脂糖胶浓度为2％，每个样品上样8ul，120V电泳40min，Marker为DNA 100bp ladder。有大小约为300bp。目的DNA片段即为检测阳性。
(12)可以按照胶回收试剂盒3S Spin Agrose Gel DNA Purification Kit试剂盒的方法进行目的DNA回收并进行克隆和DNA序列分析与GENEBANK进行比较分析。
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一种检测空调过滤网灰尘中尘螨变应原基因的方法
<110>深圳大学
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<160>8
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<223>检测粉尘螨主要变应原Der f1基因的正向外引物Der f p1
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<223>检测屋尘螨主要变应原Der p1基因的反向内引物Der p R2
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